KR100423551B1 - 에드워드 타다, 스트랩토코커스 이니에 및 우결핵균에대한 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법 및 상기방법으로 생산된 계란, 난황 및 상기 항-혼합균특수면역단백질을 함유한 양어사료 - Google Patents

에드워드 타다, 스트랩토코커스 이니에 및 우결핵균에대한 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법 및 상기방법으로 생산된 계란, 난황 및 상기 항-혼합균특수면역단백질을 함유한 양어사료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 넙치에서 주로 발생하는 어병인 에드워드시엘라 타다(Edwardsiella tarda)와 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae)와 항체 함량 촉진균으로서 우결핵균(Mycobaterium bovis: ATCC19015)의 세 가지 혼합균을 동시에 항원화시키고 어린 병아리에 접종하여 넙치 질병을 예방할 수 있는 혼합균 특수면역단백질을 생산하는 방법을 제공하는데 그 특징이 있다.
다른 발명은 상기 혼합균 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황, 특수면역단백질함유 수용성 단백질 및 이들 난황분말 또는 특수면역단백질함유 수용성 단백질분말을 양어사료에 활용하는 방법을 제공하는 특징도 있다.
본 발명에 의해서 제조된 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 난황이나 양어사료는 넙치(광어) 질병을 예방 및 치료하는 효과가 있다.

Description

에드워드 타다, 스트랩토코커스 이니에 및 우결핵균에 대한 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법 및 상기 방법으로 생산된 계란, 난황 및 상기 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 양어사료{Method for the production of a egg containing anti-Edwardsiella tarda IgY, anti-Streptococcus iniae IgY and Mycobaterium bovis IgY simultaneously, and egg, fish diets containing specific IgY thereof}
본 발명은 넙치에서 주로 발생하는 어병인 에드워드 타다(Edwardsiella tarda)와 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae)와 항체함량 촉진균으로서 우결핵균(Mycobaterium bovis: ATCC19015)의 세 가지 혼합균을 동시에 항원화시켜서 어린 병아리에다 접종하여 넙치 질병을 예방할 수 있는 특수면역단백질을 생산하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
다른 발명은 상기 혼합균 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황, IgY함유 수용성 면역단백질 및 이들 난황분말 또는 특수면역단백질함유 수용성 단백질분말을 양어사료에 활용하는 방법을 제공하는 특징이 있다.
본 발명과 관련한 종래의 기술을 살펴보면, 다음과 같다.
넙치에서 어병을 일으키는 원인균으로 에드워드시엘라 타다병(Edwardsiella tarda: 이하, 에드워드 타다라 함)과 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae)병에 대한 보고가 많다(레한 등 2000, 미와 등 2000, 아쉬포드 등 1998, 이시리 등 1997, 페레이드 등 1997, 레리클리프 등 1996, 잔다 등 1993, 쇼메이크 등 2001, 퍼구슨 등 2000, 브로마가 등 1999, 엘다 등 1999, 졸트킨 등 1998, 웨인스테인 등 1997, 엘다 등 1997, 버코비어 등 1997).
엘다(Eldar, 1997) 등은 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae)병에대한 백신을 개발하여 무지개 송어에 투여시 한번 주사로 4개월간 효력이 있었으며, 대조구(비접종구)는 폐사율이 50% 이상인데 비해서 백신 접종구는 5% 이하였다고 보고했다.
최근 일본 및 여러 나라에서 새로운 수산용 의약품이 개발되어, 양식어류에 응용하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 미국의 FDA에서는 옥시테트라씨클린(Oxytetracycline: OTC)과 Romet30(Ormetoprim-ulfamethoxine)의 두 항생제만을 공식 수산용 항생제로 허용하고 있다.
그러나 아직까지 항생제에 대한 안전성 높은 대체 수산용 항생제의 발굴 노력이 여러 각도에서 추진되고 있으나 실용화된 예가 많지 않으며, 국내에서도 아직 어병에 대한 치료제나 예방 제제의 적극적인 개발 연구가 이루어지지 않고 있는 실정이다.
종래의 어병치료제로는 수산용 의약품에서는 1세대 퀴놀론계 항균제인 옥소린산, 날리딕산, 피로미딕산과 2세대 퀴놀론계 항균제인 플루메킨, 미로삭신 등을 사용하여 왔으나, 세균의 내성획득으로 인해 그 효과를 별로 발휘하지 못하고 있는 실정이다.
퀴놀론계 항균제는 4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린(4-oxo-1,4-dihydro quinolin)으로부터 유래된 다양한 그룹의 약제이다. 퀴놀린계 항균제의 중요한 특징은 플라스미드에 의해 개재된 내성의 획득이 드물고, 전이가 되지 않는다는 것이다. 이런 약재들 중 다수는 그람음성의 세균성 질병에 매우 효과적이다. 그러나 이 약제에 대한 세균의 내성은 이 퀴놀린계 항균제 사이에 교차내성으로 인하여 양식업에서 문제시되었다.
최근 우리나라의 양식업은 비약할만한 발전을 하여 현재 여러 양식어류의 세균성 질병의 치료에 사용되는 수산용 의약품으로서 사용되고 있는 항균물질은 매우 여러 가지가 사용되고 있으나, 대부분의 항균물질들이 어류의 병원성 세균에 감수성이 미약하다. 이는 수산양식의 대량생산을 위한 고밀도 사육과 사료의 과다투여 등으로 인한 사육환경의 부적절에 기인한 새로운 집단 전염의 양식을 띤 세균성 질병의 발생과 만연으로 병원성 세균이 이들 항균물질 등에 내성을 획득함으로서 양식생산에 커다란 차질과 경제적 손해를 입히고 있는 상황이다.
