KR100285653B1

KR100285653B1 - 미꾸라지베타-액틴유전자조절부위영역을포함하는유전자발현벡터

Info

Publication number: KR100285653B1
Application number: KR1019980020255A
Authority: KR
Inventors: 김철근; 재 구 노; 조규남; 남윤권; 김동수
Original assignee: 김철근; 노재구; 조규남; 김동수; 남윤권
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1998-06-01
Publication date: 2001-04-02
Also published as: KR20000000576A

Abstract

본 발명은 우리 나라의 대표적인 담수 어종인 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 이용한 어류 특이적 발현 벡터를 제공하기 위한 것으로, 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 포유류 및 어류를 포함하는 다양한 기원의 배양 세포주에서 정상적으로 작동하여 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있으므로, 이를 이용하여 어류에서 유용 유전자를 발현시킴으로써 신품종 어류의 개발에 기여할 수 있다.

Description

미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 유전자 발현 벡터

본 발명은 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 유전자 발현 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한국산 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 및 유전자 발현 조절 부위의 염기 서열을 분석하고, 이로부터 제조된 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 어류 특이적 발현 벡터를 이용하여, 어류에서 유용한 목적 유전자를 효율적으로 발현시키기 위한 것이다.

분류학적으로 잉어목, 미꾸리과에 속하는 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)는 우리나라를 비롯하여 중국, 대만, 일본, 러시아 등 동북 아시아 지방에 서식하는데, 식품 영양학적 우수성과 강장 식품으로서의 가치를 인정받아 예로부터 식용 및 약용으로 널리 애용되고 있는 우리 나라의 대표적인 담수 어종이다(동의보감, 방약합편). 불과 몇 년 전까지만 해도 논과 하천 등 전국 어디서나 볼 수 있었던 미꾸라지는 일본 등지에 수출하여 외화 획득의 일익을 담당하기도 하였으나, 하천과 농수로의 오염, 농약의 남용 등으로 인하여 자연 채취량이 매년 감소되고 있는 실정이다. 이러한 현상이 미꾸라지에만 한정된 것이 아니라는 점을 고려할 때, 국내 어류 자원의 보존과 효율적인 이용을 위하여 새로운 양식 기술의 개발과 더불어 경제성, 유용성이 높은 우수한 품종을 개량해야 할 필요성이 대두되고 있다. 이의 일환으로, 어류의 다양한 유용 유전자 자원을 확보하고, 생명공학 기법을 이용하여 이들 유전자를 조작하고 직접 어류에 이식하는 형질전환 어류를 제조하기 위한 연구들이 다양하게 이루어져야 할 것이다.

형질전환 어류의 제조에 관한 연구는 포유류에서 얻은 유전자와 이들의 조절 부위를 이용하여 1970년대 후반부터 시작되었다. 이들 형질전환 어류에서 인위적으로 넣어준 유전자의 발현에 대해서는, (1) 유전자의 발현이 전혀 일어나지 않는 경우, (2) 유전자의 발현은 감지되나 생리적인 영향을 주지 못하는 경우, 그리고 (3) 유전자가 발현하여 생리적인 변화를 주는 3가지 결과가 나타났다. 유전자의 발현이 일어나지 않는 경우는 포유류 또는 포유류 바이러스의 유전자 조절 부위가 어류에서 인지되지 못하기 때문인 것으로 해석하고 있다. 또한, 특정 이질 유전자가 어류에서 발현되더라도 생리적 영향을 주지 못하는 이유는, 세포내에서 기질 특이적 단백질-단백질 상호 작용이 원만히 일어나지 못하기 때문이다. 즉, 이식하려는 유전자의 발현 산물은 어류의 것과 구조적 유사성이 있어야 효과를 나타낼 수 있는 것이다. 이러한 결과는, 형질전환 어류에 이용하려는 유전자와 이들의 조절 부위로서는 동종 어류의 것이 최적이며, 가능한 유연 관계가 가까운 근연종의 것 일수록 성공률이 높을 것임을 시사해 주고 있다.

어류의 형질전환에 관한 연구 초기에는 대부분 포유류에서 기원한 벡터를 이용하였는데, 고등 척추동물과 바이러스의 여러 프로모터들이 어류 세포에서도 높은 효율로 외부 유전자 전사를 유도한다는 것이 보고되었다(Foster, R., P. E. Olson 및 L. Gedamu, 1989. Mol. Cell. Biol. 9: 4105-4108; Gedamu, L., P. E. Olson 및 M. Zaffarullah, 1990. Regulation of rainbow trout metallothioneine genes. In: Transgenic models in Medicine and Agriculture. Church, R.(ed.) New York: Willy-Liss, pp. 101-108; Inoue, K., S. Yamashita, J. Hata, S. Kabeno, S. Asada, E. Nagahisa 및 T. Fujita, 1990. Cell Differ. Dev., 29: 123-128; Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. S. Guise, A. R. Kapuscinski 및 P. B. Hackett, 1990. Bio/Technol 8: 1268-1272; Friedenreich, H 및 M. Schartl, 1990. Nucl. Acids Res., 18: 3299-3305; Bearzotti, M., E. Perrot, C. Michard-Vanhee, G. Jolivet, J. Attal, M. C. Theron, C. Puissant, M. Drano, J. J. Kopchick, R. Powell, F. Gannon, L. M. Houdebine 및 D. Chourrot, 1992. J. Biotechnol. 26: 315-325).

Zhu 등(Zhu, J., K. Xu, G. Li, Y. Xie, 및 L. He, 1986. Tongbao 31:988-990)은 생쥐의 메탈로티오네인(metallothioneine) 유전자의 프로모터에 사람의 성장 호르몬 유전자를 결합시켜 미꾸라지, 금붕어, 비단 잉어 등에 이식함으로써 대조군에 비해 3배 이상 큰 형질전환 어류를 만드는 데 성공하였다. 그러나, 척추동물 및 바이러스의 프로모터를 어류에 적용할 경우, 이들이 어류 세포내에서 발현하는데 필요한 전사 조절 인자(transcription factor)에 제한이 따를 수 있고, 상업적으로는 이렇게 생산된 어류에 대하여 소비자들이 거부감을 가질 수 있다는 문제점이 있다(Du, S. J., Z. Gong, C. L. Hew, C. H. Tan 및 G. L. Fletcher, 1992. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1(4/5): 290-300).

