KR100258826B1

KR100258826B1 - Cd28 발현의 조절을 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR100258826B1
Application number: KR1019970705496A
Authority: KR
Inventors: 로버트 씨 탐
Original assignee: 와트 씨 데이빗; 아이씨엔 파마슈티컬스 인코포레이티드; 해리 에이 루스제
Priority date: 1995-02-09
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2000-07-01
Also published as: CN1181021A; SK108697A3; CZ250097A3; MX9705963A; JP2002515013A; AU5295896A; AU703139B2; KR19980702101A; CA2211621A1

Abstract

올리고머는 T-세포내에서 CD28 유전자를 감소시킬 수 있는 것이 제공된다. 특이적 서열에 추가하여, 발명은 3 내지 5염기에 의해 분리된 GGGG의 적어도 두 서열을 가지는 올리고머의 종류를 포함한다. 목적은 CD28 유전자, 5′비번역 부분 및 개시코든, 및 그들의 각 전사물을 포함한다. 방법은 이식조직 대 숙주 질병, 패혈병성 쇼크 증후군, 바이러스성 질병, 건선, I형(인슐린-의존성) 당뇨병, 갑상선염, 유육종증, 다발성 경화증, 자가면역 포도막염, 류마티스성 관절염, 전신계 홍반성 낭창 및 염증성 보울병을 포함하는 면역계 중개의 질병내에서의 면역계에 대한 병리적 효과를 조절하기 위한 올리고머의 사용을 포함한다.

Description

CD28 발현의 조절을 위한 방법 및 조성물

생명을 위협하는 감염에 대해 면역계가 고등생물을 보호하는데 있어서 중요한 역할을 담당하고 있으며, 또한 면역계는 다양한 질병의 병인론(pathogenesis)에서 중요한 역할을 담당한다. 면역계가 한 역할을 담당하는 그러한 질병은, 예를 들면 전신계 홍반성 낭창과 같은 면역계가 자가(autologous) 항원에 대하여 반응하는 자가면역 질병, 또는 예를 들면 조직이식 거부에서 발견되는 이식조직 대 숙주 질병과 같은 외래 항원에 대한 반응에 의해 개시되는 면역조절과 관련된 질병을 포함한다.

많은 일반적 T-세포 중개 질병의 발생 및 악화하는 비정상적 T-세포 활성화에서 유래되는 부적절한 면역반응에서 초래한다. 활성화된 T-세포의 존재는 많은 T-세포 중개 피부 질병에서 보고되어 왔다(Simon et al., (1994) J. Invest Derm., 103:539-543). 예를 들면 4백만 미국인을 포함하는 2%의 서부 인구를 괴롭히는 건선은 피부케라틴세포(keratinocyte) 과다증식 및 활성화된 T-세포의 비정상적 피부 및 표피 침윤에 의해 특징지워지는 피부병이다. 많은 보고서가 건선 병인론(Baadsgaard et al., (1990) J. Invest Derm., 95:275-282, Chang et al., (1992) Arch. Derm., 128:1479-1485, Schlaak et al., (1994) J. Invest Derm., 102:145-149) 및 AIDS-악화된 건선(Duvic(1990) J. Invest Derm., 90:38S-40S)에서의 이들 활성화된 T-세포의 주요 역할을 제시한다. 건선에서, 활성화된 병변성(lesional) T-세포는 Th1 시토킨(IL-2, 인터페론-감마)을 현저하게 방출한다(Schalaak et al., (1994) J. Invest Derm., 102:145-149). 이들 분비된 시토킨은 정상 피부케라틴세포를 건선 병변에서 발견되는 것과 동일한 표현형(HLA DR+/ICAM-1+)으로 발현하도록 유도한다(Baadsgaard et al., (1990) J. Invest Derm., 95:275-282). 또한 그것의 시험관내 및 생체내 전염증성(proinflammatory) 성질의 덕분에, 그리고 건선 병변으로부터의 활성화된 T-세포 및 피부케라틴세포 둘다에 의해 많은 양으로 분비되므로, IL-8은 피부케라틴세포 과다증식과 같은 건선성 피부에서 보이는 병리학적 변화에 주요 원인물질인 것으로 고려된다. 더욱이 수용체(활성화된 APC상에서 발견되는 CD28에 대한 천연 리간드)의 B7족(family)의 하나인 BB1은 건선에서 발현되는 것으로 보여지나 병에 걸리지 않은 피부케라틴세포에서는 보여지지 않았다(Nicholoff, et al., (1993) Am. J. Pathology, 142:1029-1040).

I형(인슐린 의존성) 당뇨병, 갑상선염, 유육종증, 다발성 경화증, 자가면역 포도막염, 류마티스성 관절염, 전신계 홍반성 낭창, 염증성 장(bowel)질환(크로스 및 궤양성 대장염) 및 자가면역 간염을 포함하는 다른 많은 질병이 이상 T-세포 활성화에 의해 기인하는 것으로 생각된다. 또한 패혈병성 쇼크 및 종양-유도된 악액질을 포함하는 다양한 증후군은 T-세포 활성화 및 림포카인의 잠재적 독성 수준의 생산증가를 포함한다. 또한 정상 T-세포 활성화는 “외래”제공자 조직의 유효 파괴에 필요한 신호를 제공하는 것에 의해 이식된 세포 및 기관의 거부작용을 중개한다.

T-세포 증식 및 유전자 발현 및 특이적 면역조절성 시토킨의 분비를 유도하는 T-림프구의 활성화는 두 개별적 신호를 필요로 한다. 일차 신호는 특이적 T-세포 수용체/CD3 복합체에 의한, 항원 제공 세포(APCs)의 표면상의 주요 조직적합성 복합체 분자에 의해 제공되는 항원의 인식을 포함한다. T-세포와 APCs 간의 항원-비특이적 세포간 상호작용은 항원에 대한 T-세포 반응을 조절하는 이차 신호를 제공한다. 이들 이차 또는 동시자극(costimulatory) 신호는 항원에 대한 T-세포 반응의 크기를 결정한다. 동시자극된 세포는 특이적 시토킨 유전자 전사의 수준 증가에 의해 그리고 선택된 mRNAs의 안정화에 의해 반응한다. 동시자극이 없는 경우, T-세포 활성화는 부전성 또는 아네르기성 T-세포 반응을 초래한다. 한 중요 동시자극 신호는 T-세포 표면 수용체 CD28과 APC상의 B7-관련 분자와의 상호작용에 의해 제공된다(Ann. Rev. Immunol., 11:191-212). CD28은 95%의 CD4⁺T-세포(B-세포 항체 생성에 대해 조력자 기능을 제공함) 및 50%의 CD8⁺T-세포(세포 독성 기능을 가짐)상에 본질적으로 발현된다(Yamada et al., (1985) Eur. J. Immunol. 15:1164-1168). 항원성 또는 시험관내 유사분열성 자극에 이어서, 어떤 면역조절성 시토킨의 생성 뿐만아니라 CD28의 표면 수준의 유도도 일어난다. 이들은 T-세포의 세포주기 진행에서 요구되는 인터루킨-2(IL-2), 광범위한 항바이러스 및 항암 효과를 나타내는 인터페론-감마 및 호중구와 림프구에 대한 강력한 주화성인자로 알려진 인터루킨-8을 포함한다. 이들 시토킨은 T-세포 활성화의 CD28 경로에 의해 조절되는 것으로 보여져왔다(Fraser et al., (1991) Science, 251:313-316, Seder et al., (1994) J. Exp. Med., 179:299-304, Wechsler et al., (1994), J. Invest Derm., 153:2515-2523). IL-2, 인터페론-감마, 및 IL-8은 광범위한 면역반응의 촉진에서 필수적이며 많은 T-세포 중개 질병 상태에서 과발현되는 것으로 보여져왔다.

알레르기성 접촉 피부염 및 평편태선과 같은 몇몇 T-세포 중개 피부병에서, CD28은 주요 피부 및 표피 CD3⁺T-세포에서 높은 수준으로 발현되지만, 정상 피부 및 기저 세포암(비 T-세포 중개의 피부병)에서는 CD28은 단지 혈관주위 T-세포에서만 발현되었다. 유사하게 알레르기성 접촉 피부염 및 평편태선에서, B7 발현은 피부 수지상(dendritic)세포, 피부 APCs 및 피부케라틴세포에서 발견되었으나 정상세포 및 기저 세포암에서는 보이지 않았다(Simon et al., (1994) J. Invest Derm., 103:595-543). 따라서 이것은 CD28/B7 경로가 T-세포 중개 피부병의 중요한 중개 물질이라는 것을 암시한다.

자기내성(self-tolerance)의 유실에 기인하는 몇몇의 자가면역 질병과 관련된 이상 T-세포 활성화는 CD28⁺T-세포의 존재 및 활성화된 전문적 APCs(단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포)상의 그것의 리간드인 B7의 발현에 의해 현저하게 특성지워진다. 이것들은 자가면역 그레이브 갑상선염(Garcia-Cozar et al., (1993) Immunol., 12:32), 유육종증(Vandenbergh et al., (1993) Int. Immunol., 5:317-321), 류마티스성 관절염(Verwilghen et al., (1994) J. Immunol., 153:1378-1385) 및 전신계 홍반성 낭창(Sfikakis et al., (1994) Clin. Exp. Immunol., 96:8-14)을 포함한다. 이식된 세포 및 기관의 거부를 중개하는 정상 T-세포 활성화에서 T-세포 수용체가 관련하는 동안 그것의 적절한 B7 리간드에 의한 CD28의 결합은 예를 들면 공급자 조직상에 외래 항원에 대한 적절한 동종(allogeneic) 반응에 중요하다(Azuma et al., (1992) J. Exp. Med., 175:353-360, Turka et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105).

자가면역 질병에 대한 종래 치료는 T-세포 활성화; 자기항원에 대한 자동반응성의 면역반응에서 작용인자 단계를 방지하지는 않는다. 스테로이드 및 비스테로이드 항-염증제(NSAIDS)와 같은 약품이 증상을 경감시키기 위해 현재 사용되고 있으나, 그것들은 그 질병의 진행을 방지는 않는다. 게다가 스테로이드는 골다공증, 기관 독성 및 당뇨병의 유도와 같은 부작용을 가지며 연골 퇴화 반응을 가속할 수 있으며, 2 내지 8시간동안 소위 주사후 플레어(flare)를 일으킬 수 있다. NSAIDS는 위장성 부작용이 있을 수 있으며 무과립구증 및 치료에 의하여 생기는(iatrogenic) 간염의 위험을 증가시킬 수 있다. 또한 면역억제 약품도 특히 진전된 질병 단계에서의 또다른 치료의 형태로 사용된다. 그러나 이들 약품은 면역계 전반을 억제하며 치료는 종종 고혈압 및 신장독성을 포함하는 심각한 부작용을 가진다. 또한 시클로스포린 및 FK506과 같은 입증된 면역억제물질은 CD28-의존성 T-세포 활성화 경로를 저해할 수 없다(June et al., (1987) Mol. Cell. Biol., 7:4472-4481).

면역계-중개 질병 치료를 위한 현재 입수가능한 약품 및 방법의 단점을 고려하면, 그러한 질병을 치료하기 위한 새로운 방법 및 조성물을 제공하는 것은 흥미가 있다.

발명은 올리고머, 상세하게는 면역계-중개 질병 치료에 유효한 올리고머의 사용을 통한 조절(modulating)유전자 발현의 분야에 관련되어 있다.

제1도는 CD28 유전자의 5′ 번역되지 않은 영역의 서열(1A) 및 인간 CD28의 mRNA 서열(1B, 1C)이다. 제1(b)도 및 1(c)도는 폴리뉴클레오티드 서열의 다른 인접 부분을 나타낸 도면.

제2도는 다양한 CD28 특이적 및 대조포스포로티오에이트 및 포스포로티오에이트-3′히드록시프로필아민 올리고뉴클레오티드 처리후 생존(살아있는) T-세포의 백분율을 나타낸 그래프.

제3도는 두 제공자(GV010 및 JC011)로부터의 인간 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체/PMA 및 유도된 CD28 발현(A), 및 CD28 특이적 및 대조 포스포로티오에이트(B, 배치 1 및 2) 및 포스포로티오에이트-3′히드록시프로필아민(C) 올리고뉴클레오티드의 동일한 2 제공자로부터의 말초 혈액 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체/PMA 유도된 CD28 발현에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.

제4도는 A) 제공자 KS006으로부터의 인간 T-세포내에서의 유사분열물질(mitogens)에 의한 T-세포 증식의 유도 및 B) 항CD3 모노클로널 항체/PMA 유도된 인간 T-세포 증식에 대한 CD28 특이적 및 대조 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸 그래프.

제5도는 인간 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체 PMA에 의한 인터루킨-2(IL-2) 생성의 유도(A), CD28 특이적 및 대조 포스포로티오에이트 (B) 포스포로티오에이트-3′히드록시프로필아민(C) 올리고뉴클레오티드의 인간 말초 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체/PMA 유도된 IL-2 생성에 대한 효과를 나타낸 그래프.

제6도는 인간 T-세포냉서의 항CD3 모노클로널 항체 및 PMA에 의한 인터페론-감마(IFNγ) 생성의 유도(A), CD28 특이적 및 대조 포스포로티오에이트(B) 포스포로티오에이트-3′히드록시프로필아민(C) 올리고뉴클레오티드의 인간 말초 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체/PMA 유도된인터페론-감마 생성에 대한 효과를 나타낸 그래프.

