KR100389292B1 - 신규한 양전하 지질 및 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜 - Google Patents

신규한 양전하 지질 및 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자의 전달 및 발현을 효율적으로 수행하기 위하여, 라이신(lysine)과 아스파르트산염(aspartate)을 기본으로 탄화수소쇄(hydrocarbon chain)의 길이를 다양하게 변화시켜 합성된 양전하 지질, 그의 제조방법 및 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 제조된 양전하 지질을 함유하는 리포솜을 사용하여 유전자를 세포내로 전달할 경우에 기존의 양전하 지질에 비하여 유전자 전달효율이 월등히 우수할 뿐만 아니라, 아미노산을 기본 물질로하여 생체적합성이 뛰어나기 때문에, 이를 유전자 요법에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

Description

신규한 양전하 지질 및 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜{Positively Charged Lipid and Liposome Containing the Same}
본 발명은 신규한 양전하 지질 및 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전자의 전달 및 발현을 효율적으로 수행하기 위하여, 라이신(lysine)과 아스파르트산염(aspartate)을 기본으로 탄화수소쇄(hydrocarbon chain)의 길이를 다양하게 변화시켜 합성된 양전하 지질, 그의 제조방법 및 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜에 관한 것이다.
양전하 지질은 외부 유전자의 체외 전달수단으로서 널리 이용되어, 현재까지 DOTMA(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium chloride), DOTAP(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl sulfate), DOSPA(2,3-dioleyloxy-N-[2-(sperminecarboxyamide)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanammonium trifluoroacetate), DC-Chol3)β-[N-(N'N'dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol 등이 개발되어, 유전자 치료 연구에 상당한 기여를 하여 왔으나, 유전자 전달효율이 낮은 점 때문에 새로운 양전하 지질을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 유전자 전달효율이 뛰어난 양전하 지질을 개발하기 위하여 예의 노력 연구한 결과, 라이신과 아스파르트산염을 기본으로 탄화수소쇄의 길이를 다양하게 변화시켜 신규한 양전하 지질을 합성하고, 그를 이용하여 리포솜을 제조하여 유전자를 세포내로 전달할 경우에 기존의 양전하 지질에 비하여 유전자 전달효율이 월등히 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 신규한 양전하 지질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 방법에 의하여 제조된 양전하 지질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜을 제공하는 것이다.
도 1a는 293 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DM 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 1b는 293 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 293 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DM 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 293 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 B16BL6 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DM 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 B16BL6 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 B16BL6 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DM 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 B16BL6 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 하기의 일반식(Ⅰ)으로 나타내어지는 신규한 양전하 지질을 제공한다:
상기 식에서,
R은 수소, C10-C18의 알킬기 또는 C10-C18의 알켄기이며; 및,
X는 F, Cl, Br, I, CF3CO2, HSO4또는 NH3이다.
전기 양전하 지질의 제조방법은 아미노 작용기가 보호된 아스파르트산염(Ⅱ)을 수화 톨루엔술폰산 또는 무수 톨루엔인 산촉매하에서 알코올(Ⅲ)과 에스테르화 반응 또는 짝지움 반응에 의하여 화합물(Ⅳ)을 수득하는 공정; 전기 수득된 화합물(Ⅳ)의 보호기를 무수 테트라하이드로퓨란(THF) 용매내에서 5 내지 20%(w/w)의 Pd/C 또는 수소의 존재하에 제거하여 화합물(Ⅴ)를 수득하는 공정; 전기 수득된 화합물(Ⅴ)를 화합물(Ⅵ)과 짝지움 반응을 시킴으로써 화합물(Ⅶ)를 수득하는 공정; 전기 수득된 화합물(Ⅶ)를 Cl-디옥산 용액, 무수 디옥산 또는 이들의 혼합물과0 내지 10℃에서 1 내지 6시간 동안 반응시켜서, R3를 제거하여 화합물(Ⅷ)을 수득하는 공정; 및, 전기 수득된 화합물(Ⅷ)에 염을 형성시킴으로써 하기 일반식(Ⅰ)의 양전하 지질을 수득하는 공정을 포함한다.
