KR100346639B1 - 피타아제 ｂ 유전자 발현용 재조합 효모 및 이로부터얻은 재조합 피타아제 ｂ 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피타아제 B 유전자 발현용 재조합 효모 및 이로부터 얻어진 피타아제 B 효소에 관한 것으로 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 분리한 피타아제 B 단백질을 암호화하는 신규한 유전자에 의해 형질전환된 재조합 효모는 사료 첨가제로 유용한 피타아제 B 효소를 대량 발현하는 효과가 있으며 특히 재조합 피타아제 B 효소는 열안정성과 내산성이 우수하여 사료 제조공정 중 뜨거운 열에도 활성을 유지하며 이 사료를 가축에 섭취시켰을 경우에 위내의 낮은 산도하에서도 활성을 최대로 유지하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

피타아제 Ｂ 유전자 발현용 재조합 효모 및 이로부터 얻은 재조합 피타아제 Ｂ 효소{Recombinant yeast for expressing phytase B gene and the recombinant phytase B obtainable therefrom}

본 발명은 피타아제 B 유전자 발현용 재조합 효모 및 이로부터 얻어진 피타아제 B 효소에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 분리한 피타아제 B 효소 유전자로 재조합한 효모와 이 재조합 효모를 배양하여 얻은 내산성 및 열안정성이 우수한 재조합 피타아제 B 효소 단백질에 관한 것이다.

피타아제(Phytase; myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase, EC 3.1.3.8)는 식물, 미생물, 진균등에 존재하며 식물의 중요한 유기인산 저장 화합물인 파이트산(phytic acid)(myo-inositol hexaphosphoric acid)를 가수분해하여 미요-이노시톨(myo-inositol)과 자유 오르토-포스포르산(free ortho-phosphoric acid)을 생산하는 효소이다(Reddy et al,1982). 이와 같은 피타아제는 사료첨가제로 사용시 사료내 유기태인의 이용성을 60% 이상 증가시키고, 무기질의 체내흡수를 증가시킬 뿐 아니라 단백질 이용률 및 소화흡수율 증진효과를 나타내어 사료의 영양가치 증진에 필수적이다(Denbow, 1995). 또한, 사육 가축의 골 성장(bonemineralization)을 건실화 할 수 있을 뿐 아니라 기타 칼슘과 아연 등 필수 무기염류의 흡수율을 향상시키는 부가적 기능도 가지고 있다(Harper et al., 1997). 이에 따라 최근에는 미생물에서 분리하여 상업적으로 대량생산한 피타아제(예; NatuphosR)를 첨가함으로써 사료에 첨가하는 무기인의 함량을 줄이고, 또한 이를 섭취한 가축의 배설물에서의 분비되는 유기인의 양을 감소 시키고 있다(Yi et al, 1996). 그러나, 현재 세계적으로 판매되고 있는 피타아제는 pH에 불안정하여 실제 단위동물에 투여하여도 위(stomach)를 통과할 때 낮은 pH 때문에 대부분 활성을 잃어버린다(Ullah et al, 1988). 더우기 열안정성이 낮아(최대 70℃) 사료 제조공정 중, 특히 전체사료의 절반을 차지하는 펠렛(pellet) 제조시 실활되어 현재로서는 펠렛 사료에는 첨가되지 못하고 가루사료에만 첨가되고 있는 실정이다. 이를 해결하기 위하여 캡슐레이션(capsulation) 방법 등이 이용되고 있으나 제조원가 부담 등으로 인하여 실용화되지 못하고 있다.

