KR100306000B1 - 산화되고고리열린당화물에의한헤모글로빈의선택적인가교결합 - Google Patents

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메그닌 안토니에이.
헤모솔 인코포레이티드
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Abstract

혈액 대용액의 주성분을 형성하는 헤모글로빈은 라피노오스같은 디/트리-당화물의 고리 열림 산화에 의해 생성된 폴리알데히드와의 반응에 의해 헤모글로빈을 가교결합시킴으로써 변형되며, 이때, o-당화물 용액이 pH 약 5.0-7.0에서 유지되며 상기 반응은 헤모글로빈 4합체에 대한 디/트리-당화물의 몰비를 기준으로 하여 약 1:1 내지 4:1의 계산량으로 이루어지며, 이어서 그것들을 안정화시키기 위하여 상기와 같이 형성된 시프 염기 결합을 적절히 환원시킨다. 디/트리-당화물의 고리 열림에 있어서 pH의 주의깊은 제어는 원하지 않는 부산물 없이 폴리알데히드의 균일한 생성을 보장하며 또한 특정 계산량으로 헤모글로빈과 이 생성물을 반응시킴으로써 소정의 조성 및 이로운 성질을 가진 안정된 4합체의 헤모글로빈 및 소중합체가 소수율로 얻어진다.

Description

[발명의 명칭]
산화되고 고리 열린 당화물에 의한 헤모글로빈의 선택적인 가교결합
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 혈액 대용액 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 헤모글로빈에 기초한 혈액 대용액, 및 혈액 대용액의 주성분으로서 이용하는데 적합성을 향상시키기 위한 헤모글로빈의 화학적 변형 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
혈액의 원래의 산소 운반체 성분으로서 헤모글로빈은 혈액 대용액, 즉 수용액으로서의 주성분을 형성하는 명백한 후보다. 혈액대용액으로서 작용하는 만족스런 헤모글로빈 용액을 제공하기 위한 시도에 있어서 넓은 과학적 연구가 행해졌으며 또한 보고되었다. 그러나 적혈구 밖의 헤모글로빈의 화학적 성질은 적혈구 내의 화학적 성질, 즉 산호 친화력에 관해서는 현저하게 다르다. 혈액 대용액으로서 이용하는데 적합하도록 하기 위하여 헤모글로빈의 몇가지 형태의 화학적 변형에 대한 필요성이 인식된지 오래이며 또한 아주 넓게 연구되어 왔다.
헤모글로빈은 4개의 기본구성단위(subunit), 즉 글로빈(globin) 펩티드 사슬을 각각 가지는 2개의 α 기본구성단위와 글로빈 펩티드 사슬을 각각 가지는 두개의 β 기본구성단위의 4합체를 포함하는 것으로 잘 알려져 있다. 4합체는 대략 64킬로돌턴(kilodaton)의 분자량을 가지며, 또한 각각의 기본구성단위는 대략 같은 분자량을 가진다. 묽은 수용액에서 4합체의 헤모글로빈은 즉시 α-β 2합체로 해리되며, 몇몇 조건하에서는 α 기본구성단위 단량체와 β 기본구성단위 단량체로까지 해리된다. 2합체와 단량체는 신체의 순환 시스템에서 유지하기에는 너무 작은 분자량을 가지며, 또한 소변으로 배설하는 신장에 의해서 여과된다. 이는 신체에서 이러한 생성물의 반감기가 허용될 수 없이 짧은 것으로 나타난다. 게다가 가교되지 않은 헤모글로빈은 심각한 신장 독성을 유발시키는데, 이 때문에 생성물에서 가교되지 않은 헤모글로빈의 농도를 최소화할 필요가 있다. 4합체의 형태를 확실하게 유지하기 위하여 기본구성단위 사이의 화학 결합(“분자내의 가교결합”)에 대한 필요성은 이전에 인식되었다. 또한 64킬로돌턴보다 더 큰 분자량의 헤모글로빈 소중합체(oligomer) 및 중합체를 형성하기 위하여 둘 혹은 그 이상의 4합체 단위의 상호 결합(“분자간의 가교결합”)은 많은 경우에 바람직한 것으로 인식되었다.
적혈구내에 존재할 때, 헤모글로빈은 헤모글로빈 분자에서 특별한 자리에 있는 DPG 클레프트(cleft) 혹은 파킷(pocket)으로 알려진 자연리간드 디포스포글리세레이트(diphosphoglycerate)(DPG)와 결합되어 있다. 적혈구 세포막이 제거될 때 DPG는 결과적으로 헤모글로빈 분자의 입체 재배열 및 헤모글로빈의 산호 친화력에 바람직하지 않은 증가를 수반하면서 헤모글로빈으로부터 해리된다. 헤모글로빈에 기초한 만족스런 혈액 대용액은 원래의 전 혈액에 존재하는 헤모글로빈과 거의 같은 방법 및 같은 조건하에서 산소와 결합하고, 산소를 운반하고, 해리시킬 수 있어야만 한다. 이 문제는 과거에는 피리독살-5´-포스페이트(pyridoxal-5´-phosphate) PLP같은 DPG-유사체를 혈액 대용액의 주성분을 형성하기 위하여 헤모글로빈에 공유결합시키는데 역점이 주어졌다.
