KR100254810B1 - 노보바이오신을 첨가한 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질의 제조시 세포주기 억제제로 노보바이오신이 첨가된 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈청이 포함된 배지를 사용하여 동물세포를 충분히 성장시킨 다음 세포분열 전단계에서 세포를 억제하여 세포의 증식은 저해하고 단백질의 발현을 유도하는 물질인 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 줌으로써 단위세포당 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법으로 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포를 배양하면 재조합 단백질의 생산량을 최소 4배 이상 증가시킬 수 있다.

Description

노보바이오신을 첨가한 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 배양방법

본 발명은 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질의 제조시 세포주기 억제제인 노보바이오신이 첨가된 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 혈청이 포함된 배지를 사용하여 동물세포를 충분히 성장시킨 다음 세포분열 전단계에서 세포를 억제하여 세포의 증식은 저해하고 단백질의 발현을 유도하는 물질인 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 줌으로써 단위세포당 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법으로 동물 세포를 배양하면 재조합 단백질의 생산량을 최소 4배 이상 증가시킬 수 있다.

지금까지 동물 세포를 배양하여 단백질 생산량을 높이기 위하여 많은 방법들이 사용되어 왔고 이는 크게 두 단계로 나누어지는데 첫 번째로 유전자 조작을 통하여 세포의 단백질 발현량을 증대시키는 세포 내적인 단계(Biotechniques 14, 972, 1993)와 두 번째로 배지 및 운전 조건 등의 최적화를 통하여 고농도로 세포를 배양하는 세포 외적인 단계(Biotech. Bioeng. 39, 327, 1992; Biotech. Bioeng. 42, 1077, 1993)를 들 수 있다.

세포의 농도를 증가시켜 단백질 생산량을 높이는 방법은 부착성 세포배양 방법과 현탁 세포배양 방법에 따라 그 접근방식이 상이하여 고체 표면에 부착해서 증식하는 부착성 세포배양의 경우는 표면적에 따라 세포의 증식이 영향을 받으므로 표면적이 넓은 배양기의 개발이 주된 목표였다. 그러나 부착성 세포 배양의 경우 무한정 표면적을 넓히기 어렵기 때문에 대량 배양공정 및 생산공정에 적용하기 어려운 문제점이 있어 부유 적응된 세포를 이용하는 현탁 배양이 실제 공정에서 단백질을 대량 생산할 수 있는 공정으로 대두되었다. 현탁 배양의 경우는 세포를 고농도로 유지하면서 연속 배양이 가능한 기술적 장치들을 개발하는 방향으로 연구가 진행되어 왔으나 현탁 배양되는 세포는 부착성 세포보다 외부환경에 훨씬 더 민감하므로 그 만큼 고농도로 세포를 배양하기가 더 어렵다.

상기와 같이 세포의 농도를 증가시켜 단백질 생산량을 높이는데 주 목적이 있는 방법들은 세포의 농도를 증가시키는 것에는 한계가 있기 때문에 단백질의 발현량을 증가시켜 단백질의 생산량을 높이는 방법이 효율적일 수 있다.

수많은 연구자들에 의하여 현재까지 동물세포 배양시 재조합 단백질의 생산을 증가시키는데에 가장 많이 사용된 것은 소듐뷰틸레이트(Sodium butyrate)이다. 실제로 소듐뷰틸레이트를 세포 배양 배지에 첨가하였을 때 그 세포에 의해 생산되는 단백질의 양이 증가한 결과가 보고된 바 있다(J.Biotechnology, 19, 35, 1991).

소듐뷰틸레이트는 세포 주기에 관여하는 물질로 알려져 있는데 이 물질을 배양배지에 첨가하면 세포가 분할되기 전단계(단백질 생산 단계)에 세포를 머무르게 해서 더 많은 수의 세포가 증식을 멈추고 단백질을 생산할 수 있도록 한다는 것이다.

노보바이오신은 토포아이소머라제 Ⅱ(topoisomerase Ⅱ)의 저해제로 알려져 있다. 토포아이소머라제는 DNA 의 복제시 이중 나선 구조를 풀었다가 다시 결합해주는데 관여하는 효소이며 따라서 노보바이오신 등이 토포아이소머라제의 활성을 저해하면 상기 역할을 수행하지 못하게 되고 결과적으로 세포의 분열이 일어나지 않게 된다.

