KR100351619B1 - 미세조류 응집제를 생산하는 패니바실러스 폴리믹사ｋｃｔｃ 0766ｂｐ - Google Patents

Abstract

본 발명은 미세조류 응집제를 생산하는 신균주 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP와, 이러한 신균주가 생산하는 응집제를 이용하여 대량 배양된 미세조류를 효과적으로 응집 침전시켜 수확하는 방법에 관한 것이다.

Description

미세조류 응집제를 생산하는 패니바실러스 폴리믹사 ＫＣＴＣ 0766ＢＰ{Bioflocculant Produced by Paenibacillus polymixa KCTC 0766BP for Microalgae Harvesting}

본 발명은 미세조류 응집제를 생산하는 신균주 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP와, 이러한 신균주가 생산하는 응집제를 이용하여 대량 배양된 미세조류를 효과적으로 응집 침전시켜 수확하는 방법에 관한 것이다.

미세조류 중에서도 클로렐라(Chlorella)는 구형이고 세포의 직경이 5 ∼ 10 ㎛인 단세포성 녹조류로서 호수나 못, 지소 등에 널리 분포하는 식물성 플랑크톤이다. 담수산 클로렐라의 경우는 수산양식용 윤충(Rotifer) 및 치어의 먹이생물로 사용되며, 건강식품으로도 상품화되고 있다. 또한, 일본과 대만에서는 1965년 건강식품으로서 클로렐라의 상업적 대량생산을 시작하였으며, 국내에서도 최근에 사료 및 건강식품으로 대량배양하고 있다[오와 이,생물산업 12(4), 30, 1999].

그러나, 클로렐라(Chlorella)는 수중에 부유하는 특성이 있어 수확하는 공정상의 많은 어려움이 있다. 클로렐라의 수확방법과 관련된 종래 기술로서는 명반(alum)을 이용한 미세조류의 응집[대한민국 특허등록 제93651호], 전극을 이용한 클로렐라 수확장치[대한민국 실용신안등록 제31226호], 미세조류 배양액의 회전 및 가압에 의한 부유 회수장치[미국 특허등록 제6,000,551호, 제5,951,875호] 등이 소개된 바 있다. 또한 원심분리법(centrifugation)에 의한 클로렐라의 수확[Noue and De Pauw,Biotech. Adv.6, 725, 1988]이 흔히 사용되고 있기도 하다.

그러나, 상기한 종래 수확방법은 화학 응집제의 과다 사용에 의한 독성 및 환경오염의 우려와 고가장비의 구입과 전기비 등 유지관리비의 부담으로 클로렐라 생산원가의 상승요인으로 작용하고 있다.

본 발명자들은 클로렐라를 비롯한 미세조류가 수중에서 부유하는 특성을 가지고 있어 조체를 수확하기가 용이하지 않는 바, 이러한 미세조류 특히 배양된 클로렐라를 효과적으로 수확할 수 있는 방법에 대하여 여러 연구를 시도하던 중, 클로렐라를 대상으로 우수한 응집능을 가지는 응집제를 생산하는 신균주 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP를 동정하게 되었고, 또 응집제의 처리 조건 및 독성시험을 한 결과 클로렐라를 효과적으로 응집 침전하여 수확할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 미세조류 응집제를 생산하는 신균주 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP와, 이러한 응집제를 이용하여 대량 배양된 미세조류 그 중에서도 특히 클로렐라(Chlorella)를 효과적으로 수확하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP의 분자계통학적 분류도 이다.

본 발명은 미세조류 응집제를 생산하는 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP로부터 생산된 응집제를 이용하여 미세조류를 수확하는 방법에도 또다른 특징이 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 수중에 분산되어 있는 미세조류에 대하여 우수한 응집능을 가지는 고분자 응집제를 생산하는 신균주와, 이러한 신균주가 생산하는 응집물질에 의해 미세조류를 효과적으로 응집 및 침전시켜 일시에 수확하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미세조류 응집제를 생산하는 KCTC 0766BP 균주는 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석에서 패니바실러스 속(Paenibacillus sp.)에 속하는 균주로서, 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa), 패니바실러스아조토픽산스(Paenibacillus azotofixans), 패니바실러스 페오리애(Paenibacillus peoriae)를 포함하는 그룹에 가까운 유연관계를 보여준다. 특히 98.6 %의 상동성으로서 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa)의 표준균주에 가장 높은 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다[도 1 참조].

또한, 본 발명에 따른 신균주가 생산하는 고분자 응집제는 미세조류에 대한 특이성이 강하며 특히 클로렐라를 대상으로 광범위한 응집능을 비교 분석한 결과 우수한 응집능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

다음의 실시예는 본 발명이 KCTC 0766BP 균주가 생산하는 고분자 물질을 미세조류 응집제로 선정하는 과정과, 이러한 응집제를 사용하여 미세조류를 수확하는 방법을 구체화하여 설명한 것으로 본 발명이 다음의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 신균주 KCTC 0766BP의 분리 동정

응집제 생산 미생물의 분리를 위하여 논, 밭, 산림 등지의 토양에서 균원 시료를 채취하였다. 균원 시료는 분리용 평판배지상에서 배양한 후 생성된 집락으로부터 점성을 갖거나, 집락표면이 탄성을 보이는 집락들을 선발하였다. 이와 같은 방법으로 100여 응집제 생산 미생물 균주를 확보하였다. 분리된 균주의 액체배양을 통하여 생장성, 점액성 물질의 점도, 열안정성 등이 우수한 균주를 미세조류 응집제 생산 균주로 최종 선발하였다[Ahn et al.,J. Microbiol. Biotechnol.Vol.8, 171, 1998].