[종래 기술에 대한 간단한 고찰]
1989년 8월 15일에 등록된 미국 특허 제4,857,636호 시아(Hsia)는 화학적으로 변형된 헤모글로빈에 기초한 혈액 대용액을 개시하고 있는데, 상기 특허에서는 헤모글로빈이 폴리알데히드와의 반응에 의해 분자내에서 가교결합된다. 시아 특허에서 이용이 추천된 특정한 폴리알데히드는 라피노오스(raffinose), 3당류같은 당화물의 고리 열림 산화반응의 생성물이다. 상기 반응은 합성된 4합체의 산소 친화력에 대한 제어를 위해 T-배열 혹은 R-배열에서 4합체 헤모글로빈을 안정시키기 위하여 기본구성단위의 글로빈 사슬 상호간에 비영역(non-site) 특이적 가교결합에 의해 헤모글로빈 기본구성단위를 4합체에 결합시키는 것이다. 상기 반응은 또한 안정된 4합체와 함께 소정의 양만큼 분자 상호간 가교결합에 의해 헤모글로빈의 소중합체를 형성하도록 제어할 수 있다고 한다. 시아 특허에 따른 글로빈 사슬의 비영역 특이적 가교결합은 계산량 만큼의 반응물이 보통 요구되는 영역(site) 특이적 가교결합에 반하여 가교결합되고 안정화된 헤모글로빈의 향상된 수율을 위해 폴리알데히드를 아주 과량 사용할 수 있다는 점에서 잇점이 있는 것으로 가르쳐진다.
그러나 시아 특허에서 개시된 방법 및 생성물의 추가 연구 및 조사결과는, 몇몇 반응 조건 및 다른 요소의 변화에 의해, 방법의 제어와 재현성 및 최종 생성물의 균일성과 성질에서 예상되지 않은 개선이 얻어질 수 있다는 것으로 밝혀졌다. 살아있는 동물에 투여하려고 하는 혈액 대용액같은 생성물은 제어 및 재현할 수 있는 조성의 성분을 가져야 하며 이에 따라 생성물의 효과 및 부작용이 적절하게 모니터링될 수 있다.
[발명의 개요]
본 발명의 목적은 헤모글로빈에 기초한 혈액 대용액의 새로운 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 헤모글로빈과 당화물의 산화적 고리 열림 반응으로부터 유도된 폴리알데히드의 반응의 개선된 방법 및 조건을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은, 디/트리-당화물(이 말은 2당류 및 3당류를 표시하기 위하여 여기에서 사용됨)의 산화적 고리 열림 반응의 폴리알데히드 생성물이 헤모글로빈의 2,3-디포스포글리세레이트 결합(DPG) 클레프트에 있는 특정 영역과 반응함에 있어 매우 특이적이어서, 만약 폴리알데히드 그 자체가 실질적으로 동질성(homogeneous)이라면, 거기의 두개의 β-글로빈 사슬을 가교결합시킨다는 발견을 어느 정도 기초로 하고 있다. 고리-열리고, 산화된 디/트리-당화물은 알칼리성 조건하에서 가수분해를 겪는다. 예를 들어 pH〉7에서 저장된 고리-열리고, 산화된 라피노오스(o-라피노오스)의 용액은 산화된 3당류와 혼합시 심각한 알칼리성 가수분해를 통해 산화된 이당류(즉, o-자당) 및 산화된 단당류(즉, o-갈락토스)를 제공한다. o-라피노스 용액의 안정성은 저장용액을 pH〈7, 바람직하게는 pH〈6으로 유지하는 것에 의해 달성된다.
그러나 본 발명의 방법은 pH 5.0 내지 7.0에서 라피노오스같은 고리-열리고, 산화된 디/트리-당화물 용액의 pH를 유지함으로써 실질적으로 동질의 폴리알데히드를 제조한다. 이 생성물이 약 1:1 내지 4:1의 게산량(헤모글로빈의 4합체에 대한 디/트리 당화물의 몰에 기초하여)으로 헤모글로빈과 반응될 수 있어 고수율의 가교결합되고, 안정화된 헤모글로빈 생성물이 얻어진다. 고수율의 생성물을 얻는데 있어 전술된 시아 특허에서 추천된 20:1 정도의 매우 큰 초과량의 가교결합 반응제는 불필요한 것으로 드러났다. 게다가 가교결합 반응물을 이와 같이 큰 초과량을 이용할 때 나타나는 부작용, 즉 결과로 나오는 가교결합된 생성물인 조성물의 성질의 제어 및 재현성의 부족은 대부분 피해진다. 고분자량 집합체의 형성은 가교결합 반응물의 한계된 계산양을 이용함으로써 피해진다.
따라서 본 발명의 한 측면에 따르면 수용액 형태의 혈액 대용액으로서 이용하는데 더욱 적합하게 하기 위하여 헤모글로빈을 화학적으로 변형시키는 방법이 제공되는데, 이는 다음을 포함한다:
(a) 디/트리-당화물을 산화적 고리 열림 반응시켜 이로부터 폴리알데히드를 생성하는 단계;
(b) 상기와 같이 형성된 폴리알레히드의 어떠한 실질적인 가수분해도 방지하기 위하여 상기 결과의 생성물 용액의 pH를 약 pH 5.0 내지 pH 7.0 범위 내의 값으로 조절 및 유지하는 단계;
(c) 2당류와 헤모글로빈 4합체를 기준으로 하여 약 1:1 내지 4:1의 계산 비율로, 용액에서 (b) 단계의 생성물을 헤모글로빈과 반응시키는 단계;
(d) 상기와 같이 형성된 시프염기(Schiff base) 결합을 2차 아민 결합으로 환원시키는 단계; 및
(e) 상기와 같이 형성된 변형된 헤모글로빈을 회수하는 단계.
본 발명의 이용에 의하여 얻을 수 있는 가교결합된 생성물의 성질 및 조성은 제어 및 재현할 수 있을 뿐만 아니라 잇점도 있다. 생성물은 변형되지 않은 헤모글로빈을 거의 포함하지 않으며, 또한 있다하더라도 필요하다면 투석여과(diafiltration)에 의해서 쉽게 제거될 수 있다. 그것은 고분자량(600,000돌턴보다 더 큰) 헤모글로빈 집합체가 없다. 그것은 필수적으로 약 40%의 4합체 헤모글로빈, 5% 이내의 2합체 헤모글로빈, 및 나머지 64,000과 500,000 사이의 분자량을 가진 소중합체로 이루어진다.
