KR0169093B1

KR0169093B1 - 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법

Info

Publication number: KR0169093B1
Application number: KR1019940030508A
Authority: KR
Inventors: 현창기; 나광휘; 홍승서; 이현수; 강충경
Original assignee: 김경환; 주식회사삼양제넥스
Priority date: 1994-11-19
Filing date: 1994-11-19
Publication date: 1999-01-15
Also published as: KR960017844A

Abstract

본 발명은 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 빙핵활성 미생물을 이용한 빙핵활성 촉진제에 안정제를 가하여 높은 빙핵활성능을 유지하는 미생물 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법은 동결건조에 의한 빙핵활성능의 역가 저하를 효율적으로 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 저장중의 역가도 안정되게 유지 할 수 있는 효과가 있다.

Description

빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법

본 발명은 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 빙핵활성 미생물을 이용한 빙핵활성 촉진제에 안정제를 가하여 높은 빙핵활성능을 유지하는 미생물 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

빙핵활성 단백질(ice nucleation protein)은 주로 식물잎의 표면에 생존하는 미생물로서 부터 생성되어 미생물 세포의 외막에 존재하는 단백질로서, 물의 동결과정에서 빙핵으로 작용하여 결빙을 촉진하는 기능을 갖는다. 결빙과정에서 물은 과냉각되기 때문에 대량의 에너지가 소모되나, 빙핵활성 단백질을 이용하면 빙행 작용에 의하여 과냉각시 필요한 에너지를 절감할 수 있으므로, 빙핵활성 단백질은 결빙 촉진제의 유효성분으로서 널리 응용 되고 있다.

이러한 빙핵활성 단백질을 생성하는 미생물은 이미 슈도모나스(Pseudomonas), 잔토모나스(Xanthomonas) 및 어위니아(Erwinia) 등이 발견 되어 보고되었다 (참조 : 일본특개소 63-102672, 63-102673, 63-291577 ; 일본 특개평 1-171477, 1-285186, 2-76589). 빙핵활성 미생물 제제는 인공제설분야에서의 응용연구가 진행됨에 따라, 인공설을 만드는 스키장에서 제설 촉진제로 사용되고 있으며, 제빙, 동결농축, 동결건조, 식품의 동결 및 저장 등의 산업분야에 널리 응용하고자, 용도개발의 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 이와 같으 산업적 이용 및 용도개발을 위해서는 빙핵활성 미생물 제제의 안정된 역가 유지가 필수적 과제로 대두된다. 즉, 빙핵활성 미생물 제제의 제조과정은 배양한 빙핵활성 세균의 균체 농축액을 동결건조하여 살균과정을 거쳐 제제화하는데, 이 과정에서 동결전조시 상당한 빙핵활성능의 손실을 가져오게 된다는 것이 당업계의 문제점으로 지적되었으나 아직까지 이러한 역가 손실의 문제를 해결할 만한 안정화 방법에 관하여 보고된 바가 전혀 없는 실정이다.

이에, 본 발명의 발명자들은 슈도모나스, 잔토모나스 및 어위니아 등 산업적으로 이용될 수 있는 빙핵활성 미생물에 대하여, 동결건조시 역가의 저하를 방지하도록 제제화한 다음, 안정제로서 이당류(수크로스, 트리할로스 등), 다당류(덱스트린, 전분 등), 당 알콜(솔비톨, 만니톨 등) 및 단백질 가수분해물 (카제인 가수분해물, 효모 가수분해물 및 펩톤 등) 등을 적절한 농도로 첨가한 결과, 빙핵활성 미생물 제제의 역가저하가 획기적으로 방지되며 높은 빙핵활성능이 안정하게 유지되는 것을 발견하고 본 발명의 완성화게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 안정제를 첨가하여 빙핵활성능의 역가를 안정하게 유지할 수 있는 빙핵활성 미생물 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