이하, 본 발명의 신규한 양전하 지질을 제조하는 방법을 공정별로 나누어 설명하고자 한다.
제 1공정: 아스파트르산염으로부터 화합물(Ⅳ)의 수득
아미노 작용기가 보호된 아스파르트산염(Ⅱ)을 수화 톨루엔술폰산 또는 무수 톨루엔인 산촉매하에서 알코올(Ⅲ)과 에스테르화 반응 또는 짝지움 반응에 의하여 화합물(Ⅳ)을 수득한다: 이때, 짝지움 반응에 사용될 수 있는 시약은 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 또는 디이소프로필디이미드(diisopropyldiimide, DIC)를 사용할 수 있다. 아울러, 아미노기의 보호에 사용되는 R1은 당업계에서 널리 알려진 적절한 보호기를 선택하여 사용할 수 있으나(참조: T.W., Green et al.,Protective Groups in Organic Chemistry, 2nd Edition, 1991, Wiely, p309-405, p406-412, p441-452), 반응조건이 산성인 경우에, R1은 벤질 카르바메이트(benzyl carbamate, Cbz), p-메톡시벤질 카르바메이트(p-methoxybenzyl carbamate, Moz), p-브로모벤질 카르바메이트(p-bromobenzyl carbamate) 또는 9-플루오로메틸 카르바메이트(9-fluoromethyl carbamate, FMOC), 가장 바람직하게는 벤질 카르바메이트를 사용하며, 반응조건이 염기성인 경우에, R1은 t-부틸 카르바메이트(t-butyl carbamate, t-Boc) 또는 1-아다만틸 카르바메이트(1-adamantyl carbamate, Adoc)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제 2공정: 화합물(Ⅴ)의 수득
전기 수득된 화합물(Ⅳ)의 보호기를 무수 테트라하이드로퓨란(THF) 용매내에서 5 내지 20%(w/w)의 Pd/C 또는 수소의 존재하에 제거하여 화합물(Ⅴ)를 수득한다.
제 3공정: 짝지움 반응에 의한 화합물(Ⅶ)의 수득
전기 수득된 화합물(Ⅴ)를 화합물(Ⅵ)과 짝지움 반응을 시킴으로써 화합물(Ⅶ)를 수득한다: 이때, 화합물(Ⅴ)와 화합물(Ⅵ)는 직접적으로 짝지움 반응을 시킬 수 없으므로, 화합물(Ⅵ)에 활성그룹을 붙여 수득된 화합물과 화합물(Ⅴ)를 반응시킨다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 디터셔리 부틸 디카르보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)를 NaOH, THF 및 물의 존재하에 실온에서 반응시켜 화합물(Ⅵ)를 수득한 후, 전기 화합물(Ⅵ)을 N-하이드로숙신이미드, 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 CH2Cl2와 실온에서 반응시켜 활성그룹을 가진 화합물(Ⅵ)를 수득하여 화합물(Ⅴ)와 짝지움 반응시켜 화합물(Ⅶ)을 수득한다. 이때, 화합물(Ⅶ)의 아미노기를 R3로 보호하게 되며, R3은 전술한 R1과 동일한 물질을 사용한다.
제 4공정: 화합물(Ⅷ)의 수득
전기 수득된 화합물(Ⅶ)를 Cl-디옥산 용액, 무수 디옥산 또는 이들의 혼합물과 0 내지 10℃에서 1 내지 6시간 동안 반응시켜서, R3를 제거하여 화합물(Ⅷ)을 수득한다.