또한, 분리된 균주에 대해서는 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 통하여 균주 동정을 실시하였는 바, 그 실시 결과는 다음과 같다.

균주로부터 추출된 DNA와 만능 프라이머(universal primer; 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3')를 사용하여 이전에 알려진 조건[Yoon et al.,Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 111, 1997]에 따라 PCR를 행하여 16S rDNA(16S rRNA coding gene)를 증폭하였다. 증폭된 16S rDNA는 PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 후 시퀀싱 반응에 이용하였다. 염기서열 결정은 분석기(Genetic analyzer 377, Perkin-Elmer)을 이용하였으며, 염기서열의 분석은 주로 CLUSTAL W 프로그램[Thompson et al., 1994] 및 PHYLIP 프로그램[Felsenstein, 1993]을 사용하였다.

신균주는 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 98.6 %의 상동성으로서 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa)의 표준균주에 가장 높은 유연관계를 보여주는 균주로 동정되어 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) 균주로 명명하였다.

또한, 본 발명의 신균주 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa)는 생명공학연구소내 유전자은행에 2000년 3월 29일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 0766BP를 부여받았다.

실시예 2 : 미세조류 및 응집제 생산 균주 KCTC 0766BP의 배양

클로렐라는 Chu 13 배지[KNO₃0.371 g/ℓ, K₂HPO₄0.08 g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.2 g/ℓ, CaCl₂·2H₂O 0.107 g/ℓ, 구연산 철(Fe citrate) 0.02 g/ℓ, 구연산(Citric acid) 0.1 g/ℓ]와 미량원소 1 ㎖/ℓ[H₃BO₃2.86 g/ℓ, MnCl₂·4H₂O, 1.81 g/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.391 g/ℓ, CuSO₄·5H₂O, 0.079 g/ℓ, Co(NO₃)₂·6H₂O, 0.0494 g/ℓ]에 실험 2 주전에 배양하여 이것을 접종원으로 사용하였다. 접종원에 포함된 클로렐라 수는 4.16 ×105/㎖ 정도로 이 배양액을 실험군에 3 % 접종하였다. 건조세포중량은 시료를 샘플링 매니폴드(sampling manifold)(Millipore)를 이용하여 유리섬유 필터(Whatman GF/C)로 여과한 후 여과된 고형물을 100℃에서 24 시간동안 건조하여 측정하였다.

응집제 생산 미생물 균주 KCTC 0766BP의 배양용 배지조성은 다음 표 1과 같으며, 미생물 균주는 30 ℃, 130 rpm에서 5 일간 배양하였다.

실시예 3 : 응집활성시험

Chu 13 배지를 기본으로 온도 30 ℃, 교반속도(shaking speed) 90 rpm, 90 μE/㎡/s의 조건에서 1 주일간 전 배양한 클로렐라 배양액을 대상으로 KCTC 0766BP 균주가 생산한 응집제에 대해서는 다음과 같은 방법으로 응집활성 시험을 수행하였다.

클로렐라 배양액(50 ㎖)에 5 % CaCl₂·2H₂O(1 ㎖)를 첨가한 후 300 rpm 교반속도로 30 초동안 교반하였다. 여기에 균주 배양액(1 ㎖)을 첨가한 후에 다시 300 rpm 교반속도에서 30 초동안 그리고 100 rpm 교반속도에서 30 초동안 계속 교반하였다. 그리고 10 분동안 정치시킨 후 상등액 5 ㎖를 취하여 흡광도(680nm)를 측정하였다. 응집활성은 다음 수학식 1에 의하여 산출하였다[Toeda and Kurane, Agricultural and Biological Chemistry 11, 2793, 1991].

상기 수학식 1에서 : A는 시험구의 흡광도이고, B는 대조구의 흡광도이다.

총 170 여종의 균주를 대상으로 클로렐라에 대한 응집활성을 시험하여 제거효율이 90 %를 초과하는 5 종의 균주를 최종 선발하였고, 선발된 5 균주를 대상으로 실시한 응집 시험 결과는 다음 표 2에 나타내었다. 다음 표 2에 의하면, 선발된 균주 중에서 KCTC 0766BP 균주의 응집효율은 3회 실험으로 평균 92.2 % 이었다.

실시예 4 : KCTC 0766BP 균주 배양액의 희석 농도에 따른 응집능 비교 시험

상기 실시예 3의 방법에 따라 KCTC 0766BP 균주 배양액을 증류수로 2배, 5배 및 10배 희석하여 동일한 조건에서 3회 반복으로 응집활성을 시험하였다.