제7도는 인간 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체 및 PMA에 의한 인터루킨-8(IL-8) 생성의 유도(A), CD28 특이적 및 대조 포스포로티오에이트(B) 포스포로티오에이트-3′히드록시프로필아민(C) 올리고뉴클레오티드의 인간 말초 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체/PMA 유도된 IL-8 생성에 대한 효과를 나타낸 그래프.

제8도는 CD28 특이적 및 대조 포스포로티오에이트-3′히드록시프로필아민 올리고뉴클레오티드로, 또는 이것 없이 처리한 인간 말초 T-세포내에서의 항CD3 모노클로널 항체 및 PMA에 의한, 인터루킨-2 수용체(IL-2R, CD25로도 알려짐)(A) 및 세포내 부착 분자-1(ICAM-1 또는 CD54로도 알려짐)(B)의 발현의 유도를 나타낸 그래프.

제9도는 항CD3 모노클로널 항체 및 PMA 처리 전후의 HUT 78(A) 및 저캣(Jurkat) (B) 인간 T-세포주내에서의 CD28 발현 및 항CD3 모노클로널 항체 및 PMA 처리된 저캣 세포내에서의 CD28 특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과(C)를 나타낸 그래프.

제10도는 항CD3 모노클로널 항체 및 PMA 처리된 HUT 78(A) 및 저캣(Jurkat) (B) 인간 T-세포주내에서의 인터루킨-2 생성에 대한 CD28 특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸 그래프.

제11도는 부속(accessory) 분자의 표면 발현 및 활성화된 T-세포내에서의 시토킨 분비에 대한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸 그래프.

제12도는 CD28 및 CD25 mRNA 수준에 대한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸 그래프.

제13도는 기능적 CD28 발현에 대한 저해효과에 관한 올리고뉴클레오티드 RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)의 특이성을 나타낸 그래프.

제14도는 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드, RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)에 의한 시험관내 내성유도를 나타낸 그래프.

제15도는 세포외 상징액(상부 구획) 및 저캣 세포 분해물(하부 구획)내에서의³²P 표지된 포스포로티오에이트, RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)의 시험관내 안정성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 면역계 중개 질병의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 관심의 세포에서 CD28의 발현을 감소시키는 성질을 갖고 있어서 면역계 중개 질병에서의 면역계의 병원성 효과를 차례로 조절한다. CD28 발현을 감소시키는 본 방법은 또한 CD28⁺T-세포의 항원성 자극의 효과를 감소하는 방법으로 역할함으로써 CD28⁺T-세포의 활성화 및 인터루킨-2, 인터페론-감마 및 인터루킨-8을 포함하는 T-세포 활성화와 관련된 시토킨의 방출의 수준의 감소시킨다. 본 발명의 조성물은 CD28의 발현을 감소시킬 수 있는 많은 다른 올리고머들을 포함한다.

본 발명의 일면은 CD28의 발현을 방해함에 의해 CD28의 발현을 감소시킬 수 있는 올리고머들을 제공하는 것이다. 본 발명의 올리고머는 CD28 유전자 또는 CD28 유전자 전사물, 또는 그것들의 부분에 상동적인 핵산서열을 갖고, 여기서 상동성은 세포내 조건하에서 핵산 이중가닥 나선 또는 삼중가닥 나선을 형성하기에 충분한 것을 가르킨다. 본 발명의 올리고머는 DNA, RNA 또는 그것들의 다양한 합성 유사체들일 수 있다. 특정 구체예에서, 3 내지 5염기에 의해 분리된 적어도 두개의 GGGG 서열을 포함하는 11 내지 50염기를 갖는다.

본 발명의 다른 면은 관심의 세포, 바람직하게는 천연적으로 CD28를 발현하는 세포내에서 본 발명의 올리고머의 세포내 발현을 위한 유전 공학으로 제조된 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른면은 하나 이상의 본 발명의 다른 올리고머를 포함하는 약제학적 조제물을 제공하는 것이다. 약제학적 조제물은 신체에 대한 투여 및 신체내로 재도입될 세포에 대한 투여의 다양한 형태로 적용될 수 있다.

본 발명의 다른면은 면역계 중개 질병의 치료방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 본 발명의 올리고머의 유효량을 투여하는 것에 의해 CD28 발현을 조절하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 자가면역질병 치료방법, 염증반응을 감소시키는 방법, 선택된 시토킨 생성을 감소시키는 방법, T-세포 불활성화 방법 및 조직이식 환자의 면역억제 방법들을 포함한다.

면역계 중개 질병 치료를 위한 방법 및 조성물이 여기 기술되며, 여기서 요구되는 치료효과는 CD28 발현을 감소시킴으로써, 활성화된 CD28⁺T-세포 기능을 파기하고 다른 면역계 세포의 활성을 감소시켜서 달성된다. 본 발명자는 항원 의존성 T-세포 활성화는 CD28⁺T-세포S O에서의 CD28 발현을 감소시킴에 의해 저해될 수 있음을 발견했다. 본 발명은 T-세포내에서 CD28 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있는 수 많은 화합물을 제공한다.

여기 개시된 본 발명은 T-세포내에서 CD28 발현의 감소가 T-세포의 항원 특이적 활성화를 방해할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 이 발견은 CD28 발현을 감소시키는 CD28에 표적화된 올리고머 및 비 올리고머 화합물로 면역계 중개 질병의 많은 치료하는 방법을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 이 명세서에서 개시된 바와 같이 CD28 발현을 감소시키는 생물학적 효과의 발견을 이용하는 것에 의해, 면역계 중개 질병의 많은 치료방법이 제공되며, 그러한 방법은 아직 합성되거나 정제되지 않았던 비-올리고머 화합물을 사용할 수도 있다.

본 발명의 한 관점은 어떤 유전자들의 발현을 저해하기 위해 사용될 수 있는 올리고머들을 제공하는 것이고, 이는 “인티센스” 올리고뉴클레오티드 또는 “안티센스 치료”의 사용으로서 자주 참조되는 확립된 기술이다. 구성상의 다양한 출판물 및 안티센스의 사용이 가능하다. 그러한 출판물의 예는 Stein et al., Science, 261:1004-1012(1993); Milligan, et all, J. Med. Chem. 36:1923-1937(1993); Helene, et al., J. Biochim. Biophys. Acta, 1049:99-125(1990); Wagner, Nature., 372:333-335(1994); 및 Crooke and Lebleu, Anti-sense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton(1993)이다. 여기서 사용된 “안티센스”는, 다른 것으로 지시하지 않는다면, 폴리뉴클레오티드와 이중가닥이든지 삼중가닥(삼중체) 나선을 형성하여 유전자 발현을 방해할 수 있는 올리고머(올리고뉴클레오티드를 포함함)를 언급한다. 안티센스 설계 및 이들 출판물 및 기타 유사 출판물에서 개시된 사용의 원리는 본 발명의 CD28 특이적 올리고머의 다양한 구체예를 설계, 제조 및 사용을 위한 분야에서 일반적인 기술자에 의해 이용될 수 있다.

본 발명의 올리고머는 CD28 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 본 발명의 올리고머는 CD28 전사물(또는 그것의 부분)과 혼성화하는 것에 의한 이중가닥 폴리뉴클레오티드든지, CD28의 한 부분 또는 부분들과 혼성화하는 것에 의한 이중가닥 폴리뉴클레오티드 나선을 형성할 수 있는 성질을 가지는 올리고머를 포함하며, 여기서 나선 형성은 세포내 조건하에서 일어날 수 있다. 또한 본 발명의 올리고머는 분자유인기로 작용하는 것에 의한 것과 같은 유전자 발현의 조절에 영향을 줄 수 있는 것과 CD28 유전자의 번역되지 않은 영역의 조절 요소와 전사 인자의 단백질-핵산 상호작용을 저해할 수 있는 올리고머를 포함한다. 추가적으로, 발명의 올리고머는 CD28 유전자의 한 부분 또는 부분들과 삼중가닥 폴리뉴클레오티드 나선을 형성할 수 있는 올리고머를 포함한다. 여기서, 나선 형성은 세포내 조건하에서 일어날 수 있다. 이중가닥 나선 및 삼중가닥 나선 모두의 핵산염기간의 염기 짝형성 관계(예를 들면, 아데닌-티민, 시토신-구아닌, 우라실-티민)는 본 분야에서의 당업자에게 공지되어 있으며, 발명의 올리고머의 설계에서 이용될 수 있다. 본 발명의 주어진 올리고머와 이중가닥 나선 및 삼중가닥 나선을 형성할 수 있는 CD28 유전자 또는 CD28 전사물의 영역은 그 올리고머에 의해 “표적화된”이라고 일컬어진다.

인간 CD28은 T-세포의 하위세트(subset)의 표면상에 존재하는 90-kDa 동종이량체인(homodimeric) 막투과성 당단백질이다. CD28은 대부분의 CD₄ ⁺T-세포 및 약 50%의 CD8⁺T-세포 상에 존재한다. 인간 CD28를 코드화하는 DNA 서열은 다른곳 중에서도, Lee et al., Journal of Immunology, 145:344-352(1990) 그리고 GenBank와 같은 공개적으로 접근가능한 유전자 데이타베이스에서 볼 수 있는 바와 같이 분석되었다. 인간 CD28 유전자는 4엑손을 포함하며, 각각은 예견되는 단백질의 기능적 도메인을 정의한다. 다양한 크기의 전사 생성물이 인간 CD28 유전자로부터 생성되는 것으로 관찰되었다. 본 발명의 올리고머는 CD28 유전자의 공개된 뉴클레오티드 서열 또는 CD28 유전자 유도된 cDNAs의 서열을 참조하여 설계될 수 있다. 발명의 조성물 및 방법은 인간 이외의 포유류 유래의 CD28 유전자의 서열을 참조하는 것에 의해 인간 이외의 포유류에서의 사용에 적용될 수 있다. 인간 이외의 CD28 유전자 서열은, 다른 방법들 중에서도, 이미 확인된 인간(또는 기타 포유류) 유래의 CD28 유전자 서열을 유전자 라이브러리 혼성화 프로브 및/또는 PCR(중합효소 사슬반응) 증폭 프라이머로서 사용하여 수득될 수 있다. CD28 유전자의 공개된 뉴클레오티드 서열은 정확한 것으로 믿어지지만, 본 발명은 당해 분야의 당업자에 의해 CD28의 공개된 뉴클레오티드 염기 서열이 서열 오차를 가지는지도 시험되었다. 공개된 서열내에서의 적합한 뉴클레오티드 염기서열 오차가, 다른 방법들 중에서도, 본 발명의 올리고머에 의해 표적화는 CD28 유전자(또는 CD28 유전자 전사물)의 영역의 재서열화에 의해 검출될 수 있다. 재서열화는 종래의 DNA 서열화 기술에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 올리고머는 바람직하게는 약 11 내지 약 50 핵산 염기단위를 포함한다. 본 발명의 올리고머가 50 핵산 염기단위보다 더 길수도 있다는 것을 당해 분야의 당업자는 당연히 이해할 것이다. 보다 바람직한 본 발명의 구체예에서, 올리고머는 약 8 내지 약 25 핵산 염기단위; 보다 바람직하게는 약 14 핵산 염기단위 내지 약 22 핵산 염기단위를 포함한다. 본 발명의 올리고머에 대한 바람직한 크기 제한은 세포로 세포외 투여되고, 예를 들면 표적 숙주 세포의 유전자적 조작을 위한 벡터로부터 생산된 것과 같이, 세포내 생성된 CD28 특이적 올리고머에 적용할 수 없는 올리고머들에 단지 관계가 된다.

본 발명의 올리고머는 많은 다른 핵산 염기 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 올리고머는, CD28 발현을 감소시키기 위해 실제적으로 CD28 유전자의 CD28 전사물의 어떤 영역에 혼성화함에 의해 또는 CD28 유전자의 번역되지 않은 서열을 인식하는 비-핵산 분자에 혼성화(핵산-단백질 상호작용을 통하여)함에 의해 CD28 발현을 감소시키도록 선택될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 올리고머는 CD28 전사물의 번역된 부분, CD28 전사물의 번역되지 않은 부분, CD28 전사물의 스플라이스(splice)되지 않은 부분, CD28 유전자 인트론, CD28 프로모터 서열, 및 CD28 조절 서열, CD28 전사물의 5′캡 영역, CD28 코딩 영역, 및 그 밖의 같은 것(다양한 별개의 영역의 조합을 포함)에 혼성화할 수 있도록 선택될 것이다. CD28 유전자 및 CD28 유전자 전사물의 본 발명의 올리고머에 의한 바람직한 구체예는 CD28 유전자(및 이것의 전사물)의 번역 및/또는 전사 개시부분내에 있다. 올리고머의 핵산 염기쌍 서열의 선택을 통하여 나선 형성이 일어나는 곳에서의 CD28나 CD28 유전자 전사물의 위치를 바꾸는 것에 의해 올리고머의 잠재력(potenc), 즉 소망의 생물학적 효과를 생성하기 위해 요구되는 양이 바뀔 것이다. 본 발명의 올리고머의 바람직한 구체예는 최고 가능 잠재력을 지난다. 본 발명의 다른 올리고머들의 잠재력은 당해 분야의 당업자에 공지된 다양한 시험관내 분석에 의해 측정될 수 있다. 그러한 분석의 예는 본 명세서의 실험 섹션에서 볼 수 있다. 당해 분야의 당업자는 CD28 유전자가 아닌 유전자 위치에 또한 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 표적화된 올리고머를 생성하는 것은 바람직하지 않은 것으로 받아들일 것이다. 예를 들면, CD28 전사물의 5′의 번역되지 않은 부분내에서의 Alu 서열에 표적화된 올리고머를 생성하는 것은 바람직하지 않을 것이다(CD28의 Alu 부분은 Lee et al., Journal of Immunoloty, 145:344-352(1990)에 기술되어 있음), CD28 외의 유전자 또는 유전자의 전사물과 이중가닥 또는 삼중가닥 나선을 형성하는 올리고머의 사용은 GenBank와 같은 공개적으로 접근가능한 데이타베이스에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열 정보에 대한 올리고머 뉴클레오티드 염기 서열의 상동성 연구를 실시하는 것에 의해 최소화될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 올리고머는 선택된 표적 서열에 대해 완전한 핵산 염기 상보성을 나타내며, 다시 말하자면 올리고머 내의 모든 핵산 염기는 이중(또는 삼중) 나선의 또다른 가닥상의 둘째(또는 셋째) 핵산 염기와의 염기쌍 관계를 가질 것이다. 그러나 당해 분야의 당업자는 CD28 유전자 표적에 특이적이고/이거나 CD28 발현을 저해할 수 있는 다양한 올리고머는 CD28 유전자(양쪽 가닥), CD28 유전자 전사물, 또는 CD28 특이적 조절 단백질에 완벽한 혼성화가 결여된 뉴클레오티드 염기서열을 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

바람직한 구체에에서 본 발명의 올리고머는 하기의 뉴클레오티드 염기서열을 가지는 올리고머들이다;

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, RT01, RT02, RT03 및 RT04로 개시된 뉴클레오티드 염기서열을 갖는 올리고머는 포스포로티오에이트이다. 특히 바람직한 올리고머는, Tam et al., Nucl. Acid. Res. 22:977-986(1994)에 기술된 바와 같은 포스포로티오에이트-3′-히드록시프로필아민이다.