제 5공정: 양전하 지질의 제조
전기 수득된 화합물(Ⅷ)에 염을 형성시킴으로써 일반식(Ⅰ)의 양전하 지질을 제조한다: 이때, 상술한 바와 같이 염을 형성시키는 반응은 R3를 제거시키는 방법과 동시에 진행되며, 바람직하게는 화합물(Ⅷ)를 HCl-디옥산 용액 및 무수 디옥산과 0 내지 10℃에서 1시간 내지 6시간 동안, 바람직하게는 0℃에서 2시간 내지 4시간 동안 반응시켜서 최종적으로 양전하 지질을 제조하게 된다.
상기 식에서,
R은 수소, C10-C18의 알킬기 또는 C10-C18의 알켄기이고;
R1및 R3는 벤질 카르바메이트(benzyl carbamate, Cbz), p-메톡시벤질
카르바메이트(p-methoxybenzyl carbamate, Moz), p-브로모벤질
카르바메이트(p-bromobenzyl carbamate), 9-플루오로메틸 카르
바메이트(9-fluoromethyl carbamate, FMOC), t-부틸 카르바메이
트(t-butyl carbamate, t-Boc) 또는 1-아다만틸
카르바메이트(1-adamantyl carbamate, Adoc)이며; 및,
X는 F, Cl, Br, I, CF3CO2, HSO4또는 NH3이다.
전기 방법에 의하여 합성된 양전하 지질중 유전자 전이효율이 높은 라이신-아스파르트산염-도데카놀(lysine-aspartate-dodecanol), 라이신-아스파르트산염-테트라데카놀(lysine-aspartate-tetracanol) 또는 라이신-아스파르트산염-헥사데카놀(lysine-aspartate-hexadecanol)이 바람직하고, 가장 바람직한 양전하 지질은 라이신-아스파르트산염-테트라데카놀(lysine-aspartate-tetracanol) 또는 라이신-아스파르트산염-헥사데카놀(lysine-aspartate-hexadecanol)로서, 이들을 각각 "KD-DM" 및 "KD-DP"로 명명하였다.
전기 제조된 양전하 지질과 지질을 1:1로 몰랄농도 비율로 혼합하여 유기용매에 용해시켜 유기용매를 제거한 후, 수화시켜 1 내지 70℃에서 혼합함으로써 양전하지질을 함유하는 리포솜을 제조할 수 있으며, 양전하 지질은 본 발명의 일반식 (Ⅰ)으로 나타내어지는 양전하 지질을, 바람직하게는 KD-DM 또는 KD-DP를 사용할수 있다. 본 발명에서는 전기 제조된 양전하 지질인 KD-DM 또는 KD-DP를 각각 콜레스테롤 또는 디올레일포스파티딜에타놀아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE)과 1:1의 몰랄농도 비율로 혼합하여 KD-DM/Chol, KD-DM/DOPE, KD-DP/Chol 또는 KD-DP/DOPE의 리포솜을 제조하였다.
한편, 전기 제조된 리포솜을 이용하여 DNA-리포솜 복합체를 제조하여 이를 이용하여 세포내로 유전자를 전달할 경우, 유전자의 발현이 효율적으로 일어날 수 있는지를 사람의 신장세포를 대상으로 알아 본 결과, 기존의 DOTAP(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl sulfate)과 콜레스테롤을 혼합하여 제조된 리포솜인 DOTAP/Chol에 비하여, 본 발명의 KD-DM을 함유하는 리포솜은 DNA의 전달효율이 현저히 높아졌으며, KD-DP를 함유하는 리포솜은 DOTAP/Chol과 비슷한 유전자 전달효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 양전하 지질을 이용하여 리포솜을 제조할 경우, 체내외 유전자를 세포내로 전달하는 데 매우 효과적이므로, 이를 유전자 요법에 유용하게 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 양전하 지질의 합성 및 분리
실시예 1-1: 화합물(Ⅳ)의 제조
N-Cbz-L-아스파르트산염(210mg, 0.8mmol), 도데카놀(dodecanol), 테트라데칸올(tetradecanol) 또는 헥사데카놀(hexadecanol)(343mg, 1.6mmol) 각각을, 수화 톨루엔술폰산(p-toluenesulfonic acid monohydrate, TsOHㆍH2O)(50mg, 0.26mmol) 및 무수 톨루엔 10mL과 반응시키고, 헥산과 EtOAc를 9.5:0.5(v/v)로 혼합한 전개액을 사용한 딘스탁 장치(Dean-stock trap)를 사용하여, 화합물(Ⅳ)를 수득하였다.
