KR100249683B1 - 핵산서열조작 - Google Patents

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Abstract

핵산서열 조작방법은 (a)타겟핵산의 특정서열과 상보적이며 이 타겟핵산 보다 짧은 단일 쇄 올리고뉴클레오타이드를 결합하고 있는 고형지지 시스템을 제공하고, (b)단일쇄 타켓핵산 재료원을 고정 지지시스템에 첨가하고 (c)타겟핵산을 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드시키고, (d)하이브리드화된 핵산조작을 포함한다. 조작은 예를들어 타겟핵산서열의 복사 또는 증폭일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 지지체는 지지체의 세척을 용이하게하여 불순물을 제거하고 조작이 실행되는 타겟핵산상에 “깨끗한” 샘플을 남기는 유체관통용기에 제공되어 진다. 지지체는 바람직하게는 올리고뉴클레타이드가 결합된 실옥산 매트릭스를 가진다. 이것은 올리고뉴클레오타디으와 지지체 사이의 안정한 결합을 제공한다. 이방법은 특히 의학적 샘플분석에 유용하다.

Description

핵산서열조작
본 발명은 고형 지지체 시스템을 사용하여 핵산서열에 대한 조작을 실행하는 방법과 장치는 물론 이러한 방법과 장치에 사용되는 지지체에 관한 것이다.
핵산서열을 조작하기 위한 여러방법이 알려져 있다. 예를들어, 유럽특허 A 0 200 362호(Cetus)에는 핵산서열을 증폭, 검출 및/또는 클로닝하기 위한 액상법이 설명되어 이다. 이 방법은, (i) 2가닥의 독립적인 핵산서열의 상보쇄를 이 상보쇄와 각각 하이브리화하는 2개의 올리고뉴클레오타이드프라이머로 처리하고; (ii) 상기 프라이머를 연장시켜 이중쇄 핵산서열을 형성하고; (iii) (ii)단계의 생성물을 변성시켜 핵산단일쇄를 생성하고; 및 (iv) (iii)단계로부터 결과된 단일쇄를 사용하여 상기 (i)내지 (iii)단계를 반복함으로써 전체과정을 필요한 만큼 재현하는 단계를 포함한다.
이러한 선행기술의 특징은 상보쇄 둘다를 제2 및 그 다음 증폭단계를 위한 주형으로서 사용한다는 것이다. 또한, 유럽특허 A 0 200 362호의 방법에 있어서, 반응혼합물은 하이브리드화되지 않은 타겟핵산, 하이브리드화되지 않은 타겟복사물 및 하이브리드화되지 않은 프라이머를 포함하고 있어서 그 반응시스템을 매우 비효율적으로 만든다. 더욱이, 임의의 단계에서는 복사시 일어나는 오류는 “사슬반응”으로 복사되는 오류를 나타나게 된다.
고상 지지시스템을 사용하는 증폭기술 또한 주지되어 있다. 예를들어 DYAL(상품명)자성(magnetil)비드가 유럽특허 A 0 091 453호 및 A 0 106 873호에 개시되어 있다. 이러한 비드의 사용방법에 있어서, DNA를 지성비드상에서 합성시키고 수산화암모늄을 첨가하여 자성비드로 부터 DNA를 분리시킨다. 자석을 이용하여 합성된 DNA로부터 비드를 분리할 수도 있다. 선택적으로, 비오틴을 합성 또는 지연 DNA서열의 한 말단에 첨가하고 스트렙타비딘과 예비공역된 자성비드를 사용하여 상기 서열을 회수한다(이로써 비오틴을 끌어당겨 DNA를 회수). 이러한 형태의 고형지지체나 관련된 문제점을 비오틴스트렙타비딘 결합시 생분해된다는 것이다.
다른 고체 지지시스템으로서 다공성 실리카가 있다. 이 시스템에 있어서, 기공내에서 뉴클레이오타드 사슬이 성장하여 세척시 기공내에 잔류하여 비효율적이며 수율을 감소시키고 상대적으로 비효율적인 커플링을 가져온다는 문제점이 있다.
유럽특허 A 0 184 056호에는 고형기질을 사용하여 DNA탐침자를 대량으로 생산한 벙법이 기술되어 있다. 상기 특허의 명세서상에 기술된 방법은 생성될 탐침자에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 고형기질에 공유결합적으로 연결한 다음 이 폴리뉴클레오타이드를 프라이머로서 작용하는 올리고 뉴클레오타이드와 하이브리드화시키는 것을 포함한다. 그 다음; 상기 올리고 뉴클레오타이드를 상기 기질로 부터 멀어지는 방향으로 연장시킴으로써(상기 폴리뉴클레오타이드를 주형으로서 사용하여) 상기 연결되어 있는 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 연장된 서열을 생성한다. 이와같은 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드와 연장된 올리고뉴클레오타이드를 변성시켜 연장된 올리고뉴클레오타이드를 수집하기 위해 고형기질로부터 방출시킨다. 상기 연장된 올리고뉴클레오타이드를 분석용 탐침자로서 사용할 수 있다. 따라서, 예를들어 상기 지지체에 원래 결합될 폴리뉴클레오타이드는 유전자이고 상기 연장된 올리고뉴클레오타이드는 생물학적 샘플에서 상기 유전자의 존재유무를 검출하고 탐침자로서 사용할 수 있다. 그러나, 유럽특허 A 0 184 056에 기술된 방법과 관련하여 많은 문제점이 나타난다. 특히, 지지체에 결합된 폴리뉴클레오타이드가 “순수”하지 않고 다른 폴리뉴클레오타이드를 포함한다면 그러한 다른 폴리뉴클레오타이드 또한 상기 지지체에 결합될 것이고 따라서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 그러한 다른 폴리뉴클레오타이드와 또한 하이브리드화하여 궁극적으로 수득된 연장된 폴리뉴클레오타이드는 사실상 생성물들의 혼합물이 될 수 있다. 그러므로, 상기 방법은 핵산의 “순수”샘플을 생성하는데 특별히 좋은 것이 되지 못한다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 문제점을 제거 또는 완화시키는 것이다.
본 발명의 첫째 관점에 따라, (a)타겟핵산의 특정서열과 상보적이며, 이 타겟핵산 보다 짧은 단일쇄 올리고뉴클레오타이드를 결합하고 있는 고형 지지시스템을 제공하고, (b)단일쇄 타겟핵산재료원을 상기 고형 지지시스템에 첨가하고, (c)상기 타겟핵산을 상기 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화시키고 및 (d)상기 하이브리드화된 타겟핵산 조절을 실행하는 것을 포함하는 핵산서열 조작방법을 제공한다.
상술한 방법으로, 상기 타겟핵산을 지지체상의 올리고뉴클레오타이드와 선택적으로 하이브리드화된다. 상기 시스템에 존재하는 (예를들어, 타겟핵산을 포함하는 샘플에 유입되는 것같이)불순물은 세척으로 제거되어 조작이 실행되는 “깨끗한”타겟핵산 샘플을 남긴다. 세척은 타겟핵산이 상기 올리고뉴클레오타이드와 융해 분리되지 않는 온도에서 수행된다.
상기 타겟핵산은 정제된 또는 비정제된, 자연적인 또는 합성핵산일 수 있다. 상기 타겟핵산은 바이러스, 박테리아, 동물 또는 식물로 부터 유래된 DNA 또는 RNA일 수 있다.
