KR100234979B1 - 인유두종 바이러스 타잎 16, 18의 동시 검출을 위한 pcr 프라이머를 이용한 바이러스의 동시 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인유두종 바이러스(human papillomavirus : HPV) 타잎 16, 18의 동시 검출을 위한 특정 염기서열의 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머쌍을 이용하여 바이러스를 동시에 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머쌍은 HPV16과 HPV18 둘다의 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 HPV16 및 HPV18의 공통 염기서열 부위(consensus region)를 토대로 설계되고 합성된 1차 PCR용 프라이머쌍, 및 HPV16과 HPV18 각각에 특이적인 염기서열의 DNA 단편을 증폭하면서도 2차 PCR 산물의 크기가 서로 다르도록 설계되고 합성된 2차 PCR용 프라이며 2쌍으로 구성된다. HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위해 본 발명의 프라이머쌍을 이용하면, 종래의 네스티드 PCR에서 요구되는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 수행하지 않고, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 동시 검출이 가능하므로, 그 절차와 시간을 대폭 단축시킬 수 있다. 따라서 사람의 혈액에서 수득한 DNA와 프라이머쌍 HP1/HP2을 이용하여 1차 PCR한 다음, 이 1차 PCR 반응액에 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182을 동시에 첨가하여 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18을 동시에 효과적으로 검출할 수 있다.
Description
본 발명의 인유두종 바이러스(human papillomavirus) 타잎 16, 18의 동시 검출을 위한 PCR 프라이머(polymerase chain reaction primer)를 이용한 바이러스의 동시 검출방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 인유두종 바이러스 타잎 16 및 타잎 18의 각 바이러스 검출을 위해 지금까지 필요하였던 4쌍의 프라이머 및 4번의 PCR 반응을, 3쌍의 프라이머 및 2번의 PCR 반응으로 간편화시킬 수 있는 특정 염기설열의 프라이머를 이용하여 전기 바이러스를 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 자궁경부암은 우리나라 여성암 중 가장 발병빈도가 높은 질병으로서, 인유두종 바이러스(human papillomavirus, 이하 'HPV'라 함)에 의해 발병하는 것으로 보고되고 있다. 현재까지 약 70여종의 HPV가 발견되었고, 그 중에서 HPV16과 18이 가장 중요한 발병원인으로 알려져 있다.(참조 : Schiffamn, M.H. et al., J. Netl. Cancer Inst., 85 : 958(1993))
현재까지 HPV 감염 여부의 측정을 위하여, HPV16의 외피단백질 E6 및 E7에 대한 항체를 이용하여 혈청내 항원을 검사하는 ELISA(Enzyme linked immuno sorbent assay)법이 보고되었지만(참조 : Sun Y. et al., J. Clin. Microbiol., 32 : 2216 (1994)), 항체의 제작을 위해 동물사육이 필요하고, 항체 제작 기간도 장기간이 소요되며, 항체의 다량 확보가 곤란하여 필요한 때마다 새로 항체를 만들어야 하는 번거러움이 있다는 등의 여러 가지 문제점으로 인하여, ELISA법은 통상 사용할 수 있는 혈청학적 검사법으로 활용되지 못하고 있는 실정이다.
이에, 최근 특정의 DNA 서열을 신속하고 간단하게 증폭시킬 수 있는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 함)법이 개발되어 분자생물학 분야에 널리 이용되고 있는 바, 상술한 ELISA법이 지니는 문제점을 해소하기 위해 HPV의 검출에도 PCR을 적용하게 되었다(참조 : Monk B.J. et al., Diagn. Mol. Pathol., 3 : 283(1994); Zheng P.S. et al., Gynecol, Oncol., 53 : 179(1995)).