먼저, R1이 C12H25인 화합물 1을 66%의 수율로 수득하였다:
1H NMR(CDCl3)δ: 0.87-1.94(m, 54H), 2.85(s, 2H), 4.06(m, 4H),
4.79(m, 1H), 5.12(s, 2H), 5.7(s, 1H), 7.2-7.4(m, 5H).
또한, R1이 C14H29인 화합물 2를 62%의 수율로 수득하였다:
1H NMR(CDCl3)δ: 0.87-1.94(m, 62H), 2.85(s, 2H), 4.06(m, 4H),
4.79(m, 1H), 5.12(s, 2H), 5.7(s, 1H), 7.2-7.4(m, 5H).
마지막으로, R1이 C16H33인 화합물 3을 65%의 수율로 수득하였다:
1H NMR(CDCl3)δ: 0.87-1.94(m, 70H), 2.85(s, 2H), 4.06(m, 4H),
4.79(m, 1H), 5.12(s, 2H), 5.7(s, 1H), 7.2-7.4(m, 5H).
실시예 1-2: 화합물(Ⅴ)의 수득
전기 수득한 화합물 1, 화합물 2 또는 화합물 3의 보호기를 제거하기 위하여, 이들 화합물(300mg, 0.46mmol)을 각각, 10% Pd/C(58mg, 0.55mmol)와 함께 무수 테트라하이드로퓨란(THF) 용매에서 수소 존재하에 실온에서 반응시켜 화합물(Ⅴ)를 수득하였다. 먼저, R1이 C12H25인 화합물 4를 94%의 수율로 수득하고, R1이 C14H29인 화합물 5를 91%의 수율로 수득하였으며, R1이 C16H33인 화합물 6을 91%의 수율로 수득하였다:
실시예 1-3: 활성그룹을 가진 화합물(Ⅵ)의 수득
라이신(L-lysine monohydrochloride, 화합물 7)(200mg, 1.01mmol)과 디터셔리 부틸 디카르보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)(477.9mg, 2.19mmol)을 NaOH(131.5mg, 3.29mmol), THF(3mL) 및 물(3mL)의 존재하에 실온에서 반응시켜, R3가t-BOC인 화합물 (Ⅵ)인 화합물 8을 311mg(수율 82%) 수득하였다. 전기 수득한 화합물 8(132mg, 0.38mmol),N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)(53mg, 0.46mmol), DCC(103mg, 0.5mmol) 및 무수 디클로로메탄을 실온에서 반응시켜 화합물 9를 수득하였다.
실시예 1-4: 화합물 (Ⅶ)의 수득
전기 수득한 화합물 9를 화합물 4, 5 또는 6과 실온에서 3시간 동안 반응시키고, 헥산과 EtOAc를 7:3(v/v)으로 혼합한 전개액을 사용한 딘스탁 장치를 사용하여, 화합물 (Ⅶ)를 수득하였다.
먼저, 화합물 10을 65%의 수율로 수득하였다:
1H NMR(CDCl3)δ: 0.88-2.01(m, 78H), 2.79-3.05(m, 4H), 4.10(m, 4H),
4.86(m, 2H), 6.83(s, 1H), 6.9(s, 1H).
또한, 화합물 11을 61%의 수율로 수득하였다:
1H NMR(CDCl3)δ: 0.88-2.01(m, 86H), 2.79-3.05(m, 4H), 4.10(m, 4H),
4.86(m, 2H), 6.83(s, 1H), 6.9(s, 1H).