따라서, 우리나라의 양식현실과 어종에 적절한 항생물질 대용제제를 개발해야 할 필요성이 절실하다고 하겠다.
상술한 종래의 기술은 단순히 에드워드 타다나 스트랩토코커스 이니에에 관한 질병을 예방 또는 치료하기 위한 개별균 항생제(주로 퀴놀론계 항균제)를 생산하였으나, 어병의 치료나 예방을 위한 항-혼합균 특수면역단백질을 생산하거나 또는 보다 항균효과를 높이기 위한 특수면역단백질 역가의 증진의 해결에 관한 연구나 기술개발이 전무한 상태이다.
따라서, 본 발명의 연구자들은 어병의 치료나 예방을 위한 항-혼합균 특수면역단백질의 생산 및 특수면역단백질 역가를 증진시키기 위해서, 에드워드 타다(Edwardsiella tarda)항원과 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae)항원 및 우결핵균(Mycobaterium bovis: ATCC19015)항원의 세 가지 항원을 제조한 후, 상기 세가지 균을 병아리에 동시에 접종시키고, 다시 성장된 산란계에 상기 혼합균항원을 접종하여 한 개의 계란에 이 세 가지 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법을 제공하기 위한 것이다.
또 다른 발명은 상기 방법으로 생산된 계란의 난황 내에 에드워드 타다 특수면역단백질 역가를 증진시킬 수 있는 방법을 제공함과 동시에 이를 이용한 양어사료 생산방법의 제공을 목적으로 한다.
도 1은 에드워드 타다, 스트랩토코커스 및 우결핵균의 단독 또는 혼합 접종시 항-에드워드 타다 특수면역단백질 IgY의 역가의 변화이다.
도 2는 에드워드 타다, 스트랩토코커스 및 우결핵균의 단독 또는 혼합 접종시 항-스트랩토코커스 특수면역단백질 IgY의 역가의 변화이다.
도 3은 에드워드 타다, 스트랩토코커스 및 우결핵균의 단독 또는 혼합 접종시 항-우결핵균의 특수면역단백질 IgY의 역가의 변화이다.
도 4는 에드워드 타다, 스트랩토코커스 및 우결핵균의 단독 또는 혼합 접종시 항-에드워드 타다 특수면역단백질 IgY의 평균역가이다.
도 5는 에드워드 타다, 스트랩토코커스 및 우결핵균의 단독 또는 혼합 접종시 항-스트랩토코커스 특수면역단백질 IgY의 평균역가이다.
도 6은 에드워드 타다, 스트랩토코커스 및 우결핵균의 단독 또는 혼합 접종시 항-우결핵균의 특수면역단백질 IgY의 평균역가의 변화이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 구성은, 넙치에서 주로 발생하는 어병인 에드워드 타다(Edwardsiella tarda)와 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae)와 항체 함량 촉진균으로서 우결핵균(Mycobaterium bovis: ATCC19015)의 세 가지 혼합균을 동시에 항원화하고, 어린 병아리에 접종하여 넙치 질병을 예방할 수 있는 혼합균 특수면역단백질을 생산하며, 또한 이 혼합균 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황, 특수면역단백질함유 수용성 면역단백질 및 이들 난황분말 또는 특수면역단백질함유 수용성 단백질분말을 양어사료에 활용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구성은 어린 병아리에 에드워드 타다(Edwardsiella tarda)와 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae)와 우결핵균(Mycobaterium bovis) 세 가지 항원과 수산화 알루미늄으로 일정 비율 유화시킨 혼합균유화액 1.0㎖를 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고 2회 째부터 유화보조제(ISA25)를 사용한 혼합균유화액을 2주 간격으로 1.0㎖씩 총 3회 접종하는 방법으로 생산한 한 개의 계란에 항-에드워드 타다 특수면역단백질, 항-스트랩토코커스 특수면역단백질, 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
상기 발명을 구체적으로 기술하면, 병아리에 접종된 균체수가 에드워드 타다항원: 스트랩토코커스 이니에항원: 우결핵균항원: 유화보조제의 비율이 3.0: 3.0: 1.0: 3.0으로 하여, 4.0×108/㎖ 에드워드 타다 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 스트랩토코커스 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 우결핵균 사균액항원 0.10㎖와 수산화알루미늄 0.30㎖를 유화시킨 혼합균 유화액 1.0㎖를 1회 접종하고, 2회때부터는 2주 간격으로 유화보조제(ISA25)를 사용한 상기 혼합균유화액을 동일 비율로 혼합한 혼합균유화액 1.0㎖씩 총 3회 접종하는 방법으로 생산한 한 개의 계란에 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 특수단백질과 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
다른 발명의 구성은, 병아리에 에드워드 타다항원과 스트랩토코커스 이니에항원과 우결핵균항원과 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 유화시킨 일정 비율의 혼합균유화액 1.0㎖를 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고, 2회 째부터 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 혼합균유화액을 상기 혼합균유화액과 동일한 비율로 1.0㎖씩 1주 간격으로 총 3회 접종하는 방법으로 생산한 한 개의 계란에 항-우결핵균 특수면역단백질, 항-에드워드 타다특수면역단백질, 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
상기 발명을 구체적으로 기술하면, 병아리에 접종된 균체수가 에드워드 타다항원: 스트랩토코커스 이니에항원: 우결핵균항원: 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)의 비율이 3.0: 3.0: 1.0: 3.0으로 하여, 4.0×108/㎖ 에드워드 타다 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 스트랩토코커스 이니에 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 우결핵균 사균액항원 0.10㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund') 0.30㎖를 유화시킨 혼합균유화액 1.0㎖를 1회 접종하고, 2회 때부터는 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)를 유화제로 사용한 혼합균유화액을 상기 혼합균유화액과 동일비율로 1.0㎖씩 총 3회 접종하는 방법으로, 생산한 한 개의 계란에 항-에드워드 타다 특수면역단백질, 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질, 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은 상기의 방법으로 생산된 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 특수면역단백질과 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란과, 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거하고 난황막이 제거된 난황 2㎏을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 9.0) 2ℓ를 첨가하여 교반하고 하루 정치한 후, 다시 알카리이온수(pH 10.0)를 18배 분량(72ℓ)을섞은 후 24시간 방치하여 둔 다음, 상층에 부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축여과(Ultra Filteration Ststem: 시간당 50ℓ농축, 막유형: 할로우 화이버, 가동압력: 2∼3㎏/㎠)하여 동결건조하는 것을 특징으로 하는 항 혼합균 수용성 특수면역단백질의 생산방법에 관한 것이다.
