KR100420963B1 - 대장균의 아세트산 대사경로를 부분 억제하는 안티센스유전자를 포함하는 벡터 및 전기 벡터로 형질전환된대장균에서의 재조합 단백질 생산 방법 - Google Patents

대장균의 아세트산 대사경로를 부분 억제하는 안티센스유전자를 포함하는 벡터 및 전기 벡터로 형질전환된대장균에서의 재조합 단백질 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균의 아세트산 대사경로를 부분 억제하는 안티센스 유전자를 포함하는 벡터 및 전기 벡터로 형질전환된 대장균에서의 재조합 단백질 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은, 아세트산 생성에 관여하는 두 가지 효소인 아세트산 인산화 효소 A(acetate kinase A, ackA) 및 포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase, pta)의 안티센스(antisense) 유전자 발현을 통해 아세트산 대사 효소의 발현을 mRNA 수준에서 부분 억제시키는 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 재조합 단백질 생산용 대장균을 고농도로 배양할 때 2차 대사산물인 아세트산의 과량 배출로 야기되는 재조합 단백질 생산 저하 및 세포성장 저해 문제를 해결하여 기존의 방법과 달리 재조합 단백질의 종류에 관계없이 고수율로 발현시킬 수 있으며 공정적 접근방식에 의한 고비용의 문제를 근본적으로 해결할 수 있다. 또한, 포도당 배지로 인한 아세트산 배출에 의한 세포 성장 저해 및 단백질 생산성 저하를 해결함으로써 낮은 생산비로 고가의 단백질을 대량생산할 수 있는 경제적 파급효과가 클 것으로 기대된다.

Description

대장균의 아세트산 대사경로를 부분 억제하는 안티센스 유전자를 포함하는 벡터 및 전기 벡터로 형질전환된 대장균에서의 재조합 단백질 생산 방법{Vector comprising antisense gene which partially inhibits acetic acid metabolism in E.coli and a process for preparation of recombinant proteins from E.coli transformed with the said vector}
본 발명은 대장균의 아세트산 대사경로를 부분 억제하는 안티센스 유전자를 포함하는 벡터 및 전기 벡터로 형질전환된 대장균에서의 재조합 단백질 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은, 재조합 단백질 생산용 대장균을 고농도로 배양할 때 2차 대사산물인 아세트산의 과량 배출로 야기되는 재조합 단백질 생산 저하 및 세포성장 저해 문제를 해결하고자, 안티센스(antisense) 유전자 발현을 통해 아세트산 대사 효소의 발현을 mRNA 수준에서 부분 억제시키는 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법에 관한 것이다.
지금까지, 박테리아, 효모, 곤충세포, 동물세포 등의 다양한 숙주 시스템에 유전공학적 기법을 이용하여 유용한 단백질을 대량생산하는 발현체계가 개발되어 왔다. 종래의 단백질 생산력 향상을 위한 주된 기술적 방법은 강력한 프로모터(promoter)를 이용한다거나, 대상 유전자의 전사(transcription) 및 번역(translation)을 증가시킬 수 있도록 유전자서열을 최적화시킨 발현벡터(expression vector)를 제조하여 외부 유전자의 발현율을 향상시키는데 중점을 두지만, 생산 숙주(host)의 생리대사(physiological metabolism)와는 무관하게 발현대상 유전자를 삽입하여 단백질을 생산하는 플라스미드만을 조작하는 것이므로 단백질 발현을 위해 필요한 에너지와 물질대사를 지원하게 되는 숙주의 대사반응(metabolic response)을 고려하지 않는 1차원적 접근으로서의 기술적 한계를 안고 있다.