응집효율은 2배, 5배, 10배 희석의 경우 각기 92.5, 93.8, 70.7 %로 조사되었다. 실시예 2의 조건에서 5일 배양된 KCTC 0766BP 균주의 배양원액의 건조중량은 1.3 g/ℓ이므로 5배 희석의 경우 배양액의 건조중량은 0.26 g/ℓ이며, 이때 응집효율은 93.8 %로 희석하지 않은 배양액의 92.2 %와 큰 차이가 없었다.

실시예 5 : 화학응집제와의 응집활성 비교 시험

클로렐라에 대한 KCTC 0766BP 균주 배양액의 응집활성과 화학응집제(2 mg/ℓ)의 응집활성을 비교 시험한 결과는 다음 표 3과 같다.

다음 표 3에 의하면, KCTC 0766BP 균주가 생산한 미생물 응집제의 응집효과는 83.4 %로 현재 가장 널리 이용되고 있는 화학응집제인 명반(alum)의 71.8 %나 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)의 77.7 %에 비하여 응집활성이 높은 것으로 나타났다.

이상의 시험에서 KCTC 0766BP 균주가 생산하는 미생물 응집제가 클로렐라의 응집 수확에 가장 효과적이며, 기존의 화학 응집제인 명반(alum)이나 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)보다 응집활성이 우수함을 알 수 있었다.

실시예 6 : 응집의 최적화-보조응집제의 영향

미생물에 대한 응집능을 향상시키기 위하여 사용되는 보조응집제가 클로렐라의 응집활성에 미치는 영향을 파악하기 위하여 5 종류의 양이온성 보조응집제를 각각 6.8 mM을 첨가하여 응집시험을 실시한 결과는 다음 표 4와 같다. 대조구에는 동량의 증류수를 첨가하였다.

미생물 배양액의 응집활성은 효과는 K⁺, Na⁺이온보다는 Ca²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺와 같이 하전수가 높은 이온을 첨가함으로써 현저히 증가하였다.

실시예 7 : 응집의 최적화-pH 영향

클로렐라 배양액의 pH 변화가 응집활성에 미치는 영향을 파악하기 위하여 1N HCl 또는 1N NaOH 용액을 사용하여 pH를 5 ∼ 11의 범위로 조절하여 KCTC 0766BP 균주의 응집활성을 시험한 결과는 다음 표 5와 같다. 선발된 KCTC 0766BP 균주는 pH 7 ∼ 11 범위에서 비슷한 응집활성을 나타내었다.

실시예 8 : 미생물 응집제의 독성시험

클로렐라의 수확에 사용하기 위한 균주 배양액의 급성경구독성 정도를 파악하기 위하여, 대한실험동물센터로부터 공급받아 유지 관리되고 있는 특정병원성부재 ICR 마우스를 사용하여 독성시험을 행하였다. 실험에 사용한 동물은 체중 25 ∼ 30 g의 수컷 5 주령이었으며, 온도 22 ±1℃, 습도 55 ±5 %, 조명 12L/12D의 동물실내에서 유지되었다. 시료의 투여는 각 처리구당 10 마리씩, 체중 20 g당 균주배양액 0.2 ㎖를 경구 투여하였으며, 대조군에는 0.85 % 식염수(saline)를 처리하였다. 균주 배양액을 투여한 후 일반증상의 변화, 체중의 변화, 사망동물의 유무, 투여 10 일째 동물을 치사시켜 해부학적으로 내부 장기를 검사한 결과는 다음 표 6과 같다. 급성경구독성의 경우 KCTC 0766BP 균주의 배양액을 투영한 결과 시험기간 중 치사동물은 없었으며, 부검 시 특별한 병변 육안 소견이 나타나지 않았고, 모든 처리구에서 정상적인 체중의 증가가 관찰되었으므로 독성을 나타내지 않는 것으로 판단되었다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP가 생산하는 배양액을 사용하여 수중에 분산되어 있는 미세조류를 효과적으로 응집 침전시켜 수확하며, 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP의 배양액은 생쥐생체검정(mouse bioassay) 결과 무독성으로 판명되어 수산양식용으로 사용되는 클로렐라 응집에 첨가하여도 무해한 것으로 판정되어 산업적으로 유용한 효과가 있는 것이다.

Claims (5)

1. 미세조류 응집제를 생산하는 것임을 특징으로 하는 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP.
2. 수중에 분산된 미세조류를 수확하는 방법에 있어서,

   패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa) KCTC 0766BP의 배양액을 미세조류 응집제로 사용하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 수확방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 미세조류가 클로렐라(Chlorella)인 것을 특징으로 하는 미세조류의 수확방법.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 균주 배양액에는 보조응집제로서 Ca²⁺, Mg²⁺및 Fe³⁺중에서 선택된 이온이 함유되는 것을 특징으로 하는 미세조류의 수확방법.
5. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 균주 배양액은 pH 7 ∼ 11 범위를 유지하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 수확방법.