그리고, 또 다른 발명은 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거하고 난황막이 제거된 난황을 동결건조하는 것을 포함한 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 난황분말 및 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 난황분말을 1.0%이상 함유하는 양어사료에 관한 것이다.
이하에서는 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 실시예 및 도면이나 도표에 의거하여 보다 상세히 설명하기로 하겠다. 다만, 본 발명의 권리범위는 실시예나 도면에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 에드워드병균 항원화 기술
(1) 재료 및 방법
가. 세균의 분리
에드워드병의 발생이 의심되는 전북지역의 넙치양식장으로부터 간장, 신장의 농양형성, 복수 저류에 의한 복부 팽창 및 항문의 탈장 등의 증상을 나타내는 물고기로부터 균분리를 시도하여 1균주의 균을 분리하였다. 세균분리는 트립틱 소이 아가 배지(Tryptic soy agar: 이하, TSA라 함. pH 7.2)에 직접 환부조직을 떼어내 도말하거나 멸균된 면봉을 이용하여 환부로부터 샘플을 취하여 도말한 후 25℃에서 2∼3일간 배양하였다. 참고주인 에드워드 타다(Edwardsiella tardaE22)는 일본 동경대학교 어류질병학 실험실로부터 분양받아 TSA배지에 도말한 후 분리주와 동일한 조건으로 계대배양하였으며, 15% 글리세롤(15% glycerol)이 포함되어 있는 트립틱 소이 브로쓰(Tryptic soy broth; 이하 TSB라 함)를 이용하여 -70℃에 보관하였다.
나. 세균의 동정
분리된 균주는 정확한 동정을 위하여 형태학적, 생리학적, 그리고 생화학적 성상에 관한 시험을 참고균주와 비교하여 일본화학요법학회(日本化學療法學會)에서 정한 방법에 의하여 행하였다.
다. 분리균주
상기와 같은 방법으로 분리한 국내 분리주 2균주는 형태학적, 생리학적, 그리고 생화학적 성상에 관한 시험과 인위감염실험을 행한 결과, 에드워드병의 원인균인 에드워드 타다(Edwardsiella tarda)로 동정되었다. 분리동정된 연쇄구균증의 스트렙토코커스균(Streptococcus sp.), 에드워드병의 에드워드 타다(Edwardsiella tarda) 균주의 분리년도 및 어종, 그리고 분리 지역은 다음과 같다.
스트렙토코커스 및 에드워드병의 에드워드 타다 균주의 분리년도 및 어종, 그리고 분리지역
학 명 분리균주(Strains) 분리년도 어종 분리 지역
스트랩토코커스균 HEO958 1995 넙치 한국
스트랩토코커스균 FPC311* 1988 넙치 일본
에드워드 타다 YSF 98003 1998 넙치 한국
에드워드 타다 E22* 1972 넙치 일본
* 와카바야시(H. Wakabayashi) 제공, 도쿄대학, 일본
(2) 에드워드병균 항원화 기술
에드워드병균(Edwardsiella tarda) 배양조건 및 항원화는 요코야마 등(1993)의 방법으로 하였다. 에드워드병균의 항원화에는 에드워드 타다(Edwardsiella tardaYSF 98003) 균주를 사용하였다. 균은 TSA(Difco cat. No 0369-17-6)에서 배양하여 활력을 높인 후 TSB(Difco cat. No 0370-17-3) 3∼4㎖에 접종하여 25℃에서 48시간 전배양하여 대용량의 TSB 배양액으로 옮기어 48∼72시간 배양하였다. 균체는 60℃에서 30분간 열처리하고 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 식염수로 현탁한 후 원심분리하여 재회수하는 방법으로 3회 수세하여 잔존 배지를 완전히 제거하여 닭 가슴에 주사하였다. 1회 주사량은 1㎖로 하였고 이때 균수는 108이며 첫 부스팅(boosting) 후 2주 간격으로 3회 주사하였다.