상기 지지체에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 최소한 8개뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오타이드는 통상 1000내지 2000염기를 포함하고 상기 올리고뉴클레오타이드 보다 상당히 된다.
올리고뉴클레오타이드는 지지체와 올리고뉴클레오타이드상에서 제공되는 적합한 반응기들간의 반응에 의해서 지지체와 결합한다. 또는 상기 올리고뉴클레오타이드는 지지체상 원장소에서 합성될 수도 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 보호기들은 상기 하이브리드화 단계(c)전에 제거된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단일쇄 타겟핵산은 상기 지지체에 결합된 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화된다. 상기 올리고뉴클레오타이드서열은 하이브리드화될 타겟에 매우 특이하게 될 것이다. 그 결과, 상기 하이브리드화하는 상기 올리고뉴클레오타이드와 타겟 사이의 하이브리드화에 매우 적합한 온도에서 실행된다. 상기 지지체상의 올리고뉴클레오타이드에 대한 상기 타겟핵산이 하이브리드화는 상기 타겟핵산이 상기 올리고뉴클레오타이드와 “용해분리”되는 온도(Tm)보다 바로 아래(예를들어 1 내지 3℃아래)의 온도에서 실행하는 것이 이상적이다. 일반적인 법칙으로서 Tm은 본 기술분야에 알려진 하기 유도식으로부터 계산될 수 있다: Tm=2(A+T)+3(G+C) 상기 식에서, A, T, G 는 C는 각각 지지체상에 결합된 올리고뉴클레오타이드에 있는 아덴닌, 티민, 구안닌 및 시토신의 수를 나타낸다. 상기 식은 보통 약 30개 뉴클레오타이드까지의 서열에 적용될 수 있다. 상기 하이브리드화 단계후에, 상기 지지체를 Tm 보다 약간 낮은 온도에서 세척하여 타겟 및 불순물(예를들어 단백질 또는 불필요한 핵산서열)을 제거한다. 따라서, 상기 고형지지 시스템에 폴리뉴클레오타이드의 혼합물(생물적 샘플에 존재할 수 있는 것과 같은)을 첨가하는 것이 가능하지만 관심대상의 특이한 폴리뉴클레오타이드만이 지지체상에 남게 된다. 따라서, 세척후에, “순수”샘플에 대한 폴리뉴클레오타이드의 조직이 실행될 수 있다.
연속적인 조작이 상기 하이브리드화된 타겟핵산상에서 실행될 수 있다. 택일적으로, 하나의 개시조작을 실행하여 지지체상에 결합된 타켓의 복사본을 생성할 수 있다. 다음, 이 복사본을 후속 조작실행에 사용하는 것이다.
각 조작사이에 불순물을 제거할 만큼 지지체를 세척한 다음 생성물을 원하는 만큼 수집할 수 있다. 지지체를 더 세척(필요하다면)한 후, 조작을 반복할 수도 있다.
조작은 예를들어 복사, 타겟핵산서열의 증폭, 시험관내 전사 또는 DNA결합 단백질의 정제를 포함할 수 있다. 상기 조작은 타겟에 대한 표식된 프라이머의 하이브리드화 시험을 통해서 타겟의 존재유무를 검출하는 것일 수도 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열상에서의 조작은 당해 기술분야에 주지된 방법절차를 사용하여 실행할 수 있다. 예를들어 DNA폴리머라제 I, 이의 클렌노우(Klenow)단편물, 열안정성 폴리머라제 또는 역전사효소를 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 및/또는 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트와 함께 조작과정(하기 설명되는)에 적절히 사용될 수 있다. 상기 뉴클레오타이드는 바람직하게는35S,32P, 발색단(크로모포어), 비오틴, 페록시아제, 포스파타제 또는 다른 생물학적 선택 표식체로 표시된다.
본 발명의 방법은 특히 특정 핵산의 존재유무를 검출하는 샘플(예를들어 의학적 샘플 )분석에 유용하다. 예를들어, 샘플을 상대적으로 많은 양의 특정 핵산(타겟)이 존재하는 의학적 조건에 대하여 시험하고자할 때, 타겟핵산에 대한 검출은 하기와 같이 수행될 수 있다. 타겟(존재한다면)을 지지체와 하이브리드화시키고 이 지지체를 세척하여 타겟의 “깨끗한”샘플을 남긴 후, 상기 타겟의 서열과 상보적인 것으로 알려진 표식된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이 프라이머가 타겟과 하이브리드화될 조건하에서 지지체에 첨가한다. 상기 표식체는 예를들어 방사성 표식체, 발색체 또는 효소와 연결된 반응물일 수 있다. 다음 상기 지지체를 세척하여 어닐링되지 않은 프라이머를 제거하는데, 세척은 타겟핵산과 하이브리드화된 프라이머가 타겟과 “용해분리”되는 온도 이하에서 수행된다. 후속적으로, 지지체의 온도를 올려 (타겟 DNA와 또는 이것없이)하이브리드화된 프라이머를 용해분리한다. 검출자를 사용하여 프라이머의 존재를 검출한다. 프라이머가 검출된다면 샘플내에 타겟핵산이 존재한다는 확증이다.
그런데 샘플이 상대적으로 적은 양의 타겟핵산만을 포함하고 있는 것이라면 증폭반응(하기 참조)을 수행할 수 있다(원래 용의점이 있는 타겟이 존재한다면 각각은 증폭된 생성물은 표식된 복사본들을 생성한다), 검출작업을 수행하여 표식된 증폭생성물이 생성되었는지 여부를 결정한다. 만약 검출되었다면, 이것은 원래 용의점이 있는 타겟이 존재하였다는 확증이다. 물론 원 샘플내에서의 매우 작은 양의 타겟 존재를 결정할 수 있다는 점에서, 바람직한 횟수의 증폭을 실시하여 상기 테스트를 매우 민감하게 만든다는 것은 바람직하다.
겔 상에서의 생성물 분리방법을 사용할 필요없이 원 샘플내에서 타겟의 존재를 검출하는 것이 수행될 수 있다는 것은 본 발명의 중요한 특징이다.
본 발명에 따라서 하기에서 설명되는 것과 같이 지지체의 세척은 물론 후속조작을 용이하게 하는 유체 관통 용기(예를들어 컬럼)에 지지체를 제공하는 것이 특히 바람직하다.
유체 관통용기의 사용은 매우 중요한 특징이고 따라서 본 발명의 두 번째 관점에 따라, 입구와 출구를 가지며, 타겟핵산상의 특정 서열과 상보적인 단일쇄 올리고뉴클레오타이드를 결합하고 있는 고형지지체 시스템을 포함하는 유체 관통용기가 제공된다.
상기 용기는 예를들어 150내지 250㎕ 크기일 수 있다.
상기 조작은 상기 용기에 반응용액을 공급하고 조작의 생성물을 수집하고 검출하기 위한 장치(상기 유체 관통용기가 장착된)를 사용하여 실행될 수 있다.
본 발명의 세 번째 관점에 따라서, 용체 관통용기, 용기로 부터 제거된 용액이 칼럼으로 돌아오기전에 세척 또는 다른 과정동안 용액을 저장수단, 핵산조작의 생성물을 검출하기 위한 검출수단 및, 용액을 용기의 내부 및 외부로, 폐기 또는 저장장소로 및 상기 검출 수단으로 전환시키는 조절수단을 포함하는 핵산서열상에서 조작을 실행하는 장치가 제공된다.
