KR100360663B1 - 우르솔산을 함유하는 치은증식 억제제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치은 증식 억제제 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 치은 증식 억제제 조성물은 우르솔산을 유효성분으로 함유함을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은 특히 디페닐히단토인 또는 니페디핀의 사용에 의해 유발되는 치은 증식의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

우르솔산을 함유하는 치은증식 억제제 조성물{Composition for inhibiting gingival hyperplasia that comprising ursolic acid}

본 발명은 치은증식을 억제하는 우르솔산의 새로운 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 우르솔산을 함유하는 새로운 치은증식 억제제 조성물에 관한 것이다.

치은 증식은 치은이 비정상적으로 증식하여 비대해지는 현상으로써 그 원인은 만성염증에 의해 발생되는 만성 염증성 증식과 5,5-디페닐히단토인(5,5-diphenylhydantoin: 이하 "디페닐히단토인"으로 약함), 니페디핀, 사이클로스포린 등의 약물 복용에 따른 부작용으로 구분된다. 이중 만성 염증성 증식은 염증액, 세포삼출액, 상피와 결합조직의 변형, 새로운 모세관의 형성, 혈관의 응혈, 출혈, 상피와 결체조직 및 새로운 교원섬유의 증식등 섬유모세포와 교원질의 섬유화 현상이므로, 치태를 제거하거나 치태 축척의 환경인자를 제거함으로써 완치시킬 수 있다.

그러나, 후자의 약물 복용에 따른 부작용으로서의 치은 증식은, 이들 약물이 간질발작의 예방용으로 투여되는 디페닐히단토인(박 준봉 등, 치주과학, 150면, 치주과학교수협의회, 1992), 협심증 예방제인 니페디핀(David et. al., Oral Durg.,57, 620-622, 1984; Nishikawa et al., J. Periodontol., 62, 30-35, 1991; Romanose et al., Periodont. Res., 28, 10-16, 1993; Robert et al., J. Periodontol., 56, 211-215, 1984), 면역억제제인 사이클로스포린(Sooriyamoorthy et al., J. Periodont. Res., 25, 25-30, 1990)등으로서 이들 약물을 복용해야 하는 환자의 경우 단기간의 투약으로 증세가 단절되는 것이 아니므로 복용을 지속해야 하고, 그로 인하여 치은 증식이 재발되며, 치은의 제거수술도 반복해야 하다. 더욱이 시술시의 고통 또한 참을수 없다.

상기 약물 중 디페닐히단토인에 의한 부작용 현상은 다음과 같다.

디페닐히단토인에 의하여 유발되는 치은 증식은 남녀 모두 50％이상으로 나타나며(Lindle, Textbook of clinical periodontology. 281면, Munksgaard. 1983; Angelopoulos et al., Oral Surg., Oral Med., Oral Pathol., 34, 898-906, 1972), 구강내 염증이 발생하였거나(do Nascimento et al., J. Periodont. Res., 20, 386-91, 1985),스트렙토코커스 솔브리누스(Streptococcus sorbrinus) 존재하에서는(Morasaki et. al., Archs. Oral Biol., 35, 753-758, 1990) 치은의 증식이 더욱 심해진다.

상기 약제에 의해 치은조직이 변하는 임상측면에서는 T세포 매개에 의한 면역반응의 증가(Dahllof. et. al., Scand. J. Dent. Res., 93: 507-12, 1985), 치은 섬유모세포(gingival fibroblast)의 증대(Rose et al., J. Dent. Res., 56, 416-426, 1977), 교원질 분해능의 감소가 관찰되었다. (Hassell. J. Oral Pathol., 11, 310-317, 1982; Goultschin et al., Biochem. Biophys. Acta., 631, 188-91, 1980;Kantor et al., J. Dent. Res., 62, 383-7, 1983). 염증 및 증식을 보이는 치은조직에서 5-알파-디히드로 테스토스테론(5-α-dihydrotestosterone; 이하 "5α-DHT"로 약함) 양의 증가(Sooriyamoorthy et. al., Archs. Oral Biol., 33, 353-359, 1988), 5α-DHT에 대한 치은 수용체의 증가(Southren et. al., J. Clin. Endocr. Metab., 47, 1378-1382, 1978)가 관찰되었고, 배양된 치은 섬유모세포에서는 5α-DHT 양은 두배까지 증가하였다. 세포활성의 증대는 디페닐히단토인 투여시 골절이나 방치의 치유가 촉진되는 것과 일치한다.(Stoner et. al., Cancer Res., 49, 1497-1504, 1989; Shafaer WG., Effect of dilantin sodium on growth of human fibroblast-like cell cultures, Proceedings of the society for experimental biology and medicine, 104, 198-201, 1960)