대장균은 많은 연구가 진행된 단백질 생산 시스템으로, 타 생물체에 비해 많은 대사정보가 알려져 있고 유전자에 대한 정보가 거의 다 밝혀져 있어서 재조합 단백질 생산에 널리 사용되나, 대장균의 고농도 배양시 2차 대사산물인 아세트산의 배지내 축적으로 인하여 세포 성장 저해 및 단백질 생산성이 저하된다는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위한 많은 시도들이 계속되어 왔다. 이러한 시도들은 크게 두 가지로서, 첫 번째는 공정적 입장에서 아세트산의 과량생산을 유도하는 고농도 탄소원의 배지 대신 탄소원을 적절하게 계속 공급하거나(참조: Robbins, J. W., and K. B. Taylor. 1989. Optimization ofEscherichia coliGrowth by controlled addition of glucose. Biotechnol. Bioeng. 34:1289-1294; Wong, H. H., Y. C. Kim, S. Y. Lee, and H. N. Chang. 1998. Effect of post-induction nutrient feeding strategies on the production of bioadhesive protein inEscherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 60:271-276) 또는 아세트산 과량생산을 일으키는 포도당 대신 다른 탄소원을 이용한 방법이다. 하지만, 전기 공정적 측면의 접근 방법은 고비용 발생 및 세포성장율이 낮아지는 등의 단점을 가진다.
두 번째는 유전적으로 아세트산의 생성 경로를 제거하거나 또는 아세트산 이외의 다른 대사산물로의 경로를 강화 또는 확대함으로써 아세트산 배출의 문제를 줄이고자 하는 방법(참조: Chou, C. H., G. N. Bennett, and K. Y. San. 1994. Effects of modified glucose uptake using genetic engineering techniques on high-level recombinant protein production inEscherichia colidense cultures. Biotechnol. Bioeng. 44:952-960; Dedhia, N. N., T. Hottiger, and J. E. Bailey. 1994. Overproduction of glycogen inEscherichia coliblocked in the acetate pathway improves cell growth. Biotechnol. Bioeng. 44:132-139)이다. 그러나, 아세트산 생성경로는 세포내 에너지원인 ATP를 생성하는 경로이고 또한 그 중간 산물인 acetyl-phosphate는 대장균에서 세포내 신호전달 및 기타 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있기 때문에(참조: McCleary, W. R., and J. B. Stock. 1994. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J. Biol. Chem.269:31567-31572; Nystr, T. 1994. The glucose-starvation stimulon ofEscherichia coli: induced and repressed synthesis of enzymes of central metabolic pathways and role of acetyl phosphate in gene expression and starvation survival. Mol. Microbiol.12:833-843) 전기 아세트산 대사 경로를 제거하는 접근법은 문제점이 있고 또 다른 경로의 흐름을 강화하는 것 또한 근본적인 접근법은 될 수 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 대장균의 2차 대사산물 중 세포성장에 저해가 크고 단위 탄소공급원 당 생산 배출량이 높아 세포내 에너지의 효율적 활용에 문제가 되지만 그 대사과정의 특성상 세포의 생리적인 여러 요소들이 관여하여 없어서는 안 될 아세트산 생성경로에 대하여 안티센스 유전자 및 전기 유전자를 포함한 벡터 시스템으로 적절히 억제를 하는 경우, 유도성 발현벡터를 이용한 외래단백질 발현에 있어서 그 유도물질에 관계없이 모든 종류의 재조합 외래 단백질 생산에 있어서 그 생산율을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 아세트산 대사경로의 부분억제효과를 갖는 안티센스 유전자 및 전기유전자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 아세트산 대사경로의 부분억제효과를 갖는 안티센스 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균에서의 재조합 단백질 생산방법을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 발현벡터 pJY103의 제조 과정을 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 재조합 발현벡터 pJY104의 제조 과정을 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 재조합 발현벡터 pJY105의 제조 과정을 나타내는 그림이다.
도 4는 pJY103, pJY104 및 pJY105 벡터의 안티센스(antisense) 유전자, 프로모터 및 터미네이터(terminator) 유전자의 조합과 이에 대한 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 5는 도 1의 pJY103 및 trc 프로모터에 GFPuv가 연결된 벡터로부터 유도된 벡터 pJY106의 제조 과정을 나타내는 그림이다.
도 6은 도 2의 pJY104 및 trc 프로모터에 GFPuv가 연결된 벡터로부터 유도된벡터 pJY107의 제조 과정을 나타내는 그림이다.
도 7은 도 3의 pJY105 및 trc 프로모터에 GFPuv가 연결된 벡터로부터 유도된 벡터 pJY108의 제조 과정을 나타내는 그림이다.
도 8은 본 발명의 재조합 벡터로부터 발현된 녹색형광단백질(GFP)의 형광강도 및 안티센스 유전자가 삽입되지 않은 녹색형광발현벡터의 형광강도를 자외선 상에서 상대적으로 비교한 그림이다.