이러한 점을 고려할 때, 보다 안정적으로 외래 유전자를 발현시키는 형질전환 어류를 제조하기 위해서는, 어류 자체에서 유래한 특이적 조절 부위와 구조 유전자를 확보하고, 이를 이용하여 발현 벡터를 개발하는 일이 절실히 요구되고 있다. 이에 따라, 연어의 프로타민(protamine) 유전자(Jankowski, J. M. 및 G. H. Dixon, 1987. Biosci. Rep. 7: 955-963), 무지개 송어의 메탈로티오네인 B (metallothioneine B; MT) 유전자(Zafarullah, M., K. Bonham 및 L. Gedamu, 1988. Mol. Cell. Biol., 8: 4469-4476), 잉어의 베타-액틴 유전자(Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. Guise, A. R. Kapuscinski 및 P. B. Hackett, 1990. Mol. Cell. Biol., 10: 3432-3440), 그리고 넙치의 항동결 단백질(antifreeze protein; AFP) 유전자(Gong, Z., C. L. Hew 및 J. R. Biekind, 1991. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1: 64-72) 등의 조절 부위들이 클로닝되었다. 특히, MT 유전자 조절 부위는 독성 물질, 중금속, 글루코코르티코이드 등의 처리에 의해 다양한 조직에서 강력한 발현을 나타내고 있다. 그러나, 발현유도를 위해 처리하는 유도체는 체내에서 대사과정을 거치는 동안 독성을 나타내거나 종양을 유발하는 경우가 있으며, 중금속 유도체의 경우에는 어류의 체내에 축적되어 최종 소비자에게 전달될 수 있다는 위험이 문제가 되고 있다(Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. S. Guise, A. R. Kapuscinski 및 P. B. Hackett, 1990. Bio/Technol. 8: 1268-1272).

액틴 유전자는 진핵생물에 존재하는 세포 골격 단백질의 유전자로, 도입된 외래 유전자의 안정적이고 지속적인 발현을 위한 조절 부위 영역으로 종종 이용되고 있다. 척추동물에서는 아미노산 서열상 약간의 차이를 보이는 적어도 6개의 이형체(isoform)가 존재하며 이들은 발생 과정중 다양하게 발현이 조절된다. 근육 특이적 발현을 하는 알파-액틴과는 달리, 베타-액틴 유전자의 프로모터는 근육을 비롯하여 모든 비근육 세포에서도 발현하므로, 이 프로모터에 외래 유전자를 결합하여 개체내에 도입시키면 원하는 외래 유전자의 발현을 효율적으로 유도할 수 있을 것이다(Quitschke, W. W., Z. Y. Lin, L. D. P.-Zilli 및 B. M. Paterson, 1989. J. Biol. Chem. 264(16): 9539-9546).

즉, 베타-액틴 유전자 조절 부위를 어류에서 발현될 수 있는 발현 벡터의 제조에 이용할 경우, (1) 프로모터가 강력하여 모든 조직에서 발현을 유도할 수 있으며, (2) 프로모터 구조의 복잡성을 이용해 다양한 단계에서 발현의 유도 및 조절이 가능하며, (3) 베타-액틴 유전자 조절 부위가 종 간에 높은 상동성을 보이므로 모든 어류 종에서 충분히 기능을 발휘할 수 있다는 이점을 갖는다(Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. Guise, A. R. Kapuscinski 및 P. B. Hackett, 1990. Mol. Cell. Biol., 10: 3432-3440).

이상과 같은 점을 고려하여, 본 발명자들은 어류에서 유용 유전자를 생체내로 전달하고 강력한 발현을 유도할 수 있는 어류 특이적 유전자 발현 벡터를 제조하기 위하여, 미꾸라지에서 베타-액틴을 코딩하는 유전자와 이의 조절 부위를 클로닝한 후, 이 베타-액틴 유전자 조절 부위 단편과 해파리 유래의 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP) 유전자를 코딩하는 단편을 결합하여 재조합 플라스미드 발현 벡터를 제조하였으며, 이와 같이 제조한 재조합 벡터가 여러 가지 배양 세포에서 발현율이 높음을 발견하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 모든 어류 종에서 유용 유전자를 발현시키는데 적합한 어류 기원의 유전자 조절 부위를 제공하고, 이러한 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터를 제조함으로써, 어류에서 원하는 외래 유전자의 발현을 효율적으로 유도하고자 하는 것이다.

도 1은 미꾸라지 베타-액틴 유전자를 포함하는 박테리오파아지 DNA의 제한 효소 지도를 나타낸 것이고,

도 2는 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 플라스미드 pmlβa41의 클로닝 과정을 나타낸 모식도,

도 3은 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위와 해파리 기원의 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합한 pmlβaGFP 플라스미드 발현 벡터의 제조 과정을 나타낸 모식도,

도 4는 E25B2 세포주에서 CMV 프로모터와 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 플라스미드 pmlβa41에 의한 GFP의 발현 조절 양상을 비교한 사진으로, 도 4a는 CMV 프로모터에 의한 발현 결과이고, 도 4b는 pmlβa41에 의한 발현 결과를 보여주는 사진.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열 1에 기재된 염기 서열로 표시되는 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 및 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 DNA를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본원 발명에서는 한국산 미꾸라지로부터 모든 유전자를 포함하고 있는 게놈 라이브러리를 제조한 후, 이로부터 베타-액틴 유전자를 클로닝하여 그 염기 서열 및 구조적 특성을 밝히고, 염기 서열이 알려진 다른 어종들의 것과 상동성을 비교 분석하였다. 또한, 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터를 제조한 후, 여기에 해파리 기원의 녹색 형광 단백질 유전자를 재조합하여 다양한 기원의 배양 세포 및 생체에서의 발현 양상을 분석함으로써, 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터가 어류에서 유용 유전자를 발현시키기에 적합한 기능적인 발현 벡터임을 증명하였다.