따라서 본 발명자들은 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 신규한 피타아제 B 효소의 유전자를 분리한 후 이 유전자로 효모를 재조합하여 열안정성 및 내산성이 뛰어난 신규한 피타아제 B를 대량 발현시키는 재조합 효모를 개발하고 이로부터 피타아제 B를 대량 생산하여 기능성 사료첨가제로 사용함으로서 본 발명을 완성하였으며 상기와 같이 사료에 첨가한 피타아제 B는 미생물에 의해 지속적으로 피타아제의 발현효과를 동물의 생체내에서 나타내어 그 효과면에서도 우수하며, 공정상의 원가감소요인을 고려할 때 현재 4,000원/kg 정도의 고가의 피타아제를 2,000원/kg 이하의 가격으로 축산농가에 공급할 수 있어 우리 축산농가의 부담도 덜어줄 수 있다.

본 발명의 목적은 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 신규한 피타아제 B 효소 유전자를 분리하여 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 피타아제 B 효소 유전자가 삽입된 피타아제 발현벡터를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 피타아제 B 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 재조합 효모를 배양하여 얻은 내산성 및 열안정성이 우수한 재조합 피타아제 B 효소를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 피타아제 B 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하고 이 유전자가 유전자 은행에 등록된 피타아제 B 효소와 유사성을 비교하여 신규한 유전자임을 확인한 후 프로모터만 다른 2종류의 효모용 단백질 발현벡터에 각각 삽입하여 피타아제 B 발현벡터 2종을 각각 제조하고 숙주 효모에 상기 2종의 발현벡터를 각각 도입하여 형질전환시킨 후 이 재조합 효모를 배양하여 피타아제 B 단백질을 발현시키고 발현된 피타아제 B 단백질의 효소활성, 단백질 성질, 최적 pH 및 pH 내성을 분석하므로써 달성하였다.

이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 아스퍼질러스 피쿰 ATCC 16882(Aspergillus ficuumATCC16882) 유래의 피타아제 B 유전자를 PCR로 증폭한 후 아가로스겔에서 전기영동한 사진도이다.

도 2는 아스퍼질러스 피쿰 ATCC 16882(Aspergillus ficuumATCC16882) 유래의 피타아제 B 유전자의 염기서열을 나타낸다.

도 3는 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882(Aspergillus ficuumATCC16882)에서 분리한 피타아제 B 유전자의 아미노산 서열을 기존의 피타아제 효소의 아미노산 서열과 비교한 결과를 나타낸다.

도 4은 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882(Aspergillus ficuumATCC16882)에서 분리한 피타아제 B 유전자를 2종류의 효모용 단백질 발현벡터에 재조합한 벡터모식도이다.

도 5는 재조합 효모에서 프로모터[GAL과 hybrid(ADHII+GPD]별로 배양시간에 따른 피타아제 B 단백질의 발현양상을 나타낸 그래프이다.

도 6는 GAL 프로모터를 사용한 재조합 효모에서 발현된 피타아제 B 단백질의반응 최적온도 및 열에 대한 내성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 GAL 프로모터를 사용한 재조합 효모에서 발현된 피타아제 B 단백질의 반응 최적 pH 및 pH 내성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882(Aspergillus ficuumATCC16882)로부터 피타아제B 단백질을 암호화하는 유전자를 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase chain reaction)을 이용하여 분리하고 분리한 유전자의 염기서열을 유전자 은행에 등록된 피타아제 B L20567의 염기서열과 비교하여 피타아제 B를 암호화하는 신규한 유전자임을 확인하는 단계; 프로모터만 다른 2종의 효모용 단백질 발현벡터에 상기 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 분리한 신규한 피타아제 B 유전자를 삽입하여 피타아제B 발현벡터 2종을 각각 제조하는 단계; 숙주효모에 상기 발현벡터를 도입하여 형질전환된 재조합 효모를 선발하는 단계; 선발한 재조합 효모를 배양하여 배양액에 존재하는 피타아제 B 활성을 분석하는 단계; 상기 재조합 효모에서 발현되는 피타아제 단백질 활성의 최적 온도, 최적 pH 및 온도와 pH의 내성을 분석하는 단계로 이루어진다.

