KR100263582B1 - 빙핵활성 미생물제제의 회수방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 빙핵 형성 활성을 갖는 미생물의 안정화 및 회수 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 신규한 빙핵활성 미생물의 제조공정중 최대의 빙핵형성능을 갖는 빙핵미생물의 건조공정에 관한 것으로, 빙핵 형성 활성을 갖는 미생물 배양액을 농축하고, 농축 배양액을 동결시키고, 상기 동결물을 초기 건조 온도 25∼35℃에서 건조하고, 품온이 -3℃ 이상이 되면 건조 온도를 10∼18℃로 유지하여 동결건조하는 것으로 이루어진다.

Description

빙핵활성 미생물제제의 회수방법

본 발명은 빙핵활성 미생물의 회수방법, 특히 동결건조를 통한 회수방법에 관한 것으로 빙핵활성미생물의 최대 빙핵활성능을 갖는 미생물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

생물학적 원인에 의한 서리 및 냉해 현상과 관련하여, 지난 20여년동안 빙핵의 생물학적 근원에 대한 연구가 많은 과학자들에 의해 진행되어, 식물의 상해 원인이 기후적인 영향에 기인한 단순한 현상이 아니라 미생물에 의해 촉진되는 생화학적 현상이라는 것이 밝혀지게 되었다. 상해의 원인이 미생물의 빙핵형성 단백질(ice nucleation protein)로부터 기인한다는 사실이 밝혀진 이후, 빙핵형성 단백질에 관한 연구가 본격적으로 시작되어, 이 단백질이 빙핵(ice-nuclei)으로 작용한다는 것을 알게 되었고, 이러한 빙핵 형성 단백질을 생산하는 미생물들은 식물잎의 표면에 서식하는 엽면 미생물(ephiphytic microorganisms)로 밝혀졌다.

일반적으로 물은 0℃에서 어는 것으로 알려져 있으나, 실제로 순수한 물은 -39℃정도의 과냉각 상태(super cooling condition)를 거쳐서 얼음이 된다. 그런데, 빙핵활성 단백질이 존재하면 물의 어는점을 -2℃ 내지 -4℃정도로 상승시켜 물의 결빙을 촉진시킬 수 있다. 즉, 결빙 과정에서 물은 -39℃정도의 과냉각 상태가 필요하지만, 빙핵활성 단백질이 존재하면 -2℃내지 -4℃ 정도의 과냉각을 요구하므로 그만큼의 에너지를 절약할 수 있다. 이와 같은 에너지 절약 효과를 위하여 빙핵활성 단백질은 여러 산업분야에 응용되고 있는데, 예를 들어 빙핵형성 미생물(icenucleating microorganism)을 보다 높은 온도에서 인공적으로 눈을 제조하기 위한 빙핵으로 사용하는 것이 보고되었으며, 또 냉동식품의 동결촉진제로 이용하는 것이 보고되었다.

빙핵형성 미생물은 인공제설의 촉진제로 널리 이용되고 있으며, 인공강우 촉진제로 이용하면 한발에 대비하여 인공강우를 유도할 수 있어서 현재 현장시험을 진행하고 있다. 결론적으로, 동결과정에 관련된 전 산업분야에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

한편, 이와 같은 산업적 이용을 위해서는 빙핵활성 미생물 제제가 일정한 기간동안 안정된 역가가 유지되어야 하는 것이 필수적이다. 일반적으로 빙핵활성 미생물 제제는 빙핵활성 미생물을 생산하여 균체 농축액을 건조하고 살균하는 과정을 거쳐 제제화되는데, 이 과정에서 균체 농축액의 건조 과정에서 빙핵 활성 미생물 제제의 빙핵활성능은 상당한 정도로 손실된다. 빙핵활성능 손실을 최소화하기 위하여주로 동결건조를 통해 빙핵활성 미생물을 건조시키고 있으나, 동결건조 역시 여전히빙핵 활셩능 손실을 가져온다. 동결건조시 건조 온도가 높으면 건조 시간은 줄일 수 있으나 빙핵 활성능 손실이 커지고, 건조 온도가 낮으면 빙핵 활성능 손실은 줄일 수 있으나 건조 시간이 과도하게 늘어나 경제성이 낮아진다.