1. 미꾸라지 게놈 DNA 라이브러리의 제조

먼저, 한국산 미꾸라지의 혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하여 제한 효소 Sau3A I으로 부분 절단한 후 초원심분리하여 15∼23 kb의 DNA 절편을 분리하고, 이들 게놈 DNA 절편을 λGEM-11 벡터에 리게이션시킨 후 대장균 파아지 추출물과 혼합하여 패키징된 파아지를 대장균 숙주 세포에 감염시키고 배양하여 미꾸라지 게놈 DNA 라이브러리를 제조한다.

2. 베타-액틴 유전자의 검색 및 염기 서열 분석

베타-액틴 유전자 탐침으로서는 생쥐 배아 세포주 cDNA 라이브러리에서 클로닝한 1.5 kb 감마-액틴 유전자 단편을 이용하는데, [α³²P] dCTP로 표지한 후 스핀 컬럼을 통해 표지된 탐침만을 순수하게 분리한다.

미꾸라지 게놈 DNA 라이브러리로 형질전환시킨 대장균 숙주 세포 KW251을 배양한 후, 파아지를 필터로 옮기고 필터 상에 붙은 DNA와 상기 감마-액틴 탐침을 하이브리드화시킨 다음 양성 플라크들을 회수하는 단계를 반복하여 양성 파아지 클론을 순수 분리한다.

단일 양성 파아지 DNA를 분리하기 위해, 대장균 숙주 세포 KW251에 파아지를 감염시켜 용해(lysis)될 때까지 배양한 후, 클로로포름을 넣고 원심분리하여 상층의 파아지 용해질(lysate)을 얻는다. 파아지 용해질을 RNase A와 DNase I과 반응시킨 후 NaCl과 PEG로 침전시키고, 침전된 파아지로부터 단백질 껍질을 제거한 다음 원심분리하여 DNA를 회수하고, 침전 및 건조시킨 후 λGEM-11 파아지 벡터 내에 존재하는 미꾸라지 베타-액틴 유전자의 제한 효소 지도를 만든다. 즉, Bam HI, EcoR I, Hind III, Pst I, Sac I, Xba I, Xho I 등의 제한 효소를 단일 또는 적절히 조합하여 DNA를 각각 절단한 후 전기영동하여 나타난 절편의 크기를 비교하여, 각 제한 효소들의 위치를 지도화 한다.

미꾸라지 베타-액틴 유전자 클론을 플라스미드 벡터인 pBluscript II KS(-)로 서브클로닝하기 위해, 제한 효소 Xho I과 EcoR I을 λ 파아지 DNA와 pBS 벡터와 반응시키고 전기영동하여 올바른 크기의 삽입 DNA와 벡터를 회수한 후 T4 DNA 리가제를 이용하여 리게이션시킨다. 이것으로 대장균 숙주 세포 XL-1 blue MRF' 균주를 형질전환시키고 암피실린과 X-gal이 들어 있는 아가 플레이트에서 배양한 다음, 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 일부를 제한 효소로 절단하고 정확한 삽입체가 들어 있는지 여부를 확인하여 pmlβa34로 한다.

pBS 벡터에 서브클로닝된 미꾸라지의 베타-액틴 유전자를 포함하는 3.4 kb 클론(pmlβa34)에 BamH I, Kpn I, Sac I, Xba I 등의 제한 효소들을 단일 또는 조합 반응시켜 각 제한 효소들의 위치를 지도화하고, 이를 기본으로 엑소뉴클레아제 III(Exonuclease III)를 이용한 Erase-a-base 방법에 따라 일련의 결손 돌연변이체를 얻어 염기 서열을 분석한다.

3. 베타-액틴 유전자 조절 부위의 클로닝

pmlβa34의 3702 bp 위치의 Sty I과 pBS 벡터 내에 존재하는 670 bp 위치의 Not I부위에서 절단하고 블런트 리게이션시켜 베타-액틴 구조 유전자 부위를 제거한 pmlβa34S/N 플라스미드를 얻는다. 이어서, 이를 Xho I으로 완전 절단 후 BssH II로 부분 절단하여 444 bp의 조절 부위 단편을 확보한다.

또한, 베타-액틴 유전자 조절 부위의 클로닝을 위해 3.4 kb 클론의 5' 상위에 존재하는 Xba I, Xho I의 3.9 kb 단편 역시 pBS 플라스미드 벡터의 Xba I, Xho I 위치에 클로닝하여 pmlβa39 플라스미드를 얻은 후, 염기 서열을 분석한다. 다음에, 유용 유전자들의 재조합을 용이하게 하기 위해 벡터의 염기 서열 분석 결과 Xba I에서 182 bp 떨어진 곳에 위치하는 제한 효소 Sac I 절단 부위를 제한 효소 Sac I으로 절단한 후 블런트 리게이션시켜 제거하고, 앞서와 같이 이를 Xho I으로 완전 절단 후 BssH II로 부분 절단하여 6576 bp의 단편을 얻는다.

여기에 pmlβa34S/N의 Xho I, BssH II 444 bp의 단편을 결합하여 번역 개시 코돈 상위 4146 bp의 완전한 베타-액틴 조절 부위를 갖는 플라스미드 pmlβa41을 제조한다.

4. 베타-액틴 유전자 발현 조절에 의한 형광 단백질의 발현

베타-액틴 유전자 조절 부위의 발현 조절 능력을 확인하기 위하여 표지 유전자로 매우 유용한 해파리(Aequorea victoria)에서 유래된 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP) 유전자를 이용한다. 녹색 형광 단백질 발현 벡터 phGFP-S65T를 Mlu I과 Sac I으로 절단하여 586 bp의 발현 조절 부위인 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 부분을 제거하고, 플라스미드 pmlβa41을 제한 효소 BssH II와 Sac I으로 절단하여 얻은 4194 bp의 단편을 리게이션시켜 베타-액틴 유전자 조절 부위에 의해 녹색 형광 단백질 발현 조절을 받는 플라스미드 pmlβaGFP를 제조한다.

베타-액틴 유전자 조절 부위의 발현 조절 능력을 확인하기 위하여 플라스미드 pmlβaGFP 벡터를 배양중인 세포주에 형질도입하여 GFP의 발현 정도를 측정한다. 대조군으로 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 갖고 있는 phGFP-S65T를 형질도입하여 비교하고, 배양 세포주로는 연어 배아 세포주(Chinook salmon embryonic cell line; CHSE-214), 사람 혈구암 세포주(Human erythropoietic cell line; K562), 원숭이 신장 세포주(African Green Monkey kidney cell line CV1 drived E25B2), 쥐의 혈구암 세포주(Mouse erythroid leukemia cell line; MEL)를 이용한다.

