KR100382170B1 - 월계수 잎으로부터 분리한 항산화제 및 그의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 월계수(Laurus nobilis) 잎으로부터 분리한 천연 항산화제 및 이의 정제방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 월계수 잎의 에탄올 추출물로부터 에틸아세테이트로 분획하고, 흡착 크로마토그래피, 크기배제 칼럼크로마토그래피를 수행하여 황산화활성, 특히 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 갖는 물질을 분리하여 제공함으로써, 본 발명의 항산화제 및 정제방법은 기능성 식품 및 가공식품 등의 소재로 이용되어 식품에서는 지질 산패를 방지하고 생체내에서는 세포막 지질과산화에 의한 노화를 억제할 수 있다.
Description
본 발명은 천연 항산화제 및 이의 정제방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 월계수 잎을 유기용매로 추출하고 정제하여 항산화 활성, 특히 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 갖는 물질을 분리하여 제공한다.
일반적으로 인체는 호기성 호흡대사, 즉 미토콘드리아내에서 전자를 산소가 받아 물로 환원시키는 에너지 생성과정 중 약 4% 정도는 부분 환원물인 활성산소(수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical), 하이드로젠 페록사이드, 하이드록시 라디칼 등)를 생산한다. 최근에는 지질과산화 반응에서 생성되는 지질 알콕시 라디칼, 지질 하이드로페록사이드, 지질 페록시 라디칼 등의 산화물 및 과산화물과 Fe2+O2 등의 금속산소착제들도 활성산소에 포함시키고 있다. 적정량의 활성산소는 생체내에서 살균작용, 세포간의 신호전달, 불필요성 단백질의 제거 등에 이용되고 있다. 그러나 신체 균형이 깨어질 경우 활성산소는 축적되며 이들 라디칼은 주변물질과 반응, 특히 단백질을 변성, 수식하여 원래의 활성을 잃게 하거나 생체막의 지질을 산화하여 막기능을 저해할 뿐만 아니라, DNA와 반응하여 DNA 스트랜드의 절단, 풀림을 유도하여 세포의 생체내 활성을 잃게 한다. 이러한 손상이 축적되면 세포의 항상성 등이 깨어짐으로써 결국 세포의 사멸을 일으키고 암, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 염증, 류마티스, 자가면역질환 등의 다양한 질병과 노화의 원인으로 발전하게 된다(참조: 김영곤(金永坤), 김영균(金永杓), 프리 라디칼, 여문각(麗文閣), 1997).
항산화제는 체내에서 생성된 각종 활성 프리 라디칼에 대해 항산화제 분자 자체가 가지고 있는 활성 수소원자를 내줌으로써 라디칼을 활성이 없는 안정한 화합물로 만들어 주면서 동시에, 자신은 공명에 의해 안정화된, 따라서 활성이 상대적으로 낮은 라디칼로 바뀐 후 다시 다른 라디칼들과의 상호반응에 의해 라디칼이 아닌 안정된 화합물로 되는 반응기구를 가지고 작용하게 된다.