2. 스트랩토코커스균(Streptococcus sp.) 항원화 기술
(1) 재료 및 방법
가. 세균의 분리
스트랩토코커스균 병의 발생이 의심되는 경남지역의 넙치양식장으로부터 안구백탁과 돌출, 아가미 덮개의 출혈과 농양 등의 증상을 나타내는 물고기로부터 균분리를 하여 1균주의 균을 분리하였다. 세균분리는 TSA(pH 7.2)에 직접 환부조직을 떼어내 도말하거나 멸균된 면봉을 이용하여 환부로부터 샘플을 취하여 도말한 후 25℃에서 2∼3일간 배양하였다. 참고주인 연쇄상구균(Streptococcus sp.FPC311)은 일본 동경대학교 어류질병학 실험실로부터 분양받아 TSA배지에 도말한 후 분리주와 동일한 조건으로 계대배양하였으며, 15% 글리세롤(15% glycerol)이 포함되어 있는 트립틱 소이 브로스(Tryptic soy broth; 이하 TSB라 함)를 이용하여 -70℃에 보관하였다.
나. 세균의 동정
분리된 균주는 정확한 동정을 위하여 형태학적, 생리학적, 그리고 생화학적 성상에 관한 시험을 참고균주와 비교하여 일본화학요법학회(日本化學療法學會)에서 정한 방법에 의하여 행하였다.
다. 분리균주
상기와 같은 방법으로 분리한 국내 분리주 2균주는 형태학적, 생리학적, 그리고 생화학적 성상에 관한 시험과 인위감염실험을 행한 결과, 연쇄구균증의 원인균은 스트랩토코커스균(Streptococcus sp.)으로 동정되었다.
(2) 스트랩토코커스 이니에 항원화 기술
스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae) 배양조건 및 항원화는 요코야마 등(1993)의 방법으로 하였다. 스트랩토코커스 이니에(Streptococcus iniae) 항원화에는 스트랩토코커스 스파이시스(Streptococcus spices)(엔테로코커스 세리오리시다:enterococcus seriolicida) HEO 958균주를 사용하였다. 균은 TSA(Difco cat. No 0369-17-6)에서 배양하여 활력을 높인 후 TSB(Difco cat. No 0370-17-3) 3∼4㎖에 접종하여 25℃에서 48시간 전배양하여 대용량의 TSB 배양액으로 옮기어 48∼72시간 배양하였다. 균체는 60℃에서 30분간 열처리하고 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 식염수로 현탁 후 원심분리하여 재회수하는 방법으로 3회 수세하여 잔존배지를 완전히 제거하여 닭가슴에 주사하였다. 1회 주사량은 1.0㎖로하였고 이때 균수는 108이며 첫 부스팅(boosting)후 2주 간격으로 3회 주사하였다.
3. 우결핵균(Mycobacterium bovis)의 분리동정 및 항원제조
(1) 우결핵균의 일반성상
우결핵균은 그램양성의 간균으로 대표적인 항산성염색양성(acid-fasteness)균이다. 항산성염색인 질 닐젠(Ziehl-Neelsen)법으로 염색시 적색으로 염색되고, 균의 배열은 뗏목모양으로 뭉치거나 T, V, Y 자상의 배열을 나타내고 협막이나 편모가 없고 아포를 형성하지 않는다. 열에 대한 저항성은 강하여 62℃, 30분에 사멸되며, 사체에서 4년, 객담에서 2∼6개월, 하수에서 100∼200일간 생존하였다.
(2) 우결핵균의 확인법
가. 질 닐젠법
우결핵균은 대표적인 항산성균으로서 항산성염색을 통해서 확인하였다. 항산성염색 중 가장 널리쓰이는 질 닐젠법을 이용하여 균을 확인하였다.
균액을 도말한 슬라이드 유리 전면을 카볼 푹신(carbol-fuchsin)용액을 덮고 램프로 끓지 않을 정도로 가온하면서 3∼5분간 염색한 후 흐르는 물에 슬라이드 유리 뒷면으로해 염색액을 씻는다. 그 다음 염산 알코올로 탈색하는데 적색으로 보이지 않을 때까지 약 30초에서 60초간 탈색한다. 다시 흐르는 물에 씻은 다음 대조염색액(methylen blue)으로 약 30초간 대조염색을 한다. 다시 수세한 후 자연건조 또는 건조기 위에서 건조한 다음 검경한다.
나. 카탈라아제 테스트(Catalase test)
카탈라아제 테스트는 항산성균의 카탈라아제능(catalase activity)을 측정할 때 사용하는 시험법으로 수직으로 만든 배지에 균을 배양시켜 균집락에 트윈-페록시다아제(Tween-peroxidase) 혼합액을 가해서 거품의 높이를 측정한다. 카탈라아제는 과산화수소(H2O2)에 작용하여 생기는 발생기 산소에 의해 거품양을 측정하였다.
항산성균인 우결핵균은 카탈라아제 테스트에서 양성을 나타낸다.
(3) 우결핵균의 항원화
가. 우결핵균(Mycobacterium bovis)
단백질형성 촉진균으로서 사용된 우결핵균(Mycobacterium bovis)은 ATCC에서 분양받아 사용하였다. 우결핵균은 ATCC 제품번호 19015를 사용하였다.