유전자가 도입된 세포는 도입 60-72 시간 후 수거하여 형광 현미경으로 GFP를 발현하는 세포 수를 계수하여 발현 비율을 분석하고, 일부는 LacZ 염색으로 대장균 LacZ 유전자를 발현하는 세포를 계수하여 [GFP]/[LacZ]의 값을 구하고 GFP의 발현양을 정량 분석한다.

그 결과, 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 포유류 및 어류를 포함하는 다양한 기원의 배양 세포주에서 정상적으로 작동하여 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 것으로 나타나, 어류에서 유용 유전자의 발현에 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1: 미꾸라지의 게놈 DNA 라이브러리의 제조

미꾸라지의 미부 정맥에서 혈액을 채취하여 블린과 스탠포드의 방법에 따라 게놈 DNA를 추출하였다(Blin ＆ Stafford, 1976, Nucleic Acid Res., 3: 2303). 추출한 게놈 DNA(200 ㎍)를 제한 효소 Sau3A I으로 부분 절단(0.04 U/㎍ DNA, 30분)하여 10∼40% 자당 밀도 구배 용액에서 초원심분리(22,000 rpm, 22시간, 20 ℃)한 후, 30 개 분획을 받아 각 분획에 포함된 절편의 크기를 전기영동으로 확인하여, 이 중에서 파아지 벡터로 들어갈 수 있는 적당한 크기인 15∼23 kb의 절편을 분리하였다.

이들 15∼23 kb 게놈 DNA 절편들을 제조 회사의 실험 방법(Genomic cloning manual. Promega, 미국)에 따라 BamH I 절단 λGEM-11 벡터(Promega, 미국)에 리게이션시키고, 대장균 파아지 추출물(Promega, 미국) 50 ㎕와 리게이트 5 ㎕를 섞어 3시간 동안 실온에서 정치시켜 패키징한 다음, 파아지 완충 용액(20 mM Tris-HCl; pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄) 445 ㎕와 클로로포름 25 ㎕를 첨가하였다. 패키징된 파아지를 대장균 숙주 세포 KW251(F-, supE44, galK2, galT22, metB1, hsdR2, mcrB1, mcrA, [argA81:Tn10], recD1014, Promega, 미국)에 감염시켜 플레이트에 넣고 밤새 배양하였다. 나타난 플라크를 계수한 결과, 1.5 X 10⁶pfu/㎍ DNA의 타이터를 갖는 미꾸라지 게놈 DNA 라이브러리가 제조되었고, 이를 증폭하여 1.26 X 10⁹pfu/㎍ DNA의 증폭 라이브러리를 제조하였다.

실시예 2: 베타-액틴 유전자의 검색 및 염기 서열 분석

① 베타-액틴 유전자 탐침의 제작

베타-액틴 유전자 탐침으로서는 생쥐 배아 세포주 cDNA 라이브러리에서 클로닝한 1.5 kb 감마-액틴 유전자 단편을 이용하였으며, 탐침 제작은 랜덤 프라임드 라벨링 키트(random primed labeling kit, B.M., 독일)를 사용하여 제조 회사의 실험 방법에 따라, 37 ℃에서 1 시간 동안 [α³²P] dCTP로 표지한 후 스핀 컬럼을 통해, 탐침으로 사용하기에 너무 작은 단편들과 합성되지 않은 dNTP들을 제거하고 표지된 탐침만을 순수하게 분리하였다.

② 플라크 하이브리드화

미꾸라지 게놈 DNA 라이브러리를 150 mm 플레이트 10 개에 각각 5만개 정도의 플라크가 형성될 수 있도록 타이터를 조절하여 0.3 ㎖의 대장균 숙주 세포 KW251과 혼합하고 37 ℃에서 20분간 배양하여 파아지를 숙주에 감염시켰다. 벤톤과 데이비스의 방법(Benton ＆ Davis, 1977, Science, 196: 180-182)에 따라 형질 전환된 대장균 숙주 세포 KW251을 7 ㎖의 0.7% 탑(top) 아가로스와 섞어 아가 배지가 깔린 150 mm 플래이트에 넣고 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서 나일론 필터를 배양 접시 위에 올려 놓아 파아지를 필터로 옮기고 1분 후 필터를 떼어 내었다. 이 필터를 순차적으로 변성 용액(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl)에 2분, 중성 용액(1 M Tris; pH 7.4, 1.5 M NaCl)에 5분, 2X SSC(0.3 M NaCl, 30 mM 구연산나트륨)에 1분간 담근 후 DNA가 나일론 필터에 견고하게 부착되도록 UV 교차결합시키고 공기 건조하였다.

필터 상에 단단히 부착된 DNA와 앞서 제작한 감마-액틴 탐침을, 서던의 방법(Southern E.M., 1975, J. Mol. Biol., 98: 503-517)을 응용하여 65 ℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화시키고 42 ℃에서 16시간 동안 하이브리드화시킨 후, 1차 세척 용액(2X SSC, 0.1% SDS)과 2차 세척 용액(0.1X SSC, 0.1% SDS)으로 여분의 탐침을 씻어내고, 증강 스크린(intensifying screen)을 덮어 -70 ℃에서 X-선 필름에 24시간 동안 노출시킨 다음 자동 필름 현상기로 현상하였다. 필름 상에 나타난 양성 신호와 일치하는 플레이트 상의 플라크들을 파스퇴르 피펫으로 회수하여 1 ㎖의 SM 완충 용액을 넣은 다음 클로로포름 2 방울을 첨가하고, 파아지들이 용액내로 나오도록 실온에서 4시간 동안 정치하였다. 완전한 양성 단일 플라크의 분리를 위해, 1차 검색에서 얻어진 플라크들을 약 50개 정도의 플라크가 형성되도록 타이터를 조절하여 배양한 후 2회에 걸쳐 위와 같은 방법으로 재검색하여 총 50만개의 플라크 중 10개의 양성 파아지 클론을 순수 분리하였다.