높은 항산화 효과와 경제성 때문에 가장 널리 이용되고 있는 합성 항산화제인 부틸화 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole(BHA)), 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene(BHT)), 그리고 t-부틸하이드로퀴논(tertiary butylhydroquinone(TBHQ)) 등은 합성 페놀 화합물로 안전성에 논란이 되고, 소비자들의 거부감이 날로 심해지고 있다(참조:신동화, 식품과학과 산업, 30, 1, 1997). 따라서 근래에는 인간이 안전하게 오랫동안 먹어 왔던 식물로부터 항산화 효과가 높은 물질을 분리, 이용하려는 시도가 활발히 이루어지고 있다(참조:김종평, 생물산업, 11, 4, 6-14, 1998). 그 중에서도 여러 향신료들을 첨가하면 식품의 보존성이 증가한다는 사실로부터 향신료의 항산화 성분에 관한 많은 연구가 이루어져 왔다. 최근 향신료로부터 보고된 항산화활성물질로는 샐비어(Sage)의 로세마리-9-에틸에테르(rosemary-9-ethylether)(참조:Djarmati, Z., Jankov, R. M., Schwirtlish, E. Djulinac, B. and Djorkjevic, A., J. Am. Oil Chem. Soc., 68,731,1991), 로세마리의 카르노솔(carnosol)(참조:Brieskorn, C. H. Fuch, A., Bredenberg, J. B., Mc Chesney, J. D. and Wenkert, E., J. Org. Chem., 29, 2298, 1964), 로세마리퀴논(rosemariquinone), 로세마리디페놀(rosemaridiphenol)(참조:Wu, J. W, Lee, M. H., Ho, C. T. and Chang, S.S., J. Am. Pil Chem. Soc, 59, 339, 1982), 생강의 큐레이미노이드(cureyminoids), 오레가노스(oreganos)의2-카페오일록시-3-[2-4(하이드록시벤질)-4, 5-디하드록시]-페닐 프로피온산{2-caffeoyloxy-3-[2-4(hydroxylbenzyl)-4, 5-dihydroxy]-phenyl propionic acid}과 페닐 글리코사이드 등 그 외에도 카라웨이(Caraway), 큐민(cumin), 팀(thyme), 클로브(clove) 등이 알려져 있으며, 새로운 항산화제의 개발은 계속되고 있다.
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 안전성이 확립된 식물로부터 분리하여 식품 및 생체내에서의 산화를 억제할 수 있는 새로운 항산화제를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 항산제를 유효성분으로 포함하며, 기능성 식품 또는 식품의 첨가제등으로 이용가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 항화산제를 월계수 잎으로부터 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 월계수 잎으로부터 알킬 페록시 라디칼 소거물질을 분리하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 2는 세파덱스(Sephadex )LH-20 컬럼 크로마토그래피한 결과를 보인 크로마토그램이다.
도 3는 HPLC-C18 컬럼 크로마토그래피한 결과를 보인 크로마토그램이다.
도 4는 ESR(electron spin resonance)를 이용한 정제된 물질의 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 보여주는 그래프이며, met-Hb는 메트-헤모글로빈(Met-hemoglobin)을 나타낸다.
A): DMPO + met-Hb + t-BuOOH B): DMPO + met-Hb + t-BuOOH + 정제물
*: DMPO/·CH3 **: DMPO/·OH ***: DMPO/·OOH
도 5는 정제된 물질과 기존의 항산화제의 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 비교한 그래프이다.
기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 월계수 잎의 추출물을 유효성분으로 하는 항산화제를 제공한다.
본 발명에 따른 항산화제에 있어서, 상기 월계수 잎 추출물은 월계수 잎을 에탄올로 추출하거나, 에탄올 및/또는 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차 추출한 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 항산화제이 있어서, 상기 월계수 잎 추출물은 월계수 잎을에탄올, 에틸아세테이트로 순차 추출하고, 흡착 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피로 정제한 것이 바람직하다.