본 발명에서 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882(Aspergillus ficuumATCC16882)로부터 피타아제 B 단백질을 암호화하는 유전자를 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase chain reaction)을 이용하여 분리하였고 분리한 유전자의 전체 염기서열을 결정한 후 기존 유전자의 염기서열(L20567)과 유사성을 비교한 결과 총 480개의 아미노산중 14개의 아미노산이 다른 피타아제 B를 암호화하는 유전자임을 확인하였다. 이렇게 분리, 확인을 거친 피타아제 B 유전자를 프로모터만 다른 2종류의 효모용 단백질 발현벡터 YEpAG-TER, YEpGAL-TER에 삽입하여 피타아제 B 발현벡터 2종 pYEAG-phyB, pYEG1-phyB을 각각 제조하였다. 각 벡터에는 피타아제 B 자체의 분비신호(signal peptide)가 포함되어 있어서 발현되는 재조합 단백질이 효모의 세포 밖으로 분비될 것이다. 상기 제조한 발현벡터를 알카리 양이온(Alkali Cation)방법을 사용하여 ura- 인 숙주효모(Saccharomyces cerevisiae Y2805)에 형질전환하여 재조합 효모를 선발하였고 선발한 재조합 효모들은 일단 YPD 배지에서 배양하여 배양액에 존재하는 피타아제 B의 활성을 분석하였다. 피타아제 B의 활성은 pH2.5인 0.1 M 아세테이트 버퍼(acetate buffer) 350 ㎕에 배양액 50 ㎕와 100 mM Na-phytate 4 ㎕를 섞고 58℃에서 30분간 반응한 뒤 800 ㎕의 AAM 용액 및 80 ㎕의 1 M 시트르산(citric acid)과 차례로 섞어 405 nm에서의 흡광도를 측정함으로서 결정하였다. 이 때 표준으로는 KH₂PO₄를 사용하여 피타아제 B의 활성을 정량하였다. 결과적으로 GAL 프로모터의 경우 배양 후 1일에 피타아제 B의 역가가 관찰되기 시작하여 4일까지 역가가 지속됨을 알 수 있었다. 또 발현된 피타아제 B 단백질의 최적 반응온도는 60℃, 최적 pH는 2.5이었고, 20 ~ 60℃에서 15분 처리 후에도 거의 역가의 손실이 없었으며, 80℃에서 15분 처리 후에도 50℃역가의 45% 이상을 유지하였다. 또한 pH 1.5~8.5에서 20시간 방치한 후에 역가를 측정한 결과 pH 8.5에서 단백질이 가장 안정하였고 pH 2.5 이상인 경우 역가를 70% 이상 유지하는 등 높은 열안정성과 내산성을 나타내었다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 효모 제작

제 1단계; RT-PCR을 이용한 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882(Aspergillus ficuumATCC16882)로부터 피타아제B 유전자 분리

공시균주인 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882(Aspergillus ficuumATCC16882)에서 피타아제B 유전자를 분리하기 위하여, 먼저 전체 RNA를 분리한 후 첫 번째 가닥 cDNA(first-strand cDNA)를 합성하기 위하여 앞서 분리한 전체 RNA 3 ㎍을 65℃에서 10분간 두었다가 얼음물에 식혔다. 여기에 10 × PCR 버퍼 II 2 ㎕, 25mM MgCl₂4 ㎕, dGTP, dATP, dCTP, dTTP 각각을 2 ㎕, RNase 저해제(Inhibitor) 1 ㎕, 역전사 효소(Reverse transcriptase) 1㎕, 올리고(Oligo) dT 1㎕ , DEPC 처리된 물 2 ㎕을 넣고 42℃에서 1시간 30분 동안 반응시킨 후 95℃에서 5분간 반응시켰다. 이렇게 합성한 첫 번째 가닥 cDNA(first-strand cDNA) 5 ㎕에 10 × PCR 버퍼 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 2 ㎕, 5'-, 3'-프라이머(20μM) 각 1 ㎕, 25mM MgCl₂4㎕, Taq polymerase (Takara) 2.5 U, dH₂O 31.5㎕를 넣고, 94℃, 5분, (94℃, 30초-50℃, 30초-72℃, 1분 30초) × 30 cycles, 72℃, 7분의 PCR을 수행하였다. 이를 1% 아가로스젤에서 전기영동시킨 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 약 1.6 kbp에 해당하는 DNA band를 관찰할 수 있었다. 이 밴드는 예상한 PCR 산물의 크기와 일치하며, 이를 다시 pGEM-T Easy (Promega Co.) 벡터(vector)에 라이게이션(ligation)하여 서열목록 1에 나타낸 바와 같이 전체 염기서열을 결정하여(도 2) 기존의 염기서열(L20567)과 유사성을 비교한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 피타아제 B 단백질을 암호화하는 1603 염기서열중 104개의 염기서열에서 차이를 나타내었고, 그 결과 480개의 아미노산중 14개의 아미노산이 다른 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882(Aspergillus ficuumATCC16882)의 피타아제B 단백질을 암호화하는 유전자임을 알 수 있었다.