이전에는 메트헤모글로빈(methemoglobin)의 과도한 형성에 대한 두려움 때문에 pH 7.4 밑에서의 헤모글로빈의 가교결합을 피하는 것이 필요하다고 생각되었다. 본 발명에 있어서 추가의 예상되지 않은 이로운 특징은, 여기에서 개시된 가교결합 반응제와 있을 때, 헤모글로빈 가교결합 반응이 메트헤모글로빈의 과도한 형성 없이 pH 5.0 - 7.0 범위 내에서 이루어질 수 있다는 것이다. 이것은 물론 o-당화물(폴리알데히드)이 안정하게 유지되는 pH 범위 내이며, 이 때문에 가교결합 반응 이전에 pH 조절 등의 추가적인 가공 단계가 피해지는 잇점이 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 라피노오스의 산화적 고리 열림의 화학 반응에 의해 헥사-알데히드를 생성하고, 이어서 아세탈 화합물과 화학적인 평형을 이루는 것에 대한 도식적인 묘사이며;
제2도는 폴리알데히드의 헤모글로빈과의 화학적인 반응 및 이어지는 화학적인 환원 단계의 도식적인 묘사이며;
제3도는 아래에서 기술된 실시예 1의 생성물의 HPLC 분석 커브이며;
제4도는 아래 실시예 3에서 기술된 반응 역학의 도식적인 묘사이며;
제5도는 아래 실시예 4로부터의 변형되지 않은 헤모글로빈의 C4 글로빈 사슬 분석을 나타내는 크로마토그램(chromatogram)인데, 헴(heme), β 사슬 및 α 사슬을 보여주며;
제6도는 제5도와 유사한 크로마토그램인데, 아래 실시예 4로부터의 가교결합된 헤모글로빈의 C4 글로빈 사슬 분석을 도시한다.
[바람직한 실시예의 설명]
본 발명에 있어서 이용하려는 바람직한 디/트리-당화물은 3당류 라피노오스이므로 투명성 때문에 라피노오스의 이용과 특별히 관련하여 본 발명이 더 기술된 것이다. 그러나 이것은 디/트리-당화물의 바람직한 실시예이며 본 발명이 이에만 한정된 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 다른 적절한 3당류는 플란테오스(planteose), 만니노트리오스(manninotrose), 갈락토트리오스(galactotriose), 겐티아노오스(gentianose), 멜레지토오스(melezitose), 오르소-알파-디-갈락토피라노실-(1,6´)-만노비오스(o-alpha-D-galactopyranosyl-(1,6´)-mannobiose), 말토트리오스(maltotriose) 및 셀로트리오스(cellotriose)를 포함한다. 적절한 2당류는 자당(sucrose), 락토오스(alctose), 말토오스(maltose), 이소말토오스(isomaltose), 셀라비오스(cellabiose), 멜리비오스(melibiose), 플란테오비오스(plantebiose), 갈락토비오스(galactobiose), 겐티아비오스(gentiabiose), 투라노오스(turanose) 및 만노비오스(mannobiose)를 포함한다. 본 발명은 특별히 언급된 디/트리-당화물의 이용에만 한정된 것은 아니다.
바람직하게는 상기 라피노오스는 과요드산염, 예를 들어 과요드산나트륨, 과요드산 칼륨같은 강산화제와 용액에서 반응하여 산화에 의해 고리가 열려진다. 이 산화는 매우 낮은 pH에서 일어난다. 반응이 이루어진 후 용액은 적당한 완충작용에 의해 pH 5.0 내지7.0, 바람직하게는 pH 6.0 내지 6.5로 조절된다. 이어서 헤모글로빈과의 반응을 방해 할 수 있는, pH 조절 결과로서 형성된 어떠한 염도 이 단계에서 제거(즉, 결정화, 혼합 베드(bed) 이온 교환, 겔 침투 크로마토그래피, 역삼투 등에 의해서)되는 것이 바람직하다. 인산염 완충제는 효과적이지만 용액에서 잔여 인산염 이온이 이어지는 가교결합 반응을 방해할 수 있기 때문에 피해지는 것이 바람직하다. 결과로 생기는 생성물은 즉시 사용할 수 있도록 바람직하게 약 pH 6.0으로 완충된 수용액 상태로 저장될 수 있다. 적당한 완충제는 pH 6 내지 7 범위로 안충작용을 하는 것들이며, MES(2-[N-모플리노]에탄 설폰산)(2-[N-morpholino]ethane sulphonic acid); BIS-TRIS(비스[2-히드록시에틸]이미노-트리스[히드록시메틸]메탄)(bis[2-hydroxyethyl]imino-tris[hydroxymethyl]methane; ADA(N-[2-아세타미도]-2-이미노이아세트산)(N-[2-acetamido]-2-iminodiacetic acid; ACES(2-[(2-아미노-2-옥시에틸)-아미노]에탄 설폰산)(2-[(2-amino-2-oxoethyl)-amino]ethanesulfonic acid); PIPES(피페라진-N,N´-비스[2-에탄설폰산])(piperazine-N,N´-bis[2-ethanesulfonic acid); MOPSO(3-[N-모폴리노]-2-히드록시프로판 설폰산)(3-[N-morpholino]-2-hydroxypropanesulfonic acid); BIS-TRIS PROPANE(1,3-비스[트리스(히드록시메틸)-메틸아미노]프로판)(1,3-bis[tris(hydroxymethyl)-methylamino]propane); BES(N,N-비스[2-히드록시에틸]-2-아미노에탄 설폰산)(N,N-bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethane sulphonic acid); MOPS(3-[N-모폴리노]프로판설폰산)(3-[N-morpholino]propanesulfonic acid); TES(N-트리스[히드록시메틸]메틸-2-아미노에탄설폰산)(N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonic acid); HEPES(N-[2-히드록시에틸]피페라진-N´-[2-에탄설폰산](N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N´-[2-ethanesulfonic acid]을 포함하며, 가장 바람직하게는 BIS-TRIS 및 BIS-TRIS PROPANE을 포함한다.