상기 장치의 바람직한 형태에 있어서, 상기 용기의 출구는 (i)시약저장부위, (ii)조작생성물 검출부위 및 (iii)폐기물 출구와 선택적으로 연결되어 있다. 상기 시약 집합로위는 용기의 입구를 통해 용기로 처음 공급된 시약 용액이 동일한 타겟핵산(또는 이의 복사물)상에서 반복조작이 실행되는 용기로 되돌아오게 하기 위한 새약 집합부위로 옮겨지게 한다. 각 조작에서 나온 생성물은 검출부로 옮겨진다. 바람직하게는 연속적인 조작에서 나온 생성물이 검출부로 옮겨지기 전에 수집되는 그러한 장치이다.
상기 장치는 물론, 용액, 생성물등이 상기 장치를 통하여(바람직하게는 가스 압력하에서)움직이는 것을 가능하게 하는 적합한 밸브설비(예를들어, 솔레노이드 작동밸브)를 포함한다.
상기 고형지지체는 100 내지 200미크론 크기의 비다공성 입자를 포함한다. 비다공성 물질은 선행기술에서 사용된 다공성 지지체와 관련된 문제점, 즉 기공내에서 뉴클레오타이드 사슬성장이 일어나서 세척시 기공내에 잔기가 남게되어 비효율적이고 따라서 수율을 감소시킴 비효율적인 커플링을 결과하는 것을 피할 수 있기 때문에 유리하다. 상기 지지체는 100내지 200미크론 직경의 하소된 구형입자로 구성될 수 있다. 예를들어 지지체는 비다공성 실리카 겔일 수 있다.
지지체는 지지체상에 올리고뉴클레오타이드 서열을 부동화시키는데 사용되는 반응기(예를들어 에폭시기)를 가진다.
지지체는 지지체상에 부동화된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는데 사용될 수 있는 반응기를 포함하는 가교된 실옥산 매트릭스를 가지는 것이 바람직하다. 그러한 지지체는 매우 중요한 특징이며 그러므로 본 발명의 네 번째 관점에 따라서 지지체상에 부동화된 핵산을 제공하는데 사용될 수 있는 반응기를 포함하는 가교된 실옥산 매트릭스를 가지는 핵산서열의 부동화용 고형 시스템이 제공된다.
본 발명의 다섯째 관점에 따라서, 유리 히드록실기를 가지는 고형지지체를 상기 유리 히드록실기와 반응성이 있으며 지지체상에 핵산서열을 부동화시키는데 사용될 수 있는 실옥산 매트릭스 선구체과 반응시키는 단계 및 이 반응생성물을 가열하여 실옥산 매트릭스를 형성하는 핵산서열의 부동화용 지지체를 제조하는 방법이 제공된다.
상기 실옥산 매트릭스의 사용은 특히 이의 산/염기 안정성 때문에 유리하다. 이것은 생분해되는 비오틴 스트렙타비딘 결합을 포함하는 선행기술 지지체와 대비되는 것이다. 상기 실옥산 매트릭스로 인하여 상기 올리고뉴클레오타이드가 지지체로부터 제거되지 않고 넓은 범위의 조작이 실행될 수 있다. 예를들어, 지지체상에 잔류하고 있는 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하기 위한 시약으로서 암모니아를 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 부동화시키기 위해 사용되는 정상 숙신산 결합은 염기에 불안정하여 올리고뉴클레오타이드를 상기 지지체상에서의 분리를 야기한다.
바람직하게 핵산서열의 부동화에 사용될 수 있는 반응기는 에폭시기이다.
필요하다면, 실옥산매트릭스 선구체와의 반응 후 그러나 가교된 실옥산 매트릭스 형성전에 지지상에 존재하는 유리 히드록실기는 예를들어 클로로실란을 사용함으로써 보호할 수 있다.
바람직하게는 상기 실옥산 메트릭스 선구체는 하기 식의 글리시독시화합물이다:
상기 식에서 R은 1내지 4탄소원자의 알킬기이고 R1는 알킬렌 잔기이다. 가장 바람직하게는 R은 메틸이고 R1는 -(CH2)3-이다.
합성올리고뉴클레오타이드는 상기 엑폭시기를 통해 지지체상에 공유결합적으로 연결될 수 있다. 택일적으로, 뉴클레오타이드의 나트륨염이 상기 지지체에 공유결합적으로 연결되고 올리고뉴클레오타이드 합성(β-시아노에틸 포스포아마이드를 사용하여)을 실행할 수도 있다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조한 구체예의 방법으로 더욱 설명될 것이다.
제1도는 본 발명의 원리를 다이아그램적으로 표시한다.
제2도는 올리고 -고형 시스템을 포함하는 유체관통컬럼의 종단면도이다.
제3도는 올리고뉴클레오타이드 부동화용 고형 지지체 생성반응 경로를 설명한다.
제4(a) 및 (b)도는 고형 지지시스템과 올리고뉴클레오타이드를 이에 결합하는데 있어서 관련된 반응을 다이아그램적으로 나타낸다.
제5(a) 내지 (b)도는 타겟핵산의 증폭에 포함된 단계를 다이아그램적으로 나타낸다.
제6도는 본 발명에 따라서 조작을 실행하기 위한 장치를 설명한다.
제7도는 실시예 3의 결과를 나타내는 방사선사진이다.
제1도를 참조하면, 고형 지지물질의 다수입자 1을(많이 증폭된 척도로) 설명하고 있다. 상기 입자 각각은 자체에 많은 수의 동일한 올리고뉴클레오타이드서열 2를 부동화시키고 있다. 이 서열은 단일 쇄 타겟핵산서열 3에 특이적이다. 상기 단일쇄 타겟핵산서열은 샘플 4에 포함되어 있으며 이것은 또한 삼각형 5로 표시되는 불필요한 불순물(예를들어 다른 핵산서열, 단백질등)을 포함한다.
샘플 4를 핵산서열 3의 일부가 상기 올리고뉴클레오타이드와 결합하는 하이브리드와 조건에서 지지체 1에 첨가하여 비하이브리드화된 산 3을 불순물 5와 함께 액상으로 남긴다. 후속 세척동안 상기 비하이브리드화된 산 3을 불순물 5와 지지체 1로 부터 제거하여 지지체에 결합된 타겟핵산 3의 깨끗한 샘플을 남긴다.
특히 바람직하게는 상기 입자 1이 제2도에 도시된 바와같이 입구밸브 7과 출구밸브 8은 물론 히터 9를 포함하는 유체 관통컬럼 6내에 포함된다. 편의상, 제2도의 도시된 입자 1은 이에 부동화된 올리고뉴클레오타이드 서열을 하나만 가지는 것을 나타낸다.
타겟핵산은 입구밸브 7을 통해 적절한 버퍼, 예를들어 고열 하이브리드화버퍼에서 예를들어 1000:1 올리고뉴클레오타이드:타겟의 비율로 유체 관통 컬럼에 첨가되고 지지체 결합의 올리고뉴클레오타이드와 타겟핵산에 적합한 조건에서 하이브리드화를 실행한다. 이중쇄 DNA가 타겟핵산원이라면, 컬럼에 첨가하기 전이나 컬럼상에 놓여있는 중에 통상의 방법으로 단일 쇄로 먼저 분리한다.