디페닐히단토인은 배양된 정상 치은섬유세포의 전체단백질 및 교원질의 합성은 감소시키는 반면 세포증식에는 영향이 없음이 보고되어 있으며(Salo et al., J. Oral Pathol. Med., 19, 404-7, 1990), 낮은 활성을 보이는 섬유모세포에서는 세포독성을 보이고 높은 활성을 보이는 세포에는 활성을 높여 기질형성이 증대됨을 작용기전으로 제시하였다.(Hassel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2902-2912, 1976)

결론적으로 이들 약물에 의한 치은증식에 관한 뚜렷한 기작 등은 아직까지 밝혀지지 않았으며, 약물을 투여해야 하는 환자들의 고통을 해결하는 방안도 없다는 것이다.

이러한 상황하에서, 본 발명자들은 상기 약물을 투여받는 환자들의 치은증식에 의한 고통을 덜어주고자 하는 목적으로 상기 약물과 함께 투여할 수 있는 생약성분을 검토하였고, 그 결과로서 레티놀산, 감초산, 올레산 및 우르솔산 등의 생약성분이 섬유 모세포의 변형을 정상화함을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 우르솔산을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 치은 증식 억제제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 우르솔산을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 치은 증식 억제제 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 특히 디페닐히단토인 또는 니페디핀의 사용에 의해 유발되는 치은증식을 억제하는 데 효과가 크다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용한 실험방법은 다음과 같다.

<단계 1> 치은 섬유모세포의 분리 및 1 차 배양

정상환자의 발치시 발치부위와 주위의 치은을 절제하여 얻은 치은조직을 40％ 우태아 혈청(Gibco 사 제품)과 20％ 항생제(페니실린 G, 스트렙토마이신, 암포테리신 B bh함, Gico사 제품)을 첨가한 α-MEM(minimal essential medium, Gibco사 제품)으로 3회 세척하였다.

세척한 치은조직을 건조되지 않은 상태에서 1㎟로 세절하였다. 세절한 치은조직을 세포배양용 접시에 펼쳐놓은 뒤, 각 접시당 10％ 우태아 혈청과 1％ 항생제가 첨가된 α-MEM 배지 2㎖를 주입하고, 37℃, 5％ 탄산 개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 배양하였다. 단일 세포층이 형성될 때까지 3일 간격으로 배양액을 교환하였다.

<단계 2> 2차 배양

배양액을 제거하고 행크 완충액(HBSS; Hank's buffered salt solution, Gibco사 제품)으로 2회 세척하였다. 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사 제품)을 2ml 첨가하여 3분간 실온에 방치한 뒤, 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시에 부착된 잔여세포를 분리시켰고, 1200rpm으로 10분간 원심분리하였다. HBSS로 2회 원심-세척하고, α-MEM배지로 부유시킨 뒤, 37℃, 탄산개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 배양하여 5회 계대배양하였다.

<단계 3> 약물에 의해 유도된 세포활성도의 측정

약물에 대한 투여농도는 문헌(Salo et al., J. Oral Pathol. Med., 19, 404, 1990)을 참고하여 결정하였다. 디페닐히단토인은 10㎍/㎖가 되도록, 니페디핀은 5㎍/㎖가 되도록 에탄올에 녹이고, 사이클로스포린은 5㎍/㎖가 되도록 올리브유에 녹였다.