따라서 노보바이오신도 세포내에서 일종의 세포증식 억제제로 작용하는 것이며 이런 특성으로 인하여 노보바이오신은 암세포의 증식을 억제하는 물질로 연구 대상이 되어왔다(Cancer Research 49, 4752, 1989 ; Cancer Research 50, 2577, 1990 ; Cancer Research 52, 3515, 1992). 또한 노보바이오신은 상기의 소듐부틸레이트와 같이 일종의 세포주기 억제제이다. 즉 노보바이오신은 G2-M-G1-S-G2 의 세포 주기에서 세포 분열 전단계인 G2 기 또는 그 앞에서 세포를 억제한다고 알려져 있다. 따라서 세포 배양에서 노보바이오신을 사용하게 되면 세포의 증식을 억제하는 대신 다른 신진대사를 활발하게 함으로써 단백질의 생산성을 높일 수 있는 가능성이 있다.

이에 본 발명자들은 동물세포를 이용한 기존의 재조합 단백질의 대량 배양에 있어서 어느 정도 배양일이 경과되고 세포가 표면에 포화되면 더 이상 성장을 할 수 없게 되는데 이때 노보바이오신을 첨가하면 증식은 억제되지만 단백질 생산은 오히려 증가될 것이라는 점에 착안하여, 에리스로포에틴을 생산하는 중국 햄스터 난소 상피세포를 혈청이 포함된 배지를 사용하여 충분히 성장시킨 다음 세포의 주기를 억제하는 물질인 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 단위세포당 에리스로포이에틴의 생산량이 노보바이오신을 첨가하지 않았을 때에 대비하여 3배 이상 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질 제조시 세포주기 억제제인 노보바이오신을 첨가한 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1 은 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 유래 세포를 다양한 조성의 무혈청 배지에 배양하여 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO)이 생산되는 양을 배양시간에 따라 나타낸 것이고,

● : 기본 배지 CHO-s SFM Ⅱ ;

■ : 0.05mM 노보바이오신 첨가 배지;

▲ : 0.1mM 노보바이오신 첨가 배지;

▼ : 1.0mM 소듐뷰틸레이트 첨가 배지;

도 2 는 EPO를 생산하는 CHO 세포를 다양한 조성의 무혈청 배지를 사용하여 매일 신선한 배지로 갈아주며 배양하였을 때 생산되는 EPO 의 양을 배양시간에 따라 나타낸 것이고,

도 3 은 EPO를 생산하는 CHO 세포를 다양한 조성의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 매일 신선한 배지로 갈아주며 배양하였을 때 생산되는 EPO 의 양을 배양시간에 따라 나타낸 것이다.

● : 기본 배지 IMDM + 10% FBS ;

■ : 0.05mM 노보바이오신 첨가 ;

▲ : 0.1mM 노보바이오신 첨가 ;

▼ : 1.0mM 소듐뷰틸레이트 첨가 ;

상기 목적을 달성하기 위하여, 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질의 생산시 혈청이 포함된 배지를 사용하여 동물세포를 충분히 성장시킨 다음 세포분열 전단계에서 세포를 억제하여 세포의 증식은 저해하고 단백질의 발현을 유도하는 물질인 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 줌으로써 단위세포당 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 세포 배양을 통한 재조합 단백질 제조시 세포주기 억제제인 노보바이오신을 첨가한 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 혈청이 포함된 배지를 사용하여 동물세포를 충분히 성장시킨 다음 세포분열 전단계에서 세포를 억제하여 세포의 증식은 저해하고 단백질의 발현을 유도하는 물질인 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 줌으로써 단위세포당 재조합 단백질의 생산량을 증가시킨다.

이 때 노보바이오신을 첨가한 배지는 무혈청 배지와 혈청이 포함된 배지를 모두 사용할 수 있다.

구체적으로, 재조합 에리트로포이에틴(recombinant Erythropoietin, 이하 “EPO”로 약칭함)을 생산하는 유전자 재조합 CHO 세포주(수탁번호 KCTC 0220BP)를 혈청이 포함된 배지에서 충분히 성장시킨 다음 세포분열 전단계에서 세포를 억제하여 세포의 증식은 저해하고 단백질의 발현을 유도하는 물질인 노보바이오신이 첨가된 배지로 교환하여 배양함으로써 EPO 의 생산량을 증가시킨다.