라피노오스 반응 용액의 인산염 완충작용은 또한 반응의 효율성의 측면에서 피해지는 것이 가장 좋다. 헤모글로빈과 고리 열린 라피노오스 폴리알데히드 생성물과의 이어지는 가교결합에서 가교결합 반응제는 DPG 결합 영역에서 특이적으로 반응하지만 인산염도 또한 그 영역에서 반응할 것이다. 따라서 인산염의 회피는 종 사이의 반응 경쟁을 피하여 결과로 생성되는 화학 생성물에 대해 더 큰 수율, 더 빠른 반응 및 더 좋은 제어를 가능하게 한다.
이 반응의 화학적인 진행은 첨부된 도면의 제1도에서 도식적으로 설명된다. pH가 적당하게 제어되지 않으면 o-라피노오스가 부분적으로 가수분해 되어 o-자당과 o-갈락토오스의 혼합물, 및 몇몇 조건하에서는 더 작게 산화된 단편(fragment)을 형성한다. 결과로 생기는 디알데히드와 테트라-알데히드의 생성 혼합물은 그것의 비동질성 및 비재현성 측면에서 바람직하지 않은 혼합물일 뿐만 아니라 헤모글로빈에 대해 반응성이 더 적으며, 그 때문에 좋은 수율의 생성물을 얻기 위해서는 더 많은 양의 이용을 필요로 한다. o-자당과 헤모글로빈의 가교결합은 본 발명의 범위내에서 효과적이며 유용하지만, o-라피노오스의 경우에서보다 더 느리게 일어나며 다른 특이성을 가지고 있다.
본 발명의 방법에서 이용하는 헤모글로빈은 바람직하게는 적혈구로부터 추출된 인간의 헤모글로빈이다. 그러나 본 발명은 또한 혈액 대용액의 주성분을 형성하는 동물 헤모글로빈, 특히 소의 헤모글로빈, 양의 헤모글로빈 등같은 다른 종류의 헤모글로빈에도 적용할 수 있다. 인간 환자에게 투여하기 위한 혈액 대용액의 주성분을 형성하기 위하여 인간의 헤모글로빈이 현재 바람직하게 선택된다.
헤모글로빈은 표준의 공지된 기술에 따라서 본 발명에서 이용하기 위하여 회수 및 제조될 수 있다. 그러므로, 원심분리, 여과 등의 표준 기술에 의해서 적혈구를 용혈하고 세포의 부스러기 및 기질은 이로부터 제거된다. 바람직하게는 2 내지 14중량%의 헤모글로빈 농도를 가지고 있는 헤모글로빈 용액이 이용되어 가장 바람직한 조성 및 조합의 성질을 가진 생성물을 얻는다. 최종 생성물에서 유독성을 피하기 위하여 헤모글로빈의 순도는 실용적으로 얻을 수 있는한 매우 높아야 한다. 최종 정제는 크로마토그래피 방법에 의해 적절하게 이루어진다.
헤모글로빈은 디옥시(deoxy)헤모글로빈으로 보통 추정되는 단단한(T) 형태 혹은 보통 옥시(oxy)헤모글로빈으로 추정되는 느슨한(R) 형태로 자연스럽게 존재한다. 디옥시-헤모글로빈의 산소 결합 특성은 더 바람직한 특성인데, 이는 혈액에서 본래의 적혈구 내의 헤모글로빈에 대해 보통 추정되는 구조이기 때문이다. 따라서 디옥시헤모글로빈에 대해 본 발명의 방법, 즉 T-형태에서 헤모글로빈을 안정시키는 역할을 하는 라피노오스의 고리 열림으로부터 유도된 폴리알데히드와의 가교결합 반응을 실행하는 것이 바람직하다. 그러나 어떠한 이유 때문에 R-형태 헤모글로빈으로 출발하는 것을 선택하면, 본 발명에 따른 가교결합 반응은 헤모글로빈을 R-형태로 시종 안정시킨다.
가교제와 반응하기 이전에 헤모글로빈 용액을 공지된 기술에 따라서 질소같은 비-산소부가 가스로 처리함으로써 헤모글로빈의 탈산소화에 의해 디옥시헤모글로빈이 바람직하게 형성된다. 전술한 시아 특허에 기술된 것을 포함하여 몇몇 종래 기술의 방법은 옥시-헤모글로빈의 최종 미량을 제거하기 위하여 디티온산 나트륨같은 환원제를 이용하는 것을 제시한다. 디티온산염 잔기의 존재는 4합체 헤모글로빈 단위의 o-라피노오스-관여된 소중합을 방해하는 것으로 알려졌기 때문에, 상기 기술은 본 발명에서는 바람직하지 않다. 따라서 디옥시헤모글로빈으로의 완전한 전환을 실시하기 위하여 충분히 장기간의 시간 동안 질소 흐름으로 처리 후, 이어 적당한 가스제거를 계속하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 형성된 폴리알데히드 가교결합 반응제와 디옥시헤모글로빈 수용액의 반응은 4 내지 40℃ 범위의 온도에서 2 내지 96시간 동안, 바람직하게는 약 24시간 동안 수용액에서 일어나는 것이 적당하다. 반응 용액은 헥사-알데히드의 가수분해 및 분해의 위험을 피하기 위하여 바람직하게는 비스-트리스 충전 시스템으로 pH 7.5를 초과하지 않게, 바람직하게는 pH 5.0 내지 7.0 범위로 완충된다. 전술된 것처럼 헤모글로빈에 대한 폴리알데히드의 몰비는 헤모글로빈 4합체에 대한 o-라피노오스를 기준으로 하여 1:1 내지 4:1 범위, 바람직하게는 약 2.5:1 내지 3.5:1의 계산양이다. 디옥시헤모글로빈의 농도는 1-15%(w/v), 바람직하게는 5-10%(w/v) 범위가 적당하다.