도 9는 녹색형광단백질의 발현정도를 웨스턴블랏(Western blot)으로 정량화한 그림이다.
1번줄 : 단백질 분자량 크기 마커
2번줄 : 순수한 녹색형광단백질(500ng)
3번줄 : 발현벡터 pTrc-GFPuv에서 유도 후 2시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
4번줄 : 발현벡터 pJY107에서 유도 후 2시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
5번줄 : 발현벡터 pTrc-GFPuv에서 유도 후 4시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
6번줄 : 발현벡터 pJY107에서 유도 후 4시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
7번줄 : 발현벡터 pTrc-GFPuv에서 유도 후 6시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
8번줄 : 발현벡터 pJY107에서 유도 후 6시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
9번줄 : 발현벡터 pTrc-GFPuv에서 유도 후 8시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
10번줄 : 발현벡터 pJY107에서 유도 후 8시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
11번줄 : 발현벡터 pTrc-GFPuv에서 유도 후 10시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
12번줄 : 발현벡터 pJY107에서 유도 후 10시간에 얻은 시료의 녹색형광단백질
도 10은 녹색형광단백질의 형광강도와 발현양의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 11은 4종류의 형질전환된 대장균이 발현한 녹색형광단백질의 양을 비교한 그래프이다.
도 12는 안티센스 유전자와 녹색형광단백질이 삽입된 세 종류의 벡터로 형질전환된 대장균과 녹색형광단백질만이 삽입된 비교용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양했을 때의 세포성장곡선을 비교한 그래프이다.
도 13은 1% 포도당이 포함된 M9배지에서 배양시 배지내에 잔존하는 포도당의 농도를 각각의 형질전환된 대장균에 대해 측정한 그래프이다.
도 14는 도12와 같은 조건 하에서 배양시 배지로 배출되는 각종 2차 대사산물인 아세트산의 농도를 각각의 형질전환된 대장균에 대해 비교한 그래프이다.
도 15는 배양규모를 달리하여 1000ml 플라스크에 400ml의 M9배지에서 배양한 것과 실시예 4의 규모의 것에 있어서 pJY107을 함유한 대장균과 pTrc-GFPuv를 함유한 대장균의 녹색형광단백질 발현 증가율을 비교한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세트산 대사경로의 부분억제효과를 갖는 안티센스 유전자를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 안티센스 유전자는 대장균 내에서 아세트산 생성에 관여하는 두 가지 효소인 아세트산 인산화 효소 A(acetate kinase A, ackA) 및 포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase, pta)의 유전자로부터 유도된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 유전자는ackA에서 유래된 프로모터 서열,ack및/또는pta유전자의 안티센스 서열, 및pta에서 유래된 터미네이터 서열이 5'-3' 순서대로 연결된 것을 특징으로 한다. 이는 ackA와 pta가 대장균의 세포성장곡선에서 성장기(log phase)의 후반부부터 정지기(stationary phase)에 이르기까지 과잉작용을 한다는 데 착안하여 안티센스 유전자의 발현시점을 ackA 및 pta 효소의 작용이 일어나는 시점으로 맞추기 위한 것이다.
본 발명을 더 자세히 설명하면, 전사를 개시하게 하는 프로모터 서열은ackA의 프로모터 서열을 그대로 이용하되, 전사 과정에 깊이 관여하는 upelement, -35 부위, TATA box 및 전사 개시 때 DNA 이중나선이 열린 형태로 다른 기구와 공존하는 범위인 20bp까지를 포함하여 정확한 조절을 이루고자 하였다(참조: Aiyar, S. E., R. L. Gourse., and W. Ross. 1998. Upstream A-tracts increase bacterial promoter activity through interactions with the RNA polymerase subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14652-14657). 본 발명의 실시예에서는 구체적으로ackA의 -79 ~ +21 위치의 서열 부분(서열번호 1)을 포함하는ackA의 프로모터 서열을 사용하였다.