샘플 4는 출구밸브 8을 닫음으로 컬럼내에 있게 된다. 하이브리드화 단계이후에, 불필요한 불순물(지지체상에 부동화되지 않은)을 세척함으로써 제거하여 지지체상에 깨끗한 샘플타겟핵산을 잔류시킨다.
고형지지체를 (부동화된 올리고뉴클레오타이드와 함께) 제조하는 방법은 제3내지 5도에 도시되어 있다. 먼저 제3도를 참조하면, 올리고뉴클레오타이드가 부동화되는 반응기를 가지는 지지체를 얻는 반응경로의 한 구체예가 설명되어 있다.
상기 과정은 도시된 바와같이 표면에 히드록실기를 가지는 실리카겔 입자(I)로 시작한다. 제1반응단계에 있어서, 상기 입자는 3-글리시독시 프로필 트리메톡시 실란(III)으로 예를들어 95℃를 넘지않은 온도에서 2시간 동안 질소부위기하에서 처리된다. 이 결과, 축합반응이 일어나고, 이로써 (II)의 잔기가 실리카 입자(I)에 결합되어 (III)으로 표시된 생성물을 산출한다. 도면상에는 2개의 잔기만이 실리카 입자에 결합되어 있는 것으로 나타나 있지만 이것은 단순히 명확히 하기 위한 것이고 실제로는 상당히 많은 잔기가 실리카 입자에 결합되어 있다. 통상결합수준은 실리카 그람당 약 40내지 45마이크로몰이다.
다음, 생성물(III)을 무수 톨루엔, 무수메탄올 및 무수에테르로 연속 세척한다.
다음 단계는 생성물을 가열하여 잔기의 가교를 실행하는 것이다. 이러한 가교반응은 통상 110℃의 온도에서 2시간 이상으로 실시된다. 결과된 산물은 (IV)에 도시되어 있고 실리콘 원자가 산소원자를 통해 연결되어 있는 것을 볼 수 있다.
실리카 입자의 표면상에 남아있는 유리 히드록시 기는 필요하다면 클로로실란으로 보호될 수 있다. 상기 보호제는 예를들어 트리메틸 클로로실란일 수 있고, 이때 반응은 실온에서 2시간 동안 피리딘에서 실행된다. 보호반응에 이어서, 상기 지지체는 상술한 바와같이 세척된다.
결과로서 수득한 지지체는 올리고뉴클레오타이드의 부동화에 사용될 수 있는 유리 에폭시기를 가진다.
예를들어 주지된 방법을 사용하여 지지체상 본래 타겟핵산의 특정 서열과 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 것이 가능하다. 따라서, 디메톡시 트리틸(DMT)의 나트륨염으로 보호된 뉴클레오타이드는 지지체와 반응하고 이로써 뉴클레오타이드의 3′위치에 있는 -0-부분이 유리히드록시와 반응하여 생성물(V)를 산출한다. 상기 무수 DMF에 DMT 뉴클레오타이드(P2O5로 탈수된)를 용해시키고 무수분위기하에 상기 용액을 유지시키고 소듐히드나이드를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 다음, 소듐 히드라이드를 여과제거하여 상기 나트륨염을 남긴다.
DMT 보호기 제거후, 올리고뉴클레오타이드합성에 알려진 방법을 이용하여 각 개별 뉴클레오타이드로부터 바람직한 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다.
택일적으로, 예비 합성된 올리고뉴클레오타이드(타겟핵산상의 특정서열과 상보적이고 바람직하게는 제한 효소부위를 포함하는)를 지지체에 결합하는 것이 가능하다.
특정 박테리아, 바이러스, 기생체 등의 존재시험에 대한 탈침자로서 사용될 수 있는 수많은 타겟핵산서열에 상보적인 수많은 합성올리고뉴클레오타이드가 이용가능함, 부록 A참조, 특정예로서, 본 발명은 예를 들어 하기에 주어진 올리고뉴클레오타이드 서열이 지지체상에서 부동화된 하기의 바이러스등을 검출하는데 사용될 수 있다.
엡실론 바 바이러스(Epsilon Ba Virus) 톡소플라즈마 곤디 트리파노소마 브루세이 브루세이 올리뉴클레오타이드는 지지체상에 3′-5′또는 5′-3′방향으로 결합될 수 있다. 지지체상의 에폭시 기와 뉴클레오타이드의 나트륨염(예를 들어 티미닌 뉴클레오타이드(디메톡시트리틸 디데옥시리보뉴클레오타이드(dT)(제4(a)도 참조))의 히드록실 기를 반응시켜 현재 이동되고 있는 결합기와 달리 산과 알카리 둘다에 안정한 결합을 생성함으로써 3′-5′방향으로의 결합을 이룰 수 있다.
5′-3′방향으로의 결합은 하기와 같이 이루어진다(제4(b)도 참조). 5′-요오도 -5′-디데옥시티미딘을 DMF에서 소듐 트리페닐 메틸머캡타일과 반응시켜 S-티리틸 화합물을 형성한다. 이 화합물을 디이소프로필 아미노 테트라졸리드 및 2-시아노 에톡시 비스(NN 디이소프로필 아미노)포스포아미다이트와 DCM에서 더 반응시켜 β-시아노에틸을 생성한다. S-티리틸기는 당해분야에 주진된 환원반응 방법(코놀리(connolly), Nucleic Acid Research, 13, 12, 1985: 추(chu), Nucleic Acid Research, 16, 9, 1988; 구아(Gua) Nucleic Acid Research, 17, 11, 1989)으로써 소듐히드라이드를 이용한 에폭시 치환 지지체와 결합전에 제거한다. 5′-3′방향으로 결합한 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 다른 방법이 주지되어 있다(아니소르기(Anisorge), Nucleic Acid Research, 15, 11, 1987; 스프로트(Sproat), Nucleic Acid Research, 15, 12, 1987; 주커만(Zukerman), Nucleic Acid Research , 13,5305 1987; 베르헤이덴(Verheyden), JOREGA, CHEM, 35, 2319, 1970). 비록 상기 리스트가 총망라한 것은 아니지만 당해분야의 숙련자에게 명백한 다른 방법을 사용하여 본 발명의 고형 지지시스템에 3′-5′방향 또는 5′-3′방향으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드가 합성반응으로 인한, 3′-5′올리고물의 염기(G, A, C)상의 부틸/이소프로필기 및 5′-3′올리고물의 β-시아노에틸기와 같은 보호기를 가지고 있는 경우, 이러한 것들은 합성후에 반드시 제거되어야 한다. 상기 올리고-고형 지지체는 38% NH4OH에서 55℃로 2시간 가열되어 상기 보호기를 제거하여 탈보호된 올리고뉴클레오타이드를 생성한다.
이러한 시스템에 적합한 조작의 한 예는 타겟핵산서열의 증폭이다.
제5(a) 내지 (c)도는 프라이머 부위의 위치, 올리고뉴클레오타이드의 방향(예를들어 3′-5′ 또는 5′-3′) 및 따라서 타겟핵산서열과 하나이상의 올리고뉴클레오타이드서열(예를 들어 역방향 올리고물)의 존재에 증폭기술에 포함된 단계를 다이아그램적으로 나타내고 있다. 증폭에 포함된 단계는 주지되어 있다. 예를들어 프라이머의 첨가, 프라이머 연장 타겟 복사물을 역복사하는 제2프라이머의 첨가등이다.