헤모글로빈과 헥사-알데히드의 반응, 즉 헤모글로빈 사슬상에서 아미노 그룹이 가교결합 반응제의 알데히드 그룹과 반응한 결과로서, 가역의 결합인 시프 염기 결합이 형성된다. 커플링된 생성물은 비가교결합된 헤모글로빈 및 가교결합자(crosslinker)와 효과적으로 평형 관계를 맺는다. 이것은 첨부된 도면의 제2도에 도식적으로 나타나 있다. 이제 이 결합은 혈액 대용액 목적을 위해 헤모글로빈의 가교결합을 완성하기 위하여 안정하고 비가역적인 1차 아민 결합을 환원될 필요가 있다. 환원제는 가교결합 반응의 실질적인 완성 후 반응 혼합물에 부가되는 것이 바람직하다. 예를 들어 전술한 시아 특허같은 종래 기술은 환원제로서 수소화 붕소 나트륨(sodium borohydride)의 이용을 추천하는데 반해, 본 발명의 바람직한 측면에 따라서는 환원제로서 보란 디메틸아민(borane dimethylamine)이 이용된다. 이것은 수소화 붕소 나트륨이 이용될 때 발생하며 공정의 제어 및 일반적인 처리를 어렵게 하는 수소 가스 발생을 피한다는 점에 있어서 종래의 기술보다 상당한 잇점을 가지고 있다. 보란 디메틸아민의 사용은 이 분야에서 상당한 진전이다. 보란-터트-부틸아민(brane-tert-butylamine), 보란 암모니아(borane-ammonia), 보란-디메틸아민(borane-dimethylamine), 보란-트리메틸아민(borane-trimethylamine), 보란 트리에틸아민(borane-triethylamine)을 포함하며 반드시 이에 한정된 것은 아닌 다른 수용성 보란(borane)의 다소 낮은 알킬 아민 환원제 또한 사용될 수 있다. 또 다른 유용하지만 덜 바람직한 환원제는 수소화 시아노 붕소나트륨(sodium cyanoborohydirde)이다.
반응시키지 않은 알데히드 그룹의 가교결합 및 환원 동안 형성된 시프 염기의 환원은 2 내지 25℃의 온도 범위에서 2 내지 26시간의 기간 동안, 바람직하게는 24시간 동안 수용액에서 일어나는 것이 적절하다. 반응 혼합물은 pH 5-8, 바람직하게는 pH 6.5-7.0으로 완충되는 것이 적당하다. 이민과 알데히드 그룹의 합계에 대한 환원제의 몰비는 가교결합을 개시하기 위하여 부가된 알데히드 그룹에 대한 환원제의 계산양을 기준으로 2:1 내지 5:1, 바람직하게는 2.5:1 내지 3.5:1의 범위이다.
디메틸아민 보란으로 환원시킴으로써 가교결합된 생성물의 안정화가 이루어진 후, 저장하기 위하여 헤모글로빈의 방호된 복합체를 형성하기 위하여 생성물은 일산화탄소로 처리되는 것이 적당하다. 반응 온도에서 상기와같이 형성된 반응 용액으로 일산화탄소를 통과시킴으로써 간편하게 일산화탄소로 처리한 후, 혼합물은 잔여 환원제 및 어떠한 다른 반응 잔기를 적절하게 제거하기 위하여 투석여과시키는 것이 바람직하다. 잔여 완충제는 겔 침투 크로마토그래피에 의해서 제거될 수 있다. 필요하다면, 가교결합되지 않은 헤모글로빈 잔기를 제거하기 위하여 염화마그네슘을 첨가하여 가교결합되지 않은 4합체의 헤모글로빈을 해리한 후 잔기의 제거를 위한 투석여과를 실시한다. 그런 다음 결과로 생기는 물질은 이용할 때까지 멸균된 상태로 저장될 수 있는 상태로 된다.
[가장 바람직한, 특정 실시예의 상세한 설명]
본 발명은 아래에서 특정한, 제한하지 않은 실시예의 보고에 의해서 추가 설명될 것이다.
[실시예 1]
[과요드산염으로 산화된 라피노오스의 제조]
아이스 배쓰(bath)에서 4 내지 10℃로 냉각된 라피노오스(76그램, 0.128몰)의 무균수 용액에서(sterile water)(1리터)에서 용액의 고체의 소디움-m-과요드산(181그램)이 소량씩 부가되며 또한 부가의 속도 조절 및 아이스 배쓰에서 냉각에 의해서 온도가 〈15℃로 유지되었다. 소디움-m-과요드산의 최종 부가 후, 산화 반응의 완성을 위해 용액을 10-15℃로 유지하여 2-24시간 동안 교반했다. 그런 다음 용액을 4℃로 냉각시키고 과량의 과요드산염은 아황산 나트륨의 제어된 부가에 의해 중화되었다. 그런 다음 용액의 pH는 10N NaOH(100ml)로 조절되었으며, 고체의 Bis-Tris(20mM의 최종 농도까지)가 부가되어 pH 5.0으로 주의깊에 조절되었다. 용액은 결정화를 유도하기 위하여 4℃에서 16 내지 24시간 동안 저장함으로써 부분적으로 탈염되었으며 또한 산화된 라피노오스를 포함하는 투명한 상등액을 가만히 따라내어 여과하였다. 용액의 최종 pH는 5.9+/-0.1로 주의깊에 조절되었다.
pH 6.0에서 21시간 동안 반응 용액의 저장 후에 취해진 위 방법의 생성물에 대한 HPLC 분석 결과는 제3도에 도시되어 있다. 고리 열린 당화물 생성물, 즉 헥사-알데히드 o-라피노오스와 관련하여 유일한 하나의 피크가 나타남은 주목할 만한 것으로 생성물의 동질성과 알칼리성 가수분해 생성물이 없음을 나타낸다. 크로마토그램에 대한 유일한 다른 중요한 피크는 염과 포름산에 관계하는데, 이는 쉽게 제거할 수 있다.
o-라피노오스는 다음 방법을 이용하는 탈염에 의해서 보다 더 정제될 수 있다;a) 이온 교환 혼합 베드 수지, b) 싸이즈 배제 크로마토그래피 혹은 c) 역삼투.