상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 상술한 바와 같은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 식품의 산화방지제 및 세포막 지질과산화에 의한 노화의 억제제로 이용가능한 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 월계수 잎을 유기용매로 추출하여 유기용매 분획을 수득하는 단계; 상기 유기용매 분획을 흡착 크로마토그래피, 크기배재 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 월계수 잎으로부터 항산화물질을 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 정제방법에 있어서, 상기 유기용매 분획은 에탄올로 추출하여 수득된 분획, 에탄올 및 클로로포름으로 순차 추출하여 수득되는 분획 및 에탄올, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차 추출하여 수득되는 분획으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 정제방법에 있어서, 상기 크로마토그래피는 실리카겔 흡착 크로마토그래피와 세파덱스 칼럼을 이용한 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 것이 바람직하며. 이러한 과정에 더하여 소수성 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
일반적으로 월계수(Laurus nobilis L.)는 상록교목으로 원산지는 남부유럽의 지중해연안이고 남부지방에서는 정원수로, 중부이북은 분화초로 재배하여 향신료로 이용한다. 생잎은 약간 쓴맛이 있으나 건조시킨 잎은 달고 강하며 독특한 향기가있어 서양요리에는 필수적일 만큼 널리 쓰이는 향신료다. 또한 식욕을 촉진시킬 뿐만 아니라 풍미를 더하며 방부력도 뛰어나 소스, 소시지, 피클, ?? 등의 부향제와 생선, 육류, 조개류 등의 요리에 많이 이용된다. 항산화 물질로 알려진 성분들로 캄펜 시아니딘(camphene cyanidin), 유게놀(eugenol), γ-테르피넨(γ-terpinene), 카엠프페르놀(kaempferol), 메틸-유게놀(methyl-eugenol), 미르센(myrcene), 퀘에르세틴(quercetin), 루틴(rutin)이 있으며, 그 외 외국에서 신경통, 류마티스의 진통제, 발진, 구풍제, 소화제, 수렴제 등으로 쓰여져 왔다(참조:최영전, 예가, 1997).
본 발명자들은 식품내에서 지질의 산화 방지 및 생체내에서 세포막 지질과산화에 의한 노화를 억제하는 천연항산화제 개발의 일환으로 향신채소의 이용 가능성을 연구하던 중 상술한 바와 같은 월계수 잎의 에탄올 추출물에서 높은 항산화활성, 특히 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 확인하고, 에탄올 추출물로부터 항산화활성, 특히 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 갖는 플라보노이드를 정제함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 월계수 잎 추출물을 함유하는 항산화제를 제공하는데, 본 발명의 항산화제는 특히 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 갖는다. 상기 월계수 잎의 추출물은 에탄올 추출물, 에탄올 및 에틸아세테이트의 순차적 추출물, 에탄올, 클로로포름 및 에틸아세테이트의 순차적 추출물 또는 이러한 에탄올 및 에틸아세테이트의 순차적 추출물의 정제물인 것이 바람직하다.
그 추출 및 정제 과정을 개략적으로 도시한 도 1를 따라 설명하면, 월계수 잎의 건조 분쇄물을 핵산으로 환류 추출하여 월계수 잎에 포함되어 있는 지질류를 제거한 후 잔사를 에탄올로 환류 추출하고 농축 건조하면, 에탄올 추출물을 수득할 수 있다. 이 에탄올 추출물질이 항산화 활성, 특히 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 갖는지 여부는 타카아키 아카이케 등의 방법(Takaaki Akaike, Sumiko Ijiri, Keizo Sato, Takato Katsuki, and Hiroshi Maeda, J. Agric. Food Chem. 43, 1864-1870, (1995))을 사용하여 확인할 수 있다.
상기 방법은 유기과산화물과 메테모글로빈(Fe3+)의 반응에 의해 생성된 알킬 페록시 라디칼의 미생물 살균반응을 이용한 것으로서, 유기과산화물, 메테모글로빈(methemoglobin), 미생물 및 에탄올 추추물을 넣고 배양한 후 미생물의 성장률을 측정하는 것이다. 그 결과 월계수 잎 에탄올 추출물에서 높은 항산화 할성, 특히 알킬 페록시 라디칼 소거활성이 확인되었다.
이에 본 발명자들은 월계수 잎에 포함된 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 보인 물질을 분리하고자 상기 에탄올 추출물을 적당량의 증류수에 분산시킨 후 클로로포름, 에틸에세테이트, 부탄올의 순으로 분획을 실시하여 각 유기용매의 가용분획을 얻고 이들의 알킬 페록시 라디칼 소거능을 상술한 바와 같은 타카아키 아카이케 등의 방법으로 확인한 결과 그 중 활성이 가장 높은 에틸아세테이이트 분획임을 알 수 있었다.
상기 에틸아세테이트 분획을 흡착과 크기배제의 원리로 물질이 분리되는 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피의 선택과 실시는본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 기술이다.