본 발명의 올리고머는 내화된(internalized) 세포외 적용된 본 발명의 올리고머를 가진 T-세포내의 CD28의 발현을 감소시키도록 설계될 것이다. 추가적으로 본 발명의 올리고머는, 올리고머가 유전자 발현 벡터를 사용하여 세포내 생산될 때 CD28의 발현을 감소시키도록 설계될 것이다. CD28 발현의 저해는 (I) CD28 유전자 전사의 방해, (II) CD28 유전자 전사물의 번역 방해, (III) CD28 전사물의 프로세싱의 방해, 또는 (I), (II) 및 (III)의 조합을 통해 이루어질 수 있다. CD28 발현의 방해의 정확한 정도 및 기작은 특정 올리고머의 구조, 올리고머의 뉴클레오티드 염기서열, 올리고머의 투여량, 올리고머의 투여 방법 및 그와 같은 인자들에 의존할 것이다.

여기서 사용된 용어 “올리고머”는, 예를 들면 DNA, RNA와 같은 천연발생적 폴리뉴클레오티드 및 DNA나 RNA와 이중가닥이든지 삼중가닥 나선의 형성능력이 있는 천연발생적 핵산의 다양한 인공적 유사체들을 나타낸다. 천연발생적 폴리뉴클레오티드의 인공적 유사체인 많은 올리고머들은 본 발명의 방법에서의 사용에 있어서 DNA나 RNA보다 그것들을 우수하게 하는 성질들을 갖고 있다. 이들 성질들은 DNA/RNA에 대한 보다 높은 친화력, 엔도뉴클라제 저항성, 엑소뉴클라제 저항성, 지질 용해성, RNAse H 활성화 및 그와 같은 것을 포함한다. 예를 들면, 증진된 지질 용해도 및/또는 뉴클라제 소화에 대한 저항성은 알킬포스포네이트 올리고뉴클레오티드나 알킬포스포트리에스테르 올리고뉴클레오티드를 형성하는 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 결합내에서 인산 산소(phosphate oxigen)를 알킬기나 알콕시기로 치환하는 것에 의해 이루어진다. 이것들과 같은 비이온성 올리고머들은 상보적 산서열과 안정한 복합체의 형성능력을 유지하면서 증가된 뉴클라제 가수분해에 대한 저항성 및/또는 증가된 세포성 섭취(uptake)에 의해 특징지워진다.

천연발생적 핵산의 유사체인 많은 올리고머가 여기서 명백히 기술되며, 그리고/또한 당해 분야의 당업자에게 공지되기도 하지만, 미래에 개발될 수도 있는 핵산 유사체인 많은 올리고머는 CD28 유전자의 발현을 저해하기 위해 본 분야의 일반적 기술자에 의해 용이하게 적용될 수 있듯이 이해된다. CD28 유전자(및 그것의 전사물)를 표적화하기 위한 적절한 핵산 염기서열의 선택에 의해 본 발명의 올리고머로서 사용될 수도 있는 현재 유용한 여러가지의 DNA/RNA 유사체의 간략한 개관이 아래에 제공되어 있다. 그러한 출판물에 기술된 다양한 올리고머는 본 발명의 방법 및 조성물에서의 CD28 발현의 저해를 위해 적합한 여러가지의 가능한 구체예의, 제한이 아닌 예이다. 메틸포스포네이트(및 기타 알킬 포스페이트) 올리고머는 다양한 방법, 용액내 및 불용성 중합체 지지체상 양쪽에서 제조될 수 있다(Nucl. Acids Res., 6:3009-3024(1979); Miller et al., Biochemistry, 18:5134-5142(1979); Miller et al., J. Biol. Chem., 255:9659-9665(1980); Miller et al., Nucl. Acids Res., 11:5189-5204(1983); Miller et al., Nucl. Acids Res., 11:6224-6242(1983); Miller et al., Biochemistry, 25:5092-5097(1986); Sinha et al., Tetrahedron Lett. 24:877-880(1983); Dorman et al., Tetrahedron, 40:95-102(1984); Jager and tbswels, Tetrahedron Lett., 25:1437-1440(1984); Noble et al., Nucl. Acids Res., 12:3387-3404(1984); Callahan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1617-1621(1986); Koziokiewicz et al., Chemica Scripta, 26:251-260(1986); Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett., 38:3539-3542(1987); Lesnikowski et al., Tetrahedron Lett., 28:5535-5538(1987); Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7488-7451(1988).

올리고머로서의 사용을 위한 추가적인 올리고뉴클레오티드 유사체는 Inova et al., Nucleic Acids Res., 15:6131(1987)(2′-O-메틸리보뉴클레오티드), Inova et al., FEBS Lett., 215:327(1987)에 기술되어 있다.

포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트의 제조방법 및 사용에 대한 기술을, 다른 곳들 중에서도, 하기 출판물에서 볼 수 있다:미국특허 5,292,875호, 미국특허 5,286,717호, 미국특허 5,279,019호, 미국특허 5,264,423호, 미국특허 5,218,103호, 미국특허 5,194,428호, 미국특허 5,183,885호, 미국특허 5,166,387호, 미국특허 5,151,510호, 미국특허 5,120,846호, 미국특허 4,814,448호, 미국특허 4,814,451호, 미국특허 4,096,210호, 미국특허 4,094,873호, 미국특허 4,092,312호, 미국특허 4,016,225호, 미국특허 4,007,197호, 미국특허 3,972,887호, 미국특허 3,917,612호 및 미국특허 3,907,815호, Dagle et al., Nucl. Acids Res. 18:4751-4757(1990), Loke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3474-3478(1989), Laplanche, et al., Nucleic Acids Res., 14:9081(1986) 및 Stec, et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984) 및 Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209-3221(1988).

포스포르아미데이트의 제조방법 및 사용에 대한 기술은, 다른 곳들 중에서도, 하기 출판물에서 볼 수 잇다:Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:7079-7083(1988), Dagle et al., Nucl. Acids Res., 18(6):4751-4757(1990), Dagel et al., Nucl. Acids Res. 19(8):1805-1810(1991).

관심의 기타 폴리뉴클레오티드 유사체는 백본 구조내에서 아세탈 또는 티오아세탈을 가지는 화합물을 포함한다. 그러한 화합물의 제조방법 및 사용에 대한 예를, 다른 곳들 중에서도, Gao et al., Biochemistry 31:6228-6236(1992), Quaedflieg et al., Tetrahedron Lett. 33(21):3081-3084(1992), Jones et al., J. Org. Chem. 58:2983-2991(1993)에서 볼 수 있다.

관심의 기타 폴리뉴클레오티드 유사체는 백본 구조내에서 실릴 또는 실옥시 가교를 가지는 화합물을 포함한다. 그러한 화합물의 제조방법 및 사용에 대한 예를, 다른 곳들 중에서도, Ogilvie and cormier, Tetrahedron Lett., 26(35):4159-4162(1985), Cormier and Ogilivie, Nucl. Acids Res. 16(10):4583-4594(1988), PCT 공보 WO 94/06811에서 볼 수 있다.

과심의 기타 폴리뉴클레오티드 유사체는 백본 구조내에서 실릴 또는 아세트아미데이트 가교를 가지는 화합물을 포함한다. 그러한 화합물의 제조방법 및 사용에 대한 예를, 다른 곳들 중에서도, Gait et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1:1684(1974), Mungall and Kaiser, J. Org. Chem. 42(4):703-706(1977), 및 Coull et al., Tetrahedron Lett. 28(7):745-748(1987)에서 볼 수 있다.

모르포리노-기초 백본 결합을 가지는 폴리뉴클레오티드 유사체도 기술되었다. 그러한 뉴클레오티드 유사체의 제조방법 및 사용에 대한 예를, 다른 곳들 중에서도, 미국특허 5,034,506호, 5,235,033호, 5,034,506호, 5,185,444호에서 볼 수 있다.

다양한 아민, 펩티드, 및 기타 아키랄(achiral) 및/또는 중성 결합을 가지는 폴리뉴클레오티드가 기술되어 있다:Caulfield et al., Bioorganic ＆ Medicinal Chem. Lett., 3(12):2771-2776(1993), Mesmaeker et al., Bioorganic ＆ Medicinal Chem. Lett., 4(3):395-398(1984); Angew. Chem. Int. Ed. 뚜히., 33(2):225-229(1994), 미국특허 5,166,315호, 및 미국특허 3,5,142,047호.

티오에테르 및 기타 하위단위(subunit)간의 황결합을 가지는 폴리뉴클레오티드가 다른 곳중에서도 Schneider and Brenner, Tetrahedron Lett., 31(3):335-338(1990), Huang et al., J. Org. Chem., 56:3869-3882(1991); Musichi and Widlanski, Tetrahedron Lett., 32(10):1267-1270(1991); Huang and Widlanski, Tetrahedron Lett., 33(19):2657-2660(1992); 및 Reynolds et al., J. Org. Chem. 57:2983-2985(1992), 및 PCT 공보 WO 91/15500에서 볼 수 있다.

관심의 기타 폴리뉴클레오티드는 펩티드 헥산(PNAs) 및 관련 폴리뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 펩티드 핵산의 제조방법 및 사용에 대한 기술을, 다른 곳들 중에서도, Buchardt et al., Trends in Biotech., 11(1993) 및 PCT 공보 WO 93/12129에서 볼 수 있다.

안티센스 저해에서의 사용을 위한 기타 올리고머가 Thuong et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:5129-5133(1987), 미국특허 5,217,866호, Lamond, Biochem. Soc. Transcactions, 21:1-8(1993)2′-O-알킬올리고리보뉴클레오티드), Ono et al., Bioconjugate Chemistry, 4:499-509(1993)(디옥시리보스의 1′-위치에서 아미노 링커를 가지는 2′-디옥시우리딘 유사체), kawasai et al., J. Med. Chem., 36:831-841(1993)(2′-디옥시-2′-플루오로포스포로티오에이트올리고뉴클레오티드), PCT 공보 WO 93/23570, Augustyns et al., Nucl. Acids Res., 21(20):4670-4776(1993)에 기술되어 있다.

추가적으로 올리고머는 이중체(duplexes)의 안정성을 증가 및/또는 세포성 섭취를 증가시키기 위해 더 변형될 수 있다. 그러한 변형의 예가 “Conformationally Restrained Oligomers Containing Amide or Carbamate Linkages for Sequence-Specific Binding” 제목의 PCT 공보 WO 93/24507, Nielsen et al., Science, 254:1497-1500(1991), “Modified Internucleoside Linkages” 제목의 PCT 공보 WO 92/05186, “Oligonucleotide Anologs with Novel Linkages” 제목의 두 PCT 공보 WO 91/06629호, 10월 24일 출원됨, 1991년 4월 24일 출원된 미국특허 5,264,562호, “Pseudonucleosides and Psuedonucleotides and their Polymers” 제목의 PCT 공보 WO 91/13080, “2′-Modified Oligonucleotides” 제목의 PCT 공보 WO 90/06556, 1990년 6월 5일 출원된 “Exonuclease Resistant Oligonucleotides and Methods for Preparing the Same” 제목의 PCT 공보 WO 90/15065 및 미국특허 5,256,775호에서 볼 수 있다.

본 발명의 올리고머는 다양한 핵산 염기를 포함한다. 예를 들면 시토신, 아데닌, 구아닌, 티미딘, 우라실 및 히포크산틴과 같이 DNA 또는 RNA에서 천연발생적인 것으로 보이는 핵산 염기에 덧붙여서 본 발명의 올리고머는 천연발생적 핵산 염기의 합성 유사체인 하나 이상의 핵산 염기를 포함할 수 있다. 그러한 비-천연발생적 헤테로고리 염기는 기타 헤테로고리 염기 유사체 뿐만아니라 이에 제한되지는 않으나, 아자 및 디아자 피리미딘 유사체, 아자 및 디아자 퓨린 유사체를 포함하고, 여기서 퓨린 및 피리미딘 고리의 하나 또는 그 이상의 탄소 및 질소 원자가, 예를 들면 산소, 황, 셀레늄, 인 및 그와 같은 헤테로원자로 치환되어 있다. 바람직한 염기 부분(moieties)은 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 한 가닥으로 통합되어 이중가닥 폴리뉴클레오티드에서 상보적 가닥상의 천연발생적 염기와의 염기쌍 구조적 관계를 유지하게 하는 염기들이다.