마지막으로, 화합물 12를 62%의 수율로 수득하였다:
1H NMR(CDCl3)δ: 0.88-2.01(m, 94H), 2.79-3.05(m, 4H), 4.10(m, 4H),
4.86(m, 2H), 6.83(s, 1H), 6.9(s, 1H).
실시예 1-5: 양전하 지질의 제조
화합물 10, 11 및 12(150mg, 0.16mmol) 각각을 HCl 4mL(4.0M의 디옥산 용액) 및 무수 디옥산 4mL과 0℃에서 반응시켜, 양전히 지질인 화합물 13, 14 및 15를 각각 92%, 94% 및 92%의 수율로 수득하였다. 이 중, 화합물 14 및 화합물 15를 각각 "KD-DM" 및 "KD-DP"로 명명하였다.
실시예 2: 양전하 지질을 함유하는 리포솜의 제조
양전하 지질을 이용하여, DOTAP/Chol, KD-DM, KD-DM/Chol, KD-DM/DOPE, KD-DP, KD-DP/Chol 및 KD-DP/DOPE 리포솜을 제조하였다.
실시예 2-1: DOTAP/Chol 리포솜의 제조
DOTAP/Chol 리포솜을 제조하기 위하여, DOPAT(Avanti Polar Lipids, USA)과 콜레스테롤(cholesterol, Sigma Chemical Co., U.S.A.)을 1:1 몰랄농도로 혼합용매에 용해시켰다. 이때, 혼합용매는 클로로포름과 메탄올이 2:1(v/v)의 비율로 혼합된 것이다. 이어, 질소가스로 각 지질용액에서 유기용매를 제거하였고, 진공펌프를 이용하여 미량의 유기용매를 제거한 다음, 탈이온 증류수로 수화시키고, 실온에서 소용돌이혼합기(vortex mixer)를 이용하여 DOTAP/Chol 리포솜을 제조하였다.
실시예 2-2: KD-DM 리포솜의 제조
KD-DM를 혼합용매에 용해시키는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법을 사용하여 KD-DM 리포솜을 제조하였다.
실시예 2-3: KD-DM/Chol 리포솜의 제조
라이신-아스타르트산염-테트라데카놀(lysine-aspartate-tetradecanol, KD-DM)과 콜레스테롤을 1:1 몰랄농도로 혼합용매에 용해시키는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법을 사용하여 KD-DM/Chol 리포솜을 제조하였다.
실시예 2-4: KD-DM/DOPE 리포솜의 제조
KD-DM과 디올레일포스파티딜에타놀아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE, Doosan S.R.L, Korea)을 1:1 몰랄농도로 혼합용매에 용해시키는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법을 사용하여 KD-DM/DOPE 리포솜을 제조하였다.
실시예 2-5: KD-DP 리포솜의 제조
KD-DP를 혼합용매에 용해시키는 것과 65℃에서 소용돌이혼합기를 이용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법을 사용하여 KD-DP 리포솜을 제조하였다.
실시예 2-6: KD-DP/Chol 리포솜의 제조
라이신-아스타르트산염-헥사데카놀(lysine-aspartate-hexadecanol, KD-DP)과 콜레스테롤(cholesterol)을 1:1 몰랄농도로 혼합용매에 용해시키는 것과 65℃에서 소용돌이혼합기를 이용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법을 사용하여 KD-DP/Chol 리포솜을 제조하였다.
실시예 2-7: KD-DP/DOPE 리포솜의 제조
KD-DP와 DOPE를 1:1 몰랄농도로 혼합용매에 용해시키는 것과 65℃에서 소용돌이혼합기를 이용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법을 사용하여 KD-DP/DOPE 리포솜을 제조하였다.
실시예 3: 양전하 지질을 함유하는 리포솜에 의한 유전자 발현
양전하 지질을 함유하는 리포솜에 의한 세포내 유전자 발현 효율은 표지유전자로 루시페라제(luciferase) 유전자를 이용하여, DNA농도와 DNA:리포솜 비율변화에 따른 유전자 발현을 발광계수기(luminometer)를 사용하여 분석하였다.