제 2단계: 피타아제 B 효소 단백질의 효모에서의 발현을 위한 피타아제 발현벡터 제조

상기 1단계에서 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 분리한 피타아제 B 유전자를 생균제로 이용이 가능한 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현시키기 위하여 2 종류의 효모 형질전환용 유전자 운반체YEpAG-TER, YEpGAL-TER에 삽입하였다. 이를 위해 먼저 제한효소SalI 과XbaI으로 자른다음, T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 역시 제한효소SalI과XbaI으로 절단한 벡터에 접합시켜서 2종류의 피타아제 B 발현벡터(pYEAG-phyB, pYEG1-phyB)를 만들었다. 이를 도 4에 나타냈다.

제 3단계: 피타아제B 발현 재조합 벡터의 효모 사카로마아세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae )로의 도입

아가플레이트의 단일 효모 콜로니를 5 mL YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 펩톤 20 g/L, 덱스트로스 20 g/L)에 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 이 배양액 50 ㎕를 50 mL YPD 배지에 접종하고 30℃에서 16시간 진탕배양하였다. 이를 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체만 회수한 뒤 50 mL 멸균수로 1회 세척한 다음 균체를 500㎕ LiDTT(100 mM 리튬 아세테이트(Lithium Acetate), 1 × TE,25mM DTT)로 잘 섞어 준 후 30℃에서 40분간 배양하였다. 이를 100㎕ 취하여 DNA 1㎍과 연어 정자(Salmon sperm) DNA 40㎍와 잘 섞어준 다음 다시 30℃에서 40분간 배양하였다. 배양한 균체에 700㎕ LiPEG(40% PEG, 100mM 리튬 아세테이트, 1 × TE)를 넣어 잘 섞은 후 30℃에서 40분간 배양한 다음, 42℃에서 5분간 열충격(heat shock)을 주고 4mL YPD 배지를 넣어 30℃에서 2시간 배양한다. 이를 1300 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체만 회수한 뒤 5mL 멸균수로 1회 세척하고, 5mL TE(pH7.5)에 잘 섞은 후 멸균 URA 플레이트(YNB w/o aa 6.7 g/L, casamino acid 5 g/L, dextrose 20 g/L, adenine 0.03 g/L, 트립톤 0.03 g/L, agar 20 g/L)에 도말하여 30℃에서 48시간 배양하였다.

본 발명에서 두 종류의 발현벡터에 의해 형질전환된 두 종류의 재조합 효모중 pYEAG-phyB로 형질전환된 재조합 효모 TSB01을 한국종균협회에 KFCC-11092로 기탁하였다.