본 발명은 많은 면역장애의 치료방법을 제공한다. 여기서 질병과 관련해서 사용된 용어 “치료(treatment)” 또는 “치료하기(treating)”는 예방 및 이미 개인내에 존재하는 증상의 경감 모두를 나타낸다. 치료가 질병의 시작을 방지하는 것 또는 질병과 관련된 증상을 감소시키는 것에 있어서 완전하게 유효할 필요가 없다는 것은 본 분야의 일반적 기술자에게 받아들여질 것이다. 증상의 심각성의 어떤 감소, 증상의 시작에서의 지연, 또는 증상의 심각성의 진행에서의 지연은 환자에게 바람직하다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 면역장애는, CD28 발현 T-세포가 바람직하지 않은 특발성(idiopathic) 효과에 대해 중개 또는 기여하는 질병을 포함한다. CD28 발현의 저해는 활성화된 CD28⁺T-세포에 의해 정상적으로 생성되는 시토킨의 발현의 감소를 초래하며, 이러한 시토킨은 인터루킨-2, 인터페론-감마, 및 인터루킨-8을 포함한다. 따라서 본 발명의 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 질병발생(pathogenesis)이 인터루킨-2, 인터페론-감마, 인터루킨-8 또는 그들의 조합을 통해 중개됨에 의해 T-세포 중개 면역 반응이 방해되거나 감소되는 것에 의한 질병의 치료방법을 포함한다. 환자에게 본 올리고머를 투여하는 것에 의해 치료될 수 있는 면역장애의 예는 기관 이식의 거부반응, 패혈병성 쇼크, 암에서 유도된 악액질 및 다양한 자가면역 질병을 포함한다. 본 방법에 의해 치료되는 자가면역 질병은, I형(인슐린 의존성) 당뇨병, 갑상선염, 유육종증, 다발성 경화증, 자가면역 포도막염, 궤양성대장염, 무형성빈혈, 전신계 홍반성낭창, 류마티스성 관절염, 기생충에서 유도된 염증 및 육아종, 크론병, 건선, 다근염, 피부근염, 공피증, 맥관염, 건선성 관절염, 그레이브스병, 및 그와 같은 것을 포함하는 이상 T-세포 활성화에 의해 중개되는 질병들을 포함한다. 또한 본 발명의 방법 및 조성물은 패혈병성 쇼크 및 암에서 유도된 악액질을 포함하는 다양한 증후군의 치료를 위해 제공되며, 여기에서 병원성 효과가 적어도 부분적으로는 활성화된 CD28⁺T-세포로부터 분비되는 림포카인에 의해 중개된다.

본 발명의 질병 치료 방법은 본 올리고머를 환자에게 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다. 환자에게 투여되는 CD28 특이적 올리고머의 정확한 투여량, 즉 유효한 양은 치료할 특정 질병, 치료용 조성물에서의 정확한 올리고머(또는 올리고머들), 환자의 연령 및 상태, 및 그와 같은 다양한 인자들에 따라 다를 것이다. 적절한 약제학적 투여량의 결정을 위한 프로토콜은 당해 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 다른 곳 중에서도 Remington′s Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton, Pa., 및 그와 같은 곳에서 볼 수 있다.

환자에게 CD28 표적화된 올리고머를 직접 투여하는 것에 추가하여, 본 발명은 CD28⁺세포(또는 CD28 발현 가능성이 있는 세포)가 환자로부터 제거되며 본 발명의 하나 이상의 다른 올리고머로 형질전환되는 것에 의한 치료방법을 의도한다. 형질전환은 예를 들면 전기영동, DOTMA 또는 DOSPA와 같은 양이온성 지질, 및 그와 같이 당해 분야의 당업자에게 잘 공지된 다양한 방법중 어떠한 것에 의한다. 형질전환된 세포는 이어서 신체내로 재도입된다.

발명의 또다른 관점은 CD28 특이적 올리고머의 투여에 의한 면역장애의 치료 방법을 제공하는 것이며, 여기서 올리고머는 재조합 폴리뉴클레오티드 발현벡터를 통해 세포내에서 생성된다. 세포내에서 생성된 CD28 특이적 올리고머는 반드시 RNA 또는 DNA 분자이어야 한다. 관심의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터는 분자생물학 분야에서 당업자에게 잘 공지된 사항이다. 관심의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 재조합 벡터의 상세한 설명은, 다른 곳 중에서도, “Somatic Gene Therapy.”ed. P.L. Chang, CRC Press, Boca Raton(1995), R.C. Mulligan, Science, 260:926-932(1993), F.W. Anderson, Science, 256:808-873(1992), Culver et al., Hum. Gene Ther., 2:107-109(1991) 및 그와 같은 곳에서 볼 수 있다. 유전자공학을 통한 면역장애 치료방법에서의 사용을 위한 적합한 재조합 벡터는 T-세포의 게놈내로 통합될 수 있든지 T-세포의 원형질내에서 복제될 수 있다. 세포내 투여에서의 사용을 위한 CD28 특이적 올리고머는 바람직하게는, 세포외 투여를 위한 CD28 특이적 올리고머보다 분명히 더 길다. 세포내 투여의 본 방법의 바람직한 구체에에서, CD28 특이적 올리고머는 하나 이상의 전체 CD28전사물 또는 전체 CD28 유전자에 대해 상보적이다; 그러나, 적절한 세포내-생성되는 CD28 특이적 올리고머는 현저하게 짧은 길이일 것이다. 세포외 투여되는 CD28 특이적 올리고머와는 달리, CD28-특이적 올리고머는 세포내 섭취 또는 세포외 효소에 의한 가수분해 문제를 보이지 않는다. 세포내 CD28 특이적 올리고머의 본 사용 방법은 CD28 특이적 올리고머를 코딩화하는 재조합 벡터를 환자에게 직접 투여하는 것을 포함한다. 다르게는 CD28 특이적 올리고머-생성 벡터는, 형질전환된 세포가 생성되도록 환자로부터 제거된 세포(즉, 간세포(stem cell), T-세포, 전혈, 골수, 기타)로 직접 투여될 수 있다. 형질전환된 세포는 이어서 환자로 재도입될 것이다.

또한 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 올리고머를 발현할 수 있는 발현벡터를 특이적으로 제공한다. 일반적으로 이러한 발현벡터는 작동가능한 조합으로, 프로모터, 또는 T-세포내에서 CD28의 발현을 저해할 수 있는 올리고머를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 비록 많은 다른 프로모터들이 발명의 벡터에서 사용되지만, 바람직한 프로모터는 T-세포내에서 고수준 발현을 유도할 수 있어야 한다. 또한 본 발명의 벡터는 다양한 조절 서열을 포함한다. 현재 사용가능한 발현 벡터, 특히 유전자치료를 위해 명백히 설계된 벡터는 발명의 CD28 표적화된 올리고머의 발현을 위해 적합한 것이다. 벡터는 Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에 기술된 바와 같은 종래의 유전공학기술을 사용하여 CD28 표적화된 올리고머의 발현에 적용될 수 있다.

발명의 또다른 관점은 면역계 중개 질병의 치료를 위한 본 발명의 올리고머의 투여를 위한 약제학저 조제물을 제공하는 것이다. 이들 약제학적 조제물은 약제학 분야의 당업자에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 그러한 조제물은 하나 이상의 본 발명의 올리고머를 함유한다; 그러나 본 발명의 구체에에서는 한가지 이상의 다른 형태의 올리고머를 함유하며, 올리고머는 바람직하게는 다른 한가지와 혼성화할 수 없도록 선택된다. 본 발명의 약제학적 조제물은, 경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 국소적, 및 그와 같은 것을 포함하는 투여의 선택된 방법에 적합한 수많은 방법으로 신체에 투여를 위해 적용될 수 있다. 하나 이상의 다른 본 발명의 올리고머를 포함하는 것에 추가하여, 약제학적 조제물은 하나 이상의 비-생물학적 활성 화합물, 즉 안정화제(장기간 저장의 증진), 유화제, 결합제, 증점제, 염, 방부제, 및 그와 같은 부형제를 포함할 수 있다.

비경구적 투여용 조제물은 완충액, 희석제, 및 기타 적절한 첨가물을 또한 함유하는 멸균수용액을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조제물은 조성물내의 올리고머의 세포 섭취를 촉진하기 위해 설계될 수 있으며, 예를 들면 올리고머는 적절한 리포좀내에 캡슐화될 수 있다.

국소적 투여용 약제학적 조제물은 국소적 치료의 경우 특히 유용하다. 국소적 치료용 조제물은 연고, 스프레이, 겔, 현탁액, 로션, 크림 및 그와 같은 것을 포함한다. 국소적 투여용 조제물은 본 올리고머에 추가하여, 이소프로판올, 글리세롤, 파라핀, 스테아릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 공지의 담체물질을 포함할 수 있다. 또한 약학적으로 수용가능한 담체는 공지의 화학 흡수 촉진제를 포함할 수 있다. 흡수 촉진제의 실예로는 예를 들면, 디메틸아세트아미드(미국특허 3,472,931호), 트리클로로-에탄올 또는 트리플루오로에탄올(미국특허 3,891,757호), 몇몇 알콜 및 그 혼합물(영국특허 1,001,949호), 및 영국특허 명세서 1,464,975호이다.

본 올리고머의 치료적 사용에 추가하여, 이 올리고머는 T-세포 활성화의 분석적 실험도구로도 사용될 수 있다. T-세포는 CD28 및 항원 특이적 T-세포 수용체에 추가하여 몇몇의 표면 수용체를 가진다. 다중 수용체 중개 경로간의 잠재적 및 실제적 상호작용 때문에 선택된 수용체의 개별적인 생물학적 성질의 연구에서 어려움이 있다. T-세포내에서 CD28 발현을 감소시키기 위한 기작을 제공하는 것에 의해, 본 발명의 올리고머 및 방법은 또한 CD28 활성화 경로의 개별적 T-세포 행동 연구를 위한 유용한 실험 방법을 제공한다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하는 것에 의해 보다 잘 이해된다. 하기 실시예는 발명의 설명을 목적으로 제공되며 발명을 제한으로 이해되지는 않아야 한다.

[실시예]

[시리즈 1]

[올리고뉴클레오티드]

올리고뉴클레오티드를 자동화 DNA 합성기(Applied Biosystems사 모델 394) 상에서 표준 포스포르아미디트 화학을 이용하여 합성하였다. β-시아노에틸포스포르아미디트, 합성시약 및 CPG 폴리스티렌 칼럼을 Applied Biosystems사(ABI, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 3′-AminoModifier C3 CPG 칼럼을 Glen Research사(Sterling, VA)로부터 구입하였다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 경우, 표준 산화병을 테트라에틸티우람 디술피드/아세토니트릴로 교체하고, 포스포로티오에이트 결합의 단계적 첨가를 위해 표준 ABI 포스포로티오에이트 프로그램을 이용하였다. 조절된 세공(pore)유리 칼럼으로부터의 절단한 후, 올리고뉴클레오티드를 55℃에서 8시간동안 농축된 수산화암모늄으로 처리하는 것에 의해 보호기를 제거하였다. 이 올리고뉴클레오티드를 역상 세미프렙 C8 칼럼(ABI)을 이용하는 HPLC에 의해 정제하였다. DMT 보호기의 절단, 80% 아세트산 처리 및 에탄올 침전에 있어서, 생성물의 순도는 분석적 C18 칼럼(Beckman, Fullerton, CA)을 이용하는 HPLC에 의해 평가하였다. 순도 ＞90%인 모든 올리고뉴클레오티드를 건조상태까지 동결건조하였다. 올리고뉴클레오티드를 멸균 탈이온수(ICN, Costa Mesa)에 다시 녹여 400μM로 맞추고 OD 260nm에서의 평가에 이어서, 실험에 앞서 나누어서 -20℃에서 저장하였다. 모든 경우, 표 1에 있는 각 올리고뉴클레오티드의 적어도 3배치를 사용하였다.

[세포주 및 T-세포 정제]

건강한 제공자로부터의 60ml 혈액을 Ficoll-Hypaque 농도 구배 원심분리하고 이어서 말초 혈액 단핵세포(PBMCs)를 연층으로부터 단리하였다. 그리고 나서 T-세포를 T-세포에 특이적인 Lymphokwik 임파구 단리제(LK-25T, One Lanbda, Canoga Park CA)를 사용하여 PBMCs로부터 정제하였다. 그리고 나서 평균 수율 40 내지 60×10⁶T-세포를 37℃에서 20 내지 30ml의 RPMI-APS(20μM HEPES 완충액, pH 7.4, 5% 자가 혈장, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.05% 2-머캡토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 배지(ICN, Costa Mesa, CA))내에서 하룻밤 배양하여 모든 오염성 부착 세포를 제거하였다. 모든 실험에서, T-세포를 RPMI-AP5로 세척하고 그리고 나서 96-웰의 미크로티터 플레이트상에 2 내지 3×10⁶세포/ml의 세포농도로 도말하였다.

[표 1]

[표 2]

T-세포 임파종 세포주, 저캣 E6-1(CD28⁺/CD4⁺) 세포(152-TIB) 및 HUT 78(CD28^-/CD4⁺) 세포(TIB-161)(ATCC, Rockville, MD)를 RPMI-10(20μM HEPES 완충액, pH 7.4, 10% 소 태아 혈청(FCS)(Hyclone, Logna, UT), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 RPMI-1640 배지)내에서 유지시켰다.