제5(a)도에 설명된 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5′말단은 지지체에 결합되고 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화된 타겟핵산을 증폭시킨다. 이경우, 올리고뉴클레오타이드는 프라이머로 작용하거나 별개의 프라이머 11가 하이브리드화 단계전에 올리고뉴클레오타이드와 결찰된다. 어떤 경우에서든지, 프라이머로 타겟핵산의 말단까지 프라이머 연장생성물 12이 합성된다(타겟핵산을 주형으로 사용하여) 따라서 지지체에 결합되어 있고, 타겟핵산과 상보적인 핵산서열이 수득된다. 편의상, 상기 상보서열을 “복사타겟”이라 칭한다.
다음, 지지체를 세척하고 하이브라화된 핵산쇄(예를들어, 타겟과 복사타겟)을 당해분야에 주지된 방법(예를들어 특정온도에거 가열함으로써)으로 변성시켜 고형지지체에(올리고뉴클레오타이드를 통해서) 결합된 복사타겟만을 남긴다. 편의상, 결합된 올리고뉴클레오타이드를 가지는 고형지지체를 이하에서 -“올리고-고형지지체”로 지칭한다.
지지체 시스템을 세척하고 이 시스템에 잔류되어 있는 복사타겟을 원래의 타겟핵산을 양산하는데 사용한다. 그러한 합성은 프라이머 13을 복사타겟과 하이브리드화시키고, 지지체를 세척하여 하이브리드화되지 않은 프라이머를 제거하고, 프라이머 연장을 실시하고(여기서 복사타겟은 주형으로 작용)변성시킨 후 합성된 핵산서열 14을 수집하는 것을 포함한다. 이러한 방법을 필요한 만큼 반복하여 원래의 타겟핵산이 바람직한 정도로 사실상 증폭시킨다. 각 증폭단계는 동일한 세트의 복사타겟분자를 사용하는 것으로 이해된다.
제5(a)도에 설명된 과정은 의학적 샘플내에 적은 양의 타겟핵산이 존재하는 것을 검출하기에 특히 적합하다. 프라이머 13을 주지된 기술로 표식하고 검출단계를 실시하여 대응 표시된 핵산서열 14을 검출한다. 표식이 검출된다면 이것은 타겟핵산 3이 원래 샘플에 존재하였다는 확증이다.
제5(a)도에 설명된 방법의 변형으로서, 이중쇄 핵산은 제한부위(예를 들어 올리고뉴클레오타이드에 결찰된 프라이머에 의해 제공되는 것같이)를 포함하고 적절한 제한효소를 사용하여 지지체로 부터 이중쇄 분자를 절단한다.
본 발명의 또다른 구체예(제5(b)도 참조)로서 올리고뉴클레오타이드의 5′말단이 지지체에 결합된 경우, 표준방법(예를들어, 생거(sanger) DNA 시퀀싱 기술)을 사용하여 하이브리드화된 타겟핵산을 시퀀싱하는 것을 포함한다. 따라서, 프라이머 15는 타겟핵산(이는 지지체상의 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화 되어 있다)와 하이브리드화된다. 상기 프라이머는 타겟핵산이 상기 올리고뉴클레오타이드와 용해분리되지 않는 온도에서 타겟과 하이브리드화되는 것이어야만 한다. 다음, 쇄합성반응을 4개의 데옥시뉴클레오타이드(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)의 혼합물 및 단일 디데옥시뉴클레오타이드와 같이 실시한다. 프라이머로 부터 올리고뉴클레오타이드쪽으로 5′-3′방향으로 합성이 진행한다. 이 반응을 각각 상이한 디데옥시뉴클레오타이드를 사용하면서 4번 실시한다. 주지된 바와같이, 디데옥시뉴클레오타이드는 상이한 길이의 핵산서열이 얻어지게 한다-점선으로 표시된 것같이. 상기 4번 반응의 생성물을 적절한 겔상에서 평행하게 전개시키고 4줄의 주행선에서의 밴드위치로 부터 서열을 결정짓는다. 본 발명의 이러한 특별한 구체에는 수득한 서열을 “정상”서열을 가지고 있는 것으로 알려진 통제샘플의 서열과 비교함으로써 핵산(예를들어 의학적 샘플로서 제공되는)에서의 포인트 변이를 검출하는데 특히 적합하다.
올리고뉴클레오타이드의 3′말단이 지지체에 결합되어 있는 구체에는 타겟핵산서열을 증폭하는데 이용될 수 있다. 상술한 시퀀싱의 경우에서와 같이, 프라이머를 타겟핵산에 하이브리드화 시킨다. 사용된 프라이머는 타겟이 올리고뉴클레오타이드와 용해분리되는 온도아래에서 상기 핵산과 하이브리드화되는 것이어야 한다. 프라이머의 연장을 주지된 조건에서 실시하는바, 올리고뉴클레오타이드쪽으로 길게 실시된다. 수득한 복사생성물은 지지체와 하이브리드화된 타겟핵산을 향후의 증폭반응에 사용되도록 남기는 조건하에서 타겟핵산과 용해분리된다.
상술한 모든 증폭반응에서, 동일한 주형이 올리고-고형지지체에 결합된채로 남고 향후의 증폭반응에 사용된다. 이것은 유럽 특히 A 0 200 362호에 개시된 기술과 본 발명의 중요한 차이점이다. 왜냐하면, 상기 유럽특허에 있어서, 타겟핵산의 양쪽쇄는 주형으로서 사용되고 복사된 다음, 타겟쇄와 복사된 쇄 모두는 제2 및 그 이후의 증폭단계에서의 주형으로서 사용되기 때문이다. 따라서 임의의 시점에서 복사하는데 있어서 오류가 생겨난다면 이 오류가 “사슬반응”으로 복사되어진다.
본 발명은 단일 복사단계를 가지고 이러한 복사를 향후 모든 증폭단계에서 유지시키거나 또는 원래의 타겟서열을 모든 증폭단계에 유지시킴으로써 상기 문제를 해결하는 것이다. 본 발명은 하이브리드화되지 않는 프라이머 및 타겟 또는 복사서열을 세척하여 시스템으로부터 제거하는 반면 유럽특허 A 0 200 362호에 기술된 방법에서는 하이브리드화되지 않는 타겟, 프라이머 및 복사생성물이 방법시행동안 존재하고 따라서 시스템을 비효율적으로 만들기 때문에 본 발명은 상기 유럽특허 보다 더욱 효율적이다.
본 발명의 또다른 구체예(제5도 참조)에 있어서, 타겟 또는 복사타겟의 상이한 부분에 5′-3′또는 3′-5′방향으로 상보적인 2개의 프라이머를 첨가하여 당해분야에 주지된 방법(DNA 리가제 어닐링반응)으로 포인트 변이를 체크하는데 사용된다. 이러한 분석에 있어서, 상기 프라이머는 표식되며 예를들어 P53 종양 억제 유전자 변이의 신속한 진단시험에 사용된다. 왜냐하면 모든 결장암 환자의 75%는 이러한 유전자에서 포인트 탈락변이를 가지기 때문이다.