세포활성도 측정은 카미카엘 등의 방법(Camichael et 베., Cancer Res., 47, 939, 1987)을 이용하였다. 약물을 첨가한 배양액에서 2일간 배양한 세포를 96웰 플레이트에 옮기고, 메틸 티아졸-2-일 2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(시그마 제품, 이하 "MTT"로 약함) 1㎎을 생리식염수 1㎖에 녹인 MTT 용액 50㎕을 분주하고 4시간 배양한 뒤, MTT 용액을 제거하고, 디메틸 솔폭사이드를 50㎕씩 첨가하여 잘 흔들고, 엘리자 분석기(ELISA Alalyzer, Toyo Instrument사 제품)으로 577nm에서의 흡광도를 측정하였다. 약물을 첨가하지 않은 배양액을 대조군으로 사용하였으며, 세포활성도는 대조군과의 백분율로 산출된다(하기 수학식 1 참조).

세포활성도 = (약물 처리군의 흡광도/ 대조군의 흡광도)×100

<단계 4> 약물에 의한 세포활성의 유도를 억제하는 효과 측정

약물과 레티놀산, 감초산, 올레산, 우르솔산을 농도별로 투여하여 3일간 배양하고, 기타 방법은 3의 방법을 따라 실시하였다.

본 발명의 치은 증식 억제제 조성물은 통상의 의약 조성물의 제제화 방법에 따라 제제화 될 수 있으며, 정제, 현탁액, 시럽, 캡슐, 주사제 또는 연고 등의 비제한적인 다양한 제형을 취할 수 있다. 본 발명의 조성물중의 유효성분의 함량은 제한적이지 않으며, 일반적으로 약 0.01∼50중량％의 양으로 함유된다.

약물투여시 초래되는 치은의 과도한 증식을 치료하는 방법으로는 약물 투여시 동시에 또는 투여후에 본 발명의 생약성분을 함유하는 조성물을 투여하는 것으로 이루어진다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 건강한 인체 치은 섬유모세포의 분리와 배양

원광대하교 치과대학 부속병원 교정과에서 교정치료를 받고 있는 10세의 정상인에게서 소구치를 발치하면서 발치 부위와 주위의 치은을 절제하여 치은조직을 얻었다. 조직을 실험방법 1에 따라 조섬유세포들을 10％ 우태아 혈청과 1％ 항생제가 첨가된 α-MEM 배양액 2㎖을 주입하고, 37℃, 5％ 탄산개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 배양하여 단일 세포층을 얻었다. 배양액을 제거하고 행크 완충액(HBSS; Hank's buffered salt solution, Gibco사 제품)으로 2회 세척하였다. 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사 제품)을 2ml 첨가하여 3분간 실온에 방치한 뒤, 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시에 부착된 잔여세포를 분리시켰고, 1200rpm으로 10분간 원심분리하였다. HBSS로 2회 원심-세척하고, α-MEM배지로 부유시킨 뒤, 37℃, 탄산개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 배양하여 5회 계대배양하였다.

<실시예 2> 각 성분에 의한 치은 섬유모세포의 세포 활성 억제

디페닐히단토인(시그마사 제품)은 10㎍/㎖가 되도록, 니페디핀(시그마사 제품)은 5㎍/㎖, 사이클로스포린(시그마사 제품)도 5㎍/㎖가 되도록하고, 레티놀산은 10^-7Mole이 되도록, 감초산은 10^-7Mole이 되도록, 올레산은 10^-7Mole이 되도록, 우르솔산도 10^-7Mole이 되도록 첨가된 배양액을 96웰 플레이트에 옮기고, 실시예 1의 배양세포를 웰당 1만세포가 되도록 분주한 뒤, 37℃, 5％탄산개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 3일간 배양하였다. MTT용액 50㎕을 첨가하여 4시간 배양한 뒤, MTT용액을 제거하고, 디메틸설폭사이드를 50㎕씩 첨가하여 잘 흔들고, 577㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

세포활성을 측정한 결과는 표 1과 같다.