우선, 리포솜을 통한 유전자 전달이 효율적인지를 평가하기 위하여 사용될 세포주들을 다음과 같이 배양하였다: 즉, 사람의 신장세포(293 human kidney cell line, ATCC CRL-1573, U.S.A.)는 우혈청 10%와 스트렙토마이신과 페니실린이 포함된 둘베코의 변형된 이글배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM, Gibco,U.S.A.)을 사용하였고, 마우스 멜라노마 세포(B16BL6 mouse melanoma cell line, 미국 휴스턴 소재 MD Anderson Cancer Center의 Isaiah J. Fidler 박사 제공)는 우혈청 5%, 스트렙토마이신, 페니실린, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 바이타민 용액, 2mM 글루타민, 1mM 소디움 피루베이트(sodium pyruvate, Sigma Chemical Co., U.S.A.)가 포함된 최소필수배지(minimum essential medium, MEM, Gibco, U.S.A.)을 사용하였다. 모든 세포는 5% CO2, 37℃ 항온항습기(NAPCO, U.S.A.)에서 배양하였다.
전기 배양된 세포내로 유전자를 전달하기 위하여, 우선 24 웰 플레이트(24 well plate)에 각 웰 당 293 세포를 1×105개, B16BL6 세포를 5×104개씩 각각 분주하고 24시간 배양하여 세포를 안정화시켰다.
이와는 별도로, 루시페라제 유전자 농도에 의한 유전자 발현 효율을 분석하기 위하여, 루시페라제 DNA와 리포솜의 비율을 1:12(w/w)로 고정하고 DNA의 농도를 각 0.1, 0.5, 1, 2, 5㎍의 범위로 하여, 무혈청배지 500㎕에 리포솜과 함께 넣고 30분간 반응시켜 DNA-리포솜 복합체를 형성하였다. 형성된 DNA-리포솜 복합체를 293 세포와 B16BL16 세포가 분주된 웰에 500㎕씩 첨가하여, 5% CO2, 37℃ 항온항습기에서 4시간 동안 반응시킨 후, 혈청이 들어있는 배지로 교환하고, 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음, DNA:리포솜 비율에 의한 유전자 발현 효율을 분석하기 위하여, DNA를 1㎍으로 고정하고 DNA:리포솜 비율을 1:3, 1:6, 1:9, 1:12, 1:18 비율(w/w)로 하여, 상기한 DNA-리포솜 복합체를 형성하고 48시간 동안 반응시켰다.그 후, 배지를 제거하고 루시페라제 세포 배양 용해 시약(Luciferase cell culture lysis reagent, Promega, U.S.A.) 50㎕를 첨가하고 용해시킨 후, 14,000rpm으로 약 10초간 침전시켜 수득한 상층액을 2㎕ 취하여 루시페라제 분석 기질(Luciferase assay substrate) 20㎕에 넣고, 발광계수기(Luminometer, Mini lumat LB9506, EGG BERTHOLD)로 측정하였다. 아울러, 각 웰 당 단백질의 정량은 DC 단백질 분석(DC protein assay) 방법을 이용하여 정량하였다.
도 1a는 293 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DM 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이며, 도 1b는 293 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다. 아울러, 도 2a는 293 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DM 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이며, 도 2b는 293 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 1a, 1b, 2a 및 2b에서 보듯이, 293세포의 경우 기존의 DOTAP/Chol과 비교하였을 경우, KD-DM은 1㎍ DNA와 1:6의 DNA:리포솜 비율일 때, KD-DM/Chol은 2㎍ DNA와 1:12의 DNA:리포솜일 때, KD-DM/DOPE은 5㎍ DNA와 1:6의 DNA:리포솜 비율일 때 가장 높은 발현효율을 보였고, KD-DP은 2㎍ DNA와 1:12의 DNA:리포솜 비율일때, KD-DP/Chol은 2㎍DNA와 1:12의 DNA:리포솜 비율일 때, 가장 높은 발현효율을 보임을 알 수 있었다.