[유사분열물질로 유도된 T-세포 활성화 및 올리고뉴클레오티드 처리]

인간 말초 T-세포 또는 T-세포 임파종 세포주(0.2 내지 0.3×106)의 첨가에 앞서서, 복사체 96-웰 미크로티터 플레이트를 정제된 항-CD28 모노클로널 항원(mAb)(6.25 내지 200ng/웰)(클론 HIT 3a, Pharmingen, San Diego, CA)으로 미리 코팅하고 pH 7.4의 차가운 인산 완충된 염수(PBS)로 2회 세척한다. 항-CD3 mAb 처리된 T-세포를 2ng 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Calbiochem, La Jolla, CA)의 첨가에 의해 더 활성화시키고 48시간동안 37℃에서 인큐베이트하였다. 항-CD3/PMA-활성화된 T-세포를 1 내지 20μM C28 특이적 및 대조 올리고뉴클레오티드로 처리하고 곧바로 활성화시키고 24시간 후 재처리하였다. 한 복사체 플레이트로부터의 T-세포를 면역형광법 분석에 사용하였고 시토킨 연구를 위해 사용된 상징액 및 두번째 플레이트를 T-세포 증식 분석을 위해 사용하였다.

[면역형광법 연구]

활성화에 이어서, 첫번째 복사체 미크로플레이트로부터의 150ml의 세포상징액을 세포 유래의 시토킨 생성 분석을 위해 또다른 미크로플레이트로 옮겼다. 남은 세포를 pH 7.4의 등장액(Becton Dickinson, Mansfield, MA)으로 2회 세척하고 50ml의 등장액에 재현탁시키고 두 시료로 나누었다. 한 시료의 알리컷을 PE-CD28(FITC-CD4든지 PE-CD54/FITC-CD25 mAb로 동시 염색하고, 두번째 알리컷을 PE/FITC 표지된 아이소타입-매치된 대조 모노클로널 항체로 염색하는 것에 의해 비특이적 형광을 평가하였다. 모든 형광 표지된 모노클로널 항체는 Bacton Dickinson사(San Jose, CA)로부터 구하였다. 인큐베이션은 암소에서 4℃에서 45분간 포화 mAb 농도를 이용하여 실시하였다. 병합되지 않은 표지를 PBS로 세척하여 제거하였고 이어서 FACScan 유동세포계측기(Becton Dickinson사)로 분석하였다. 항원 밀도를 통과된 생세포로 간접적으로 측정하였고 형광의 평균 채널(MCF)로 표현하였다. 특이적 항원(CD54, CD25)의 표면 발현을, FITC- PE-표지의 항원 특이적 mAb 염색된 세포의 MCF를 빼어 얻어진 평균채널 이동(MCS)으로 다시 나타내었다. 다르게는 CD28 mAb로 염색된 세포의 CD4⁺하위세트의 표면발현을 CD28^-CD4^-세포의 MCF로부터 CD28⁺CD4⁺세포의 MCF를 빼는 것에 의해 결정하였다. 대조의 비처리 및 올리고뉴클레오티드 처리된 세포의 생존능력을 다양한 제공자내의 모든 올리고뉴클레오티드의 각 배치에서 생체 염료(vital dye)인 요오드화프로피듐(최종농도 5μg/ml)으로 염색하는 것에 의해 측정하였다. 투여량 범위 1 내지 20μM(제2도)로 모든 올리고뉴클레오티드의 모든 배치로 처리한 뒤 요오드화프로피듐을 배척한 생세포의 백분율을 유동세포계측에 의해 측정하였으며, 그 값은 ＞90%(90 내지 99%에 걸침)이었다.

[시토킨 분석]

세포 유래의 인간 시토킨 농도를 첫번째 복사체 미크로플레이트로부터의 세포 상징액에서 측정하였다. 인터루킨-2(IL-2) 수준에서의 유사분열물질로 유도된 변화를 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(R＆D systems Quantikine kit, Minneapolis, MN)을 이용하여 측정하거나 IL-2 의존성 세포주인 CTLL-2(ATCC, Rockville, MD)를 사용하는 생물학적 정량에 의해 측정하였다. 인터페론-감마 및 인터루킨-8(IL-8) 수준에서의 유사분열물질로 유도된 변화를 각각 Endogen(Cambridge, MA) 및 R＆D systems(Quantikine kit, Minneapolis, MN)로부터의 키트를 이용한 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 ELISA 결과를 pg/ml으로 나타내었으며, CTLL-2 생물학적 정량은 CTLL-2 세포에 의한³H-티미딘(ICN, Costa Mesa, CA)의 IL-2 의존성 세포성 병합을 의미하는 분당 총수로 나타내었다.

[T-세포 증식 분석]

모든 실험에서의 두번째 복사체 미크로플레이트를 유사분열물질로 유도된 T-세포 증식에서의 변화를 위해 분석하였다. 항-CD3/PMA 활성화 72시간후, 올리고뉴클레오티드의 부재 또는 존재하에서 세포를 1μCi 3H-티미딘(ICN, Costa Mesa, CA)으로 펄스시키고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 방사성 표지의 병합에 의해 평가되는 바와같이, 유사분열물질로 유도된 세포성장은 세포를 수확하고 Wallac Betaplate 계수기(Wallac, Gaithersburg, MD)상에서 신틸레이션 계수에 의해 결정하였다.

[CD28 특이적 올리고뉴클레오티드에 의한 활성화된 인간 T-세포에서의 CD28 발현의 저해]

인간 T-세포의 항-CD3/PMA 처리는 휴지중의 T-세포에서의 122±7.74의 MCS에서 150±9.27(n=9)의 MCS로 CD28의 표면발현(면역형광법 분석을 이용하여)을 증가시켰다. 휴지중 및 활성 T-세포내에서의 CD28 발현의 치아를 유사분열물질로 유도된 CD28 발현으로 정의한다(제3(a)도), 제3(b)도 및 제3(c)도는 항-CD3/PMA 활성화 T-세포를 CD28 특이적 및 대조의 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트(S-올리고머로 표시됨, 제3(b)도) 및 포스포로티오에이트-3′아민(A-올리고머로 표시됨, 제3(c)도)으로 그리고 각 올리고뉴클레오티드의 2 독립적인 배치로 처리한 것을 나타낸다. 2 내지 10μM 투여량 범위내의 RT01 내지 RT04의 네 후보 올리고뉴클레오티드중에서, RT03 및 RT04의 포스포로티오에이트 및 포스포로티오에이트-3′ 아민이 유사분열물질로 유도된 CD28 발현의 가장 활성적인 저해제였으며, 둘다 5μM 또는 그 이하에서 50%(IC₅₀)보다 크게 유도된 CD28 발현을 저해하였다. 길이가 다른 이들 두 올리고뉴클레오티드는 이중가닥 DNA의 한 범주의 길이, CD28 유전자의 전사개시 부위의 5′ 상류와 혼성화하도록 설계되었다. 대조 올리고뉴클레오티드인 RT01(서열번호 5) 내지 RT06(서열번호 10)(표1)에 대해서는, 유사분열물질 유도된 CD28 발현의 유사한 투여량 의존성 저해가 관찰되지 않았다. 모든 실험을 7 제공자로부터의 T-세포를 사용하는 각 올리고뉴클레오티드의 적어도 3배치로 실시하였다. 말초, 표피 및 피부 T-림프구가 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드의 의도된 표적이기 때문에, CD28 발현의 올리고뉴클레오티드 조절이 인간 T-세포에서 증명될 수 있다는 사실은 중요하다.

[CD28 특이적 올리고뉴클레오티드에 의한 유사분열물질로 유도된 T-세포 증식의 저해]

항-CD34/PMA 처리의 유사분열 효과가 휴지중 T-세포의 활성화에 이어서 관찰된 증가된 증식에 의해 증명될 수 있었다. 분당 총수로 나타내지는³-티미딘의 병합은 활성화된 T-세포에서 301641±47856(n=9)이고 휴지중 T-세포에서 650±566(n=9)이었다. T-세포 증식상에의 항-CD3 및 PMA의 효과는 제4(a)도에 도시된 바와 같이 상승작용적이다. 제4(b)도는 CD28 특이적 및 대조 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 항-CD3/PMA 활성화된 T-세포 증식에 대한 효과의 대표적 실험을 보여준다. 적어도 7번의 개별적 실험에서, 모두 투여량 2 내지 10μM의 범위에서, RT03 및 RT04의 포스포로티오에이트(자료 도시되지 않음) 및 포스포로티오에이트-3′아민(제4(b)도) 모두가 T-세포 증식을 45%까지 저해하여, 유사분열물질에서 유도된 T-세포 증식의 가장 활성적인 저해제였다. 대조 올리고뉴클레오티드인 RTC04(서열번호 6) 내지 RTC06(서열번호 10)으로는, 유사분열물질에서 유도된 T-세포 증식의 유사한 투여량 의존성 저해가 관찰되지 않았다. 여기서 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드인 RT03 및 RT04로의 처리는 활성화된 T-세포의 과다 증식을 반전시킬 수 있으며, 따라서 CD28 경로의 조절이 T-세포 활성화, T-세포 증식의 필수적인 생물학적 기능에 대한 중요한 효과를 가진다는 것을 증명한다.

[CD28 특이적 올리고뉴클레오티드에 의한 활성화된 T-세포 유도 시토킨 생성의 저해]

활성화된 T-세포는 IL-2, 인터페론-감마 및 IL-8을 포함하는 다양한 면역조절성 시토킨을 생성한다. IL-2 및 IL-8에 대한 CD28-유도되는 제한 요소가 두 유전자에 대한 프로모터 유전자에서 증명되었고 이어서 CD28 경로에 의해 조절되는 것으로 나타났다(Fraser et al., (1991) Science 251:313-316, Seder et al., (1994) J Exp Med 179:299-304). 인터페론-감마도 또한 CD28 경로에 의해 조절되는 것으로 나타났다(Wechsler et al., J. Immunol. 153:2515-2523(1994)). 휴지중 T-세포의 항-CD3/PMA 처리는 세 시토킨 모두의 T-세포-유도된 수준을 극적으로 증가시켰다(제5(a), 제6(a) 및 제7(a)도). 제5, 6도 및 제7도는 동일한 대표적 제공자로부터의 활성화된 T-세포내에서의 IL-2, 인터페론-감마 및 IL-8에 대한 CD28 특이적 및 대조 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트(B) 및 포스포로티오에이트-3′아민(C) 형태의 효과를 묘사한다. 대조 올리고뉴클레오티드인 RTC01(서열번호 5) 내지 RTC06(서열번호 10)을 제외한, CD28 특이적 올리고뉴클레오티드인 RT03(서열번호 3) 및 RT04(서열번호 4)는 활성화된 T-세포에서 유사분열물질-유도된 IL-2, 인터페론-감마 및 IL-8 생성을 용량-의존적으로 저해했다. CD28 특이적 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트(IC₅₀5μM) 및 포스포로티오에이트-3′아민(IC₅₀10μM)은 투여량 2 내지 10μM의 범위에서 동등하게 효과적이었다. 모든 세 시토킨에 대한 유사한 결과가 4 또는 그 이상의 여러 제공자에서 보여졌다. 이들 관찰은 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드도 또한 T-세포 활성화의 CD28 경로의 다양한 작용인자 분자를 조절할 수 있음을 증명한다.

[CD28 발현의 올리고뉴클레오티드 저해의 특이성]

CD28 특이적 올리고뉴클레오티드인 RT03 및 RT04의 특이성을 세 방법에 대해 평가하였다.

(1) CD28 의존성 T-세포 활성화 마커

첫번째 방법은 이들 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드가 CD28 동시자극 경로에서 독립적으로 작용하는 기타 인간 T-세포 활성화 마커의 발현을 저해하는 능력이 있는가를 측정하는 것이었다. 휴지중 T-세포의 활성화는 IL-2 수용체(CD25) 및 세포내 부착 분자인 ICAM-1(CD54)의 둘다의 발현을 현저하게 증가시켰다. 그러나 이들 두 보조 분자 둘다는 CD28 경로에서 독립적으로 조절된다(June et al., Mol. Cell Biol., 7:4472-4481(1987), Damle et al., J. Immunol., 149:2541(1992). 제8도는 CD28 특이적 및 대조 올리고뉴클레오티드의 유사분열물질-유도된 T-세포에서의 CD25(제8(a)도) 및 CD54(제8(b)도) 발현에 대한 효과를 보인다. 모든 CD28 특이적 및 대조 올리고뉴클레오티드를 투여량 2 내지 10μM의 범위로 처리한 후의 활성화된 T-세포에서 CD25 및 CD54 둘다의 발현의 현저한 감소는 관찰되지 않았다. 이것은 그들의 표적 단백질의 발현을 저해하는 것에서의 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드의 특이성을 증명한다.

(2) CD28-음성 T-세포주, HUT 78

둘째 방법은 CD28⁺, T-세포 백혈병 세포주인 저캣 E6-1 및 CE28^-, T-세포 임파종 세포주인 HUT 78에서의 유사분열물질-유도된 IL-2의 생성을 비교하는 것에 의해 CD28 경로가 실제적으로 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드의 표적임을 증명하는 것이다. 제9(a)도는 휴지중 및 활성화된 HUT 78세포 둘다에서 CD28 발현이 부재함을 증명하며, 하지만 구성 수준의 CD28이 저캣 E6-1 세포에서 활성화를 증가시켰다(제9(b)도), CD28⁺저캣 E6-1 세포에서는 CD28 특이적 그러나 대조는 아닌 올리고뉴클레오티드는 유사분열물질-유도된 CD28 발현(제9(c)도) 및 유사분열물질-유도된 IL-2 생성도 저해할 수 있었다(제10(b)도). 반대로 CD28^-HUT 78 세포에서는 유사분열물질-유도된 IL-2 생성은 CD28 특이적 및 대조 올리고뉴클레오티드에 의해 영향받지 않았다(제10(a)도). 이것은 이들 올리고뉴클레오티드가 단지 CD28 조절되는 IL-2 생성을 저해하는 특이성을 명백히 증명한다.