구체적으로, 본 발명에서는 실리카겔 컬럼과 세파덱스 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피는 클로로포름과 메탄올 혼합용액에서 메탄올의 농도를 변화시켜 용출하였으며, 또한 세파덱스 칼럼 크로마토그래피는 100% 메탄올로 평형화한 다음 동일 용매로 용출하였다.
상기 과정으로 얻은 활성분획을 다시 소수성의 실리카켈을 수지로 하는 컬럼에 활성분획을 주입하여 알킬 페록시 라디칼 소거능이 있는 단일 물질을 분리하였다. 이 결과 얻어진 단일물질은 플라보노이드였으며, 이를 UV-visible 스펙트로스코피, NMR, GC-MS로 구조 분석한 결과 이소퀘르시트린으로 동정되었다(표 1 참조).
또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 식품의 산화방지제 및 세포막 지질과산화에 의한 노화의 억제제로 이용가능한 조성물을 제공하는데, 이러한 조성물에 상기 항산화제 외에 포함될 수 있는 부형제는 본 발명이 속하는 기술의 통상에 지식을 가진 자에게 그 용도로 사용되는 것으로 알려진 물질이라면 특별한 제한없이 사용가능하다.
다음으로, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 하기의 실시예에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 월계수 잎 에탄올 추출물의 알킬 페록시 라디칼 소거활성 확인
월계수 잎의 에탄올 추출물이 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 타카아키 아카이케(Takaaki Akaike) 등의 방법(Takaaki Akaike, Sumiko Ijiri, Keizo Sato, Takato Katsuki, and HiroshiMaeda, J. Agric. Food Chem. 43, 1864-1870, (1995))을 사용하였다.
알킬 페록시 라디칼에 대한 소거활성은 t-부틸하이드로퍼옥사이드와 메테모글로빈(Fe3+)과의 반응에 의해 생성된 알킬 페록시 라디칼(t-BuOO·)에 의한 미생물(Staphylococcus aureus 209p, KTCT 1916) 살균반응을 이용한 방법을 사용하였다. 스타필로코쿠스 아우레우스를 브레인-하트 인퓨젼 브로뜨(brain-heart infusion broth)에 접종하여 37℃에서 12시간 배양한 후 균체를 원심분리(3,000 rpm, 5분, 4℃)한 다음 PBS(10 mM phosphate buffered saline, pH 7.3)로 3회 세정하고 PBS에 균을 현탁하여 광학 밀도(OD )0.1(1×107 CFU/mL)로 희석하였다. 균 희석액 100㎕, 100 mM PBS(pH 7.3) 100㎕, 증류수 500㎕, 에탄올 추출물 100㎕ 및 메테모글로빈(1㎎/mL) 100㎕을 혼합한 후 200 mM t-부틸하이드로페록사이드 100㎕을 가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액에 1배 농도의 만니톨 페놀 레드(mannitol phenol red) 배지를 9 mL 가한 후 37℃에서 2시간 배양하고 2배 농도의 만니톨 페놀 레드 배지를 웰당150㎕ 분주한 96 웰 플레이트에 위 반응액 75㎕를 다양한 농도로 희석한 후 37℃에서 22시간 배양한 후 엘라이자-리더(ELISA-reader) (A570-A655)로 측정하였다. 대조구는 상기 반응액의 성분 중 메테모글로빈을 첨가하지 않은 양성 대조구, 반응액의 전성분을 첨가하고 에탄올 추출물을 첨가하지 않은 음성 대조구를 사용하였다.