③ 베타-액틴 유전자 파아지 DNA 추출과 제한 효소 지도 작성

단일 양성 파아지 DNA를 분리하기 위해 밤새 배양한 KW251 500 ㎕에 파아지 20 ㎕를 37 ℃에서 20분간 감염시켜, 최종 농도 10 mM의 MgSO₄가 들어있는 LB 100 ㎖에서 용해(lysis)될 때까지 배양한 후, 500 ㎕의 클로로포름을 넣고 원심분리 (8,000 g, 10분)하여 상층의 파아지 용해질(lysate)을 얻었다. 파아지 용해질을 250 ㎖ 원심분리관으로 옮겨 RNase A와 DNase I을 최종 농도 1 ㎍/㎖로 넣고 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후, 5.8 g의 NaCl과 9.3 g의 PEG 8000을 넣어 얼음 위에서 1시간 정치시키고 원심분리(10,000 g, 20 분, 4 ℃)하여 파아지를 침전시켰다. 침전된 파아지를 10 ㎖의 파아지 완충용액(20 mM Tris-HCl; pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄)에 녹여 원심분리한 후, 상층액에 10% SDS 100 ㎕, 0.5 M EDTA(pH 8.0) 100 ㎕ 씩을 넣어 68 ℃에서 15분간 반응시키고, 이어 동량의 페놀을 첨가하여 파아지의 단백질 껍질을 제거한 다음, 5분 동안 원심분리하여 DNA가 든 상층액을 회수하였다. 잔존 페놀을 제거하기 위해 동량의 클로로포름을 처리하여 상층액만을 취한 다음, 0.1배의 5 M NaCl, 1배의 이소프로파놀을 첨가하여 DNA를 침전시키고, 70% 에탄올로 무기염류를 제거한 후 건조시켜 얻어진 DNA를 TE 1 ㎖에 녹였다.

λ Gem-11 파아지 벡터 내에 존재하는 미꾸라지 베타-액틴 유전자의 제한 효소 지도를 만들기 위해 Bam HI, EcoR I, Hind III, Pst I, Sac I, Xba I, Xho I 등의 제한 효소를 단일 또는 적절히 조합하여 DNA를 각각 절단한 후 전기영동하여 나타난 절편의 크기를 비교하여 각 제한 효소들의 위치를 지도화 하였다.

도 1은 미꾸라지 베타-액틴 유전자를 포함하는 박테리오파아지 DNA의 제한 효소 지도를 나타낸 것이다.

파아지 DNA에서 베타-액틴 유전자를 포함하는 단편을 확인하기 위해 파아지 검색에 사용한 것과 동일한 탐침를 이용하여 서던 블롯(Southern blot)을 수행한 결과, 양성 신호를 나타내는 Xho I과 EcoR I의 3.4 kb인 베타-액틴 유전자를 포함하는 단편을 확인하였다.

④ 베타-액틴 유전자의 플라스미드 벡터로의 서브클로닝

미꾸라지 베타-액틴 유전자 클론을 플라스미드 벡터인 pBluscript II KS(-) (Stratagene, 미국; pBS)로 서브클로닝하기 위해, 서던 블롯 결과 확인된 베타-액틴 유전자를 포함하도록 절단하는 제한 효소인 Xho I과 EcoR I 각 10 U씩을 2 ㎍의 λ 파아지 DNA와 pBS 벡터와 2시간 동안 반응시키고 전기영동하여, 절단된 올바른 크기의 삽입 DNA와 벡터를 회수한 후, T4 DNA 리가제를 이용하여 리게이션시켰다.

형질전환은 하나한의 방법(Hanahan O., 1983. J. Mol. Biol., 166: 557-580)을 변형하여, 2 ㎕의 리게이트를 0.5 M CaCl₂처리한 대장균 숙주 세포 XL-1 blue MRF' 균주 100 ㎕와 섞어 4 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후 42 ℃에서 90초 동안 열처리하고, LB 배양액 1 ㎖을 첨가하여 37 ℃에서 45분간 배양하였다. 이 형질전환체를 원심분리(13,000 rpm, 20 초)하여 200 ㎕에 재현탁시킨 후, 암피실린 (50 ㎍/㎖)과 X-gal(50 ㎍/㎖)이 들어 있는 아가 플레이트에 도말하고 37 ℃에서 밤새 배양한 다음, 나타난 흰색 콜로니를 무작위로 선택하여 37 ℃에서 2 ㎖ LB 배양액에 밤새 배양하였다. 이 중 1.5 ㎖을 알칼리 용해 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하고 일부를 제한 효소로 절단하여 정확한 삽입체가 들어 있는지 여부를 확인한 다음, 이를 pmlβa34라고 명명하였다.

⑤ 베타-액틴 유전자의 제한 효소 지도 작성과 염기 서열 분석

pBS 벡터에 서브클로닝된 미꾸라지의 베타-액틴 유전자를 포함하는 3.4 kb 클론(pmlβa34)에 BamH I, Kpn I, Sac I, Xba I 등의 제한 효소들을 단일 또는 조합 반응시켜 각 제한 효소들의 위치를 지도화하고, 이를 기본으로 엑소뉴클레아제 III(Exonuclease III)를 이용한 Erase-a-base 방법(Henikoff, S., 1984. Gene 28: 357)에 따라, 한쪽 방향이 순차적으로 결손된 서브클론들을 얻어 염기 서열을 분석하였다.