첨가물질에 의한 세포활성도의 변화

물질	세포활성도(％)
디페닐히단토인	111.05±18.55
니페디핀	125.08±22.10
사이클로스포린	114.59±72.20
우르솔산	45.62±22.94
레티놀산	7.65±1.32
올레산	45.41±10.76
감초산	6.60±3.11
에탄올(대조군)	100.00±54.49

<실시예 3> 디페닐히단토인에 대한 억제효과

실시예 1의 배양세포를 웰당 1만세포가 되도록 분주하고, 디페닐히단토인과 생약성분 각각을 10^-7Mole 투여하여 37℃, 5％탄산개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 3일간 배양하였다. MTT용액 50㎕을 첨가하여 4시간 배양한 뒤, MTT용액을 제거하고, 디메틸설폭사이드를 50㎕씩 첨가하여 잘 흔들고, 577㎚에서의 흡광도를 측정하고, 결과를 표 2에 나타내었다.

	세포활성도 (％)
대조군	100.00±21.05
디페닐히단토인(10㎍/㎖)	110.05±18.01
디페닐히단토인+우르솔산	46.08±22.07
디페닐히단토인+레티놀산	47.09±1.62
디페닐히단토인+올레산	67.65±11.05
디페닐히단토인+감초산	36.66±6.25

상기 표 2의 결과에서 알 수 있듯이, 디페닐히단토인에 의해 증가된 치은 섬유 모세포 활성도는 본 발명의 생약성분인 감초산의 첨가에 의해 억제된다.

<실시예 4> 니페디핀에 대한 억제효과

실시예 1의 배양세포를 웰당 1만세포가 되도록 분주하고, 니페디핀과 본 발명의 생약성분 각각을 10^-7Mole의 농도로 투여하여 37℃, 5％탄산개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 3일간 배양하였다. MTT용액 50㎕을 첨가하여 4시간 배양한 뒤, MTT용액을 제거하고, 디메틸설폭사이드를 50㎕씩 첨가하여 잘 흔들고, 577㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

세포활성을 측정한 결과는 표 3과 같다.

	세포활성도 (％)
대조군	100.00±21.05
니페디핀(5㎍/㎖)	125.08±22.01
니페디핀+우르솔산	32.75±8.66
니페디핀+레티놀산	45.39±13.07
니페디핀+올레산	38.42±7.80
니페디핀+감초산	73.89±24.31

상기 표 3의 결과에서 알 수 있듯이, 니페디핀에 의해 증가된 치은의 섬유모세포의 활성도는 본 발명의 생약성분인 감초산의 첨가에 의해 억제된다.

<실시예 5> 사이클로스포린에 대한 억제효과

실시예 1의 배양세포를 웰당 1만세포가 되도록 분주하고, 사이클로스포린과 본 발명의 생약성분 각각을 10^-7Mole의 농도로 투여하여 37℃, 5％ 탄산개스, 습도 100％로 조절된 배양기에서 3일간 배양하였다. MTT용액 50㎕을 첨가하여 4시간 배양한 뒤, MTT용액을 제거하고, 디메틸설폭사이드를 50㎕씩 첨가하여 잘 흔들고, 577㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

세포활성을 측정한 결과는 표 4와 같다.

	세포활성도 (％)
대조군	100.00±32.79
사이클로스포린	116.75±49.49
사이클로스포린+우르솔산	148.95±23.98
사이클로스포린+레티놀산	108.11±18.11
사이클로스포린+올레산	139.06±13.07
사이클로스포린+감초산	112.97±18.11

<실시예 6> 동물실험

100일된 숫컷 래트에 결찰사를 부착한 뒤, 복강을 통해 디페닐히단토인, 니페디핀, 사이클로스포린 각각을 초기 10일동안 2㎎/체중㎏의 농도로, 그 후 매주 2㎎/체중㎏씩 증가시켜 주사하였다. 발명의 생약성분 각각을 10^-7Mole의 농도로 결찰사에 발랐다. 11주까지 관찰에 의하여, 디페닐히단토인, 니페디핀, 사이클로스포린 투여군은 치은이 대조군의 섬유성 증가와는 다르게 정상군과 유사하였다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 디페닐히단토인, 니페디핀, 사이클로스포린 등에 의해 유발된 치은 섬유 모세포의 변형은 레티놀산, 감초산, 올레산, 우르솔산 등의 생약성분의 첨가에 의해 정상화된다.

Claims (2)

1. 우르솔산을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 치은증식 억제제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 치은증식은 디페닐히단토인 또는 니페디핀의 사용에 의해 유발되는 것임을 특징으로 하는 치은증식 억제제 조성물.