상기 시험결과를 보면 에탄올 추출물을 부가하지 않은 음성 대조구의 경우에는 알킬 페록시 라디칼(t-BuOO·)에 의한 스타필로로코구스의 살균작용에 의해 미생물이 성장할 수 없었고, 메테모글로빈을 첨가하지 않은 양성 대조구의 경우에는알킬 페록시 라디칼(t-BuOO·)이 발생하지 않아 미생물의 성장이 관찰되었다. 또한, 메테모글로빈과 에탄올 추출물 모두가 부가된 시료의 경우에는 양성 대조구의 경우와 같이 미생물의 성장이 관찰되었는데, 이는 월계수잎의 에탄올 추출물이 t-부틸하이드로퍼옥사이드와 메테모글로빈(Fe3+)과의 반응에 의한 알킬 페록시 라디칼(t-BuOO·)의 생성을 억제함을 의미한다.
실시예 2: 월계수 잎으로부터 알킬 페록시 라디칼 소거물질의 정제
분말 상태의 월계수 잎을 10배 가량의 헥산으로 70℃에서 3회 환류추출하고 그 잔사에 10배량의 95% 에탄올로 100℃에서 4회 환류 추출한 후 농축, 건조하여 에탄올 추출물을 얻고 이를 적정량의 물에 분산시킨 분획 여두(separating funnel)에 동량의 클로로포름을 가한 후 3회씩 분획 농축하여 클로로포름 층을 얻었고, 계속해서 같은 방법으로 수층을 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 순차 용매 분획한 후 농축하여 각각 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획을 얻었다.
알킬 페록시 라디칼에 대해 높은 소거활성을 보인 에틸아세테이트 분획을 클로로포름으로 평형화된 실리카 겔 60 컬럼(5 × 30 ㎝)에 흡착시키고 클로로포름과 메탄올의 혼합용매의 극성도를 높여가면서(100 : 0, 80 : 20, 60 : 40, 40 : 60, 100 : 0 단계순으로 용출)로 각 분획당 600 mL씩 용출하여 활성분획을 얻었다.
100% 메탄올로 평형화된 세파덱스 LH-20 칼럼(1.5 × 90 ㎝)에 상기 활성분획을 주입하고 동일 용매로 0.4 mL/min의 속도로 용출하여 활성 부분만을 농축였으며, 세파텍스 칼럼을 이용한 결과를 도 2로 나타냈다. 이어서 C18 컬럼(Semi-preparative HPLC(μ-bondapak C18 ,reverse phase, 3.9 × 300 ㎜))을 사용하여 1mL/min 의 유속으로 단일 물질을 분리하였으며, 그 결과는 도 3으로 나타냈다. 상기 정제 과정은 도1을 참조할 수 있다.
실시예 3: 월계수 잎 추출물로부터 정제한 알킬 페록시 라디칼 소거물질의 분석
알킬 페록시 라디칼 라디칼 소거활성을 보인 월계수잎 에탄올 추출물로부터 정제한 플라보노이드를 UV-visible 스펙트로스코피, NMR, GC-MS에 의해 구조를 해석한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 분자량 464 Da의 이소퀴에르시트린(isoquercitrin)으로 동정되었다.