또한, 안티센스 유전자의 암호화부분은 아세트산 생성의 부분억제를 꾀하면서 최소한의 길이를 가지도록ackA와pta의 RBS(ribosomal binding site) 및 효소발현을 억제하는 데 꼭 필요한 부분을 포함하는 130 내지 140 염기쌍의 짧은 서열로 정하여 안티센스 유전자의 발현에 의한 숙주세포의 대사부담(metabolic burden)을 줄이고자 하였다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 서열번호 4의 염기서열을 포함하는ackA안티센스 유전자와 서열번호 5의 염기서열을 포함하는pta안티센스 유전자를 사용하였다.
전사를 마치게 하는 터미네이터 서열은 대장균의pta유전자 서열에 원래 존재하는 ρ의존형 서열로 대장균 자체의 유전자 조절에 적합하도록 선택하였다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 서열번호 10의 염기서열을 포함하는pta터미네이터 서열을 사용하였다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 안티센스 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 벡터는 대장균에서 복제 및 발현이 가능한 벡터로, 본 발명의 실시예에서는 pJY103, pJY104, 및 pJY105 발현벡터가 사용되었다.
본 발명의 상기 안티센스 유전자를 포함하는 벡터는 발현하고자 하는 임의의재조합 단백질 유전자를 포함하며, 이로써 상기 기술한 아세트산 생성을 적절히 억제하여 세포성장에 영향이 없으면서 재조합 단백질 생성을 향상시킬 수 있는 효과적인 대장균 발현시스템을 제공한다. 발현하고자 하는 임의의 재조합 단백질이란 인간의 단백질을 포함하여, 질병 치료에 사용되거나 또는 산업상 이용가능한 모든 단백질을 의미한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
형질전환체로 사용될 수 있는 대장균주로는 안티센스 유전자를 얻어 낸 K12를 비롯하여 그로부터 유래된 변종인 W3110, MG1655, JM103, JM105, JM109, DH5 등과 B로부터 유래된 BL21, BL21( DE3), BL21( DE3)pLys 및 HB101 등이 있으며, 바람직하게는, 본 발명의 실시예에서 사용된 대장균주는 대장균 Top10 및 대장균 W3110, BL21이다. 벡터를 대장균으로 형질전환시키는 방법으로는 CaCl2버퍼를 이용한 competent 세포 사용, 전기침공법(electroporation) 등의 당업계에 통상적으로 알려져 있는 방법을 사용한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 대장균을 배양하여 발현하고자 하는 임의의 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 대장균을 배양하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 대장균의 배양법을 의미한다. 발현하고자 하는 임의의 재조합 단백질이란 인간의 단백질을 포함하여, 질병 치료에 사용되거나 또는 산업상 이용가능한 모든 단백질을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 안티센스 유전자를 발현하는 플라스미드 pJY103, pJY104, pJY105의 제조
대장균 K-12의 염색체를 주형으로 하여 아세트산의 생성에 관여하는 두 가지 효소인ackA와pta의 유전자서열(genebank, NCBI)로부터ackA의 -79∼+21위치의 서열부분(서열번호 1)을 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction, Mastercycler personal 5332; Eppendorf, USA)으로 증폭하여(primer (1): ACTCAAGATATTTCTTCC(서열번호 2), (2): GTCAGGGAGCCATAGAGCGG(서열번호 3)) 안티센스 유전자의 프로모터로 하고,ackA,pta각각의 안티센스 유전자(서열번호 4, 서열번호 5) 역시 K-12 염색체를 주형으로 중합효소연쇄반응으로 증폭하여(asackA: primer(1) TACGCTCTATGGCTCCCTGAC(서열번호 6) (2) ACTCTTCACCATTTACTGC(서열번호 7); aspta: primer(1) GCTGTTTTGTAACCCGCC(서열번호 8) (2) TCCATTGCACGGATCACGCC(서열번호 9)) ackA프로모터 다음위치에 도 1, 2, 3과 같은 제한효소부위를 갖도록 연결하였다. 