나. 우결핵균의 증균
(가) 로벤쉬타인- 엔젠(Lowenstein-Jensen)(L-J) 고형배지를 이용한 증균
인산칼륨(KH2PO4) 2.4g, 아황산마그네슘(MgSO(7H2O)) 0.4g, 마그네슘 시트레이트(magnesium citrate) 0.6g 및 아스파라긴(asparagine) 3.6g 등을 증류수 600㎖에 가온 용해한 기초배지에 냉각한 후 글리세린(glycerin) 12㎖와 2% 말라치트 그린(malachite green) 수용액 20㎖ 및 균질화된 전란(whole egg) 1000㎖ 등을 혼합한 후 5∼6㎖씩 분주하여 사면이 되게 하여 85∼90℃에서 60분간 응고멸균하였다. 균액을 증류수에 희석 후 배지에 접종하고 37℃의 호기성 조건으로 표면에 평행이 되도록 배치하고 오버나이트(over night)시키면서 배지표면의 습기가 건조되거나 제거시켜 스크류캡(screw cap)이나 고무(rubber)를 꼭 막고서 2∼3주간 배양하였다. 1∼2㎜ 정도로 작은 회백색으로 서서히 자라고, 계속해서 4∼8주간 배양하면 집락은 담황색의 백색표면으로 거칠어지고 건조한 것 같이 보이게 되었다.
(나) 사우톤(Sauton) 액체배지를 이용한 증균
인산칼륨(KH2PO4) 0.5g, 아황산마그네슘(MgSO(7H2O)) 0.5g, 구연산(citric acid) 2g, 아스파라긴(asparagine) 4g, 아이론 시트레이트(iron citrate) 0.05g 등을 증류수 1000㎖에 가온용해한 다음 글리세인(glycein) 35㎖를 가하고 pH 7.4가 되도록 조절하였다. 고압멸균을 하고 배지가 식으면 균액을 접종하여 6주간 증균시켰다.
(4) 우결핵균의 불활화
증균된 우결핵균을 고형배지에서 증균시켜 증균된 우결핵균을 스크랩퍼(scraper)를 이용하여 회수하였다. 이것은 멸균생리식염수에 부유하였다. 0.2% 포르말린(formaline)을 첨가하여 2일간 불활화하였다. 불활화된 균액은 멸균생리식염수를 이용하여 4,500rpm에서 20분간 3회 세척을 하였고, 균수를 측정하여 냉동보관하고 항원제조시 산란계 마리당 주사액에 108세포가 되도록 사용하였다.
액체배지에 증균된 균액은 고체배지에서 증균된 균액과 동일하게 불활화과정을 거쳐서 냉동보관하였다. 항원제조시 산란계 마리당 108세포가 되도록 사용하였다.
4. 혼합된 세가지 항원을 병아리에 접종
(1) 중추 12주령의 병아리에 접종된 항원은 우결핵균 균체수 108/㎖, 에드워드 타다 균체수 108/㎖, 스트랩토코커스 이니에 균체수 108/㎖였으며, 에드워드항원: 스트랩토코커스 이니에항원: 우결핵균항원: 유화보조제의 비율은 3.0: 3.0: 1.0: 3.0으로 하였다. 상세하게는 4.0×108/㎖ 에드워드 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 스트랩토코커스 이니에 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 우결핵균 사균액항원 0.10㎖와 수산화 알미늄 0.30㎖를 유화시킨 후 1회 접종을 하였고, 2회 째부터 부스팅에 사용된 유화보조제는 공지된 ISA25를 사용하여 접종하였는데, 일차적으로 혼합균 유화액을 1회째 접종을 포함하여 병아리 한쪽 다리에 1.0㎖씩 2주 간격으로 총 3회 접종하였다.
(2) 중추 12주령의 병아리에 접종된 우결핵균 균체수 108/㎖, 에드워드 타다 균체수 108/㎖, 스트랩토코커스 이니에 균체수 108/㎖였으며, 에드워드 타다항원: 스트랩토코커스 이니에항원: 우결핵균항원: 유화보조제의 비율은 3.0: 3.0: 1.0: 3.0으로 하였다. 상세하게는 4.0×108/㎖ 에드워드 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 스트랩토코커스 이니에 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 우결핵균 사균액항원 0.10㎖와 프로인트 완전유화제(Adjuvant complete Freund's) 0.30㎖를 유화시킨 후 1회 접종하였고, 2회째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 프로인트 불완전유화제(Adjuvant incomplete Freund's)를 사용하여 접종하였는데, 상기 혼합균유화액을병아리 한쪽 다리에 1.0㎖씩 2주 간격으로 1회째 접종을 포함하여 총 3회 접종하였다. 그 결과 상기 혼합균유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 한 개의 계란에 항-우결핵균 특수면역단백질과 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란을 생산하였다.
5. 난황분리, 난황분말추출, 면역단백질 분리 및 역가 측정
(1) 난황분리
상기 방법에 의하여 생산된 계란은 난가공공장에서 난백과 난황을 분리하였다.
(2) 난황분말
상기 분리된 신선 난황을 앞서 언급된 알카리 이온수로 지방층을 제거한 뒤 잔여 수용성 단백질과 침전물을 함께 농축여과 후에 동결건조하여 난황분말을 생산하였다.
(3) 면역단백질 분리 및 역가 측정
상기의 방법으로 생산된 항-우결핵균 특수면역단백질과 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란과 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거하고 난황막이 제거된 난황 2㎏을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 9.0) 2ℓ를 첨가하여 교반하고 하루 정치한 후, 다시 알카리이온수(pH 10.0)를 18배 분량(72ℓ)을 섞은 후 24시간 방치하여 둔 다음, 상층에 부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축여과(Ultra Filteration Ststem: 시간당 50ℓ농축, 막유형: 할로우 화이버, 가동압력: 2∼3㎏/㎠)하여 동결건조하여 분리하였다.