일반적으로, 임상시료로부터 병원성 미생물을 검출하기 위해서는 높은 검출 민감도 및 신뢰도를 제공하는 검출방법이 요구되는데, PCR을 이용한 검출시에도 이를 만족시키기 위해, 첫 번째 프라이이머쌍에 의해 증폭된 PCR 산물을 다시 새로운 두 번째 프라이머쌍에 의해 증푹시키는 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행한다. 따라서, HPV16 및 HPV18의 2종 바이러스 검출에도 상술한 네스티드 PCR을 적용하면, 1종의 바이러스당 2쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR이 요구되는 바, HPV16 및 HPV18의 동시 검출에는 총 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR이 수행되어야만 한다.
이러한 기술배경하에서, 본 발명자들은 자궁경부암을 유발시키는 HPV16 및 HPV18의 2종 바이러스를 동시에 간단히 검출하고자 예의 연구노력한 결과, 네스티드 PCR에 통상적으로 요구되는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 그 절차와 시간을 단축시켜, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 상기 HPV16 및 HPV18의 2종 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 특정 염기서열의 프라이머를 설계 및 합성하였고, 그 PCR 프라이머쌍을 HPV16 및 HPV18 표준 균주에 적용하여 PCR한 결과, HPV16 및 HPV18을 효과적으로 구분하여 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 HPV16 및 HPV18 2종의 바이러스를 동시에 간편하게 검출할 수 있는 PCR 프라이머쌍을 이용하여 HPV16 및 HPV18를 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
제1도는 본 발명의 PCR 프라이머를 이용한 HPV16 및 HPV18의 동시 검출과정을 나타내는 모식도이다.
제2도는 HPV 타잎별 염기서열 및 HPV16과 HPV18에 특징적인 각 DNA 단편의 증폭을 위한 1차 및 2차 프라이머 위치를 나타내는 그림이다.
제3도는 1차 및 2차 PCR에 의해 증폭된 HPV16 및 HPV18 특이 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 구제적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 임상시료로부터 HPV16 및 HPV18으 동시 검출을 위하여, HPV16 및 HPV18에 특징적인 각 DNA 단편을 동시에 간단히 네스티드 PCR에 의해 증폭시킬 수 있는 프라이머를 다음과 같이 설계하고, 합성한다. HPV16 및 HPV18 둘다의 DNA 단편을 증폭할 수 있도록, HPV의 타잎별 염시서열을 분석한 다음, HPV16 및 HPV18의 공통 염기서열부위(consensus region)를 토대로 하기와 같은 1차 PCR용 프라이머쌍 HP1/HP2를 설계 및 합성한다. 이어, HPV16 및 HPV18 각각에 특이적인 염기서열의 DNA 단편을 증폭하면서도 2차 PCR 산물의 크기가 서로 다르도록, 하기와 같은 2차 PCR용 프라이머 2쌍을 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182를 설계 및 합성한다.
HP1 : 5' - CCRYTGCTGYATGYSATAAATGT-3'
HP2 : 5' - CATTTTCGTYCTCGTCATCTGA-3'
상기에서, R은 A 또는 G;
Y는 C 또는 T; 및
S는 G 또는 C이다.
HPV161 : 5'-TCGATGTATGTCTTGTTGCAG-3'
HPV161 : 5'-GGTTACAATATTGTAATGGGC-3'
HPV181 : 5'-CAACATAGCTGGGCACTATAGA-3'
HPV181 : 5'-ACATACACAACATTGTGTGACG-3'
상술한 프라이버쌍을 이용한 네스티드 PCR에 의해 HPV16 및 HPV18의 특이 DNA 단면이 동시에 증폭되는지 알아보기 위하여, HPV16 및 HPV18 표준균주로부터 분리한 DNA에 프라이머쌍 HP1/HP2를 첨가하고, 1차 PCR한 다음, 이 반응액애 프라이머 2쌍을 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182를 동시에 첨가하여 2차 PCR하고, 아가로스 겔 전기영동한다. 그 결과, HPV16의 특이 PCR 산물인 225bp DNA 단편과 hpv18의 특이 PCR 산물인 295bp DNA 단편이 동시에 증폭됨을 알 수 있었다.