먼저 플라스미드 pmlβa34 13 ㎍을, 제한 효소 절단 가닥이 3' 말단을 형성하여 Exo III에 의해 분해되지 않는 Sac I과, 5' 말단을 제공하여 Exo III에 의해 분해되는 BamH I으로 절단하고, 페놀·클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 절단된 DNA를 회수하여 56.3 ㎕의 증류수에 녹였다. 여기에 10배 Exo III 반응 완충 용액을 6.2 ㎕, Exo III(175 U/㎕)를 3.4 ㎕ 넣고 37 ℃에서 반응시키면서 30초 간격으로 2.5 ㎕씩을 분주하여, 미리 7.5 ㎕의 S I 뉴클레아제 혼합 용액을 넣어 얼음에 넣어 둔 시험관에 넣었다. 총 25개의 시험관으로 분주가 끝난 후 실온에서 30분간 S I 뉴클레아제와 반응시킨 다음, S I 반응 정지 용액 1 ㎕씩을 넣고 68 ℃에서 10 분간 열처리하여 반응을 중지시켰다. 각 시험관 당 10 ㎕의 반응액 중 2 ㎕를 전기영동하여 연속적인 결손을 확인하고, 나머지는 클레나우(Klenow) 혼합 용액 1 ㎕와 dNTP 혼합 용액 1 ㎕씩을 넣어 37 ℃에서 5분간 반응시켜 단일 가닥으로 남아있는 말단을 채웠다. 이어서, 리게이션 혼합 용액 40 ㎕씩을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켜 앞서와 같은 방법으로 대장균 숙주 세포 XL-1 blue MRF'에 형질전환시켰다.

다음은 각 반응 용액의 조성을 나타낸다.

제한 효소반응

pmlβa34(1.3 ㎍/㎕) 10 ㎕

BamH I(10 U/㎕) 1 ㎕

Sac I(10 U/㎕) 1 ㎕

10배 완충 용액 5 ㎕

증류수 33 ㎕

S I 뉴클레아제 혼합 용액

10배 S I 완충 용액 18.8 ㎕

S I 뉴클레아제 (50 U/㎕) 0.4 ㎕

증류수 168.3 ㎕

S I 반응 정지 용액

0.3 M Tris(pH 8.0)

0.05 M EDTA

클레나우 혼합 용액

Klenow 반응 완충 용액 50 ㎕

Klenow (5 U/㎕) 1.5 ㎕

클레나우 반응 완충 용액

20 mM Tris(pH 8.0)

10 mM MgCl₂

리게이션 혼합 용액

10배 리게이션 반응 완충 용액 80 ㎕

40% PEG 100 ㎕

0.1 M DTT 80 ㎕

T4 DNA 리가제(1 U/㎕) 5 ㎕

증류수 535 ㎕

형질 전환체를 도말하여 밤새 배양한 25 개의 플레이트에서 각각 콜로니를 무작위로 선택하여 LB 2 ㎖에서 밤새 배양한 후, 알칼리 용해방법으로 플라스미드 DNA를 추출하고 이를 제한 효소로 절단하여 결손된 크기를 확인하였다. 염기 서열 분석은 생거 등의 디데옥시 체인 터미네이션(dideoxy chain termination) 방법(Sanger, F., S. Nicklen 및 A. R. Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74: 5463-5467)에 의해 서열결정 키트(Sequenase version 2.0, USB, 미국)를 사용하여, 각각 결손된 클론들의 염기 서열을 읽어 중복되는 염기 서열을 통해 각 클론들의 염기 서열을 연결하고, 블라스트 서버(BLAST server)를 이용한 유전자 은행(GenBank) 검색을 통해 아미노산 서열 및 유전자 구조 등을 분석하였다.

서열 1은 클로닝된 미꾸라지 베타-액틴 유전자의 염기 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열, 그리고 5' 상위의 베타-액틴 유전자 조절 부위의 염기 서열을 나타낸 것이다.

베타-액틴 유전자의 염기 서열을 분석한 결과, 베타-액틴 유전자는 RNA로는 전사되나 아미노산을 암호화하지 않는 1번 엑손을 포함하여 GT-AT 엑손-인트론 경계법칙을 따르는 6개의 엑손으로 구성되어 있으며, 액틴 단백질은 2번 엑손내 번역 개시 코돈(ATG)으로부터 시작된 375개의 아미노산으로 구성되어 있을 것으로 추정할 수 있었다. 따라서, 클로닝한 7336 bp의 DNA에는 베타-액틴 유전자는 물론 4339 bp의 5' 유전자 상단부와 1170 bp의 3' 유전자 하단부를 포함하고 있다.

미꾸라지의 베타-액틴 유전자의 염기 서열은 잉어(common carp)와 89.4%, 쥐와 87.1%, 사람과는 86.4%의 상동성을 보이고, 아미노산 서열에서는 각각 98.4%, 97.9%, 98.1%의 상동성을 갖고 있다. 1990년 Liu 등은 잉어 베타-액틴 유전자의 염기 서열이 닭과 91%, 사람과 88.5%, 쥐와 87.9% 상동성을 보이고, 아미노산 서열에서는 각각 99.5%, 99%, 99% 상동성을 보이며, 전사 개시 부위에서 상위로 100 bp까지의 프록시말 프로모터 영역과 1번 인트론의 3′쪽 340 bp가 발현에 관여하는데, 이 부위의 염기 서열이 종간에 높은 상동성을 나타내고 있음을 보여주었다. 본 종 역시 이들 프록시말 프로모터 영역에서 CAAT 박스(CCAAT)와 CArG 모티프 (CCTTATATGG), 그리고 TATA 박스(TATAAAA)의 염기 서열들이 확인되었고, 1번 인트론의 3' 쪽에서 인헨서 염기 서열과 높은 상동성을 보이고 있어, 본 발명을 통해 얻어진 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위를 이용한 유용 유전자 발현 벡터가 여러 종에서 기능적으로 작동할 수 있는 가능성을 보여준다.