| 위치 | 프로톤 | C0SYa)에서상관 프로톤 | 카본 | HMQCb)에서상관 프로톤 |
| 화학적 이동, δ(ppm) | 화학적 이동, δ(ppm) | |||
| 2 | 156.253 | |||
| 3 | 133.206 | |||
| 4 | 177.281 | |||
| 5 | 12.63(OH) | 161.177 | ||
| 6 | 6.19 d(1.885) | 98.664 | H-6 | |
| 7 | 164.457 | |||
| 8 | 6.40 d(1.925) | 93.457 | H-8 | |
| 9 | 156.008 | |||
| 10 | 103.717 | |||
| 1' | 121.032 | |||
| 2' | 7.58 d(-) | 116.083 | H-2' | |
| 3' | 144.742 | |||
| 4' | 148.426 | |||
| 5' | 6.84 d(9.055) | H-5' | 115.128 | H-5' |
| 6' | 7.57 dd(-,-) | H-6' | 121.475 | H-6' |
| 1' | 5.46 d(7.38) | 100.828 | H-1' | |
| 2' | 74.0028 | |||
| 3' | 76.4171 | |||
| 4' | 69.8378 | |||
| 5' | 77.4446 | |||
| 6' | 60.8677 | |||
| a)는 1H, 13C and two-dlmentional double-quanum-filtered correlation spectroscopy임b)는 hetero nuclear multiple correlation spectroscopy임 |
실시예 4: 월계수 잎 추출물로부터 정제한 알킬 페록시 라디칼 소거물질의 ESR 측정
75㎕의 메테모글로빈 (0.25 mg/mL), 30㎕의 t-부틸하이드로퍼옥사이드(t-BuOOH )(20 mM), 30㎕의 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DETAPAC)(0.1 mM), 5㎕의 5-디메틸-1-피롤린-N-옥사이드(DMPO) (60 mM)의 반응액에 완충액을 첨가하여 총 300㎕로 조제한 다음 이를 40초 후에 곧바로 측정하여 그 결과를 도 4의 A로 하였고, 상기 반응액에 상기 실시예 3에서 얻은 정제 물질 50㎍을 더 부가하고 40초 후에 측정한 결과를 도 4의 B로 하였다.(확인 바람 : 확인)
도 4의 B를 보면, DMPO/·CH3 및 DMPO/·OH에 대해서는 정제물질을 첨가하지 않은 A와 거의 유사하게 나타나는 반면 DMPO/·OOH는 A와는 달리 모두 소실었음을 알 수 있었다. 이는 정제물질이 페록시 라디칼에 대한 소거활성이 높다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 정제 물질과 시판 항산화제들의 항산화활성 비교
상기 실시예 1에서 에탄올 추출물의 항산화 활성의 측정시와 동일한 방법으로 실시예 3의 정제물질 및 현재 시판되는 항산화제의 활성을 실험하여 그 결과를 도 5로 나타냈다. 대조구는 반응액의 성분 중 메테모글로빈을 첨가하지 않은 양성 대조구, 반응액의 전성분을 첨가하고 실시예 3의 정제물질 및 현재 시판되는 항산화제를 포함하지 않는 음성 대조구를 사용하였다.
항산화제도 구조적 차이에 따라 그 활성이 변화한다. 효과적인 라디칼 소거제의 3가지 특징은 1) B-링에 o-디하이드록시, 2) C-링에 4-옥소- 기능(function)을 가지고 2, 3-이중 결합, 3) A와 C-링의 3-과 5-OH 그룹을 갖는 것으로 보고되어 있다(Catherine A. Rice-Evans, Nicholas J. Miller, and George paganga,Free 라디칼 Biology and Medicine, 20, 7, 933-956, 1996). 기존에 잘 알려져 있는 항산화제와 정제된 물질을 같은 농도로 하여 알킬 페록시 라디칼 소거활성을 측정한 결과 에피카테킨(epicatechin), 루틴, 카페인산, 퀴에르세틴, 갈르산(gallic acid), 프로부콜(probucol)의 활성에는 미치지 못했지만 에피칼로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate(EGCg)), 레스베라트롤(resveratrol)과는 유사한 값을 보였고 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT),큐마린, 비타민 C, 카테콜보다는 높은 활성을 나타내었다. 일반적으로 페록시 라디칼들을 불활성화 시키는데는 플라보노이드가 페놀계 황산화제(BHA, BHT, 카테콜) 등 보다 훨씬 높다고 한다. 또한 모노페놀은 폴리페놀 물질보다 활성이 떨어진다. 이것으로 큐마린의 활성이 낮은 이유를 설명할 수 있으며, 같은 하이드록시사나민산(hydroxycinamic acid)류인 카페인산이 활성이 높은 이유는 오르토-위치에 OH를 하나 더 가지고 있기 때문이다. 