각각의 안티센스 유전자 다음에는 대장균 K12 염색체의pta유전자서열중 터미네이터 서열에 해당하는 부분(서열번호 10)을 중합효소연쇄반응으로 증폭하여 (primer(1) TCTCGTCATCATC(서열번호 11) (2) ATGCAGCGCAGTTAAG(서열번호 12)) 도 1, 2, 3의 제한효소부위에 삽입하였다. 상기 방법으로 제조된 각각의 플라스미드를 pJY103(안티센스pta), pJY104(안티센스ackA), pJY105(안티센스pta:ackA)라 명명하였다. 본 발명의 대장균용 발현벡터pJY103, pJY104, pJY105는 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, 대전광역시 유성구 어은동 52)에 2001년 8월 27일자 기탁번호 제 KCTC 10051BP 호, 제 KCTC 10052BP 호, 제 KCTC 10053BP 호로 각각 기탁되었다. 각각의 중합효소연쇄반응은 통상적인 반응조건(10mM Tris-HCl(pH9.0), 50mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2mM MgSO4) 아래 95℃에서 8분간 변성시킨 후 Taq DNA 중합효소(Promega, USA)를 첨가하고 95℃/50sec(denaturation), 55℃/30sec(annealing), 72℃/10sec(extension)로 30회 반복수행하였다. 중합효소 연쇄반응 후 증폭된 DNA는 1% 아가로스 젤 상에서 확인 후 정제하여 제한효소반응에 이용하였다. 제한효소 처리된 각각의 DNA조각들을 pTrcHis 벡터(Invitrogen, USA)의 다중삽입부위(multicloning site)에 도 1, 2, 3에 개시된 것과 같이 삽입하였다. 각 단계마다 삽입된 유전자의 삽입여부를 확인하기 위해 형질전환된 대장균에서 플라스미드를 추출하여 이를 다시 원래 삽입부위의 제한효소로 처리하여 잘린 DNA 조각의 크기를 1% 아가로스 젤 상에서 전기영동하여 비교하는 방법을 사용하였다.
실시예 2: 녹색형광단백질을 모델단백질로 이용하는 벡터의 제조
녹색형광단백질 GFPuv 유전자를 pGFPuv(Clontech, USA)으로부터 PCR 중합효소연쇄반응으로 얻었다(GFP primer(1) : CGG CTA GCA TGA GTA AAG GAG AAG AAC(서열번호 13) (2) CGA AGC TTT CAT TAT TTG TAG AGC TCA TC(서열번호 14)). 전기 GFPuv 유전자가 trc 프로모터 다음에 삽입된 발현벡터를 제조하고 pTrc-GFPuv로 명명하였다. pTrc-GFPuv벡터로부터 GFPuv와 터미네이터 서열이 포함되고 도 5, 6, 7에 나타난 바와 같이 적절한 제한효소부위를 갖도록 다시 PCR 중합효소연쇄반응으로 얻은 다음(primer (1) : CCG TCA TGA GGG GTT CTC ATC AT(서열번호 15) (2) : GGC TCA TGA CGT CCT GCC CGC CAC CCT(서열번호 16)), 해당하는 제한효소로 절단 후 실시예 1로부터 얻은 각각의 벡터 pJY103(안티센스pta), pJY104(안티센스ackA), pJY105(안티센스pta:ackA)를 같은 해당 제한효소로 절단하여 삽입유전자와 벡터를 T4 DNA ligase(MBI, USA)를 이용하여 결합하였다. 상기 방법으로 제조된 각각의 벡터를 pJY106(안티센스pta-GFPuv), pJY107(안티센스 ackA-GFPuv), pJY108(안티센스pta:ackA-GFPuv)로 명명하고 이들에 대한 발현 비교용 벡터로 pTrc-GFPuv 벡터를 사용하였다. 상기 벡터들을 가지고 안티센스 유전자의 발현이 재조합 단백질의 모델로 사용된 녹색형광단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보았다.
실시예 3: 대장균 형질전환체(transformant)의 제조
통상적으로 클로닝용으로 많이 쓰이는 대장균 Top10(Invitrogen, USA)의 경우, CaCl2버퍼를 사용, 컴피턴트(competent) 세포를 만든 후 열충격(42℃)방법에 의해 플라스미드를 숙주세포내로 넣는 방법을 사용하였으며 단백질 발현용으로 사용된 대장균 W3110의 경우 실험의 편의상 전기천공법(electroporation)에 의한 방법을 사용하였다. 사용된 전기천공장치(electroporator)는 Easyject optima(Equibio, 영국)를 사용하였다. 형질전환된 콜로니 선별은 사용된 플라스미드의 특성상 앰피실린(ampicillin, Sigma, USA)을 사용하여 선별하였다.