상술한 것에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 고상시스템과 장치가 증폭된 핵산의 효율과 수율에 있어서 더욱 큰 결과를 가져온다는 점에서 주지된 방법과는 다르다는 것을 알 수 있다. 이것은 단계적으로 수행될 수 있는 본 발명의 방법상의 능력에 기인한다. 본 발명의 컬럼은 각 하이브리드화 후에 세척하여 하이브리드화되지 않는 DNA등을 제거하고 시스템을 깨끗이 하여 효율을 매우 향상시킨다. 컬럼상의 반응용액내용물 예를들어, 새로이 증폭된 타겟서열을 컬럼과 연결된 광학셀과 같은 검출부로 전달하여 타겟서열의 존재유무를 빨리 확인한다. 이것은 환자샘플에 대한 특정질환야기의 유기물의 존재여부를 지금까지는 이용되지 못한 간단하고 신속하며 신뢰성있는 방법으로 진단하는데 응용될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예(증폭을 포함하지 않는다)가 제 5(d)도에 설명되어 있다. 이것은 상대적으로 많은 양의 타겟핵산의 존재유무에 대한 샘플테스트에 적용될 수 있다. 제5(d)도의 구체예에서, 타겟핵산이 올리고뉴클레오타이드와 용해분리하는 온도 아래에서 타겟핵산과 하이브리드화되는 프라이머를 표식시킨 후 지지체시스템에 첨가한다. 타겟핵산 3이 존재한다면, 프라이머는 타겟핵산과 하이브리드화할 것이다. 지지체를 프라이머 16이 타겟핵산과 용해분리되는 온도 아래에서 세척하여 어닐링되지 않는 프라이머 16을 제거한다. 다음단계에서, 고형 지지체를 프라이머 16이 (타겟핵산과 또는 이것없이)용해분리되는 온도로 가열하고, 지지체를 세척하고 용출된 생성물을 검출부로 이송한다. 표식이 검출된다면, 이것은 원래 샘플에 타겟핵산이 존재하는 것을 증명하는 것이다.
제6도를 참조하면, 지지체 결합 올리고뉴클레오타이드와의 타겟핵산 하이브리드화는 물론 증폭반응이 수행되는 장치가 설명되어 있다.
제6도에 설명된 장치는 올리고뉴클레오타이드 22를 가지는 지지체입자 21로 예비로딩된 컬럼 20(제2도의 컬럼 6과 동일)을 포함한다. 컬럼 20은 통상 약 200㎕의 부피를 가지며, 입구 23과 출구 24를 가진다. 이 입출구에는 컬럼내에 입자 21을 유지시키는 기공보유요소 25가 설비되어 있다. 이 장치는 밸브설비 26-34를 가지며 화살표 G를 따라 압축가스가 공급된다. 이 가스는 장치내에서 시약과 생성물의 이동을 수행하는데 사용된다. 특정 밸브는 가스를 화살표 V 방향으로 배출하기 위한 것이다.
밸브 26은 컬럼 20의 내부를 (예를들어 샘플, 프라이머, 버퍼등)을 함유하는 개별용기 35a-35d를 가지는 시약공급 어셈블리와 선택적으로 유통시키는 것으로 상기 용액은 가스압력으로써 밸브 26과 27을 통해 컬럼 20에 공급된다.
밸브 28의 출구쪽으로 이송 부위 36이 있는 바 이것은 (밸브 30을 통해) 생성물 집합부 37과 선택적으로 유통되고 상기 집합부는 예를들어 광학검출부 또는 방사성 표식 검출부일 수 있는 검출부 38과 연결되어 있다. 다른 형태의 검출부 또한 사용될 수 있다.
이송부 36은 (밸브 31을 통해서)용액 보유부 39 또는 폐기물 저장소 40과 선택적으로 유통된다. 용액수집부 39는 상기 장치의 하나의 관에 의해 제공되고 컬럼 20의 부피와 적어도 동일한 부피를 가진다.
가열기 41이 도시된 바와 같이 컬럼주위로 제공된다.
상기 설명된 장치의 밸브는 예를들어 제로 데드 테프론 시티드 밸브(미국 제너럴 밸브제작)일 수 있고 상기 장치에 사용된 튜브는 1.5mm 직경의 테프론 튜브일 수 있다.
상기 장치를 사용하는데 있어서, 상기 지적한대로 가스압력으로 샘플을 적절한 버퍼와 함께 컬럼 20으로 공급한다. 적절한 온도에서 타겟핵산을 하이브리화시키고 컬럼을 세척한다(어셈블리 35로부터 공급된 용액으로)이 세척물은 폐기물 저장소 40으로 이송될 수 있다(적절한 밸브세트 28과 31을 통해). 밸브 34는 상기 과정동안 잉여압력을 배출하기 위해 열려져 있다.
지지체상에 포착되어 있는 타겟핵산상에서 조작을 실행한다. 이를 위해 새약용액이 어셈블리 35로 부터 적절한 밸브세트(용액공급 및 가스밸출을 위한)를 통해 적절히 공급된다.
조작 후, 시약용액을 컬럼 20으로 부터 용액보유부 39로 이송한다.
조작 생성물을 지지체 21가 용해분리시키고 즉각적인 검출 또는 보관을 위해 생성물 수집부 37로 이송한다.
지지체상의 타겟핵산(또는 이의 복사물)에 대한 조작을 더 실행해야 한다면, 보유부 39에 보유된 용액을 가스압력하에서 밸브 32를 통해 컬럼 20으로 되돌릴 수 있다. 상기 광정을 반복한다.
조작생성물은 수집부 37에 필요한 만큼 자주수집될 수 있다. 생성물 수집동안, 밸브 33은 가슬르 배출하도록 설정되어질 것이다. 생성물이 검출부로 즉시 이송되는 것을 방지하기 위하여, 밸브 33을 짧은 시간동안 폐쇄시켜 수집된 생성물이 수집부 37을 따라 검출부 38에 도달하기에 충분히 멀리 이송되지 않도록 한다.
상기 장치에서 전기적 조절하에서 밸브설정이 자동화되는 것으로 이해된다.
상기 장치는 제6도에 설명된 바와 같이 단일 컬럼을 포함할 수도 또는 단일 샘플상에서 다수의 올리고뉴클레오타이드 탐침자를 시험하기 위한 또는 다수의 샘플상에서 단일 올리고뉴클레오타이드 탐침자(예를들어 HIV I)를 시험하기 위한 다수의 컬럼을 포함할 수도 있다.