따라서, HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위해 본 발명의 프라이머쌍을 이용하면, 종래의 네스티드 PCR에서 요구되는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 수행하지 않고, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 동시 검출이 가능하므로, 그 절차와 시간을 대폭 단축시킬 수 있다.
결국, 사람의 혈액에서 수득한 DNA와 프라이머쌍 HP1.HP2을 이용하여 1차 PCR한 다음, 이 1차 PCR 반응액에 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181.HPV182을 동시에 첨가하여 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18를 동시에 효과적으로 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1 : HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위한 프라이머의 설계]
시료내에 미량 존재하는 HPV16 및 HPV18을 선택적으로 동시에 증폭시킬 수 있는 프라이머를 다음과 같은 과정에 의해 설계하였다 : HPV16 및 HPV18 둘다의 DNA 증폭을 1차 PCR 과정에서 수행하는데, 이때 사용되는 1쌍의 프라이머는 실험의 간편성을 위해 HPV16 및 HPV18의 공통 염기서열 부위를 토대로 설계하였다. 이어, HPV16 및 HPV18의 선택적 증폭을 2차 PCR 과정에서 수행하는데, 이때 사용되는 각쌍의 프라이머는 각각의 2차 PCR 산물의 크기가 서로 다르게 되도록 하고, HPV16 및 HPV18을 구분할 수 있는 특정 염기서열을 증폭하도록 설계하였다. 이와 같은 PCR 프라이머를 이용한 HPV16 및 HPV18의 동시 검출과정을 모식적으로 제1도에 나타내었다.
[실시예 2 : HPV16 및 HPV18 동시 검출용 프라이머의 합성
HPV16 및 HPV18을 동시에 검출할 수 있는 PCR 프라이머를 합성하기 위하여, 우선 현재까지 보고된 임상적 중요성을 갖는 HPV의 타잎별 염기서열을 분석하고, 다른 HPV 타잎과 구분되는 HPV16 및 HPV18의 공통 염기서열 부위를 조사한 다음(참조 : 제2도), 이를 토대로 하기와 같은 1차 PCR 프라이머쌍 HP1 및 HP2를 설계 및 합성하였다. 제2도에서, 서열 중간에 위치하는 (-)는 결실된 염기를 나타내고, (*)는 보존된 염기 (conserved base)를 나타내며, 그의 위치의 보존도가높은 염기를 나타내고, 박스는 HPV16 및 HPV18의 DNA 증폭에 이용되는 PCR 프라이머에 해당되는 부분을 나타낸다.
HP1 : 5'- CCRYTGCTGYAGYSATAAATGT-3'
HP2 : 5'- CATTTTCGTYCTCGTCATCTGA-3'
상기에서, R은 A 또는 G;
Y는 C 또는 T; 및
S는 G 또는 C이다.
아울러, 2차 PCR 프라이머는 HPV16 및 HPV18의 DNA 염기서열을 상호 비교하여, HPV16에만 특이적인 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 HPV161/ HPV162, HPV18에만 특이적인 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 HPV181/ HPV182를 설계 및 합성하였다.
HPV161 : 5'- TCGATGTATGTCTTGTTGCAG-3'
HPV162 : 5'- GGTTACAATATTGTAATGGGC-3'
HPV181 : 5'- CAACATAGCTGGGCACTATAGA-3'
HPV182 : 5'- ACATACACAACATTGTGTGACG-3'
[실시예 3 : HPV16 및 HPV18 표준균주로부터 DNA의 분리]
HPV16 및 HPV18 표준균주로부터 DNA를 분리하기 위하여, HPV16이 감염된 CaSki 세포주(ATCC CRL 1550) 및 HPV18이 감염된 HeLa 세포주(ATCC CCL 2) 각각을 6,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 수득한 다음, 100μ1의 SE용액(75mM NaCl 및 25mM EDTA로 구성된 용액)에 현탁시키고, 5μ1의 10% SDS 및 1μ1의 단백질가수분해효소 K(20㎎/ml)를 첨가하여 50℃에서 2시간 반응시켰다. 그런다음, 페놀/클로로포름에 의한 추출 및 알콜에 의한 DNA 침전과정을 거쳐, DNA를 수득하고 100μ1의 증류수에 현탁시켰다.