실시예 3: 베타-액틴 유전자 조절 부위의 클로닝

염기 서열 분석 결과 플라스미드 pmlβa34의 4093 bp 위치의 Xho I으로부터 반시계 방향으로 394 bp 앞에 번역 개시 코돈인 ATG 염기 서열이 존재하므로 3700 bp 위치의 Sty I 부위와 pBS 벡터내에 존재하는 670 bp 위치의 Not I 부위를 절단하고 블런트 리게이션시켜 베타-액틴 구조 유전자 부위를 제거한 pmlβa34S/N 플라스미드를 얻었다. 블런트 리게이션은 플라스미드 pmlβa34 1 ㎍을 반응 완충 용액과 제한 효소 Sty I 10 U 및 Not I 10 U을 넣고 반응 용적 20 ㎕에서 2시간 반응시킨 후, 10 ㎕를 아가로스 젤에서 전기영동하여 완전 절단을 확인하고, 나머지 반응액 10 ㎕와 60 ㎕의 S I 반응 용액(S I 뉴클레아제 15 U/ 0.3 ㎕, 10배 반응 완충 용액 6 ㎕, 증류수 53.7 ㎕)을 실온에서 30분간 처리하여 절단 말단의 단일 가닥을 제거하여 시행하였다. 이 후 70 ㎕의 반응 용액 중 10 ㎕를 40 ㎕의 리게이션 혼합 용액(10배 반응 완충 용액 4 ㎕, 40% PEG 4.9 ㎕, 0.1 M DTT 0.4 ㎕, T4 DNA 리가제 0.28 ㎕, 증류수 30.4 ㎕)과 섞어 실온에서 밤새 반응시키고, 이 중 10 ㎕를 앞서와 같은 방법으로 대장균 숙주세포 XL-1 blue MRF'에 형질전환시켰다. 나타난 콜로니들을 임의로 선택 배양하여 플라스미드를 추출하고 제한 효소 반응을 통해 베타-액틴 구조 유전자 부위가 제거된 클론을 확인하여 이를 pmlβa34S/N으로 명명하였다. 이어서, 이를 Xho I으로 완전 절단 후 BssH II로 부분 절단하여 444 bp의 조절 부위 단편을 확보하였다.

또한 베타-액틴 유전자 조절 부위의 클로닝을 위해 3.4 kb 클론의 5' 상위의 Xba I, Xho I의 3.9 kb 단편 역시 pBS 플라스미드 벡터의 Xba I, Xho I 위치에 클로닝하여 pmlβa39 플라스미드를 얻은 후, 염기 서열 분석을 위하여 Xho I 바깥쪽 pBS 벡터내의 Kpn I과 조절 부위 상위의 Xba I으로 잘라내 pUC19 벡터(NEB, 미국)의 동일 제한 효소 위치로 옮기고, 3' 말단을 형성하여 Exo III에 의해 분해되지 않는 Sph I과 5' 말단을 제공하여 Exo III에 의해 분해되는 Xba I으로 잘라 Erase-a-base 방법으로 염기 서열을 분석하였다.

다음에, 유용 유전자들의 재조합을 용이하게 하기 위해, pmlβa39 플라스미드의 염기 서열 분석 결과 Xba I에서 186 bp 떨어진 곳에 위치하는 제한 효소 Sac I 절단 부위를 제한 효소 Sac I으로 절단 후 블런트 리게이션시켜 제거하고, 앞서와 같이 이를 Xho I으로 완전 절단 후 BssH II로 부분 절단하여 6584 bp의 단편을 얻었다. 여기에 앞서 얻은 pmlβa34S/N의 Xho I, BssH II 444 bp의 단편을 결합하여 번역 개시 코돈 상위 4151 bp의 완전한 베타-액틴 조절 부위를 갖는 플라스미드 pmlβa41을 제조하였다.

도 2는 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 플라스미드 pmlβa41의 클로닝 과정을 나타낸 모식도이다.

이상과 같이 제조된 플라스미드 pmlβa41는 대장균 숙주 세포(Escherichia coli XL-1 blue MRF')에 형질전환시켜 생명공학연구소에 1998년 5월 12일자 기탁번호 KCTC 8889P호로서 기탁되어 있다.

실시예 4: 베타-액틴 유전자 발현 조절에 의한 형광 단백질의 발현

① 형광 단백질 발현 벡터의 제조

미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위의 발현 조절 능력을 확인하기 위하여 표지 유전자로 매우 유용한 해파리(Aequorea victoria)에서 유래된 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP) 유전자를 이용하였다. 녹색 형광 단백질 발현 벡터 (phGFP-S65T; Clonetech, 미국)를 Mlu I과 Sac I으로 절단하여 586 bp의 발현 조절 부위인 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 부분을 제거하고, 플라스미드 pmlβa41을 제한 효소 BssH II와 Sac I으로 절단하여 얻은 4202 bp의 단편을 리게이션시켜 베타-액틴 유전자 조절 부위에 의해 녹색 형광 단백질의 발현 조절을 받는 플라스미드 pmlβaGFP를 제조하였다.

도 3은 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위와 해파리 기원의 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합한 pmlβaGFP 플라스미드 발현 벡터의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.

② 베타-액틴 유전자 발현 조절에 의한 형광 단백질의 발현

베타-액틴 유전자의 발현 조절 능력을 확인하기 위하여 앞서 제조한 플라스미드 pmlβaGFP 벡터를 배양중인 세포주에 형질도입하여 GFP의 발현 정도를 측정하였다. 대조군으로 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 갖고 있는 phGFP-S65T를 형질도입하여 비교하였으며, 배양 세포내로의 형질전환 효율의 보정은 pCMV-LacZ 벡터를 함께 도입함으로써 정량 분석하였다. 배양 세포주로는 연어 배아 세포주(Chinook salmon embryonic cell line; CHSE-214), 사람 혈구암 세포주(Human erythropoietic cell line; K562), 원숭이 신장 세포주(African Green Monkey kidney cell line CV1 derived E25B2), 쥐의 혈구암 세포주(Mouse erythroid leukemia cell line; MEL)를 이용하였는데, CHSE-214, K562, MEL 세포주에는 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로, 그리고 E25B2 세포주에는 인산칼슘 침전법으로 각각 형질도입하였다.

CHSE-214 세포주는 10 %의 소태아혈청(Sigma, 미국; FBS)이 들어있는 DMEM 배양액에서 배양하고, 트립신-EDTA를 처리하여 배양 용기로부터 떼어낸 후 PBS와 HBS(21 mM HEPES; pH 7.05, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na₂HPO₄, 6 mM glucose)로 세척하여 최종 밀도가 5 X 10⁶세포/㎖이 되도록 HBS에 재현탁하였다. 이중 800 ㎕의 세포와 10 ㎍/200 ㎕의 플라스미드 DNA를 큐벳에 넣고 섞어 얼음에서 3분간 정치 후 일렉트로포레이터(electroporator)에 장착하고 500 ㎌, 330 V의 조건으로 전기 충격을 주었다. 다음에, 얼음에서 10분간 정치 후 세포를 배양 용기로 옮겨 배양액을 더해주고 18 ℃에서 72시간 배양하였다.