또한, 컬럼 20은 상기 장치의 고정 부분일 필요가 없다. 예를들어, 올리고뉴클레오타이드가 결합된 고형지체로 예비로딩된 일회용 컬럼 20을 제공하고 이 컬럼을 제6도에 도시된 장치의 다른 부분에 위치시키는 것이 가능하다. 이것은 고정된 컬럼이라면 컬럼으로 부터 고형지지체를 비우는 것이 요구되는 것을 극복할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에서 더욱 설명될 것이다. 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오타이드-컬럼결합 및 컬럼절단(프라이머 샘플)둘다는 Biosearch Model 8500 DNA 합성기상에서 표준커플링 프로그램으로 합성되었다. β-시아노에틸 보호의 포스포아미다이트가 이 합성에 이용되었다. 컬럼 절단의 프라이머 샘플은 완전히 탈브로킹되고(모든 DMTr기가 제거) CPG컬럼으로 부터 자동적으로 NH4OH 절단되었다. 컬럼결합 올리고뉴클레오타이드는 별다른 언급이 없으면 NH4OH 절단되지 않고 최종 DMT기가 제거되지 않았다. 합성후에, 컬럼결합 및 컬럼 절단올리고뉴클레오타이드 둘다를 38% NH4OH(1ml)를 함유하는 나사마개 튜브로 이송하였다. 이 튜브를 겸자에서 끼워 1시간 동안 55℃ 오븐에 두어 보호기를 제거하였다. 상기 겸자에 끼워진 튜브를 -20℃ 냉동실에 10분간 두었다. NH4OH 상등액을 컬럼 결합 뉴클레오타이드로 부터 제거하고 폐기하였다. 샘플은 Savant 원심분리 건조기에서 동결건조시키고 건조기에 보관하였다. 각 칼럼 절단 올리고뉴클레오타이드를 3개 튜브로 나누고 동결건조시켰다. 이들 중 하나를 취하여 조올리고뉴클레오타이드르 정제하였다.
[실리카 지지체 제조]
하소된 Spherisorb GC 지지체(1g)을 위하여 무수톨루엔 40㎖를 담고 있는 둥근 바닥 플라스크에서 P2O5로 탈수시킨다. 플라스크의 내용물을 자기 교반기로 교반시키고 결과로 나타나 슬러리를 오일 중탕에서 90-95℃로 가열하였다. 무수 3-글리시독시프로필 트리메톡신 실란(1.5㎖)를 상기 슬러리에 첨가하여 90-95℃에서 3시간 동안 교반시키면서 반응을 진행시켰다. 온도가 95℃를 넘지 않도록 주의 하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하고, 무수톨루엔(40㎖), 메탄올(40㎖) 및 에테르(20㎖)로 세척하였다. 관능화된 실리카겔을 P2O5및 실리카로 밤새 건조시켰다.
[실시예 2]
[시토신뉴클레오타이드 치환된 지지체의 합성]
(a) 뉴클레오타이드 유도체에 나트륨염 제조 디메톡시트리틸 데옥시리보뉴클레오시드 시토신(DMTr dC)(1g)을 취하여 P2O5및 실리카 상에서 수일간 건조시켰다. 건조된 DMTr dC를 질소하에서 무수 N, N-디메틸 포름아미드(DMF)(20㎖)에 용해시켰다. 용액을 완성한 후 소듐 하이드라이드(0.6g)를 첨가하고 무수 AMF에서 20분간 교반하면서 DMTr dC와 반응시켰다. 다음 NaH를 반응혼합물로 부터 여과제거하였다.
(b) 제조된 실리카 겔 및 뉴클레오시드 유도체의 반응: 건조된 실리카 겔 지지체를 직접 뉴클레오시드의 정제된 나트륨염에 직접 첨가하고 혼합물을 환류하에서 2시간 동안 교반하였다. 결합된 뉴클레오시드와 지지체 혼합물을 밤새 실온으로 냉각시켰다. 치환된 실리카 지지체를 실론화된 소성 유리필터로 여과하고 각각 20㎖의 무수 DMF, 무수톨루엔, 메탄올, 메탄올 및 에테르로 세척하였다. 끝으로, 고형지지체를 건조시키고 건조기에서 보관하였다.
상기 뉴클레오시드 유도체의 당부분에서의 5′산소의 DMT기로 보호되며, 이것은 산에 약하고 디클로로아세트산(DCA)와 같은 무수산에 의해 제거되어 밝은 오렌지 DMTr 양이온을 생성한다. 상기 건조된 치환지지체 일부를 디클로로아세트산(2% DCA함유 디클로로메탄 1㎖)으로 처리하여 밝은 오렌지색이 나타난다. 이는 지지체 실리카와 시토신 뉴클로에시드 유도체의 결합이 성공했음을 나타내는 것이다.
[실시예 3]
시험시스템으로서, 방법절차를 설정하여 박테리아 바이러스 DNA의 혼합물로부터 클론을 분리하였다. 타겟서열(클론된 유전자)을 박테리오파지 M13mp내에 위치시키고 하기 두서열을 함유하였다.
GCG GGT CCC AAAA GGG TCA GTG CTG (1)
AGT GTG TCC TTT GTC GAC GAT ACTG (2)
M13mp는 분자생물학에 사용되는 표준 바이러스로서 시퀀싱 운반체로서 보통사용된다.
예를들어 서열(1)과 상보적인 하기 서열의 올리고뉴클레오타이드를 실시예 2에서 제조된 지지체 상에서 합성하였다.
CGC CCA GGG TTT CCC AGT CAC GAC (3)
상기 서열의 좌측 말단의 시토신 잔기는 실시예 2에서 제조된 지지체에 혼입된 것이다. 고형지지체(15㎎) 및 이에 결합된 올리고뉴클레오타이드 서열을 유체통과 컬럼에 두고 이. 콜리(E. coli)(108세포의 생성물)과 1㎍의 M13DNA의 혼합물을 열로 변성시킨 후 상기 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 (Tm-2)℃의 온도에서 유지시켰다. 여기서 Tm은 서열(3)의 융점으로 하기 식으로 계산된다.
상기식에서, A, T, G 및 C는 각각 서열(3)에 있는 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신 잔기 수이다.
컬럼이 융점(Tm) 바로 아래에서 유지되기 때문에, 바이러스 DNA는 결합된 올리고뉴클레오타이드와 어닐링될 수 있다.
컬럼은 (Tm-2)℃로 유지시키고 어닐링 버퍼(10mM MgCl2및 10mM트리스 HCl pH 7.5)의 21/2㎖로 세척하였다. 컬럼에서 나온 세척물을 200㎕ 분액(토탈 1ℓ)으로 튜브에 수집하였다.
수집된 분액 각각을 상기 서열의 1ng을 DNA 폴리머라제(클렌노우 단편) 및 데옥시리보뉴클레오타이드 및 디데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 표준 반응혼합물과 함께 상기 각 튜브에 첨가함으로써 표준 시퀀싱 반응(Sanger Coulson 방법)시켰다.32p 표식된 데옥시티미딘을 반응혼합물에 첨가시켰다.
상기 컬럼상에 부동화된 반응물을 시퀀스 반응시켰다. 컬럼결합된 물질을 컬럼과 용해분해시키고 수집하였다. 용액상 시퀀싱에서 사용된 것과 동일한 반응 혼합물을 사용하여 시퀀싱을 실시하였다.
시퀀스 반응의 생성물, 지지체 결합 및 용액상 둘다를 표준 8% 폴리아크릴아미드 겔상에서 통상적인 방법으로 전개시켰다. 결과는 제7도의 방사선 사진에 나타나 있다.