상기 여과에 의해 얻어진 수용성 단백질함량과 특수면역단백질의 함량을 다음과 같이 측정하였다.
또한, 특수면역단백질의 함량 측정도 샌드위치 엘라이저(ELISA)방법에 의해 수행되었다. 에드워드 타다균을 흡광도(O.D.)값이 660㎚에서 0.05가 되도록 완충액으로 희석하였다. 상기 희석된 균체를 마이크로플레이트에 코팅하고 16시간 방치하였다. 이 마이크로플레이트를 세척한 후 상기 여과된 수용성 단백질을 넣고 반응시킨 다음 세척하여, 1/10,000로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가한다. HRP의 기질로는 TMB를 사용하였고, 반응 정지액으로는 2N-황산(2N-H2SO4)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 1∼도 6에 도시하였다.
실시예 2
1. 세 가지 단백질을 함유한 양어사료 제조
(1) 수용성 단백질 추출
수용성 단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다. 상기의 방법으로 생산된 항-에드워드 타다 특수면역단백질(IgY)과 항-스트랩토코커스 특수면역단백질과 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란과, 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거하고 난황막이 제거된 난황 2㎏을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 9.0) 2리터를 첨가하여 교반하고 하루 정치한 후, 다시 알카리이온수(pH 10.0)를 18배 분량(72리터)을 섞은 후 24시간 방치하여 둔 다음, 상층에부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축여과(Ultra Filteration System: 시간당 50ℓ농축, 막유형: 할로우 화이버, 가동압력: 2∼3㎏/㎠)하여 동결건조하여 분리하였다.
(2) 혼합 특수면역단백질을 함유한 양어사료 제조 배합비
상술한 바와 같이 에드워드 타다항원과 스트랩토코커스 이니에항원과 우결핵균항원으로 혼합시킨 혼합항원을 접종 후, 생산된 계란에서 추출한 수용성 단백질(crude IgY) 분말을 첨가하여 양어사료를 제조하였으며, 양어 습식사료(모이스트 펠렛)의 제조배합비는 아래 표 2에 제시된 바와 같다.
넙치 질병예방 특수면역단백질함유 양어 습식사료 배합비 예
원 료 배합비 A 배합비 B 배합비 C
생사료(냉동고등어 등 잡어류) 90.00 92.00 90.00
양어배합사료 6.50 6.50 6.00
특수면역단백질(IgY) 난황분말 2.50 - 1.00
특수면역단백질(IgY) 수용성 단백질분말 - 0.50 2.00
점결제(sodiumpolyacrylate, 1%) 1.00 1.00 1.00
* 혼합균은 세 가지 균을 동시 접종 후 생산된 난황분말
(3) 혼합균 특수면역단백질을 투여시 효과
가. 기호성 시험
(가) 혼합균 특수면역단백질 분말제제
본 발명에 사용된 혼합균 특수면역단백질 분말제제는 연쇄구균증의 원인균인 스트렙토코커스균(Streptococcus sp.HEO958)와 에드워드증의 원인균인 에드워드 타다균(Edwardsiella tardaYSF98003)을 산란계에 면역처리하여 얻은 난황 중의 특수면역단백질이 주성분으로 이루어진 분말제제(powder)로써, 동결건조된 제제를 사용하였다. 기호성 시험을 위한 본 혼합균 특수면역단백질 분말제제의 투여방법은독성시험법에 의거한 투여허용 최대용량(급이량의 0.1%)을 물에 녹여 사료에 균등하게 혼합하였고, 투여경로는 경구투여(oral administration)를 통하여 어체에 적용하였다.
(나) 공시어종 및 사육방법
넙치의 치어를 해안에 인접한 육상 종묘배양장의 수조에서 실험을 했다. 수조를 4개 이상 확보하여 1개의 수조는 대조군, 나머지 3개의 수조는 각각 난황 성분만을 처리한 약제를 투여한 제1실험군, 연쇄상구균증의 원인균인 스트렙토코커스균(Streptococcus sp.HEO958)을 면역시켜 처리한 약제를 투여한 제2실험군, 에드워드증의 원인균인 에드워드 타다균(Edwardsiella tardaYSF98003)을 면역시켜 처리한 약제를 투여한 제3실험군을 넣어 양어장에서 행하던 사육방법과 동일하게 사육하였다.
또한 공시어종의 사육조건은, 사육수온은 그 범위가 22±2℃, pH 6.8∼8.2, 용존산소량(dissolved oxygen)은 4.3∼6.2로 유지시켰으며, 암모니아 농도는 20ppm이하가 되도록 하였으며, 이를 위해 육상수조에서는 환수율을 10∼20%로 하였다.
(다) 기호성 시험
대조군과 실험군 각 500마리씩으로 나누어 일주일간 사육수조에서 사육하면서 실험군은 사료에 시험약제를 혼합하여 1일 1회씩 3일간 3회 급이율(총 어체중의 3.5%)에 의거하여 섭취하게 하였고, 대조군은 모이스트펠렛 사료를 실험군과 동일한 방법으로 투여하였다. 즉, 현장에서의 여러 환경요인을 감안하여 급이율에 의거 경구투여한 후, 사료섭취의 정도를 대조군과 비교하여 기호성(사료섭취율)의 유무를 판단하였다.
