KR100355490B1

KR100355490B1 - 로타바이러스에 대해 감염 억제활성을 갖는 지각 추출물

Info

Publication number: KR100355490B1
Application number: KR1019990044355A
Authority: KR
Inventors: 김동현
Original assignee: 주식회사태창물산
Priority date: 1999-10-13
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2002-10-09
Also published as: KR20010037063A

Abstract

본 발명은 약초인 지각(Citrus aurantiumfruit)을 용매추출하여 얻은 것으로서, 전염성 급성설사 및 장염을 일으키는 주된 원인체인 로타바이러스에 대해 감염 억제활성을 갖는 지각(Citrus aurantiumfruit) 추출물에 관한 것이다.

Description

로타바이러스에 대해 감염 억제활성을 갖는 지각 추출물{Inhibitory activity of Citrus aurantium fruit extract on rotavirus infectivity}

1943년에 라이트(Light)와 호데스(Hodes)는 유아에게 발생하는 심각한 설사현상을 보고한 바 있는데, 이 문헌에서는 유아의 분변에서 설사를 야기시키는 거름성 물질(filterable agent)을 분리하였으나, 그 형태학적 특성을 밝히지는 못하였다. 분리된 상기 거름성 물질의 형태학적 특성은 1973년에 전자현미경에 의해 밝혀졌고, 포유동물과 조류에서 분리된 것은 레오바이러스(reovirus)와 비슷하였다. 이러한 상기 바이러스는 바이러스 입자의 이중 캡시드(double capsid)가 수레바퀴 모양과 비슷하다하여 라틴어의 로타(rota)(영어의 wheel)에서 유래되어 로타바이러스(rotavirus)로 명명되었으며, 1978년에 레오비리대(reoviridae) 과의 로타바이러스 속으로 분류되었다.

로타바이러스는 항원적으로 서로 다른 6군(A ∼ F)으로 구성되어 있다. A, B 및 C군은 사람과 동물 모두에게서 나타나고, D, E 및 F군은 동물에서만 발견된다. 혈청별로 구분되는 군은 공동의 또는 교차되는 항원을 가지고 있는데, 이들 중 A군은 로타바이러스의 존재가 처음 보고된 이후, 가장 많이 연구되어 성격 규명이 잘 되어 있고, 사람 분리주들의 대부분을 차지하고 있다.

또한, 로타바이러스는 소아와 소, 말, 돼지 및 원숭이 등의 어린동물에서 전염성 급성설사 및 장염을 일으키는 주된 원인체로 알려져 있다. 유아와 어린이에게서 일어나는 돌발적인 설사는 세계적으로 중요한 질병으로서, 세계보건기구의 통계자료에 의하면 지구상의 5세 이하의 어린이들 중 설사증으로 사망하는 숫자가 매년 500만 명에 달하며, 이들 중 20%에 해당하는 100만 여명이 로타바이러스로 인한 설사증으로 사망하고 있다고 한다. 그리고, 미국에서 발생하는 유사설사의 35 ∼ 50%는 로타바이러스에서 기인한다. 게다가, 개발도상국에서는 문제가 더 심각하여 6 ∼ 11개월의 유아에서 약 10번 정도의 로타바이러스 기인성 설사가 발생한다고 알려져 있으며, 90%의 유아가 24개월 이전에 로타바이러스 항체를 보유하는 것으로 알려져 있다.

서울 지역의 소아설사군을 대상으로 12개월 동안 12종류 이상의 설사 유발 원인체들을 조사한 연구보고에 의하면, 설사군의 47%에서 로타바이러스가 검출되어 가장 높은 출현빈도를 나타내었으며, 이는 세계보건기구의 통계치인 20%의 두 배를 웃도는 수치를 나타낸다[표 1 참조].

상기 로타바이러스는 분변에서 경구의 경로로 감염되어, 만 2세 이하의 어린 유아에게서 발생하는 전염성 급성설사 및 장염의 원인이 되는데, 이런 감염상태를 흔히 유아성 위장관염 또는 급성 위장관염으로 부른다. 로타바이러스에 의한급성위장관염은 발열, 구토, 설사 및 호흡기증상 등의 임상증상을 동반한다. 바이러스는 증상이 나타난 약 8일 후에 분변으로 대량 배설되며, 분변 g당 10¹¹개의 바이러스 입자가 발견되고, 감염시 탈수와 물질 대사 산독증이 발생한다. 또한, 설사가 나타나는 것은 로타바이러스 감염으로 장관 점막세포의 흡수기능에 장애가 생기기 때문으로 알려져 있다.

로타바이러스에 의한 급성위장관염은 우리나라를 비롯한 온대지방에서는 늦가을부터 초겨울사이에 대부분 발생하며, 이 기간의 소아 설사증 환자의 70 ∼ 80%를 차지한다.

이와 같은, 어린 유아에게서 전염성 급성설사 및 장염의 원인이 되는 로타바이러스 감염을 방지하기 위해, 경구투여용 백신의 개발이 시도되고 있으나, 아직까지는 효능이 좋은 백신의 개발이 이루어지지 못하고 있다.