도 3a는 B16BL6 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DM 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이며, 도 3b는 B16BL6 세포에서 DNA의 양에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다. 아울러, 도 4a는 B16BL6 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DM/Chol, KD-DM/Dope 또는 KD-DME 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 B16BL6 세포에서 DNA와 리포솜의 비율에 따른 KD-DP/Chol, KD-DP/Dope 또는 KD-DP 리포솜의 발현효율을 나타낸 그래프이다.
도 3a, 3b, 4a 및 4b에서 보듯이, B16BL6 세포의 경우 KD-DM은 1㎍ DNA와 1:6의 DNA:리포솜일 때 가장 높은 발현효율을 보였고, KD-DP는 0.5㎍ DNA와 1:9의 DNA:리포솜 비율일 때 가장 높은 발현효율을 보였다. 아울러, KD-DM리포솜의 경우 기존의 DOTAP의 보다 5배 이상의 발현 효율을 보였으며, KD-DP 리포솜의 경우에는 2배 이상의 발현효율을 보임을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 유전자의 전달 및 발현을 효율적으로 수행하기 위하여, 라이신과 아스파르트산염을 기본으로 탄화수소쇄의 길이를 다양하게 변화시켜 합성된 신규한 양전하 지질, 그의 제조방법 및 전기 양전하 지질을 함유하는 리포솜을 제공한다. 본 발명에 의하여 제조된 양전하 지질을 함유하는 리포솜을 사용하여 유전자를 세포내로 전달할 경우에 기존의 양전하 지질에 비하여 유전자 전달효율이 월등히 우수할 뿐만 아니라, 아미노산을 기본 물질로 하여 생체적합성이 뛰어나기 때문에, 유전자 요법에 유용하게 활용할 수 있을것이다.

Claims (5)

  1. (ⅰ) 아미노 작용기가 보호된 아스파르트산염(Ⅱ)을 수화 톨루엔술폰산 또는 무수 톨루엔인 산촉매하에서 알코올(Ⅲ)과 에스테르화 반응 또는 짝지움 반응에 의하여 화합물(Ⅳ)을 수득하는 공정;
    (ⅱ) 전기 수득된 화합물(Ⅳ)의 보호기를 무수 테트라하이드로퓨란(THF) 용매내에서 5 내지 20%(w/w)의 Pd/C 또는 수소의 존재하에 제거하여 화합물(Ⅴ)를 수득하는 공정;
    (ⅲ) 전기 수득된 화합물(Ⅴ)를 화합물(Ⅵ)과 짝지움 반응을 시킴으로써 화합물(Ⅶ)를 수득하는 공정;
    (ⅳ) 전기 수득된 화합물(Ⅶ)를 Cl-디옥산 용액, 무수 디옥산 또는 이들의 혼합물과 0 내지 10℃에서 1 내지 6시간 동안 반응시켜서, R3를 제거하여 화합물(Ⅷ)을 수득하는 공정; 및,
    (ⅴ) 전기 수득된 화합물(Ⅷ)에 염을 형성시킴으로써 하기 일반식(Ⅰ)의 양전하 지질을 수득하는 공정을 포함하는 양전하 지질의 제조방법:
    상기 식에서,
    R은 수소, C10-C18의 알킬기 또는 C10-C18의 알켄기이고;
    R1및 R3는 벤질 카르바메이트(benzyl carbamate, Cbz), p-메톡시벤질
    카르바메이트(p-methoxybenzyl carbamate, Moz), p-브로모벤질
    카르바메이트(p-bromobenzyl carbamate), 9-플루오로메틸 카르
    바메이트(9-fluoromethyl carbamate, FMOC), t-부틸 카르바메이
    트(t-butyl carbamate, t-Boc) 또는 1-아다만틸
    카르바메이트(1-adamantyl carbamate, Adoc)이며; 및,
    X는 F, Cl, Br, I, CF3CO2, HSO4또는 NH3이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC)
    또는 디이소프로필디이미드(diisopropyldiimide, DIC)를 사용하여
    (ⅰ) 공정의 짝지움 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는
    양전하 지질의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    디터셔리 부틸 디카르보네이트(di-tert-butyl dicarbonate), NaOH,
    THF 및 물의 존재하에 (ⅲ) 공정의 짝지움 반응을 수행하는 것을
    특징으로 하는
    양전하 지질의 제조방법.