(라) 기호성 시험결과
각각의 시험약제를 사료와 혼합하여 치어 500미에 경구투여하였다. 이때 투여한 사료의 양은 어체중과 수온에 따른 급이율(3.5%)을 기준으로 하여 결정하였다.
시험결과, 모든 실험군에서 약제를 혼합한 사료를 투여하고 물고기가 약 5분 이내에 수조바닥에 가라앉았던 사료도 대부분 섭취를 하였으며, 일주일간 실험이 실시되는 동안에도 계속하여 활발한 섭이상태를 보였다. 또한, 이러한 결과는 대조군과 동일한 기호성을 나타낸다고 인정되었다. 즉, 표 3에서와 같이 대조군과 시험군 모두 비슷한 사료섭취율이 인정되어, 본 약제가 사료섭취시 기호성에 전혀 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
시험약제를 사료혼합하여 경구투여할 경우의 어종별 사료섭취율
어군(%) 평균어체중(g) 총급이량(g)*1 섭취량(g) 섭취율
대조군 10.6 ±0.3*2 185 182 ±2.3 98.3
제1실험군 11.7 ±0.7 205 198 ±3.4 96.6
제2실험군 10.8 ±0.8 189 184 ±4.2 97.5
제3실험군 12.5 ±0.5 220 216 ±2.5 98.2
*1 급이율은 총어체중의 3.5%를 기준으로 하였으며, 사료의 중량은 습식중량임.*2 대조군 편차〈 0.05
나. 독성시험
(가) 급성독성시험
경구투여의 급성독성시험 결과, TLm48h는 400㎎/어체중㎏ 이상이었다. 즉, 본 시험에서 투여한 최대 농도에서도 공시어는 아래 표 4에서 보는 바와 같이 전혀 폐사하지 않았으며, 외관상의 이상 및 행동 이상도 관찰할 수 없었다.
병리조직학적 소견으로는 소화기관에서 강제투여시 발생한 것으로 추정되는 식도 및 위장의 미란을 관찰할 수 있었으며 장관 내에는 아직 소화, 흡수되지 않는 시료를 관찰할 수 있었다. 한편, 소화기관에서 점액분비세포의 증식을 관찰할 수 있었다.
특수면역단백질제제의 급성독성시험결과
투여제제량(㎎/어체중㎏) 0 25 50 75 100 200 300 400
폐사율(폐사어수/공시어수) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
(나) 아급성 독성시험
본 약제를 100, 200㎎/ 어체중㎏/ 일(day)의 농도로 사료에 혼합, 30일간 경구투여한 후, 60일동안 섭이, 성장, 폐사상황 등을 관찰한 결과, 전 실험군 및 대조군에서 폐사개체는 물론 아무런 이상을 관찰할 수 없었다. 또한 실험종료 후 공시어를 채집, 병리조직학적 관찰을 행하였으나 표 5에서 나타낸 바와 같이 아무런 이상을 관찰할 수 없었다.
특수면역단백질제제의 아급성 독성시험결과
실험기간중 폐사율(%) 실험개시전 평균체중(g) 실험종료후 평균체중(g)
대조군 0 2.8 10.4
100㎎ 투여군 0 2.8 10.9
200㎎ 투여군 0 2.7 11.1
다. 양어사료 제형결정시험-모이스트펠렛 사료 투여시험
시험 결과, 분말상태의 제제를 그대로 사료와 혼합하여 투여하는 방법은 본 제제가 용해성이 매우 높은 탓에 공시어가 사료를 섭취하기 전에 용해되어 버리는단점이 있었다. 또한 비교적 가벼운 분말이라 바람에 날리기 쉬운 등의 단점도 발견되었다. 생사료와 혼합하는 방법은 역시 물 속에서 쉽게 풀어져 공시어가 효과적으로 제제를 섭취하지 못하는 단점이 있었다. 한편, 점결제(sodium polyacrylate, 1%) 또는 부형제(만니톨 또는 락토오즈, 잔량)를 사용하여 사료와 혼합하여 투여한 결과, 이러한 단점들이 개선되었다. 따라서, 양어사료에 본 제제와 함께 적당량의 점결제 또는 부형제를 첨가하여 어류에 공급할 경우 약제가 물 속으로 손실되는 경제적 문제점을 제거하여 실제 양식현장에서 효과적으로 사료에 혼합하여 어류에 투여할 수 있게 되었다.
라. 용법 및 용량 시험
본 제제를 용량 단계별로 투여한 지 일주일 후에 인위감염실험을 통하여 에드워드증과 연쇄상구균증을 유발한 후, 일주일간의 실험군과 대조군의 누적폐사량과 누적폐사율은 표 6과 같았다.
대조군에서는 질병발생 후 일주일 이내에 50마리 중 46∼48마리의 거의 모든 공시어가 폐사한데 반하여, 실험군에서는 약제 용량의존성이 인정되는 질병발생 억제효과(예방효과)가 있었다. 즉, 10㎎/㎏의 용량을 사용한 실험군의 경우에서 에드워드증과 연쇄상구균증에 의한 폐사의 감소가 인정되었으나, 유의할만한 예방 효과가 확인되지는 못하였다. 그러나 20㎎/㎏의 용량을 사용한 실험군의 경우 누적폐사량이 현저히 적은 것을 보아 유의할만한 예방효과가 인정되었다. 또한 20㎎/㎏의 실험군과 40㎎/㎏의 용량을 사용한 실험군의 경우 서로 유의할만한 예방효과의 차이는 인정되지 않았다.