레 인 설 명
1 2.5㎖의 어닐링 혼합물로 세척한 고형지지체 결합물질상에서 제조된 서열
2 생성된 첫 번 200㎕ 서열
3 생성된 둘째 200㎕ 서열
4 기타
5 기타
6 기타
7 기타
8 기타
9 기타
10 기타
11 기타
12 기타
레인 1은 타겟핵산(바이러스 DNA)가 실제 지지체와 결합된 것을 증명한다(프라이머 서열(3)은 타겟핵산과 어닐하고 시퀀싱반응을 일어나게 할 수 있다는 사실에 의해 증명되는 바와같이). 레인 1-10은 E. coli DNA로 부터 혼선 또는 오점이 없다는 것을 증명한다. 그러므로, 바이러스 DNA는 지지체상에 선택적으로 잔류된다. 또한, 지지체 결합 타겟 DNA는 지지체상에 안정하게 포착되어 있다. 시퀀싱 서열이 지지체 결합 DNA상에서 실행되기 때문에 지지체 자체에 의한 클렌노우 단편의 입체 장애는 없다.
레인 2-12는 칼럼으로 부터의 세척물에서의 타겟 DNA(예를들어 바이러스 DNA)의 양을 점진적으로 감소시키는 것을 증명한다. 그러므로 잉여 바이러스 DNA를 컬럼에 첨가하고 올리고뉴클레오타이드 서열(3)과 어닐링시키지 않았다. 따라서, 타겟핵산 농도에 대한 컬럼의 결합능력을 조율하는 것이 가능하다.
부 록 A
[동물바이러스]
피그 파르보바이러스
피그미코플라즈마 히프뉴모니에
[허피스]
시토메가로바이러스(CMV)
엡스타인 바
심플렉스 허피스바이러스
[파필로마바이러스]
인체 파필로마 바이러스 6(HPV)
인체 파필로마 바이러스 11(HPV)
인체 파필로마 바이러스 16(HPV)
인체 파필로마 바이러스 8(HPV)
인체 파필로마 바이러스 33(HPV)
[파르보바이러스]
파르보 바이러스 B 19
[피코르나바이러스]
리노바이러스(엔테로바이러스)
리노바이러스 HRV2-14
[헤파티터스 바이러스]
헤파티티스 A(HPV)
헤파티티스 B
헤파티티스 C
헤파티티스 D
[리트로바이러스]
인체면역결핍 바이러스 1(HIV I)
인체면역결핍 바이러스 2(HIV II)
인체 T세포 림프아구 바이러스 I(HTLV I)
인체 T세포 림프아구 바이러스 II(HTLV II)
[박테리아]
레지오넬라 뉴모필리아
미코박테리움 아비움
보비스
포르르투어텀
튜베르쿨로시스
미코플라즈마 뉴모니에
에체리키아 콜리 톡신
보렐리아 부르그도어페리
클라미디아 트라코마티스
살모넬라 티피무리움
스타필로코커스 오리우스
클로스티디움 퍼프린젠스
클렙시엘라 뉴모니에
에어로모나스 살모니시다
미코박테리움 보비스
[기생체]
트리파노조마;
트리파노조마 부르세이 부르세이:
트리파노조마 크루지
트리파노조마 콘골렌스
톡소플라즈마
톡소플라즈마 곤디
플라즈모디아
플라즈모디움 팔시파럼
오발
비박스
말라리에

Claims (20)

  1. (a)타겟핵산의 특정서열과 상보적이며 이 타겟핵산 보다 짧은 단일쇄 올리고뉴클레오타이드를 결합하고 있는 입자 고형 지지시스템을 유체관통 용기에 제공하고, (b)단일쇄 타겟핵산 재료원을 상기 고형지지시스템에 첨가하고, (c)상기 타겟핵산을 상기 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화시키고, 및 (d)상기 지지체에 부동화된 타겟핵산의 최소 일부 서열을 복사하는 것을 포함하는 핵산서열의 복사물을 수득하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하이브리드화 후에 지지체를 세척하여 임의의 하이브리드화되지 않은 타겟핵산을 제거하고 상기 복사가 실행되는 지지체상에 타겟핵산의 “깨끗한”샘플을 남기는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 5′말단이 지지체에 결합되는 방법.
  4. 제1항내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 복사를 실행하여 지지체상에 결합된 타겟핵산서열을 생성하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 타겟핵산을 복사타겟과 용해분리시키고, 및 세척하여 타겟핵산을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 지지체상에 결합된 복사타겟상에서 적어도 하나의 복사반응을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 3′말단을 지지체에 결합하는 방법.
  8. 제9항에 있어서, 상기 조작은 타겟핵산을 시퀀싱하는 것을 포함하는 방법.
  9. 샘플내에 타겟핵산의 존재유무를 시험하는 방법에 있어서, (a)상기 타겟핵산상의 특정 시퀀스에 상보적인 단일 쇄 올리고뉴클레오타이드를 결합하여 가지고 있는 고형지지체 시스템을 유체 관통 용기에 제공하고, (b)상기 타겟핵산이 상기 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화될 조건하에서 상기 샘플을 상기 지지체 시스템에 첨가하고, (c) 상기 지지체를 세척하여 불순물을 제거하고, (d)존재한다면, 타겟핵산과 하이브드화될 표식된 탐침자를 지지체에 첨가하고, (e)세척하여 하이브리드되지 않은 탐침자를 제거하고, (f)표식된 탐침자를 이용하여 적어도 하나의 복사 반응을 실시하고, 및 (g)복사된 표식 생성물의 존재를 시험하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중에 어느 한항에 있어서, 상기 지지체는 100 내지 200미크론 크기의 입자를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항중에 어느 한항에 있어서, 지지체는 실리카성인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항중에 어느 한항에 있어서, 지지체는 올리고뉴클레오타이드가 결합된 가교 실옥산 매트릭스를 가지는 방법.
  13. 입구 및 출구를 가지며, 및 타겟핵산상의 특정 서열에 상보적인 단일쇄 올리고뉴클레오타이드가 결합된 가교 실옥산 매트릭스를 가지는 입자 고형 지지 시스템을 포함하는 유체관통용기.
  14. 타겟핵산상의 특정 서열에 상보적인 단일쇄 올리고뉴클레오타이드가 결합된 가교 실옥산 매트릭스를 가지는 입자 고형 지지 시스템을 포함하는 유체 관통용기, 용기로 부터 제거된 용액이 컬럼으로 돌아오기 전에 세척 또는 다른 과정동안 용액을 저장하는 저장수단, 핵산조작의 생성물을 검출하기 위한 검출수단 및 용액을 용기의 내부 및 외부로, 폐기 또는 저장장소로 및 상기 검출수단으로 전환이송시키는 조절수단을 포함하는 핵산서열상에서의 조작실행 장치.
  15. 핵산서열의 부동화용 고형지지체에 있어서, 상기 지지체는 지지체상에 부동화된 핵산을 제공하는데 사용되는 반응기를 가지고 있는 가교실옥산 매트릭스를 가지는 지지체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 반응기는 에폭시기인 지지체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 지지체는 비다공성 실리카성 지지체.
  18. 제15항 내지 제17항중 어느 한항에 있어서, 100내지 200미크론 크기의 입자를 포함하는 지지체.
  19. 제15항 내지 제18항중 어느 한항에 있어서, 올리고 뉴클레오타이드를 부동화시켜서 가지고 있는 지지체.
  20. 핵산의 부동화용 지지체를 제조하는 방법에 있어서, 유리히드록실 기를 가지고 고형지지체를 상기 유리히드록실기와 반응하고 및 지지체상에 핵산서열의 부동화에 사용될 수 있는 기를 가지는 실옥산 매트릭스 선구체와 반응시키고 이 생성물을 가열하여 실옥산 매트릭스를 형성하는 방법.
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