(3) CD28 경로의 특이적 활성화

세번째 방법은 유사분열물질만으로의 T-세포 활성화에서 사용되는 것들에 대해 동일한 프로토콜을 사용하여, 항 CD28 모노클로널 항체를 유사분열물질(항 CD3/PMA)과 조합하여서 사용하여 CD28 경로를 거쳐 휴지중 T-세포를 특이적으로 활성화시키는 것이다. PMA와 또는 항 CD3와 조합하여 항 CD28 MAb는 휴지중 T-세포에 동시자극성 신호를 제공하는 것과 T-세포 증식 및 시토킨 생성의 TCR 의존성이 아닌, CD28 의존성만의 증가를 촉진하는 것으로 이전에 보였다(June et al., (1987) Mol. Cell Biol., 7:4472-4481). 특이적 그러나 대조는 아닌 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트 및 포스포로티오에이트-3′아민 형태는 항 CD28/유사분열물질-활성화된 휴지중 T-세포에서 IL-2, IL-8 및 인터페론-감마 생성의 CD28 의존성 활성화 및 T-세포 증식을 저해하는 능력이 있었다(자료 보이지 않음). 이것은 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드만이 T-세포 활성화의 CD28 경로에 대해서만 작용함을 명백히 증명한다.

[VII 실시예]

[시리즈 2]

[올리고뉴클레오티드]

올리고뉴클레오티드를 Applied Biosystems사 394 DNA 합성기로 합성하였다. 표준 산화병을 테트라에틸티우람 디술피드/아세토니트릴로 교체하고, 포스포로티오에이트 결합을 도입하였다. 올리고뉴클레오티드의 순도를 분석적 HPLC에 의해 평가하였다. 순도 ＞90%인 모든 올리고뉴클레오티드를 건조상태까지 동결건조하고 물에 다시 녹였다(400μM). 표 3 및 표 5에 게재된 각 올리고뉴클레오티드의 적어도 3배치를 사용하였다. 올리고뉴클레오티드의 5′표지화는 T4 올리고뉴클레오티드 키나제 및³²P-γATP를 사용하여 달성하였다.

[T-세포 활성화 연구]

말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 밀도구배 원심분리에 의해 건강한 제공자로부터 단리하고 이어서 Lymphokwik(One Lamda)를 사용하여 T-세포를 증량시켰다. 오염화 단구를 플라스틱에 부착시켜 제거하였다. 정제된 T-세포는 ＞99% CD2⁺, ＜1% HLA-DR⁺및 ＜5% CD25⁺이었다. 저캣 E6-1(CD28⁺/CD4⁺) T-세포 및 HUT 78(CD28^-/CD4⁺) T-세포 및 단구세포주인 THP를 ATCC로부터 얻었다. 세포들을 0.2 내지 0.3×10⁶/웰의 농도로 배양하였고 플레이트 고정화된 항 CD3 모노클로널 항체(mAb)(HIT3A 0.25μg/ml)(Pharmingen) 및 2ng 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Calbiochem)으로 활성화시켰다.

[면역형광법 연구]

세포를 PE-CD28/FITC-CD4든지 PE-CD54/FITC-CD25 mAb로 또는, PE/FITC 표지의 아이소타입-매칭된 대조(Becton Dickinson)구로 동시염색하였다. 세포 표면 항체 밀도(CD28, CD54, CD25)를 유동세포계측기(FACScan, Becton Dickinson)로 확인하였다. 모든 올리고뉴클레오티드의 각 배치 1 내지 10μM을 48시간 인큐베이트한 후) 생존성을 다양한 제공자로부터의 대조구로 처리되지 않은 및 올리고-처리된 CD4⁺세포에서 요오드화프로피듐(5μg/ml) 배척에 의해 측정하였고 일반적으로 ＞90%(90 내지 99%에 걸침)이었다.

[증식 및 시토킨 분석]

증식적 반응을 각 분석의 마지막 16시간 동안³H-티미딘(1μCi, ICN) 병합을 측정하는 것에 의해 평가하였다. 세포를 필터상에서 수확하였고 이어서 월락 베타플레이트 계수기상에서 신틸레이션 계수에 의해 DNA 합성을 측정하였다. 배양 상징액내의 시토킨 농도를 IL-2, IL-8(R＆D Systems) 및 IFN-γ(Endogen)에 대한 ELISA 키트를 이용하여, 또는 IL-2 의존성 세포주인 CTLL-2(ATCC)을 이용하는 생물학적 정량에 의해 분석하였다.

[RT-PCR 및 서던 분석]

전체 세포성 RNA를 트리졸 시약(GIBCO/BRL)을 사용하여 추출하였다. cDNA 합성반응(Promega)을 올리고머(dT)₁₅프라이머 및 AMV 역전사효소(H.C.)를 사용하여 실시하였다. PCR 반응(GeneAmp PCR 키트, Perkin-Elmer Cetus)은 3μl의 cDNA, dNTPs(각 200μM), 0.5μM의 각 프라이머 및 1 유니트의 Taq 중합효소를 함유하는 50μl의 혼합물로 구성되었다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:CD28 5′-CTGCTCTTGGCTCTCACTT-3′(센스) 및 5′AAGCTATAGCAAGCCAGGAC-3′(안티센스), 인터루킨-2 수용체 p55 알파 사슬 프라이어(Stratagene) 및 pHE7 리보좀 유전자, Kao, H.-T., Nevins, J. R. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 2058-2065. 증폭 조건은 35주기의 94℃에서 45초, 57℃에서 1분 및 72℃에서 2분, 이어서 72℃에서 8분간이었다. PCR 생성물을 2% 아가로스상에서 분리하였고, 20×SSC내의 Hygond N+ 멤브레인(Amersham)으로 하룻밤동안 옮기고 0.4M NaOH를 사용하여 고정화시켰다. 블로트들을³²P-γATP 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시켰다. 세척한 블로트들을 이어서 PhosphorImager를 이용하여 분석하였다.

[MLR 및 동종항원-특이적 T-세포 분석]

MLR 반응을 위해 PBMCs를 HLA-비상대성 개체로부터의 미토마이신 C-처리된(50μg/ml) PBMCs와 배양하였다(1:1). 동종항원-특이적 T-세포 분석에서, 파상풍-변성독소-자극된(primed) 건강한 제공자로부터 단리된 T-세포를, 파상풍 변성독소의 존재하에(2μg/ml, List Biologicals) 자가의 미토마이신 C-처리된 PBMCs와 배양하였다(1:1). 두 분석에서, 2×105 세포/웰을 37℃에서 6일간 부가적 분석에 앞서서 배양하였다.

[시험관내 올리고뉴클레오티드 안정성 연구]

일시적 올리고뉴클레오티드 안정성 분석을 이전에 기술된 바와 같이 실시하였다(Tam. R.C., Li, Y., Noonberg, S., Hwang, D.G., Lui, G., Hunt, C.A., Garovoy, M.R.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 977-986). 올리고뉴클레오티드 분해 프로파일을 전기영동에 의해 평가하였고 Nickspin 칼럼을 이용하여 정량하였다.

[포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 CD28 발현의 저해는 특이적이며 활성화 T-세포 기능에 영향을 준다.]

제11도는 표 3의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들의 보조 분자의 표면 발현에 대한 및 활성화 T-세포에서의 시토킨 분비에 대한 효과를 요약한다. 사용된 올리고머들은 CD28 유전자의 5′비번역 영역(UT)에 혼성화하도록 설계되었고, 안티센스(AS)이든지 G-풍부 서열이었다. 대조의 올리고머는 센스 가닥(SS)이든지 상보적 가닥(CS) 서열이었다. 휴지중 T-세포(R)의 항 CD3 항체 및 PMA로의 48시간 처리는 보조 분자인 CD28(A), CD25(B) 및 CD54(C), 및 시토킨인 IL-2(D), IFNγ(E) 및 IL-8(F)의 발현(Ac)을 증가시켰다. 자료를 삼중 시료의 평균 표준편차로서 나타내었다. 표 3의 포스포로티오에이트의 2μM(■), 5μM(

) 및 10μM(

)의 두번의 첨가(0 및 24시간)의 활성화-유도된 T-세포 기능에 대한 축적효과는 면역형광법 분석(부수적 분자) 및 CTLL-2 생물학적 정량(IL-2)과 ELISA(IFNγ, IL-8)를 이용하여 분비된 시토킨 수준의 측정에 의해 모니터하였다. 게이트된(gated) 살아있는 CD4⁺세포내의 표면 항원 밀도(MCS)를 IgG1 대조에 비교하여 형광의 평균채널의 증가로서 측정하였다.³H-티미딘의 IL-2 의존성 세포성 병합은 분당 계수(cpm), 및 면역활성 INFγ 및 IL-8은 pg/ml로서 측정하였다. 단일 제공자로부터 단리된 T-세포상에서 실시된 실험에서 유도된 모든 보인 자료는 9의 개별적 제공자 유래 실험을 대표한다.

[표 3]

자료는 선택된 포스포로티오에이트 올리고머(표 3)가 cd4⁺T-세포내에서 활성화 유도된 CD28 발현을 특이적으로 차단할 수 있음을 증명한다. 대표적 제공자에서(제11(A)도), IL-2 수용체(CD25)나 세포내 부착 분자-1(ICAM-1 또는 CD54) 발현이 아닌 활성화 유도된 CD28 발현은 포스포로티오에이트 올리고머인 RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)(IC50≤5μM)에 의해 투여량 의존적 방식으로 저해받았다. 안티센스 올리고머인 RT01S(서열번호 42)나 RT02S(서열번호 43), 또는 대조 올리고머인 RTC01S(서열번호 46), RTC02S(서열번호 47) 및 RTC06S(서열번호)으로는 유사한 저해가 관찰되지 않았다. 더욱이 우리는 활성 올리고머가 활성화된 인간 T-세포내에서 전사를 차단하는 것에 의해 활성화 유도된 CD28을 조절한다는 확신을 제공하였다. 10μM에서 대표적 대조 올리고인 RTC06S(서열번호 48)를 제외한 RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)는 IL-2 수용체 mRNA를 제외한 CD28의 활성화 유도된 수준의 발현을 감소시켰다(제12도).

제12도는 CD28 및 CD25 mRNA 수준에 대한 10μM의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸다. CD28 및 CD25 mRNA의 휴지중(레인 1) 및 항 CD3/PMA-활성화(6시간) 수준을, 올리고뉴클레오티드 RT03S(서열번호 44)(레인 4), RTC06S(서열번호 64)(레인 5) 및 RT03D(서열번호 49)(레인 6)의 결여(레인 2) 또는 존재하에서, 전체 세포성 RNA의 RT-PCR 및 특이적 방사능 표지된 프로브를 사용하는 서던 분석에 의해 검출하였다. CD28 프로브는 엑손 2(5′-ACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAA-3′)으로부터 유도되었으며, IL-2 수용체 경우, 프로브는 원래의 프라이머 혼합물로부터 도출되었다. pHE7 센스 프라이머로부터 도출된 프로브와 혼성화에 이어 등가(equivalent) 로딩을 평가하였다. CD28-결핍 HUT(7) 및 THP(8) 세포주로부터의 RNA가 대조구로 사용되었다. 보이는 자료는 3개별적 실험을 대표한다.

따라서 생물학적 활성 포스포로티오에이트에 의한 CD28 mRNA 수준의 특이적 저해는 CD28 표면 단백질에 대한 그들의 효과와 대등하였다. 더욱이 RT01S(서열번호 44)나 RT02S(서열번호 43) 또는 대조 올리고머인 RTC01S(서열번호 46), RTC02S(서열번호 47) 및 RTC06S(서열번호 48)를 제외한 RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 43)가 활성화 T-세포(IC₅₀≤5μM, 2 내지 10μM에 걸침)에 의해 시토킨인 IL-2, IFNγ 및 IL-8의 항 CD3/PMA 유도된 합성을 현저하게 저해한 것과 같이, 활성 올리고머들은 활성화 유도된 T-세포 기능을 현저하게 폐지하였다(제11(b)도).

다른 동시자극 경로도 활성화된 T-세포내에서 림포카인 합성을 유도할 수 있는 바와 같이(Damle, N.K., Klussman, K., Linsley, P.S. Aruffo, A.(1992) J. Immunol. 148, 1985-1992), RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)의 생물학적 활성도가 기능적 CD28 발현에 대해 특이적인가를 측정하는 것이 중요하다. 따라서 우리는 CD28⁺인 T-세포 백혈병 세포주, 저캣 E6-1 및 CD28^-인 T-세포 임파종 세포주, HUT 78내에서의 항 CD3/PMA 유도된 IL-2 생성에 대한 포스포로티오에이트의 효과를 비교하였다. 제13도에 설명되어 있는 바와 같이, 항 CD28 항체 및 PMA로 휴지중 세포(R)의 48시간 처리는, HUT 78(A, 왼쪽)세포를 제외한, 저캣(A, 오른쪽)에서의 CD28 발현을 증가시켰다. 그러나, 활성화는 저캣(C, 왼쪽) 및 HUT 78(D, 왼쪽) 세포에서 IL-2 생성을 증가시켰다. 활성 올리고뉴클레오티드인 RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)는 1μM(□), 2μM(■), 5μM(

) 및 10μM(

)에서, 활성화 저캣 세포내에서 CD28 발현(B) 및 IL-2 수준(C, 오른쪽)을 저해하였으나, 활성화 HUT 78 세포내에서 CD28 의존성 IL-2 분비에 대해서는 효과가 없었다(D, 오른쪽). 보이는 자료는 3 개별적 실험을 대표한다.