  4. 다음의 일반식(Ⅰ)으로 나타내어지는 양전하 지질:
    상기 식에서,
    R은 수소, C10-C18의 알킬기 또는 C10-C18의 알켄기이고; 및,
    X는 F, Cl, Br, I, CF3CO2, HSO4또는 NH3이다.
  5. 제 4항의 양전하 지질과, 콜레스테롤 또는 디올레일포스파티딜에타놀아민을 1:1의 몰랄농도로 혼합하여 유기용매에 용해시킨 후, 유기용매를 제거하고 수화시켜 1 내지 70℃에서 혼합함으로써 제조되는 양전하지질을 함유하는 리포솜.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100464787B1 (ko) * 2002-03-20 2005-01-06 박용석 글루탐산염을 이용한 양전하 지질의 제조방법
KR101242113B1 (ko) * 2010-10-22 2013-03-19 고마바이오텍(주) 유전자 전달용 양이온성 센다이 ｆ／ｈｎ 바이로좀 복합체

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4026915A (en) * 1975-08-27 1977-05-31 S. C. Johnson & Son, Inc. Di-mixed alky aspartate salts
US4399163A (en) * 1980-11-05 1983-08-16 Pfizer Inc. Branched amides of L-aspartyl-D-amino acid dipeptides
JPH03148247A (ja) * 1989-08-31 1991-06-25 Warner Lambert Co Ａｃａｔ阻害剤
JPH03261750A (ja) * 1990-03-09 1991-11-21 Res Dev Corp Of Japan ポリフルオロアルキル化合物及び化合物薄膜の製造方法
JPH04330046A (ja) * 1991-03-28 1992-11-18 Res Dev Corp Of Japan ポリフルオロアルキル化合物の製造方法
JPH10101633A (ja) * 1996-09-27 1998-04-21 Tosoh Corp 高光学純度光学活性アミノ酸エステルの製造法
JPH10237032A (ja) * 1996-12-27 1998-09-08 Fuji Photo Film Co Ltd アミノポリカルボン酸系キレート剤、その重金属化合物、写真用添加物、および処理方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4026915A (en) * 1975-08-27 1977-05-31 S. C. Johnson & Son, Inc. Di-mixed alky aspartate salts
US4399163A (en) * 1980-11-05 1983-08-16 Pfizer Inc. Branched amides of L-aspartyl-D-amino acid dipeptides
JPH03148247A (ja) * 1989-08-31 1991-06-25 Warner Lambert Co Ａｃａｔ阻害剤
JPH03261750A (ja) * 1990-03-09 1991-11-21 Res Dev Corp Of Japan ポリフルオロアルキル化合物及び化合物薄膜の製造方法
JPH04330046A (ja) * 1991-03-28 1992-11-18 Res Dev Corp Of Japan ポリフルオロアルキル化合物の製造方法
JPH10101633A (ja) * 1996-09-27 1998-04-21 Tosoh Corp 高光学純度光学活性アミノ酸エステルの製造法
JPH10237032A (ja) * 1996-12-27 1998-09-08 Fuji Photo Film Co Ltd アミノポリカルボン酸系キレート剤、その重金属化合物、写真用添加物、および処理方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100464787B1 (ko) * 2002-03-20 2005-01-06 박용석 글루탐산염을 이용한 양전하 지질의 제조방법
KR101242113B1 (ko) * 2010-10-22 2013-03-19 고마바이오텍(주) 유전자 전달용 양이온성 센다이 ｆ／ｈｎ 바이로좀 복합체

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