미국특허 4,706,463에는 슈도모나스 시린제의 제조방법으로 발효배양액을 농측하고 이 미생물 농축액을 냉동 펠렛으로 만들기 위하여 상기 미생물 농축액을 가는 흐름형태로 액체질소와 접촉시켜 동결시키고, 25℃이하에서 동결건조하여 빙핵활성미생물을 미생물 배양액으로부터 회수, 건조하는 방법이 기재되어 있다.

일본 특허출원 평성 1-53066에는 발효배양액을 농축시켜 생성물 온도를 50℃미만으로 유지하면서 상기 농측액를 분무건조시키는 단계로 구성되는, 빙핵활성 미생물을 발효배지로부터 회수하는 방법이 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 빙핵활성 미생물의 빙핵활성능 손실을 최소화할 수 있는 빙핵활성 미생물의 동결 건조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 보다 빠른 시간으로 빙핵활성 미생물의 빙핵활성능 손실을 최소화할 수 있는 빙핵활성 미생물을 동결건조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 빙핵활성 미생물의 빙핵활성능 손실을 최소화할 수 있는, 빙핵활성 미생물의 동결건조 안정화 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 빙핵활성능 손실을 최소화하면서 동시에 건조 시간을 줄일 수 있도록 농축물을 동결건조시키는 것으로 이루어지며, 동결 건조시 건조 온도를 초기에는 약 25∼35℃로 유지하고, 품온이 -3℃이상, 바람직하게는 0℃이상이 되면 건조 온도(이하 '후기전조온도'라 함)를 10∼18℃ 유지하여 동결건조하는 것으로 이루어진다.

본 발명에서 초기 건조 온도는 25∼35℃가 바람직하며, 28∼32℃가 더욱 바람직하다. 초기 건조 온도가 25℃보다 낮으면 건조 시간이 길어지며 35℃보다 높으면 빙핵활성능의 손실이 커져 바람직하지 못하다. 건조 온도를 품온이 -3℃이하에서 변화시키면 건조시간이 길어진다.

후기 건조 온도는 10∼18℃가 바람직하며, 13∼16℃가 더욱 바람직하다. 후기 건조 온도가 10℃보다 낮으면 건조 시간이 길어지며 18℃보다 높으면 빙핵활성능의 손실이 커져 바람직하지 못하다.

본 발명의 방법에서, 미생물의 빙핵 활성능 감소를 최소화하기 위하여 빙핵 형성 미생물 배양액의 농축시 배양 온도 이하의 저온상태에서 농축하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 미생물의 빙핵 활성능 감소를 최소화하기 위하여 동결시 동결보호제 및 건조시 빙핵단백질의 안정제로서 pH를 배양액의 pH와 동일하게 유지시키는 포스페이트 완충액(pH6.8)과 이당류 1∼5%(w/v), MSG1∼5%(w/v), 당알콜 1∼5%(w/v) 등을 첨가하여 동결하는 것이 바람직하다.

본 발명은 빙핵활성능이 있다고 알려진 미생물, 예를들면 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae)와 같은 슈도모나스속 미생물, 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)와 같은 어위니아속 미생물 등의 배양에 적용될 수 있으며, 특히 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 유용한 대표적인 미생물은 잔토모스나스(Xanthomons)속 미생물, 바람직하게는 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 계열 미생물이다.