본 발명에서는 노보바이오신이 첨가된 배지로는 CHO-s SFM Ⅱ 무혈청 배지를 사용하고 10% 우태아 혈청을 함유한 IMDM 배지를 사용하여 각각 EPO 를 생산한다. 무혈청 배지로 집코(GIBCO)사의 CHO-s SFM Ⅱ 뿐아니라 이미 상업적으로 공지된 무혈청 배지는 어느 것이라도 사용될 수 있으며 혈청을 함유한 배지도 10% 우태아 혈청을 함유한 IMDM 배지에 한정되는 것은 아니다.

이 때 첨가하는 노보바이오신의 양은 0.05mM 내지 1.0mM 농도범위내인 것이 바람직하고 0.1mM 내지 1.0mM 인 것은 더욱 바람직하다.

본 발명의 방법에 사용되는 동물세포로는 CHO 세포를 포함하여 외래단백질 생산을 위하여 유전자 조작된 동물세포이면 어느 것이든지 가능하며, 재조합 단백질도 EPO 에만 국한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서는 노보바이오신이 첨가된 배지를 1-2 일 간격으로 교환하여 주면서 세포를 배양한다.

본 발명은 동물 세포를 부착 배양하거나 현탁 배양하는 경우 모두 적용 가능한 방법이다.

본 발명에서는 세포분열 전단계에서 세포를 억제하여 세포의 증식은 저해하고 단백질의 발현을 유도하는 물질인 노보바이오신의 첨가가 EPO 의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 혈청이 포함된 배지를 사용하여 CHO 세포를 충분히 성장시킨 다음 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 얻은 배지내의 EPO 의 단위부피당 생산량을 효소 면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 조사하였다.

그 결과 노보바이오신이 첨가되지 아니한 배지를 사용한 경우와 비교하여 EPO 생산량이 4배이상 증가하고, 10% 우태아 혈청을 함유한 IMDM 배지에 노보바이오신을 첨가한 경우가 무혈청 배지인 CHO-s SFM Ⅱ에 노보바이오신을 첨가하였을 때보다 EPO의 생산량이 약 1.5배 증가함을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것으로 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 노보바이오신을 첨가한 무혈청 배지를 사용하였을 때 재조합 단백질의 생산량 조사

세포 배양 배지에 노보바이오신을 첨가하였을 때 재조합 단백질의 생산량의 변화를 알아보기 위하여, 혈청이 포함된 배지에서 동물세포의 배양을 시작하였다. 먼저 액체 질소에 냉동 보관되어 있던 EPO 를 생산하도록 형질전환된 CHO 세포(수탁번호:KCTC 0220 BP)를 꺼내어 재활시킨 다음 IMDM (GIBCO사)에 10%의 우(牛) 태아혈청(FBS, GIBCO사)이 포함된 배지가 15ml 담겨있는 페트리 디쉬(직경 10cm)에 접종하였다.

4일 후 세포가 배양기 표면에 가득차게 붙으면 세포를 떼어내서 상기 배지 15ml을 함유한 T-80 플라스크에 넣고 세포농도가 2×10⁴/cm²이 되도록 접종하였다.

3일 후 세포가 플라스크 표면에 가득 차면 혈청이 함유된 배지를 빼내고 하기 표 1의 조성을 가진 배지로 교환하였다.

배지조성

	1	2	3	4
기본 배지	CHO-s-SFMⅡ
노보바이오신	-	0.05mM	0.1mM	-
소듐뷰틸레이트	-	-	-	1.0mM

모든 배양은 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 항습 배양기에서 수행되었으며, 매일 2번씩 배지를 채취하여 분당 12000 회전하는 윈심분리기로 상등액을 분리한 다음 생성된 EPO의 양을 효소면역측정법으로 측정하였다.