이에, 본 발명자들은 여러 약초로부터 전염성 급성설사 및 장염을 일으키는 주된 원인체인 로타바이러스 감염의 억제활성을 측정하여, 감염 억제활성이 높은 유효성분을 약초로부터 분리 및 생산함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 로타바이러스에 대해 감염 억제능이 우수한 약초로부터 분리된 유효성분을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 로타바이러스에 대해 감염 억제활성을 갖는 지각(Citrus aurantiumfruit) 추출물을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 어린 유아에게서 전염성 급성설사 및 장염의 원인이 되는 로타바이러스에 대한 감염을 억제할 수 있는 약초를 용매추출하여 얻은 추출물에 관한 것이다.

따라서, 본 발명자들은 로타바이러스에 대한 감염을 억제할 수 있는 약물을 찾기 위해, 알려져 있는 여러 가지 약초를 경도시장의 흥인약업에서 구입하였다. 구입한 약초 각각의 로타바이러스에 대한 감염 억제활성을 측정하였다. 측정 결과로 로타바이러스에 대해 감염 억제능이 높은 약초를 선택하였는데, 이러한 선택 과정을 설명하면 다음과 같다.

즉, 모든 약초의 시료는 물을 가하여 추출하였고, 이러한 추출물을 로타바이러스와 로타바이러스에 감염될 수 있는 MA-104 세포에 첨가하여 세포병리적 효과(cpe)를 관찰함으로써, 로타바이러스의 감염이 억제된 정도를 측정한다. 측정한 결과, 추출물의 최종농도를 0.05 mg/㎖로 하였을 때, 로타바이러스에 대한 감염억제율은 0 ∼ 37.5%의 다양한 정도를 보였다. 사용된 약초 추출물 중에서 지각(Citrus aurantiumfruit) 추출물의 경우는 로타바이러스에 대한 감염 억제율 37.5%을 나타내었고, 황백(Phellodendron amurensecortex), 황기(Astragalus membranaceusradix) 및 당목향(Saussurea lapparadix) 추출물의 경우는 로타바이러스에 대한 감염 억제율 31.5%을 나타냈다.

따라서, 상기의 높은 감염 억제능을 보이는 약초를 이용한다면, 유아기 전염성 급성설사 및 장염의 주된 원인인 로타바이러스의 감염을 억제할 수 있을 것이라 생각된다.

한편, 본 발명에서는 로타바이러스에 대해 감염 억제율이 가장 높은 지각(Citrus aurantiumfruit)을 선택하여 유효성분을 분리한 바, 이의 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.

즉, 지각(Citrus aurantiumfruit)에 물을 가하여 얻은 추출물을 에테르 및 에틸아세테이트로 차례로 추출하고, 활성분획인 에틸아세테이트 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피의 R_f치에 따라 6가지 성분을 분리하였다. 그런 다음, 상기 분리된 6가지 성분을 사용하여 로타바이러스의 감염을 50% 억제할 수 있는 각각 성분의 함량 및 농도를 측정하였다.

측정 결과로 감염 억제능이 높은 물질을 선택하고, 선택한 물질에 대해 mass 및 NMR 등의 기기분석을 하였다.

결과적으로, 지각(Citrus aurantiumfruit)의 로타바이러스에 대해 감염 억제능이 높은 성분은 헤스페리딘(hesperidin) 및 네오헤스페리딘(neohesperidine) 성분임을 밝혀내었다.

이하, 본 발명의 로타바이러스에 대해 감염 억제활성을 갖는 약초 추출물을 다음의 실시예를 통하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : MA-104 세포의 배양

로타바이러스 감염을 위한 MA-104 세포는 소 태아 혈청(FBS : Biofluids Inc. U.S.A) 10%, 항생제-항진균제(Gibco Co. U.S.A.) 1% 및 탄산수소나트륨(화광순약공업 ; Japan) 3.5 g/ℓ을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium ; Sigma Co. U.S.A.)을 사용하여 배양하였다. 세포가 플라스크 넓이의 약 80%만큼 증식하였을 때, 0.25% 트립신으로 처리하여 세포를 떼어냄으로써, 계대 배양하였다. 이때, 세포 배양은 5% CO₂가스의 CO₂배양기를 사용하였다.

실시예 2 : 로타바이러스의 일종인 와바이러스(Wa virus) 저장액의 제조

세포 배양 플라스크(25cm²)에 2×10⁶의 MA-104 세포를 분주하고, 1시간 동안 37℃ 온도의 CO₂배양기에서 부착시킨 후, 배지를 걷어내고 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지로 2회 세포 표면을 세척하였다.

그런 후, 와 바이러스(Wa virus)액 400 ㎕에 트립신 100 ㎍/㎖을 함유한 감염 DMEM 배지 20 ㎕를 가해서 37℃ 온도에서 30분 동안 활성화시켰다. 그런 다음, 바이러스액을 세포 표면에 잘 펴고, 37℃ 온도에서 1시간 동안 감염시킨 후, 바이러스액을 걷어내었다. 그 후, FBS는 함유하지 않고 5 ㎍/㎖의 트립신을 함유하는 감염 DMEM 배지 5 ㎖을 세포에 가하고, 37℃ 온도의 CO₂배양기에서 5일 동안 배양하였다.