여기서 플라보노이드의 효과적인 활성구조를 갖춘 퀴에르세틴을 기준으로 생각하여 볼 때 루틴과 에피카테킨은 기본구조에서 3-o-치환되었기 때문에 퀴에르세틴보다 활성이 낮아야 되고, 또한 2, 3-이중결합이 없은 에피카테킨은 루틴보다 낮아야 된다. 하지만 이 분석 시스템(assay system)은 수상(aqueous phase)과 막의 지질상(lipophilic phase)이 공존하는 시스템이므로 수상에서 상호작용과 달리 지질상에서는 2, 3-이중 결합이 그리 중요하지 않고 프리 3-OH 그룹 또는 3- 및 5-OH 그룹의 존재가 중요하다. 만약 퀴에르세틴, 루틴, 에피카테킨이 수상에서만 라디칼과 작용했다면 퀴에르세틴> 루틴> 에피카테킨과 같은 항산화력이 예상되지만 그렇지 않다. 플라보노이드의 아글리콘(aglycone)은 지질친화 항산화제(lipophilic antioxidant)이기 때문에 수상에서 발생된 라디칼에만 작용한 것이 아니고 수상에 노출된 세포막의 인지질 이중막층에도 관여했을 가능성을 시사한다. 에피카테킨은 퀴에르세틴과 같은 위치에 하이드록시 그룹을 갖지만 C-링에 2, 3-이중 결합과 4-옥소 기능을 포함하지 않는다. 그럼에도 활성이 더 높은 이유는 지질상에 작용했다고 생각된다. 플라보노이드의 배당체화(glycosylation)은 배당체화가 되지 않은 물질과 비교시 활성을 감소시킴에도 불구하고 루틴이 퀘르세틴보다 활성이 높은 이유는 마이크로솜 지질 과산화(microsomal lipid peroxidation)의 저해를 연구한 다른 데이타에서도 이와같은 현상이 일어남으로 모든 활성 측면을 구조적인 측면에 비추어서 해명할 수만은 없다. 다만 여기서 위의 설명과 B-링에 카테콜 그룹과 C-링에 2, 3-이중 결합을 가진 물질은 비타민 C보다 더 강한 환원력을 가진다는 사실로부터 비타민C보다 활성이 높은 분리 물질은 B-링에 카테콜 그룹과 C-링에 2, 3-이중 결합을 가진 물질이라는 것을 추정할 수 있었다. 하지만 이런 다른 구조를 가진 항산화제들과 분리 물질이 단순히 하이드로젠-도네이팅 항산화(hydrogen-donating antioxidant) 작용했는지 자동산화 지질(autoxidasing lipids)에 지질 영역(lipophilic region)으로 접근하여 분배되는 공동효과를 나타내는지는 명확하지 않다(도 5 참조).
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 월계수 잎으로부터 분리한 항산화제 및 그 정제방법은 월계수잎의 에탄올 추출물로부터 항산화활성, 특히 알킬 페록시 라디칼 제거활성을 갖는 천연물질을 분리함으로써 이를 이용하면 식품에서는 지질의 산패를 방지하고 생체내에서는 세포막 지질과산화에 의한 노화를 억제하는 다기능 천연 항산화제가 포함된 기능성식품을 개발할 수 있다.
Claims (11)
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- 월계수 잎을 에탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트로 순차 추출하고, 흡착 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 월계수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품의 산화방지제로 이용가능한 조성물.
- 월계수 잎을 에탄올, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차 추출하는 단계;상기 추출 분획을 흡착 크로마토그래피, 크기배재 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 단계를 포함하며, 상기 흡착 크로마토그래피가 고정상으로 실리카겔 칼럼을 이용하고 이동상으로 농도구배 클로로포름 메탄올 혼합용매를 사용하고, 크기배재 크로마토그래피는 100% 메탄올로 평형화된 세파덱스 LH-20 칼럼을 이용하는 것을 특징으로 하는 월계수 잎으로부터 알킬 퍼옥시 라디칼 소거제를 정제하는 방법.
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- 제 7항에 있어서, 상기 더하여 소수성 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
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|---|
| Grasas Aceties (Sevile), vol. 46, no. 4-5, pp. 285-288 (1995) * |
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