그 결과 노보바이오신을 0.05mM 첨가한 배지에서는 생성된 EPO 의 양이 3일째까지는 뚜렷한 증가를 보이지 않다가 그 이후에 급격히 증가하였으며 노보바이오신을 0.1mM 을 첨가한 배지를 사용한 경우에는 배양 2일째가 넘어서면서 노보바이오신을 첨가하지 않은 기본배지에 비해 약 3배 이상 증가하였다. 한편 기존에 동물세포 배양에서 단백질 생산량을 증가시킨다고 알려진 소듐뷰틸레이트를 1mM 첨가한 배지에선 EPO의 생산량 증가가 거의 없었다(도 1 참조).

〈실시예 2〉 노보바이오신을 첨가한 무혈청 배지를 매일 교환하여 사용하였을 때 재조합 단백질의 생산량 조사

노보바이오신을 첨가한 무혈청 배지를 사용하였을 때 배지를 매일 교환하여 주는데 따른 재조합 단백질의 생산량 변화를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 세포를 배양하되 상기 표 1의 조성을 가진 배지로 교환후 매일 신선한 새 배지로 교환해 주면서 배양하는 점에만 차이를 두었다.

그 결과 배지 교환 후 1일째에는 EPO의 생산량이 소듐뷰틸레이트를 1mM 첨가한 배지에서 기본 배지를 사용한 경우에 비해 2-3배 증가하였고 노보바이오신을 0.1mM을 첨가한 배지를 사용한 경우에도 동일한 결과를 보였다.

3-4일째에 이르러서는 소듐뷰틸레이트의 첨가에 의한 생산량 증대 효과보다 노보바이오신을 첨가한 효과가 더 강하게 나타났으며 기본 배지를 사용한 경우에 비해서는 4배 가량 증가하였다(도 2 참조).

〈실시예 3〉 노보바이오신을 첨가한 혈청 배지를 매일 교환하여 사용하였을 때 재조합 단백질의 생산량 조사

노보바이오신을 첨가한 혈청 배지를 사용하였을 때 배지를 매일 교환하여 주는데 따른 재조합 단백질의 생산량 변화를 확인하기 위하여, 10%의 우(牛) 태아혈청(FBS, GIBCO사)이 포함된 IMDM (GIBCO사) 배지를 기본 배지로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.

그 결과 전반적으로 무혈청 배지를 기본 배지로 사용한 경우에 비해 EPO 의 생산량이 약 1.5배 높은 수치를 보였으며 상기 실시예 2와 거의 비슷한 양상을 보였다. 즉 배지 교환 후 1일째에는 EPO의 생산량이 소듐뷰틸레이트를 1mM 첨가한 배지에서 기본 배지를 사용한 경우에 비해 2-3배 증가하였고 노보바이오신을 0.1mM을 첨가한 배지를 사용한 경우에도 EPO의 생산량이 크게 증가하였다(도 3 참조).

이상에서 살펴본 바와 같이, 혈청이 포함된 배지를 사용하여 동물세포를 충분히 성장시킨 다음 세포분열 전단계에서 세포를 억제하여 세포의 증식은 저해하고 단백질의 발현을 유도하는 물질인 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 배양하면 재조합 단백질의 생산량을 최소 4배 이상 증가시킬 수 있어 재조합 단백질의 대량 생산이 가능하며, 기존에 동물세포 배양에서 단백질 생산량을 증가시킨다고 알려진 소듐뷰틸레이트의 첨가에 의한 생산량 증대 효과보다 더 큰 효과를 달성할 수 있다.

Claims (7)

1. 혈청이 포함된 배지를 사용하여 동물 세포를 충분히 성장시킨 다음 노보바이오신을 첨가한 배지로 교환하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 동물세포는 중국 햄스터 난소 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 생산량 증가방법.
3. 제1항에 있어서, 재조합 단백질은 에리스로포이에틴인 것을 특징으로 하는 생산량 증가방법.
4. 제1항에 있어서, 노보바이오신을 첨가한 배지는 무혈청 배지인 것을 특징으로 하는 생산량 증가방법.
5. 제1항에 있어서, 노보바이오신을 첨가한 배지는 5-10% 우 태아 혈청을 함유한 배지인 것을 특징으로 하는 생산량 증가방법.
6. 제1항에 있어서, 노보바이오신을 0.05-1.0mM 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 생산량 증가방법.
7. 제1항에 있어서, 노보바이오신을 첨가한 배지를 1-2 일 간격으로 교환하는 것을 특징으로 하는 생산량 증가방법.

Images