제13(a)도에서, 면역세포 형광측정 분석은, CD28의 구성의 수준이 저캣 E6-1세포에서의 활성화를 증가시켰으나, 휴지중 및 활성화 HUT 78 세포 둘다에서 CD28 발현의 부재를 확인시켰다. 더욱이 저캣 E6-1 세포내에서, RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)(1 내지 10μM에 걸침)는 활성화 유도된 CD28 발현(제13(b)도) 및 IL-2 생성(제13(c)도) 둘다를 현저히 저해하였다. 반대로, 비록 활성화된 HUT 78 세포가 IL-2의 유사한 수준을 생성하였지만, 이 림포카인의 비교할만한 올리고-의존적 저해는 관찰되지 않았다(제13(d)도).

또한 우리는 항 CD3과의 조합하여 특이적 항 CD28 mAb에 의해 조절되는 T-세포 활성화(CD28, IL-2, IL-8 및 IFNγ의 발현)는 생물학적으로 활성 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의해 차단되었음을 증명하였다(자료는 도시되지 않음). CD28 분자의 직접적 교차결합이 T-세포 증식 및 시토킨 생성을 TCT-의존적이 아닌 오직 CD28-의존적인 증가 및 촉진하는 것으로 이전에 보여져 왔다(June, C.H., Ledbetter, J.A., gillespie, M.M., Lindsten, T., Thompson, C.B.(1987) Mol. Cell. biol. 7, 4472-4481). 우리의 자료를 함께 취하여 볼때, 우리의 자료는 활성 올리고머의 생활성도는 T-세포 활성화의 CD28 경로에 대해 특이적임을 강하게 제시한다.

[포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 동종항원 의존적 T-세포 분석에서의 T-세포 증식성 반응 및 일차적 동종면역 혼합된 림프구 반응의 저해]

다음에 우리는 CD28 특이적 올리고뉴클레오티드인 RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)의 항원 특이적 일차 면역 반응에서의 효율을 시험관내에서 비교하였다. 제14도에서, CD28의 휴지중(A, B) 및 활성화(E, F) 수준을 파상풍 변성독소 특이적 T-세포 분석(상단 패널, A 및 B) 및 혼합 림프구 반응(하단 패널, E 및 F)에 대하여 표시하였다. CD4⁺인 CD28-hi T-세포의 백분율을 A, B, E 및 F에 대하여 오른쪽-핸드 마커로 나타내었다. 각 분석에서 CD28-hi 발현 T-세포(C, G) 및 활성화된 T-세포 증식(D, H)의 백분율을 감소시키기 위한 1μM(□), 2μM(■), 5μM(

) 및 10μM(

)의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 두 첨가(0 및 96시간)의 잠재력에 의해 올리고머 활성도를 평가하였다. 파상풍 변성독소에 대한 반응으로(상부 패널) 또는 미토마이신-C 처리된 자극제 PBMCs(Y)에 의한 반응자 T-세포(X)의 자극에 이어서(하부 패널) T-세포 활성화를 개시하였다. 이들 자료는 3개 별적 실험을 대표한다.

제14도에서, 파상풍 변성독소 특이적 T-세포 분석(제14(b)도) 및 일차적 혼합된 림프구 반응(제14(f)도)을 이용하여, 우리는 6일 분석기간후 활성화-유도된 CD28-hi 발현 T-세포의 부차집단(subpopulation)의 출현을 관찰하였다. RT03S(서열번호 44) 및 RT04S(서열번호 45)(2 내지 10μM)의 첨가는 CD28-hi 발현의 투여량-관련의 감소(제14(c)도, 제14(g)도), 및 파상풍 변성독소 특이적(제14(d)도) 및 반응자 세포 항원 특이적(제14(h)도) T-세포 증식에서 대응하는 감소를 초래하였다. RT01S(서열번호 42) 또는 대조 올리고머인 RTC01S(서열번호 46), RTC02S(서열번호 47) 또는 RTC06S(서열번호 48)으로는 유사한 효과가 관찰되지 않았다.

[시험관내 올리고뉴클레오티드 안정성은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 생물학적 활성도를 확대시킨다.]

포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고머의 변형은 유클라제 저항성을 주고 따라서 시험관내 생물활성도를 1-2시간 내지 24시간으로 확대하는 것으로 알려졌다(Stein, C.A., Cheng, Y.C. (1993) Science 261. 1004-1012). 표 4는 포스포로티오에이트, RT03S(서열번호 44) 및 RTC06S(서열번호 48)의 CD28 발현에 대한, 올리고뉴클레오티드의 지속적 존재하(C) 또는 2일에 세포의 환경으로부터 제거(D)할 때의, 일시적 효과를 나타낸다. 모니터는 면역형광혈구계산(immunofluorocytometry)으로 수행하였다. 결과를 활성화된 T-세포(MCF_A) 및 올리고뉴클레오티드-처리된 활성화된 T-세포(MCF_X)의 표면 항원 발현에서의 차이로 표현된다. 2일 내지 4일에서 휴지중 T-세포에서의 CD28 발현은 119 내지 121의 범위내에 있었다. “ND”는 구별할 수 있는 차이가 없음을 나타낸다.

[표 4]

표 4에서 보인 바와 같이, RT03S(서열번호 44)의 효과의 지속은 24시간을 초과하였고 올리고머 투여량에 비례하여 2, 3 및 4일 동안 유지하였다. 그러나 2일째에 세포외 환경으로부터 RT03S(서열번호 44)의 제거함에 따라, 저해 활성은 24시간 동안 유지되었고 이어서 다음 24시간 내에 완전히 없어졌다. 동일한 시간대에 걸쳐 대표적 대조 올리고인 RTC06S(서열번호 48)으로는 올리고머 활성이 관찰되지 않았다. 활성화된 T-세포 증식의 올리고-중개의 저해로는 유사한 현상이 관찰되었다(자료는 도시되지 않음). 포스포로티오에이트 변형만에 의해 제공된 증가된 생물 유용성은 RT03S(서열번호 44)의 현저하게 연장된 생물활성도를 설명할 수 없다. 따라서 우리는 효과의 연장된 지속이 RT03S(서열번호 44)의 이차구조에 의해 제공된 추가적 시험관내 안정성과 관련이 있음을 증명하였다.

제15도는 세포의 상징액(상부 패널) 및 저캣 세포 분해물(하부 패널)에서의³²P-표지된 포스포로티오에이트, RT03S(서열번호 44) 및 RTC06S(서열번호 48)의 시험관내 안정성에 대한 시험 결과를 요약한다. (A) 각 올리고뉴클레오티드(2000cpm) 시간 의존성 분해(0 내지 96시간)를 20% 폴리아크릴아미드 불활성화 겔상에서의 전기영동후 PhosphorImager를 이용한 가시화에 의해 판정하였다. (B) t=0 상대적인, 각 시점에서 남겨진 원래의 전체 길이³²P-RT03S(서열번호 44)(○) 및³²P-RTC06S(서열번호 48)(●)를 Nickspin 칼럼(Pharmacia)을 통해 적용된 10000cpm의 세포외 상징액 및 세포 분해물로부터의 용리액으로 측정하였다. 분자량 표준(Std),³²P-dNTP(N) 및 유리³²P-오르토포스페이트(P)을 동시에 분석하였다.

제15(a)도에서, 일렉트로페로그램(electropherograms)은 세포외 상징액(S) 및 세포 분해물(L) 모두, 저캣 세포로 96시간 인큐베이션 후 RTC06S(서열번호 48) 보다 현저하게 많은 원래의³²P-표지의 RT03S(서열번호 44)가 남는다는 것을 명백하게 보인다. Nickspin 칼럼 자료는 이 관찰과 일치한다(제15(b)도). 여기서 96시간후 RT03S(서열번호 44)으로부터 회수된 원래의 올리고머의 백분율은 54%(S) 및 59%(L)이었고, RTC06S(서열번호 48)으로부터는 10%(S) 및 34%(L)이었다. 더욱이 이차구조만으로는 증가된 뉴클라제 저항성 및 RT03S(서열번호 44)의 생물활성, 그것의 포스포디에스테르 상대물인 RT03D가 적은 생물활성도를 가지며(표 5), 시험관내 안정성 연구로부터, 24시간의 반감기(자료는 도시되지 않음)를 가지는 것과 같은 것을 설명하는데 충분하지 않다.

[표 5]

표 5에 대한 자료를 준비하는 데에서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 시험관내 활성을 항 CD3/PMA-활성화된 말초 인간 T-세포에서의 CD28 발현을 저해하는 그들의 능력 및 저캣 T-세포에서의 활성화된 IL-2 생성에 대한 그들의 효과에 의해 측정하였다. 결과를 7 실험에서의 저해의 범위가 CD28 발현의 52 내지 79% 및 IL-2 생성의 76 내지 89%인 5μM RT03S(서열번호 44)(100%)의 활성도에 비교하여 표현하였다. RT03D(서열번호 49)의 포스포디에스테르 형태에 대한 값은 괄호안에 있다.

[시험관내 생물학적 활성도를 주는 최소 서열의 검증]

활성 포스포로티오에이트인 RT03S(서열번호 44)는 원래 인간 CD28 유전자의 5′비번역부분과 혼성화하기 위해 설계된 18mer이며, 연속적 4G의 두 세트를 포함하는 서열을 가진다. 인간 T-세포에서 활성화-유도된 CD28 발현 및 저캣 T-세포에서의 CD28 의존적 IL-2 생성의 저해를 위해 필수적인 서열 관련 인자를 검증하기 위해, 염기를 선택적으로 RT03S(서열번호 44)으로부터 추가, 제거 또는 치환하고 활성도를 모 올리고머(표 5)에 비교하여 판정하였다. 5′ 말단(RT04S)에서 3G의 첨가 또는 두개의 4G 서열(RT05S(서열번호 51), RT09S(서열번호 52)) 사이의 영역에서의 T에서 A로의 하나 또는 그 이상의 변화는 RT03S(서열번호 44)에 관한 저해효과를 감소시키지 않았다. 흥미롭게도, 센스 서열(RT11S(서열번호 50)도 또한 RT03S(서열번호 44)에 비교하여 활성의 변화를 보이지 않았다. 그러나, 반대로 4G(RT10S(서열번호 53), RT24S(서열번호 54), RT25S(서열번호 55), RT23S(서열번호 56)(서열번호 56))의 두 세트내에서 하나 이상의 G의 시토신(C)에 의한 결실 또는 치환은 RT03S(서열번호 44)에 비교하여 현저한 활성손실을 초래하였다. RT03S(서열번호 44)에서 첫번째 4G의 5′의 여섯 잔기 결실은 올리고뉴클레오티드(RT18S(서열번호 57))의 저해 활성도에 대해서는 효과가 없었다. 반대로, 두개의 4G 서열간의 많은 수의 잔기를 감소시키거나(RT19S(서열번호 58)) 또는 증가시키는 것(RT20S(서열번호 61), RT21S(서열번호 62)) RT03S(서열번호 44)에 비교하여 저해 활성을 극적으로 감소시켰다. TGGGG, GGGG 또는 RT15S(서열번호 63)과 같은 4연속의 G를 포함하는 서열은 RT03S(서열번호 44)에 비교하여 저해활성이 적거나 없었다. 이들 자료는 RT03S(서열번호 44)의 생물학적 활성은 3 내지 5 잔기에 의해 분리된 4연속적 G의 2세트로 구성된 특이적 서열 모티프에 의존함을 증명한다.

CD28 기능을 방해하는 것에 의해 주어지는 관용원성(tolerogenicity)의 관점에서(Boussiotis, V.A., Freeman, G.J., Gray, G., Gribben, J., Nadler, L.M.(1993) J. Exp. Med. 178, 1753-1763), CD28 발현의 올리고-중개된 저해가 시험관내에서 T-세포 아네르기 및 동종항원 특이적 관용을 유도하기 위한 더 유효한 전략을 제공할 수 있는가를 시험하는 것이 중요하였다. 우리는 포스포로티오에이트 올리고머인 RT03S(서열번호 44) 및 RT04는 올리고머 투여량에 관련된 mRNA 및 성숙 단백질 수준 둘다를 감소시키는 것에 의해 인간 CD4⁺T-세포내에서의 항 CD3/PMA 유도의 CD28 발현을 저해한다는 것을 보였다. 더욱이 표적 특이성을 증명하기 위해, 우리는 CD28 경로에서 독립적으로 조절되는 것으로 알려진 두 보조 분자, IL-2 수용체 및 ICAM-1 발현에 대한 올리고-중개의 효과를 시험하였다(Damle, N.K., et al., (1992) J. Immunol. 148, 1985-1992; June, C.H. et al., (1987) Mol. Cell Biol. 7, 4472-4481; Stein, C.A., et al., Y-C.(1993) Science 261, 1004-1012; Boussiotis, V.A., et al., (1993) J. Exp. Med. 178, 1753-1763). 부합하여, CD25의 활성화된 신호 및 단백질 수준 및 CD54의 표면 발현 둘다는 올리고머 작용에 내성이 있었다.