K562 세포는 10%의 송아지 혈청(Hyclone, 미국; BCS)이 들어있는 RPMI 1640 배양액에서, MEL 세포는 10%의 BCS(Hyclone, 미국)가 들어있는 DMEM 배양액에서 37℃, 5% CO₂, 100% 습도를 유지하며 부유 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수하고, 상기와 같이 일렉트로포레이션 방법으로 플라스미드 DNA를 형질도입하였다. 일렉트로포레이션 조건은 K562 세포의 경우 50 ㎌, 500 V로 2 회, MEL 세포의 경우 50 ㎌, 1000 V로 전기 충격을 주었다.

E25B2 세포는 10%의 BCS(Hyclone, 미국)이 들어있는 DMEM 배양액에서 37℃, 5% CO₂, 100% 습도를 유지하면서 배양하고, 형질도입은 그래이엄과 에브(Graham, F. L., van der Eb, A. J., 1973. Virology 52: 456-467)의 인산칼슘 침전법을 이용하였다. 형질도입 전날 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 회수한 후 100 mm 플레이트당 1 X 10⁶개의 세포를 깔아 밤새 배양하고, 형질도입 2 시간 전에 새로운 배양액으로 교체하였다. 플라스미드 DNA는 플레이트당 10 ㎍을 에탄올 침전하여 20 ㎕의 TE에 녹이고 여기에 50 ㎕의 2.5 M CaCl₂와 430 ㎕의 0.1X TE를 넣어 잘 혼합하였다. 다음에, 폴리프로필렌 재질의 시험관에 500 ㎕의 2X HBS(42 mM HEPES; pH 7.05, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na₂HPO₄, 12 mM 포도당)를 넣고 부드럽게 보르텍스 혼합하면서 앞의 DNA/CaCl₂혼합물을 적가하였다. 이들 DNA/CaCl₂/phos- phate 혼합물을 실온에서 30 분간 정치시켜 흰색 침전이 확인되면 부드럽게 부수어 세포 배양액 위에 적가하고 가볍게 2∼3회 흔들어 준 다음 배양기에서 60시간 동안 배양하였다.

유전자가 도입된 세포는 도입 60-72시간 후 수거하여 형광 현미경으로 GFP를 발현하는 세포 수를 계수하여 발현 비율을 분석하였으며, 일부는 LacZ 염색으로 대장균 LacZ 유전자를 발현하는 세포를 계수하여 [GFP]/[LacZ]의 값을 구하여 GFP의 발현양을 정량 분석하였다.

도 4는 E25B2 세포주에서 CMV 프로모터와 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 플라스미드 pmlβa41에 의한 GFP의 발현 조절 양상을 비교한 사진으로, 도 4a는 CMV 프로모터에 의한 발현 결과이고, 도 4b는 pmlβa41에 의한 발현 결과를 보여주는 사진이다.

CHSE-214, K562, MEL 세포주에서는 CMV 프로모터에 의한 발현 조절이 더 많은 세포들에서 GFP의 발현을 유도하였으나, GFP의 밝기로 볼 때 세포당 발현양은 미꾸라지 베타-액틴 조절 부위가 더 강하게 발현을 조절하는 양상을 보였다. 또한 E25B2 세포에서의 베타-액틴 조절 부위에 의한 GFP 발현은 전체적으로 강력한 발현 조절 부위로 사용되는 CMV 프로모터에 비해 약 절반 정도의 발현 조절 능력을 나타내었다.

표 1은 E25B2 세포주에서 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 플라스미드 pmlβa41와 CMV 프로모터에 의한 GFP의 발현 조절 양상을 비교한 것이다.

	CMV-GFP	mlβa-GFP
	GFP	LacZ	[GFP] / [LacZ]	GFP	LacZ	[GFP] / [LacZ]
	발현세포수 / 전체세포수	%	[GFP] / [LacZ]	발현세포수 / 전체세포수	%	[GFP] / [LacZ]	발현세포수 / 전체세포수	%	발현세포수 / 전체세포수	%
123456789	183 / 90015 / 48929 / 1950105 / 1980174 / 5844157 / 5940138 / 428489 / 418012 / 703100.2 / 2919	20.333.071.495.302.982.643.222.131.713.43	54 / 4098 / 40714 / 266059 / 1035220 / 5709340 / 5940109 / 406575 / 22103 / 19598 / 2514	13.201.970.535.703.855.722.683.391.543.90	1.541.562.830.930.770.461.200.631.110.88	134 / 64629 / 43354 / 328086 / 148598 / 594584 / 6044110 / 439066 / 418611 / 246774.67 / 3208	20.746.701.655.791.651.392.511.580.452.33	90 / 33411 / 12355 / 2900159 / 1035299 / 5773361 / 5929244 / 4017113 / 23137 / 1210148.8 / 2626	26.958.941.9015.365.186.096.074.890.585.67	0.770.750.870.380.320.230.410.320.770.41

이상 표 1 및 도 4에서 보듯이, 미꾸라지와 다른 알려진 종들간의 베타-액틴 유전자 조절 부위에서의 상동성으로 인하여, 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 발현 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 연어 배아 세포주(CHSE-214), 사람 혈구암 세포주(K562), 원숭이 신장 세포주(E25B2), 쥐의 혈구암 세포주(MEL) 등 다양한 기원의 배양 세포주에서 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 포유류 및 어류를 포함하는 다양한 기원의 배양 세포주에서 정상적으로 작동하여 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있음을 알 수 있다.

즉, 본 발명의 미꾸라지 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 어류에서 유용 유전자의 발현에 유용하게 사용될 수 있으며, 이에 따라 성장 호르몬 유전자, 내병성 유전자 및 기타 생리 활성 물질 생산 유전자 등 유용 유전자를 어류에서 발현시킴으로써 우수한 신품종 어류의 개발에 사용될 수 있을 것이다.

〔서열 목록〕

서열 번호: 1

서열의 길이: 7314

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 2본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: genomic DNA

기원:

생물명: 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)

Claims

서열 1에 기재된 염기 서열로 표시되는 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 및 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 DNA.
미꾸라지의 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터 pm1βa41 (KCTC 8889P).