따라서, 표 6에서 제시된 바와 같이 넙치의 에드워드증과 연쇄상구균증을 예방함에 있어서 본 제제를 1일 1회 3일간 20㎎/㎏이상의 용량을 경구투여할 경우 유의할만한 효과가 있음이 실험적으로 입증되었다. 혼합균을 접종 후 세가지 특수면역단백질을 함유한 투여구의 경우도 단독 IgY 처리구와 성적이 유사한 좋은 결과를 보였다.
인위감염실험에 의한 본 약제의 에드워드증과 연쇄구균증의 예방효과
처리구 폐사수/총공시어수(폐사율 %)
투여량 에드워드병 스트랩토코커스병 혼합균
0 48/50(96) 무처리구 46/50(92) 47/50(94)
10 40/50(80) 처리구 42/50(84) 41/50(82)
20 16/50(32) 처리구 12/50(24) 13/50(26)
40 14/50(28) 처리구 10/50(20) 11/50(22)
① 수용성 단백질 IgY 투여량 ㎎/㎏ 생체중(fish body weight)② 에드워드병 처리구는 항-에드워드 IgY를, 스트랩토코커스균 처리구는 항-스트랩토코커스 이니에 IgY를, 혼합균 처리구는 세가지 IgY가 혼합된 IgY를 투여함.
본 발명은 상술한 특정의 실시예, 도표나 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.
본 발명에 의해서 생산된 세 가지 혼합균 특수면역단백질 공유 또는 함유 계란이나 양어사료는 넙치(광어) 질병예방에 탁월한 효능이 있다.
또한, 본 발명에 의한 생산방법에 의하여 생산된 계란에서 추출된 난황이나 난황분말, 또는 수용성 면역단백질을 이용한 양어사료를 제조, 넙치나 뱀장어 등양식어류에 급여시에 항생물질을 주지 않고서도 광어를 양식할 수 있는 기술로서 소비자들이 항생제 잔류성이 없는 생선회를 즐길 수 있으며, 항생제 잔류성 때문에 일본에 수출을 못하는 난관도 극복할 수 있는 효과가 기대된다.

Claims (9)

  1. 병아리에 에드워드 타다항원과 스트랩토코커스 이니에항원과 우결핵균항원과 수산화 알루미늄으로 일정 비율로 유화시킨 혼합균유화액 1.0㎖를 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고, 2회 째부터 상기 혼합균에 유화보조제(ISA25)를 사용한 혼합균유화액을 2주 간격으로 1.0㎖씩 접종하는 것을 특징으로 하는 한 개의 계란에 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질과 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 계란생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    병아리에 접종된 균체수가 에드워드 타다항원: 스트랩토코커스 이니에항원: 우결핵균항원: 유화보조제의 비율이 3.0: 3.0: 1.0: 3.0으로 하여, 4.0×108/㎖ 에드워드 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 스트랩토코커스 이니에 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 우결핵균 사균액항원 0.10㎖와 수산화 알루미늄 0.30㎖를 유화시킨 혼합균유화액 1.0㎖를 1회 접종하고, 2회 때부터는 2주 간격으로 상기 혼합균에 동일 비율로 유화보조제(ISA25)를 사용하여 혼합한 혼합균유화액 1.0㎖씩 접종하여 총 3회 접종하는 것을 특징으로 하는 한 개의 계란에 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질과 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 계란생산방법.
  3. 병아리에 에드워드 타다항원과 스트랩토코커스 이니에항원과 우결핵균항원과 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 유화시킨 일정 비율의 혼합균유화액 1.0㎖를 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고, 2회 째부터 상기 혼합균에 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 혼합균유화액을 1.0㎖씩 2주 간격으로 접종하는 것을 특징으로 하는 한 개의 계란에 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질과 항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 계란생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    병아리에 접종된 균체수가 에드워드 타다항원: 스트랩토코커스 이니에항원: 우결핵균항원: 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)의 비율이 3.0: 3.0: 1.0: 3.0으로 하여, 4.0×108/㎖ 에드워드 타다 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 스트랩토코커스 이니에 사균액항원 0.30㎖와 4.0×108/㎖ 우결핵균 사균액항원 0.10㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund') 0.3㎖를 유화시킨 혼합균유화액 1.0㎖를 1회 주입하고, 2회 때부터는 상기 혼합균에 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)를 동일 비율로 사용하여 혼합한 혼합균유화액 1.0㎖씩 접종하여 총 3회 접종하는 것을 특징으로 하는 한 개의 계란에 항-에드워드 타다 특수면역단백질과 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질과항-우결핵균 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 계란생산방법.
  5. 제 2항 또는 제 4항의 방법으로 면역화되어 생산된 것을 특징으로 하는 항-에드워드 타다 특수면역단백질(IgY)과 항-스트랩토코커스 이니에 특수면역단백질(IgY)과 항-우결핵균 특수면역단백질(IgY)을 동시에 함유한 난황을 가진 계란.
  6. 제5항의 계란으로부터 분리한 난황을 동결건조한 난황분말.
  7. 제5항의 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 9.0)를 첨가하여 교반하고 하루 정치한 후, 다시 알카리이온수(pH 10.0)를 18배 분량을 섞은 후 일정시간 방치한 후, 상층에 부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축여과(Ultra Filteration)하고 동결건조하여 제조한 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 수용성 면역단백질 분말.
  8. 제6항의 난황분말을 함유한 양어사료.
  9. 제7항의 수용성 면역단백질 분말을 함유한 양어사료.
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