실시예 4: 대장균의 배양 및 재조합 단백질의 생산
형질전환의 정확성이 확인된 각각의 균들을 LB배지에 하루정도(20hr) 배양시키고 글리세롤 농도가 10%가 되게 보관용 균액으로 만든다음 -80℃에서 배양실험 때까지 저장하였다. 배양은 전기 보관용 균액 1ml을 250ml 플라스크에 들어있는 앰피실린(50㎍/㎖)이 첨가된 50ml의 M9(6 g of Na2HPO4, 3 g of KH2PO4, 0.5 g of NaCl, 1 g of NH4Cl per liter, 포도당 1%, MgSO42mM, CaCl20.1mM)배지에 접종하여 18시간에서 20시간 정도 배양 후 이를 다시 M9배지 200ml이 들어있는 500ml 플라스크에 접종양의 비율이 5%(부피/부피)가 되도록 재접종하여 최종 배양실험을 진행하였다. 배양은 37℃, 250rpm의 조건에서 행하였다. 단백질 발현을 위해 배양액의 흡광도(absorbance)가 600nm파장에서 0.6에 이르렀을 때 유도물질인 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside, Sigma, USA)를 첨가(1mM)하여 재조합단백질인 녹색형광단백질 발현을 유도하였다.
실시예 5: 재조합 단백질 발현의 측정 및 정량분석
재조합 단백질의 발현은 모델단백질인 녹색형광단백질의 특성을 이용하여 형광강도와 실제발현양의 두 가지를 측정하였다. 형광강도는 실시간으로 매시간 형광광학측정기(fluorescence spectrophotometer; RF-5301PC; Shimadzu, Japan)를 이용하여 조사(excitation) 395nm, 방출(emission) 509nm의 조건에서 측정하였다(도 8). 또한, 실제 발현양과 형광강도의 관계를 알아보기 위해 웨스턴블랏(Western blot)방법으로 분석하였다(도 9). 매시간 마다 배양액으로부터 얻은 1ml의 시료를 4℃, 10000rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 세포침전물을 -80℃에서보관 후 분석시 사용하였다. 이를 웨스턴블랏 용 버퍼(0.5M Tris-HCl, pH 6.8; 10% glycerol; 5% SDS; 5% β-mercaptoethanol, and 0.25% bromophenol blue) 100㎕에 희석 후 100℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. 이들을 순수한 녹색형광단백질(Clontech)과 함께 15% SDS-폴리 아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후, 나이트로셀룰로즈 막에 15V 전압하에서 이동시켰다. 단백질이 전이된 나이트로셀룰로즈 막을 녹색형광단백질용 항체(Living Color Peptide antibody, Clontech)를 이용, 녹색형광단백질을 검출하고 발색반응 후 영상분석소프트웨어를 이용하여 정량화하였다. 그 결과 도 10과 같이 단백질 발현량과 형광강도사이의 일정한 비례관계를 확인하였다.
실시예 6: 배양액 내의 포도당 및 아세트산 농도 분석
배양액 내의 포도당 농도는 배양 중 2시간마다 채취한 시료를 4℃에서 원심분리 후 상등액만을 분리하여 -80℃에서 보관하고 이를 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)분석법에 의해 포도당 농도가 1 g/l 이내가 되도록 증류수로 적절히 희석한 다음 희석시료 1ml에 DNS 용액 3ml을 섞고 끓는 물에서 15분간 반응 후 550nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 한편, 배양액의 아세트산 농도는 HPLC(Agilent 1100; Hewlett packard, USA)를 이용하여 분석하였으며 Aminex HPX-87H(Biorad, USA)칼럼으로 30℃에서 8mM H2SO4를 이동상으로 0.5 ml/min의 유속으로 하여 분석하였다. 이와 병행하여 효소분석키트(No. 0148261; Roche, Germany)를 이용하여 배양액 속의 아세트산 농도를 정량적으로 확인하였다..