배양 3일 후와 5일 후에 세포병리적 효과(cytopathic effect:cpe)를 확인하였다.

세포를 냉동시키고 빠르게 녹이는 과정을 3회 반복하여 세포의 세포막을 완전히 깨뜨린 후, 4℃ 온도에서 5000 rpm 속도로 20분 동안 원심분리하여 바이러스액인 상등액을 취해 -70℃ 온도에서 냉동보관하였다.

실시예 3 : 약초의 로타바이러스에 대한 감염 억제효과

MA-104 세포를 0.25% 트립신을 처리하여 플라스크에서 떼어내고, DMEM 배지로 2회 세척한 후, 세포 수를 3×10⁵개로 희석하였다.

본 발명에 사용되는 모든 시료는 시료 약 300 g에 5배의 물을 첨가한 후, 80℃에서 6시간 동안 추출하고 여과하였다.

한편, 와 바이러스(wa virus) 저장액을 감염 DMEM 배지로 500배 희석하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 참조예 1의 0.4 mg/㎖의 시료추출물 50 ㎕, 와(wa) 바이러스 희석액 50 ㎕ 및 3×10⁵세포수/㎖의 MA-104 세포 100 ㎕를 첨가한 후, 37℃의 CO₂배양기에서 5일 동안 배양하였다.

그 후, 세포병리적 효과(cpe)를 관찰함으로써, 로타바이러스에 대한 감염 약초의 억제활성을 측정하였고, 그 결과는 다음 표 2에 나타낸 바와 같다.

상기 표 2의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명 시료의 최종농도를 0.05 mg/㎖로 하였을 때, 로타바이러스에 대한 감염 억제효과가 가장 크게 나타난 것은 지각(Citrus aurantiumfruit)으로 37.5%의 감염 억제율을 나타내었다.

실시예 4 : 지각( Citrus aurantium fruit)으로부터 로타바이러스에 대한 감염 억제물질의 분리

실시예 3의 결과로 선택한 지각(Citrus aurantiumfruit)에 5배의 물을 가하고 80℃에서 6시간 동안 추출하고 여과하였다. 추출물의 최종 농도를 0.4 mg/㎖로 맞추었다. 여과액을 에테르 및 에틸아세테이트로 차례로 추출하여 농축하였다. 다음 표 3은 에테르 분획, 에틸아세테이트 분획 그리고 나머지 잔사가 로타바이러스 감염에 미치는 영향을 관찰하고 활성분획을 조사한 결과를 나타낸다.

상기 표 3의 결과로 확인된, 활성분획인 에틸아세테이트 분획을 실리카겔 컬럼(3×20 cm)에 로딩(loading)하였고, 전개용매로는 CHCl₃:MeOH(3:1)을 사용하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 R_f치가 0.9, 0.48, 0.31, 0.21 및 0.03인 물질(전개용매 클로로포름:메탄올=4:1)을 분리하여 로타바이러스에 대한 감염 억제활성을 측정하였다. 즉, 96 웰 플레이트(well plate)에 와(wa) 바이러스 희석액 50 ㎕, 3×10⁵세포수/㎖의 MA-104 세포 100 ㎕ 및 농도가 200 및 20 ㎍/㎖인 분리한 각각의 화합물 50 ㎕를 가하여 화합물의 최종농도를 50 및 5 ㎍/㎖로 하였고, 37℃ 온도의 CO₂배양기에서 5일간 배양하였다. 측정결과는 다음 표 4에 나타낸 바와 같이, 50% 감염 억제효과를 나타낸 것은 R_f치가 0.25 및 0.21인 물질이었고, 각각은 10 μM 및 25 μM이었다.

상기 표 4의 결과에서 알 수 있듯이, 지각(Citrus aurantium fruit)으로부터 분리한 6가지 물질 중, 로타바이러스에 대한 감염 억제효과가 가장 뛰어난 것은 Rf치가 0.25 및 0.21을 나타내는 물질임을 확인하였다. Rf치가 0.25 및 0.21을 나타내는 물질을 mass 및 NMR 등의 기기분석을 한 결과, 각각 헤스페리딘(hesperidin) 및 네오헤스페리딘(neohesperidin)으로 밝혀졌고, 그 결과를 다음 표 5에 나타내었다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 로타바이러스에 대한 감염 억제활성을 갖는 약초인 지각(Citrus aurantium)의 추출물은 유아기 전염성 급성설사 및 장염의 주된 원인인 로타바이러스의 감염을 억제할 수 있는 유용한 효과가 있다.

Claims

지각(Citrus aurantiumfruit)을 에테르 및 에틸아세테이트로 차례로 추출하여 얻은 에틸아세테이트 분획으로, 헤스페리딘(hesperidin) 및 네오헤스페리딘(neohesperidin)이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 지각추출물.
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