실시예 2: 피타아제 효소 활성분석

상기 실시예 1에서 두 종류의 피타아제 B 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모에서 발현되는 피타아제 B의 배양시간에 따른 변화를 알아보기 위하여, 형질전환된 재조합 효모의 단일 콜로니를 5 mL URA 배지{YNB w/o aa 6.7 g/L, 카사미노산(casamino acid) 5 g/L, 덱스트로스(dextrose) 20 g/L, 아데닌(adenine) 0.03 g/L, 트립톤(tryptone) 0.03 g/L}에 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 여기서 얻은 1.0 × 10⁷개의 효모를 pYEG1-phyB 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 효모는 40mL YPG 배지{효모 추출물(Yeast extract) 10 g/L, 펩톤(peptone) 20 g/L, 갈락토오스(galactose) 10 g/L}에 접종하고 30℃에서 진탕배양하고, pYEAG-phyB 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모는 YPD에 접종하고 30℃에서 진탕배양하였다. 그리고 접종 1일 후부터 24시간 간격으로 1 mL씩 취하여 6,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 상징액의 피타아제 B 역가를 분석하였다. 실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 피타아제 B의 역가는 pYEG1-phyB벡터에서 1.4 unit (μmol Pi/mL/min), pYEAG-phyB벡터에서 0.7 unit (μmol Pi/mL/min) 정도 관찰되었고, 배양 1일 후에는 최대 역가의 30%, 2일 후에는 최대 역가의 80 ~ 90% 이상이 발현됨을 알 수 있었다. 또한 배양 후 3일까지는 역가가 조금씩 증가하였으나 4일째는 약간 감소하였다.

실시예 3: 재조합 효모에서 발현되는 피타아제 B 단백질의 최적온도 및 온도내성 분석

피타아제 B 발현벡터 2종 중 하나인 pYEG1-phyB로 형질전환된 재조합 효모에서 발현된 피타아제 B 단백질의 반응최적온도 및 열에 대한 내성을 분석하기 위한 실험을 실시하였다. 먼저 pYEG1-phyB로 형질전환된 재조합 효모의 단일 콜로니를 5 mL YPG 배지에 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 이 배양액 0.5 mL을 50 mL YPG 배지에 접종하고 30℃에서 39시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상징액을 취하였다. 이를 50㎕를 취하여 0.2 M 글리신-HCl 버퍼(glycine-HCl buffer)/pH 2.5 350 ㎕와 100 mM Na-피테이트 4 ㎕를 섞고 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액 100 ㎕에 AAM(10 mM ammonium molybdate : 5 N 황산 : 아세톤 = 1 : 1 : 2) 800 ㎕를 잘 섞고, 다시 1 M 시트르산 80 ㎕를 잘 섞어준 뒤 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 재조합 효모에서 발현된 피타아제 B 단백질의 반응최적 온도는 50~60℃임을 알 수 있었다. 열안정성의 경우, 상기한 최적온도와 동일하게 재조합 효모를 배양한 후, 배양액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상징액을 취하였다. 이를 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80℃에서 15분간 방치후, 50 ㎕를 취하여 0.2 M 글리신-HCl 버퍼(glycine-HCl buffer)/pH 2.5 350 ㎕와 100 mM Na-피테이트 4 ㎕를 섞고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액 100 ㎕에 AAM 800 ㎕를 잘 섞고, 다시 1 M 시트르산 80 ㎕를 잘 섞어준 뒤 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 역시 도 6에 나타낸 바와 같이 50℃가 가장 활성이 높았고, 20~60℃에서 50℃ 활성의 95% 이상을 유지하였으며 80℃에서의 활성은 50℃의 45% 수준이었다. 이로서 재조합 효모에서 발현되는 피타아제 B는 80℃에서도 45% 이상의 역가를 안정하게 유지하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 재조합 효모에서 발현되는 피타아제 단백질의 최적 pH 및 pH 내성 분석