빙핵활성 미생물인 슈도모나스, 잔토모나스 및 어위니아를 질소원 및 인의 농도가 제한된 배지조건하에서 생장속도를 느리게 배양하여 고빙핵활성능을 갖는 미생물 균체를 얻었다. 그런 다음, 배양약을 원심분리하여 일정농도의 농축액으로 농축하고 동일한 부피로 나누고, 안정제를 첨가하여 동일한 조건에서 동결건조하엿다. 건도된 시료는 균질하게 분말화하여 4℃에 저장하고,동결건조시 및 저장중의 빙핵활성능을 발리(vali)에 의해 고안된 drop freezing method(참조 : Vali, G.J., J. Atoms. Sci., 28:402-495(1971))로 측정하였다. 안정제로는 이당류로서 수크로스, 트리할로스 등 ; 다당류로서 덱스트린, 전분 등 ; 당알콜로서 솔비톨, 만니톨 등; 및, 단백질 가수분해물로서 카제인 가수분해를, 효모 가수분해물, 펩톤 등 을 단독 또는 2종이상을 첨가하여 사용하였다. 본 발명의 안정제를 첨가하였을 경우에는, 첨가하지 않은 경우에 비하여 동결건조에 의한 역가의 손실이 적고 저장중의 역가도 안정되게 유지할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법에 따르면, 동결건조에 의한 빙핵활성능의 역가 저하를 효율적으로 방지할 수 있을 뿐만아니라, 저장중의 역가도 안정되게 유지할 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예의 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

빙핵활성 미생물이 슈모나스 시링게 (Pseudomonas syringae, KCTC1832)를 300L의 발효조(B.Braun Co., Ltd.)에서 배양약을 200 L로 하여 배양하였다. 종 배양(seed culture)은 500㎖ 삼각 플라스크에서 배양액을 50㎖로 하여 25℃, 200rom의 조건으로 12시간 동안 진탕배양한 후, 30 L 발효조 (B.Braun Co., Ltd.)의 20 L 배양액에 접종하여 25℃, pH 6.4 내지 6.8, 용존산소량 10%이상으로 조절하면서 12시간 배양한 다음, 종균액으로 이용하였다. 종배양 배지의 조성은 글리세롤 20g/1, 효모 추출물 2g/1, 박토 펩톤 3.3g/1m N.B,(nutrient broth) 2,7g/1 이었고, 본 배양의 배지조건은 글리세롤 40g/1, 효모 추출물 6g/1, MgSO₄·7H₂O 0.5g/1, KH₂PO₄0.7g/1, (NH4)₂SO₄3.0g/1, 트리-소디움 사이트레이트 0.2g/1, 미량 원소 용액(CaCl₂·2H₂O 11g/l, FeSO₄·7H₂O 7g/l, MnSO₄·5H₂O 4g/l, ZnSO₄·7H₂O 4g/l, CuSO₄·7H₂O 2g/l) 2㎖로 하였다. 본 배양에서의 pH 조절은 3 N HCl과 3 N NaOH를 이용하여 6.4 내지 6.8을 유지하도록 하였으며, 온도는 25℃ 이하, 용존 산소량은 10% 이상이 유지되도록 통기량과 교반속도를 조절하면서 20시간 동안 배양하였다.

균체농도 10g/l로 얻은 배양액을 연속원심분리기(Alfa-laval Co., Ltd.)를 사용하여 시간당 120L의 속도로 주입하고, 원심분리기의 온도를 20℃ 이하로 유지하면서 균체를 분리농축하여, 균체농도가 100g/l의 농축액 20L를 얻었다. 이어, 농축액 5L를 1L씩 나누어 안정제로서 수크로스 0, 12.5, 25, 50, 100g을 각각 첨가하여 녹인 다음, 판용기에 두께가 1㎝가 되도록 분주하고 -60℃의 냉동고에 넣어 3시간 동안 급속동결시켰다. 동결된 시료를 냉동건조기(Labconco Co., Ltd)에서 가열판 온도를 10℃로 조절하면서 품온이 5℃가 될 때까지 24시간 동안 건조하였다. 건조된 시료를 작은 입자로 분말화하여 4℃에 저장하였다.