상기 실시예 4, 5를 통해 3가지의 안티센스 유전자가 발현된 정도를 재조합단백질인 녹색형광단백질만 발현된 정도와 정량적 비교를 해 본 결과 도 11에서 보는 것과 같이 안티센스 유전자의 억제조절이 되는 대장균의 경우 초기부터 녹색형광단백질을 더 많이 생산하였다. 특히, pJY107(asackA)의 경우 생산율이 가장 높았으며 배양 9시간째에는 약 1.7배의 단백질 수율의 향상을 보였다.
도 12에서 알 수 있듯이, 기존의 결과들과는 달리 세포 성장속도와 최종 세포 농도에 있어 안티센스 유전자가 발현된 경우에 전혀 저해를 받지 않았고 일부의 경우에 있어서 오히려 좋은 효과를 보였다. 또한, 단백질 생산율이 현저히 높음에도 불구하고 탄소원인 포도당의 배지내 농도는 거의 같은 수준을 보임으로써(도 13) 안티센스 유전자에 의해 대사조절된 세포가 보다 효과적으로 에너지를 이용하고 있음을 확인할 수 있었다.
대장균 W3110에 대해 4가지의 벡터로 형질전환된 균주들에 대해 배양시에 배지내로 배출된 아세트산 농도를 측정해 본 결과 도 14와 같이 안티센스 유전자의 억제조절이 되는 균주의 경우 배양시간에 따라 10~20% 가량의 아세트산이 감소한 것으로 확인됨으로써 부분적인 아세트산 대사경로의 억제가 이루어짐을 알 수 있었다. 그러나, 이러한 부분적인 수준의 아세트산 감소에도 불구하고 도 11에서와 같은 매우 높은 재조합 단백질의 발현의 향상을 얻음으로써 본 발명에 의한 안티센스 조절 방법은 단순한 아세트산 감소에 의한 재조합 단백질 발현 증가 이상의 기작을 가지는 것으로 보여진다.
도 15에서 알 수 있듯이, 상기 실시예 4의 배양조건 하(200ml 배지/500ml 플라스크)에서 1.7배의 단백질 수율의 향상을 보인 pJY107(asackA) 균주의 경우 배양의 규모를 증가시켰을 때는(400ml 배지/1000ml 플라스크) 2.5배의 증가율의 향상을 보임으로써 대규모화(scale-up) 및 고농도 배양에서는 안티센스의 조절효과가 더욱 증가함을 입증하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 대장균을 이용하여 외래 재조합 단백질을 발현 및 생산할 때 문제가 되었던 숙주 자체의 대사적 문제를 해결하여 기존의 방법과 달리 재조합 단백질의 종류에 관계없이 고수율로 발현시킬 수 있으며 공정적 접근방식에 의한 고비용의 문제를 근본적으로 해결할 수 있다. 또한, 포도당 배지로 인한 아세트산 배출에 의한 세포 성장 저해 및 단백질 생산성 저하를 해결함으로써 낮은 생산비로 고가의 단백질을 대량생산할 수 있는 경제적 파급효과가 클 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 안티센스-ackA(antisense-acetate kinase A) 유전자.
  2. 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 안티센스-pta(antisense-phosphotransacetylase) 유전자.
  3. 하기 각 항의 서열이 5'-3' 순서대로 연결된 유전자:
    (a) 서열번호 1에 기재된 ackA 프로모터의 염기서열;
    (b) 서열번호 4에 기재된 안티센스-ackA의 염기서열; 및
    (c) 서열번호 10에 기재된 pta 터미네이터(terminator)의 염기서열.
  4. 하기 각 항의 서열이 5'-3' 순서대로 연결된 유전자:
    (a) 서열번호 1에 기재된 ackA 프로모터의 염기서열;
    (b) 서열번호 5에 기재된 안티센스-pta의 염기서열; 및
    (c) 서열번호 10에 기재된 pta 터미네이터(terminator)의 염기서열.
  5. 제 3항의 염기서열과 제 4항의 염기서열이 5'-3' 순서대로 연결된 유전자.
  6. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
  7. 제 6항에 있어서,
    발현벡터는 발현하고자 하는 임의의 재조합 단백질을 암호화하는 유전 자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  8. 제 6항에 있어서,
    발현벡터는 pJY103, pJY104 또는 pJY105인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  9. 제 6항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
  10. 제 9항의 대장균을 배양하여 발현하고자 하는 임의의 재조합 단백질을 생산하는 방법.
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