피타아제 B 발현벡터 2종 중 하나인 pYEG1-phyB로 형질전환된 재조합 효모에서 발현된 피타아제 B 단백질의 최적 pH 및 pH에 대한 내성을 분석하기 위한 실험을 아래와 같이 실시하였다. 먼저 pYEAG-phyB로 형질전환된 재조합 효모의 단일 콜로니를 5 mL YPD 배지에 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 이 배양액 5 mL을 50 mL YPD 배지에 접종하고 30℃에서 30시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상징액을 취하였다. 이 상징액 50 ㎕를 pH 1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5의 버퍼(buffer) 각각 350 ㎕, 100 mM Na-피테이트 4 ㎕와 잘 섞은 다음 58℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액 100 ㎕에 AAM 800 ㎕를 잘 섞고, 다시 1 M 시트르산 80 ㎕를 잘 섞어준 뒤 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 pH 2.5에서 가장 활성이 높아 최적 pH가 2.5 임을 알 수 있었다. pH 내성의 경우, 상기와 동일하게 배양한 배양액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상징액을 취하였다. 이를 50㎕를 취하여 pH 1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5의 buffer 각각 200 ㎕와 잘 섞어 37℃에서 20시간 방치 후, 이 중 50㎕를 취하여 pH 2.5 버퍼 350 ㎕, 100 mM Na-phytate 4 ㎕를 섞고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액 100 ㎕에 AAM 800 ㎕를 잘 섞고, 다시 1 M 시트르산(citric acid) 80 ㎕를 잘 섞어준 뒤 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 pH 8.5에 방치해둔 것이 가장 안정하였고, 최적반응 pH인 2.5에 방치해둔 것은 pH 8.5에 방치해둔 것에 비해 약 78%의 역가를 나타내었다. pH 1.5의 경우 45% 정도 감소했으나 pH 2.5 이상에서는 약 75% 이상의 역가를 유지하고 있었다. 따라서 재조합 피타아제 B 단백질은 강산성에서 약알칼리성에 이르는 광범위한 pH에서 역가가 안정되게 보존됨을 알수 있었다.

이상, 실시예에서 설명한 바와 같이 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 분리한 피타아제 B 단백질을 암호화하는 신규한 유전자에 의해 형질전환된 재조합 효모는 사료 첨가제로 유용한 피타아제 B 효소를 대량 발현하는 효과가 있으며 특히 발현된 재조합 피타아제 B 효소는 열안정성과 내산성이 우수하여 사료 제조공정 중 뜨거운 열에도 활성을 유지하며 이 사료를 가축에 섭취시켰을 경우에 위내의 낮은 산도하에서도 활성을 최대로 유지하는 뛰어난 효과가 있으므로 가축사료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

1. 서열목록 1에 기재한 바와 같은 유전자 염기서열을 갖으며 아스퍼질러스 피쿰 ATCC16882로부터 분리한 피타아제 B 효소를 암호화하는 유전자.
2. 제 1항 기재의 피타아제 B 효소를 암호화하는 유전자를 효모 형질전환용 벡터인 YEpAG-TER에 도입하여 된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 pYEAG-phyB.
3. 제 1항 기재의 피타아제 B 효소를 암호화하는 유전자를 효모 형질전환용 벡터인 YEpGAL-TER에 도입하여 된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 pYEG1-phyB.
4. 제 2항 기재의 재조합 벡터 pYEAG-phyB를 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에 도입하여 형질전환시킨 재조합 효모 TSB01(KFCC 11092).
5. 아스퍼질러스 피쿰(Aspergillus fiuum)으로부터 유래하고, 서열목록 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 하기와 같은 효소 특성을 갖는 피타아제 B 효소.

   최적 pH : 2.5

   최적반응온도 : 50∼60℃

   열안정성 : 20∼60℃에서 15분 처리후에도 역가의 손실이 거의 없으며, 80℃에서 15분 처리 후에도 50℃역가의 45%를 유지함.
6. 제 5항 기재의 피타아제 B 효소를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 효소사료첨가제용 조성물.
7. 제 4항 기재의 재조합 효모 TSB01(KFCC 11092)을 배양하는 것을 포함하는 피타아제 B 효소의 제조방법.