[실시예 2]
[혼합 베드 이온 교환 크로마토그리피에 의한 o-라피노오스의 정제]
o-라피노오스의 용액(20ml, pH 5.65)에 6N HCl을 한 방울씩 떨어뜨려 그 pH를 1.6까지 조절한 다음, 그 용액을 30ml의 바이오래드 AG 501-8(D) 분석용 혼합 베드 수지(Biorad AG 501-8(D) analytical grade mixed bed resin)를 통과시켰다. 용출액(eluent)을 모아 정제된 샘플을 동결 건조하여 단단한, 흰색 결정성의 생성물을 얻었다.
[실시예 3]
[o-라피노오스에 의한 헤모글로빈의 제어된 가교결합과 이어서 디메틸아민 보란을 이용한 환원을 위한 변형된 방법]
pH 6.5의 50mM Bis-Tris 환충용액 30ml의 정제된 인간의 헤모글로빈(8%w/v)을 용해시킨 용액(30ml)을 가습된 질소 가스 흐름하, 실온에서 대략 4-6시간 동안 일정하게 교반하면서 디옥시헤모글로빈으로 전환시켰다. 가교결합 및 소중합 반응을 개시하기 위하여 고리-열리고, 산환된 라피노오스(112.5 μmoles)를 탈가스하고 부가하였다. 24시간 후 3M 아스테산 나트륨을 최종 농도가 30mM이 되도록 부가한 다음 1.3ml의 탈가스된 물에 용해된 2.25mM의 디메틸아민 보란으로 환원시켰다. 환원 반응은 밤새도록 진행되었다.
반응의 진행은 FPLC에 의해 모니터링되었고, 그 결과는 제4도에 도식적으로 나타나있다. 피크 번호 1은 혼합물에 존재하는 헤모글로빈 2합체의 기본 구성단위(32킬로돌턴)로부터 도출된 것으로 거의 존재하지 않는다. 피크 번호 2는 생성 혼합물의 약 40%를 구성하는 4합체의(64킬로돌턴) 가교결합된 헤모글로빈으로부터 도출된다. 피크 번호 3은 이합체된 헤모글로빈(128킬로돌턴)으로부터 도출되고 피크 번호 4는 평균 분자량인 약 380킬로돌턴의 소중합체 헤모글로빈 단위로부터 도출된다. 생성 혼합물은 600킬로돌턴보다 더 큰 고분자량의 분체를 포함하지 않는 것이 주목할 만하다.
[실시예 4]
[가교결합 단계의 특징성 증명]
가교결합 반응의 진행을 모니터링하기 위하여 o-라피노오스:Hb 용액을 아세트산 나트륨의 존재하에서 1시간, 2.5시간 및 23시간 동안 가교결합 후 디메틸아민 보란으로 환원시켰다. 안정된 가교결합된 64kD 분체는 0.5M 염화마그네슘의 이동상을 이용하여 슈퍼덱스(Superdex)(파마시아) 겔 침투 칼럼상에서, 제조용 싸이즈 배제 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있었다.
염화마그네슘 용액의 효과는 가교결합되지 않은 4합체의 헤모글로빈을 알파-베타 2합체(32킬로돌턴)로 해리하는 것이다. 염화마그네슘은 가교결합된 헤모글로빈을 해리하지 않는다. 이렇게 하여 가교결합된 헤모글로빈은 분석하기 위하여 가교결합되지 않은 헤모글로빈으로부터 분리될 수 있다.
가교결합된 64kD 종의 헴과 글로빈 사슬은 330Å 기공 싸이즈 C4 바이닥(Vydac) 칼럼(분석용의 250 × 4.6mm 및 제조용의 250 × 10mm; 세퍼레이션스 그룹, 헤스페리아(Hesperia) CA)을 이용하는 역상 HLPC에 의해 분리되었으며 0.1% 트리-플루오로아세트산 및 38%에서 출발하고 60%에서 끝나는 다양한 변화도의 아세토니트릴을 포함하는 전개용매(developer)가 분리하기 위하여 이용되었다. 용출액을 220nm에서 모니터링하였으며 글로빈 사슬은 냉동건조에 의해서 용출액으로부터 회수되었다.
유사한 방법으로, 가교결합되지 않고, 변형되지 않은 헴과 글로빈 사슬은 분리되었다.
첨부된 도면의 제5도는 변형되지 않은 헤모글로빈의 역상 글로빈 사슬 크로마토그래피를 보여주며, 또한 제6도는 변형되고, 가교결합된 헤모글로빈용의 역상 글로빈 사슬 크로마토그래피를 보여준다. 헤모글로빈 분석에 정통한 사람들에게는 쉽게 인식될 수 있으며, 또한 관련된 출판물로부터 쉽게 추론될 수 있듯이, 각각의 경우에서 피크 1은 헴을 나타내고, 피크 2는 변형되지 않은 베타-글로빈 사슬을 나타내고, 피크 3은 변형되지 않은 알파-사슬을 나타내고, 피크 4는 현저하게 변형된 베타-2합체를 나타내고 또한 피크 5는 현저하게 변형된 알파-2합체를 나타낸다. 제5도와 제6도의 비교에 의해서 본 발명에 따른 가교결합이 베타-2합체상에서, 즉 헤모글로빈 4합체 단위의 베타-사슬에서 특이적으로 일어난다는 것을 쉽게 알 수 있다.