[실시예 4 : PCR에 의한 HPV16 및 HPV18의 특이 DNA 단편 증폭]
HPV16 및 HPV18에 특징적인 DNA 단편의 PCR에 의한 증폭을 알아보기 위하여, 실시예 3에서 분리한 HPV16/HPV18 DNA 함유용액 1μ1와 실시예 2에서 합성한 HP1/HP2 프라이머쌍을 혼합하고, 94℃에서 5분간 미리 변성(pre-denaturation)시킨다음, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초) 및 연장(extension, 72℃에서 1분)을 총 30회 진행시키는 1차 pcr을 수행하였다.
이어, 반응이 완결된 1차 PCR 반응액 1μ1와 HPV161/HPV162, HPV181/ HPV182 4종의 프라이머를 혼합하고, 94℃에서 5분간 미리 변성시킨 다음, 변성(94℃에서 30초), 결합(52℃에서 30초) 및 연장(72℃에서 1분)을 총 30회 진행시키는 2차 PCR을 수행하였다.
이렇게 제조된 2차 PCR 반응산물을 아가로스 겔상에서 분리한 결과, HPV16과 HPV18 DNA 혼합액을 사용하는 경우는 HPV16의 특이 PCR 산물인 225bp DNA 단편과 HPV18의 특이 PCR 산물인 295bp DNA 단편이 동시에 증폭되었으며(참조 : 제3도의 레인 5, 6 및 7); HPV18 DNA만을 사용한 경우는 HPV18의 특이 PCR 산물인 295bp DNA단편만이 증폭되었고(참조 제3도의 레인 8, 9 및 10); HPV16 DNA만을 사용한 경우는 HPV16의 특이 PCR 산물인 225bp DNA 단편만이 증폭되었음을(참조 제3도의 레인 11, 12 및 13) 확인하였다. 제3도에서, 레인 1은 DNA 크기(size) 마커이며, 레인 2, 3, 4는 증류수를 사용하여 PCR을 수행한 음성 대조군(negative control)의 실험결과이다.
따라서, HP1/HP2 프라이머쌍을 이용한 1차 PCR, HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182 프라이머 2쌍을 이용한 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18을 효과적으로 동시에 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위해 본 발명의 프라이머쌍을 이용하면, 종래의 네스티드 PCR에서 요구되는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 수행하지 않고, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 동시 검출이 가능하므로, 그 절차와 시간을 대폭 단축시킬 수 있다. 따라서, 사람의 혈청에서 수득한 DNA와 프라이머쌍 HP1/HP2을 이용하여 1차 PCR한 다음, 이 1차 PCR 반응액에 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182을 동시에 첨가하여 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18을 효과적으로 검출할 수 있다.
Claims (2)
- DNA와 하기와 같은 염기서열을 갖는 프라이머쌍을 HP1/HP2을 이용하여 1차 PCR(polymerase chain reaction)한 다음, 이 1차 PCR 반응액에 하기와 같은 염기서열을 갖는 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182을 동시에 첨가하여 2차 PCR하는 것을 특징으로 하는 HPV16 및 HPV18의 동시 검출방법 :HP1 : 5'- CCRYTGCTGYATGYSATAAATGT-3'HP2 : 5'- CATTTTCGTYCTCGTCATCTGA-3'상기에서,R은 A 또는 G;Y는 C 또는 T; 및,S는 G 또는 C이다.HPV161 : 5'- TCGATGTATGTCTTGTTGCAG-3'HPV162 : 5'- GGTTACAATATTGTAATGGGC-3'HPV181 : 5'- CAACATAGCTGGGCACTATAGA-3'HPV182 : 5'- ACATACACAACATTGTGTGACG-3'
- 제1항에 있어서, DNA는 사람의 혈액에서 수득되는 것을 특징으로 하는 HPV16 및 HPV18의 동시 검출방법.
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