본 발명에서 빙핵 형성능은 발리의 동결 방울수 계측법으로 측정하였다(Schnell, R. Cand G. Vali, Nature, 236:163-165(1972)). 즉, 배지에서 배양한 배양액을 pH 7.0인 10mM 인산완충용액에 현탁시켜 세포수를 OD at600nm:1(SpectronicGENESYS5 Spechophotometer, MILTON ROY, USA)이 되도록 즉, 3×10⁹cell/ml이 되도록 현탁액을 만들고, pH 7.0인 10mM 인산완충액으로 연속희석하여 일련의 10배 희석액을 제조하였다. 이 희석액들은 파라핀으로 코팅된 알루미늄 블럭에 5㎕씩 20방울을 분주하여 냉각 수조(refrigerated batch circulater, JEIO TECH, 한국)에 올려놓고, 0℃에서 -10℃까지 0.6℃/min의 일정한 속도로 냉각시키면서 과냉각 온도(supercooling temperature)에 따른 동결 방울수를 계수하여 다음 식에 따라 계산한다. 일반적으로 빙핵을 3가지 타입으로 분류한다. -2℃∼-5℃까지의 빙핵을 타입I으로 분류하고 -6℃∼-8℃의 빙핵을 타입Ⅱ, -8℃ ∼-10℃의 빙핵을 타입Ⅲ로 분류한다.(Ruggles et al. 1993 Jounnl of bactedology 175(22):7216-7221) 특히 0℃에서 -5℃까지 냉각시키면서 생기는 동결 방울수를 계수하여 다음 식에 따라 계산하여 타입 I 빙핵수를 측정하였다.

CNI = - Ln(1-F) / (V ×D)

CM : 누적 빙핵수 f : 동결 방울의 분율

V : 방울의 부피 D : 희석 배율

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

빙핵활성 미생물 잔토모나스 켐페스트리스 KCTC0152BP의 배양

잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) KCTC0251BP를, 표 1의 액체 배지 200L에서 배양온도를 18℃로 하여 배양하였다. 배양 pH가 pH6.8∼pH7.0의 범위에서 유지되도록 3N NaOH와 3N H₂SO₄를 이용하여 조절하면서 48시간 회분배양하였다. 배양된 빙핵활성미생물에 대해, 앞에 기재된 방법으로 빙핵 활성능을 측정하였으며 타입 I의 빙핵활성능 3.2 × 10⁸/mL을 얻었다.

[표 1]

[실시예 2]

빙핵활성미생물의 회수 및 동결건조

실시예 1의 방법으로 배양한 빙핵활성 미생물을 연속원심분리기(α-label co., Ltd. USA)를 이용하여 농축시켰다. 이때 원심분리기는 냉각수를 이용하여 농축액의 온도가 배양액의 온도(18℃)보다 더 높아지지 않도록 충분히 저온상태(18℃이하)를 유지시켰다. 이 농축액에 동결건조공정과 제품의 빙핵활성능을 안정하게 유지하기 위하여 안정제로서 수크로오스 2%(w/v), MSG 1%(w/v), 만니톨 2%(w/v)을 첨가하여 완전히 혼합시켰다. 이 농축액을 각각 2L씩 동결건조기용 용기에 두께가 1cm 이하가 되도록 분주하여 동결시켰다. 이 동결액을 동결건조기에 넣고, 각각 표 2에 기재된 조건으로 건조하였다. 각 조건으로 동결건조된 미생물에 대해, 앞에 기재된 동결 방울계수법에 의하여 타입 I 빙핵활성능을 측정하였으며 그 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

본 발명의 방법에 의해, 빙핵활성 미생물의 빙핵활성능의 손실을 최소화함과 동시에 동결 건조시간을 줄일 수 있으므로, 빙핵활성 미생물 제제를 보다 경제적으로 생산할 수 있다.

Claims (4)

1. 빙핵 형성 활성을 갖는 미생물 배양액을 농축하고, 농축 배양액을 동결시키고, 상기 동결물을 초기 건조 온도 25∼35℃에서 건조하고, 품온이 -3℃이상이 되면 건조 온도를 10∼18℃로 유지하여 동결건조하는 것으로 이루어지는, 발효 배지로부터 빙핵 형성 활성 미생물을 회수하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 잔토모나스 속 미생물인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 배양액의 농축이 상기 미생물의 배양 온도 이하의 온도에서 수행되는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 농측 배양액을 동결이 이당류 1∼5%(w/v), MSG 1∼5%(w/v) 및 당알콜 1∼5%(w/v)로 이루어지는 안정제 존재하에서 수행되는 방법.