CD28 경로를 통한 동시자극은 활성화된 T-세포에서의 IL-2, IFNγ 및 IL-8과 같은 면역조절 시토킨의 발현을 직접적으로 유도한다(Fraser, J.D., et al., (1991) Science 251, 313-316 Jenkins, M.K., et al., (1991) J. Immunol. 147, 2461-2466; Seder, R.A., et al., (1994) J. Exp. Med. 179, 299-304; Wechsler, A.S., et al., (1994) J. Immunol. 153, 2515-2523). 관용원성을 성공적이도록 하기 위해, 활성 CD28 특이적 올리고머가 이 기능을 파기해야 한다. 활성 올리고머의 투여는 활성화-유도된 IL-2, IFNγ 및 IL-8 생성의 동반하는 조절을 초래한다. CD28 의존적 기능을 저해하기 위한 활성 올리고머의 예민한 특이성을 강조하기 위하여, 우리는 그들이 CD28-결핍 세포주인 HUT 78에서의 활성화-유도된 IL-2 생성을 방지할 수 없음을 보였다. 더욱이 활성화된 T-세포에서 IL-8 생성의 최대 올리고-중개된 저해는, CD28 의존적 IL-8 생성을 유도하는 대체 조절 경로가 유지됨을 암시하는 50%를 초과하지 않았다. 활성화-유도된 CD28 수준의 저해가 MLR 및 파상풍 변성독소 특이적 T-세포 분석 둘다에서 극적으로 감소된 T-세포 증식을 초래한 것과 같이, 올리고머 활성도는 다클론성 활성화된 T-세포에 제한되지 않았다. 따라서 우리의 활성 올리고머는 시험관내에서 동종항원 특이적 관용성을 중개하였고, 또한 CTLA 4 Ig, 고 친화성 B7 바인더로 보인 것과 같이 T-세포 저반응성(hyporesponsiveness)을 유도하기 위한 리간드 포획 전략의 가능한 대안을 제공한다(Tan, P., Anasetti, C., Hansen, J.A., Melrose, J., Brunvand, M., Bradshaw, J., Ledbetter, J.A., Linsley, P.S.(1993) J. Exp. Med. 177, 165-173).

활성 파마코포어(pharmacophore) 효과의 지속을 측정하는데 있어서, 우리는 놀갑게도 RT03S(서열번호 44)가 활성화된 CD28 발현 및 CD28 의존적 T-세포 증식 둘다의 저해를 올리고머 처리후 심지어 96시간동안 강하게 유지하는 것을 관찰하였다. 올리고머를 제거했을때, 저해활성의 완전한 역전이 24시간 내에 일어났으므로 생물활성도는 독성에 무관하였다. 더욱이 포스포로티오에이트, RT03S(서열번호 44) 및 RTC06S(서열번호 48)의 비교에 의해, 우리의 시험관내 안정성 연구는 RT03S(서열번호 44)내의 G-풍부한 서열에 의해 중개되는, 이차 구조가 포스포로티오에이트와 전형적으로 관련된 뉴클라제 내성을 2 내지 4배 증가시켰음을 보였다(Stein, C.A., Cheng, Y.C.(1993) Science 261, 1004-1012),³²P-RT03S(서열번호 44)의 연장된 반감기(96시간)는 생물활성의 그 지속과 관련되어 있다. 더욱이 RT03S(서열번호 44)의 포스포디에스테르 상대물인 RT03D는 감소된 시험관내 안정성 및 생물활성도, 이전의 보고(Maltese, J.-Y., Sharma, H.W., Vassilev, L., Narayanan, R, (1995) Nucleic Acids Res. 23, 1146-1151)와 일관된 관찰 둘 다를 나타냈다. 따라서 이차구조에 의해 주어진 안정성은 RT03S(서열번호 44)의 증가된 생물활성도에 대하여 단독적으로 원인이 있는 것은 아니다. 따라서 포스포로티오에이트 변형 및 이차 구조 둘다에 의해 주어진 뉴클라제 안정성은 RT03S(서열번호 44)의 연장된 저해 활성도에 원인일 것이다.

혼성화 의존적인 안티센스 및 항원 모델에서의 단일 염기쌍 치환은 활성도를 실제적으로 없앨수 있다(Maltese, J.-Y., Sharma, H.W., Vassilev, L., Narayanan, R. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 1146-1151). 반대로, 연속된 치환이 올리고머 기능에 대한 정의된 구조적 필요성을 의미하는 4G의 두 세트에서 일어나면, CD28 특이적 올리고머의 활성도는 극적으로 감소되었다. 더욱이, RT03S(서열번호 44)내에 존재하는 이차구조의 양이온성 안정화(100mM KCl 및 NaCl)에 이어서, 올리고머 융해곡선은 G-사중체(quartet) 형성을 암시하는 전위 프로파일을 보였다(Hardin, C.C., Watson, T., Corregan, M., Bailey, C.(1992) Biochemistry 31, 833-841). 종합하면, 우리의 자료는 CD28 특이적 올리고머의 이 종류는 혼성화 독립적 기작을 통해 작용한다는 것과 이 서열의 이차구조는 아마도 G-사중체 형성을 통하여 올리고머 활성의 한계를 정한다는 확신을 제공한다. 유사하게, Bennet, C.F., Chiang, M.Y., Wilson-Lingardo, L., Wyatt, J.R. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 3202-3209는 그들의 포스포로티오에이트 올리고머의 활성이 셋 또는 그 이상의 연속적 G의 두 세트를 함유하는 서열내에서의 가능한 G-사중체의 형성에 기초한다는 것과 이것이 인간 포스포리파제 A₂의 올리고-중개 조절이 특이적 핵산-단백질 상호 작용을 통한다는 것을 암시함을 증명하였다.

G-사중체 구조의 범위에 의한 특이적 단백질 인식이 텔로메어, 센트로메어(Blackburn, E.H.(1990) J. Biol. Chem. 265, 5919-5921), 면역글로블린 스위치 영역(Shimizu, A., Honjo, T. (1984) Cell 36, 801-803) 및 압타머(aptamers)라 불리는 조절 올리고머의 부류(Bock. L.C., Griffin, L.C., Latham, J.A., Vermaas, E.J., Toole, J.J.(1992) Nature 355, 564-566; Huizenga, J.E., Szostak, J.W.(1995) Biochemistry 34, 656-665; Bergan, R., Connell, Y., Fahmy, B., Lyle, E., Neckers, L.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 2150-2154)로 증명되어 왔다. 우리의 연구에서, 텔로메어에서와 같이(Smith, F.W., Feigon, J.(1992) Nature 356, 164-167) sp 연속적 G의 한 세트로부터의 분자간 네 가닥의 G-사중체 구조를 형성할 수 있는 올리고머는 CD28 발현을 약하게 저해하였다. 이것의 예는 G가 풍부한 서열이 c-myc 발현을 저해하는 것으로 다른 사람에 의해 이전에 보여진 RT15SD(서열번호 63)이다(Burgess, T.L., Fisher, E.F., Ross, S.L., Bready, J.V., 뺘무, Y.-X., Bayewitch, L.A., Cohen, A.M., Herrera, C.J., Hu, S.S.-F., Kramer, T.B., Lott, F.D., Martin, F.H. Pierce, G.F., Simonet, L., Farrell, C.L. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4051-4055에서의 서열 14). 또다른 G가 풍부한 구조인 분자간 G-사중체는 트롬빈의 압타머 저해를 중개하는 것으로 보였다(Wang, K.Y., McCurdy, S., Shea, R.G., Swaminanthan, S., Bolton, P.H. (1993) Biochemistry 32, 1989-1904; Macaya, R.F., Schultze, P., Smith, F.W., Whkw, J.A., Feigon, J. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3745-3749). RT03S(서열번호 44)의 연속적 분석은 잔기 3-4, 7-8, 12-13 및 16-17의 짝지워진 G들이 그러한 G-사중체 구조를 잠재적으로 형성할 수 있음을 예건한다. 그러나, 분자내 사중체를 분열시키는, 잔기 1-6(RT18S(서열번호 57의))의 제거는 CD28 발현 및 CD28 의존적 IL-2 생성의 저해를 방지하기에는 유효하지 않았다. 이들 자료는 RT03S(서열번호 44)의 활성이 교대의 G-사중체 구조로부터 일어남을 암시한다.

RT03S(서열번호 44)는 이량체성(dimeric) G-사중체의 형성에 필수적인, 다른 사람들에 의해 예견된 모티프(Smith, F.W., Figon, J.(1993) Biochemistry 32, 8682-8692)에 유사한 12mer 서열을 확실히 가진다. 이량체성 G-사중체는 평행 및 반평행(antiparallel)이 교대하는 두 가닥의 DNA으로부터 생긴다. 여기서, 인접한 가닥은 4G가 4중으로 겹친 G-사중체를 형성하도록 하는 원인이 된다. 연속하는 4G의 두 세트를 분리하는 네 염기와 함께 12잔기로 구성되는 각 가닥상의 모티프는 형성 및 안정성과 관련되었다. 우리는 중심 12mer 서열(RT18S(서열번호 57))이 RT03S(서열번호 44)에 대한 유사한 활성을 가지는 것을 보였다. 또한 4G 영역의 둘 다에서의 G에서 C로의 치환(RT10S(서열번호 53), RT23S(서열번호 56), RT24S(서열번호 54), RT25S(서열번호 55))은 RT03S(서열번호 44)에 비교하여 56 내지 69%의 저해활성의 손실을 초래하였다. 유사하게, 세트를 분리하는 염기의 삽입(RT20S(서열번호 61), RT21S(서열번호 62)) 또는 결실(RT19S(서열번호 58)은 상대적 생물활성도를 52 내지 70%로 감소시켰다. 종합하면, 이들 자료는 이량체성 G-사중체를 형성하는 능력이 있는, 특이적 서열 모티프는 기능적 CD28 발현의 포스포로티오에이트 올리고-중개 저해에 중요함을 암시한다.

이량체성 G-사중체의 이 형태가 그것의 생물학적 효과에 영향을 미치는 것에 의한 기작은 알려져 있지 않다. 그러나, 증거의 몇몇은 이들 모티프가 우리의 활성 올리고머가 아마도 특이적 전사 인자와의 아량체성 G-사중체 프로모터 서열의 상호 작용을 경쟁적으로 방해하는 것에 의해, 미끼로 기능할 수 있도록 한다는 가정을 입증한다. 1) CD28 유전자의 상류 영역에 상당하는 올리고머(RT11S(서열번호 50)는 RT03S(서열번호 44)에 동등한 생물학적 활성도를 보였다. 2) 우리의 활성 올리고머는 비-안티센스 기작을 통해 기능한다. 3) 이들 올리고머는 CD28 mRNA 발현을 조절하였다; 따라서 그들의 생활성도는 직접 표적 단백질 상호작용과 관련되지 않았다. 4) G가 풍부한 프로모터 영역은 널리 퍼져 있으며(Evans, T., Schon, E., Grazyna, G.M., Patterson, J., Efstratiadis, A. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8043-805; Kilpatrick, M.W., Torri, A., Kang, D.S., Engler, J.A., Wells, R.D. (1986) J. Biol. Chem. 261, 11350-11354; Clark, S.P., Lewis, C.D., Felsenfeld, G., (1990) Nucleic Acids Res. 18, 5119-5126), G-사중체 형성 프로모터 서열이 일반적 조절 현상이라는 가능성을 증가시킨다. 5) 이중 가닥 올리고머는 전사 인자인 E2F에 대한 미끼로 작동할 수 있다(Mofishita, R., Gibbons, G.H., Horuchi, M., Ellison, K.E., Nakajima, M., Zhang, L., Kaneda, Y., Ogihara, T., Dzau, V.J. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5855-5859). 6) G가 풍부한 올리고머는 Sp1 전사 인자의 유도를 중개하는 것으로 보여져왔다(Perez, J.R., Li, Y., Stein, c.A., Majumder, S., van Oorschot, A., Narayana, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5957-5961).

[참고문헌의 포함]

인용된 모든 특허, 특허 명세서 및 출판물은 여기서 참고문헌으로 포함된다.

[대응물]

상기한 명세서는 본 분야의 당업자가 발명을 실행할 수 있기에 충분한 것으로 고려한다. 또한 유기화학 분야 또는 관련 분야에서의 숙련자에게 명백한 발명을 실행하기 위한 상기의 형태의 다양한 변형은 하기한 청구의 범위의 관점내에 있는 것을 의미한다.

Claims

22 미만의 염기를 갖고, 서열 5′TTGTCCTGACGATGGGCTA3′(SEQ ID NO:1)을 포함하며, T-세포에서 CD28 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 올리고머.
22 미만의 염기를 갖고, 서열 5′AGCAGCCTGAGCATCTTTGT3′(SEQ ID NO:2)을 포함하며, T-세포에서 CD28 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 올리고머.
22 미만의 염기를 갖고, 서열 5′TTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQ ID NO:3)을 포함하며, T-세포에서 CD28 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 올리고머.
22 미만의 염기를 갖고, 서열 5′GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQ ID NO:4)을 포함하며, T-세포에서 CD28 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 올리고머.
재조합 발현 벡터로, 상기 벡터는 프로모터 및 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 올리고머를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 작동할 수 있는 조합으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
올리고머가 18 내지 50 염기의 길이이며 서열 5′TTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQ ID NO:3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포에서 CD28 유전자 발현을 감소시키는 조성물.
올리고머가 18 내지 50 염기의 길이이며 서열 5′GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGG3(SEQ ID NO:4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포에서 CD28 유전자 발현을 감소시키는 조성물.
제6항 또는 제7항에 따른 올리고머들 중에서 두가지 이상의 올리고머를 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포에서 CD28 유전자 발현을 감소시키는 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 조성물.