변형(가교결합)의 특이적 위치를 측정하기 위하여 제5도에서 피크(분획) 2, 제6도에서 피크(분획) 3 및 피크(분획) 4에 의해 도시된 글로빈 사슬은 다음과 같이 트립신을 이용하여 효소적으로 가수분해 하고 이어서 펩티드 분석했다.
[글로빈 사슬의 효소적 가수분해]
분리된 글로빈 사슬을 8M 요소에 우선 용해하여(가수분해에 대한 감응성을 증가하기 위하여) 실온에서 2 내지 4시간 동안 유지하였다. 이 용액을 pH 8.5의 90mM 암모늄 중탄산염 완충용액을 이용하여 2M 요소로 희석하였다. 트립신(총 프로테인의 2%)을 부가하였으며 그 용액을 실온에서 18 내지 20시간 동안 분해하엿다. 그런 다음 트립신의 수해물(hydrolysate)을 끓는 물에서 2분간 가열하고, 80mM 암모늄 중탄산염 완충용액을 이용하여 1M 요소로 희석하고 실온에서 다시 18 내지 72시간 동안 엔도프로테이나제 글루-C(총 프로테인의 1%)로 분해하였다. 수해물을 HPLC 칼럼상으로 주입하기 전에 원심분리 또는 여과하였다.
[펩티드 분석]
펩티드 파편(fragment)은 바이닥 C18 칼럼(25 × 0.46cm, 세퍼레이션스 그룹, 헤스페리아, CA)상에서 역상 HPLC에 의해 분리되었다. 분리는 0.1% TFA와 100분의 기간에 걸쳐 0%에서 시작하고 100%로 끝나도록 농도 변화가 이루어지는 아세토니트릴을 포함하는 전개용매를 이용하여 만들어졌다. 펩티드의 파편을 검출하기 위하여 용출액을 220nm에서 모니터링하였다.
트립신은 유리 1차의 아민 그룹을 가지는 라이신(lysine) 잔기에서 프로테인 사슬을 특이적으로 쪼갠다. 트립신은 그 반응에서, 헤모글로빈에서 라이신 잔기 혹은 말단의 아미노산 그룹으로부터만 오로지 유도될 수 있는 1차 아민 그룹에 대해 특이적이다. 헤모글로빈의 글로빈 사슬의 아미노산 배열은 공지되어 있다. 그리하여 제5도로부터의 분획 2 및 제6도로부터의 분획 4상에 대해서 역상 HPLC를 이용하는 트립신 분해체의 펩티드 분석에 의해서, 가교결합은 모두가 분획 4 샘플로부터 소실된 베타-사슬상의 라이신-82 및 절반이 분획 4로부터 소실된 베타-사슬상의 말단 발린(valine) 그룹에 대해 특이적인 것으로 나타났다.
헤모글로빈의 베타-사슬상에서 라이신-82는 헤모글로빈의 2,3-디포스포글리세레이트 결합 영역에 위치함이 종래 기술로부터 공지되어 있다. 그리하여 본 발명의 방법에 의해서 베타-라이신-82를 이용하는 DPG 결합 영역에서 가교결합의 특이성은 증명 및 확증되어 있다.
[실시예 5]
[과요드산염으로 산화된 자당의 제조]
50ml의 무균수에서 용해된 3.8g(11.1mmole)의 자당 및 10.4g의 고체 소디움-m-과요드산염을 이용하여 과요드산염으로 산화된 라피노오스를 제조하는 실시예 1에서 기술된 방법에 따라서 제조가 이루어졌다.
[실시예 6]
[o-자당에 의한 헤모글로빈의 제어된 가교결합과 보론 디베틸아민을 이용한 환원]
pH 6.5의 50mM Bis-Tris 완충용액에 정제된 인간 헤모글로빈을 용해시킨 30ml의 용액(8% w/v)을 가습된 질소 가스하, 실온에서 대략 4-6시간 동안 일정하게 교반하여 디옥시헤모글로빈으로 전환시켰다. 고리-열리고, 산화된 자당(115mM)이 탈가스 되고 부가되어 가교결합 반응이 개시되었다. 24시간 후 3M 아세트산 나트륨이 최종 농도가 30mM이 되도록 부가되었다. 이어서, 가교결합된 생성물이 0.8ml의 탈가스된 물에 용해된 1.44mM의 보란 디메틸아민에 의해 환원되었다. 환원반응은 밤새도록 진행되었다.

Claims (16)

  1. 수용액 형태의 혈액 대용액에서 산소 운반체로 이용하는데 적합하고 분자량이 600,000 돌턴이 넘는 중합체 헤모글로빈을 포함하고 있지 않는 화학적으로 변형되고 가교결합된 헤모글로빈을 제조하는 방법에 있어서, (a) 디/트리-당화물을 산화적 고리 열림 반응시켜 이로부터 폴리알데히드를 생성하는 단계; (b) 상기와 같이 형성된 폴리알레히드의 어떠한 실질적인 가수분해도 방지하기 위하여 상기 결과의 생성물 용액의 pH를 약 pH 5.0 내지 pH 7.0 범위 내의 값으로 조절 및 유지하는 단계; (c) 디/트리-당화물 및 헤모글로빈 4합체에 기준한 계산 비로 약 1:1 내지 4:1의 용액에서 (b) 단계의 생성물을 헤모글로빈과 반응시키는 단계; (d) 상기와 같이 형성된 시프 염기 결합을 2차 아민 결합으로 환원시키는 단계; 및 (e) 상기와 같이 형성된 변형된 헤모글로빈을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 디/트리-당화물이 3당류임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 3당류는 라피노오스임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 디옥시헤모글로빈임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 효과적인 양의 환원제 없이 실질적으로 완전한 탈산소화 시키기에 충분한 조건하에서 불활성 가스를 이용하여 상기 헤모글로빈에서 탈산소화 하는 개시단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 디옥시헤모글로빈에 디티온산 나트륨 및 이의 잔기가 실질적으로 완전히 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 인간의 헤모글로빈임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 초기에는 T-형태이며 상기 폴리알데히드와 반응에 의해 상기 T-형태로 안정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 라피노오스의 산화적 고리 열림은 강산성(highly acidic) 조건하에서 과요드산 나트륨 혹은 과요드산 칼륨과 반응에 의해서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 반응 생성물 용액은 인산염이 없는 완충제의 이용에 의해 pH 5.0-7.0범위로 완충되며, 또한 차후의 용도를 위해 상기 pH 한도 내에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 완충제는 비스-트리스 완충제 시스템을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, (c) 단계에서 헤모글로빈 4합체에 대한 디/트리-당화물의 계산량은 약 2.5:1 내지 3.5:1임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 1차의 아민 결합을 형성하기 위한 환원은 보란 디메틸아민과의 반응에 의해서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 디/트리-당화물은 2당류임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 2당류는 자당임을 특징으로 하는 방법.