각 조작단계별 시료의 빙행활성 역가는 발리의 drop freezing method로 측정하였다: 즉, 시료를 10mM의 인산완충용액(pH 7.0)에 현탁시켜 세포수를 3×10⁹㎖이 되도록 현탁액을 제조하고, 증류수로 연속희석하여 일련의 10배 희석액을 제조하였다. 이 희석액들을 파라핀으로 코팅된 알루미늄 호일에 5㎖씩 20방울을 분주하여 냉각수조에 올려놓은 후, 0℃에서-20℃까지 일정한 속도로 냉각시키면서 과냉각 온도에 따른 동결 방울수를 계수하고 빙핵수를 다음 식에 따라 계산하였다.

빙핵활성 역가는 현탄액 1㎖당 클래스 A(class A, -4.6℃)의 빙핵수로 나타내었다. 각 조작단계별 시료의 빙행활성 역가는 표 1과 같다.

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 동결건조 직후의 역가는 안정제를 첨가하지 않은 경우 4.4×10/㎖이었고, 수크로스를 1.25%, 2.5%, 5.0% 및 10.0%로 첨가한 경우는 각각 5.7×10/㎖, 1.0×10/㎖, 2.1×10/㎖ 및 3.2×10/㎖이었다. 이상의 결과로 부터, 수크로스 농도에 따른 빙핵활성 역가는 비례하나, 약 5 내지 10%가 바람직함을 확인할 수 있었다.

[실시예 2]

안정제로서 솔비톨을 0, 12.5, 25, 50 및 100g을 각각 첨가하여 실시예의 1의 방법으로 동결건조 조작을 반복 실시하였다. 그 결과, 2.5%의 솔비톨을 첨가한 경우, 동결건조 후의 역가가 7.1×104/㎖로서 안정화 효과가 가장 높았다.

[실시예 3]

안정제로서 카제인 가수 분해물믈 0, 12.5, 25, 50 및 100g을 첨가 하여, 실시예 1의 방법으로 동결건조 조작을 반복 실시하였다. 그 결과, 1.25%의 카제인 가수분해물을 첨가한 경우, 동결건조 후의 역가가 1.4×10/㎖로서 안정화 효과가 가장 높았다.

[실시예 4]

안정제로서 수크로스 100g 솔비톨 25g을 첨가하여 실시예1의 방법으로 동결건조 조작을 반복 실시하였다. 그 결과, 동결건조 후의 역가가 3.6×10/㎖로서 수크로스를 10%만 첨가한 경우에 비하여 안정화 효과가 약간 증가하였다.

[실시예 5]

안정제로서 수크로스 100g 카제인 가수분해물 12.5g을 첨가하여 실시예 1의 방법으로 동결건조 조작을 반복 실시하였다. 그 결과, 동결건조 후의 역가가 3.7×10/㎖로서 수크로스를 10%만 첨가한 경우에 비하여 안정화 효과가 약간 증가하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 안정제로서 이당류, 당알콜 및 단백질 가수분해물 등을 적절한 농도로 첨가하여 동결건조시 역가의 저하를 방지하여 높은 빙핵활성능을 유지하도록 하는 빙핵활성 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

Claims

동결건조시 이당류, 다당류, 및 단백질 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택 된 1종 이상의 물질과, 솔비톨 및 만니톨로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이 당알콜을 안정제로 첨가하는 공정을 포함하는 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법.
제1항에 있어서, 이당류는 수크로스 또는 트리할로스인 것을 특징으로 하는 빙핵활성 미생믈 제제의 안정화 방법.
제1항에 있어서, 다당류는 덱스트린 또는 전분인 것을 특징으로 하는 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법.
제1항에 있어서, 단백지 가수분해물은 카페인 가수분해물, 효모 가수분해물 및 펩톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의물질인 것을 특징으로 하는 빙핵활성 미생물 제제의 안정화 방법.