  16. 필수적으로 약 40%의 4합체 헤모글로빈 단위, 0 내지 5%의 2합체 헤모글로빈 단위 및 나머지가 64,000 내지 500,000돌턴 분자량의 소중합체 헤모글로빈 단위로 이루어져 있고 분자량이 600,000돌턴이 넘는 중합체 헤모글로빈은 포함하고 있지 않으며, 상기 4합체 및 소중합체 헤모글로빈 단위는 DPG 결합 영역에서 라이신-82 위치에서 β-글로빈 사슬들 사이에 화학적 가교결합을 가지는 것을 특징으로 하는, 화학적으로 변형되고 가교결합된 헤모글로빈.
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE503711C2 (sv) * 1994-12-14 1996-08-12 Medicarb Ab Flerstegsförfarande för beläggning av en intraokulär lins
US5952470A (en) * 1995-06-07 1999-09-14 Biopure Corporation Method for separating unmodified hemoglobin from cross-linked hemoglobin
US5891506A (en) * 1996-08-09 1999-04-06 Medtronic, Inc. Oxidative method for attachment of glycoproteins or glycopeptides to surfaces of medical devices
CA2263978A1 (en) * 1996-08-27 1998-03-05 Hemosol Inc. Enhanced stimulation of erythropoiesis
US5917020A (en) * 1997-01-15 1999-06-29 Kluger; Ronald H. Bis-tetrameric hemoglobin and reagents for its production
DE69831248T2 (de) 1997-02-28 2006-04-13 The Regents Of The University Of California, Oakland Verfahren und zusammensetzungen zur optimierung des sauerstofftransportes in zellfreien systemen
US5814601A (en) * 1997-02-28 1998-09-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems
CA2233725A1 (en) 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
CA2266174A1 (en) 1999-03-18 2000-09-18 Hemosol Inc. Hemoglobin-antioxidant conjugates
DE19933275A1 (de) * 1999-07-14 2001-01-18 Fresenius Ag Verwendung von Hämoglobin-Derivaten zur Bestimmung des Plasma- und/oder Blutvolumens
US6894150B1 (en) 1999-10-01 2005-05-17 Ross Walden Tye Non-pyrogenic, endotoxin-free, stroma-free tetrameric hemoglobin
US6500809B1 (en) 1999-11-12 2002-12-31 Neuron Therapeutics, Inc. Hyperoncotic artificial cerebrospinal fluid and method of treating neural tissue edema therewith
DE10031742A1 (de) * 2000-06-29 2002-01-17 Sanguibio Tech Ag Verfahren zur Herstellung künstlicher Sauerstoffträger aus kovalent vernetzten Hämoglobinen mit verbesserten funktionellen Eigenschaften durch Vernetzung in Anwesenheit chemisch nicht reagierender Effektoren der Sauerstoffaffinität der Hämoglobine
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
US20030153491A1 (en) * 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
US20050164915A1 (en) 2002-04-01 2005-07-28 Sangart, Inc. Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
JP3912206B2 (ja) * 2002-07-05 2007-05-09 株式会社日立製作所 筒内直接燃料噴射装置用燃料ポンプ
CA2495242A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
AU2003273413A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
US7135554B1 (en) * 2004-01-27 2006-11-14 Biopure Corporation Method of forming a polymerized hemoglobin solution from stabilized hemoglobin
WO2005092928A1 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
EP1865993A2 (en) * 2005-04-05 2007-12-19 Biopure Corporation Oxygenated polymerized hemoglobin solutions and their uses for tissue visualization
US7504377B2 (en) * 2006-10-23 2009-03-17 Ikor, Inc. Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin
US7494974B2 (en) * 2006-10-24 2009-02-24 Ikor, Inc. Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
US20140260586A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Schlumberger Technology Corporation Method to perform rapid formation fluid analysis

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4529719A (en) * 1983-05-04 1985-07-16 Tye Ross W Modified crosslinked stroma-free tetrameric hemoglobin
JPH0645681B2 (ja) * 1986-02-05 1994-06-15 美浜 久春 修飾ヘム
DE3636590A1 (de) * 1986-10-28 1988-05-26 Braun Melsungen Ag Blutersatzmittel
GB8710598D0 (en) * 1987-05-05 1987-06-10 Star Medical Diagnostics Ltd Hemoglobin based blood substitute
FR2640141B1 (fr) * 1988-12-14 1993-04-16 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5234903A (en) * 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
PL167340B1 (pl) * 1990-11-29 1995-08-31 Upjohn Co Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny PL
FR2680369B1 (fr) * 1991-08-14 1993-11-05 Pasteur Merieux Serums Vaccins Derives d'hemoglobine humaine, leur procede de preparation, produits en derivant et utilisation de ces derives et produits.
US5399671A (en) * 1992-11-18 1995-03-21 Kluger; Ronald Specifically crosslinked hemoglobin with free functionality

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Publication number Publication date
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