KR100222419B1 - Ace 저해 펩타이드를 생산하는 락토바실러스 카제이 hy418 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유단백질인 카제인으로부터 안지오텐신전환효소(Angiotensin I Converting Enzyme : ACE) 저해활성을 갖는 펩타이드를 생산하는 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 새로운 유산균인 락토바실러스 카제이 HY418(기탁기관: 한국종균협회, 기탁일자: 1997. 5. 26. 수탁번호: KFCC-10971)에 관한 것이며, 또한 본 발명은 락토바실러스 카제이 HY418이 카제인으로부터 생산하는 ACE 저해활성이 있는 새로운 펩타이드에 관한 것이다. 락토바실러스 카제이 HY418은 기존의 유산균에 비해 카제인 유래의 ACE 저해 펩타이드를 생산하는 능력이 탁월한 유산균으로서, 이는 원유에서 분리하여 동정한 것이며, 균학적 특성으로 보아 락토바실러스 카제이의 새로운 균주이며, 카제인으로부터 ACE 저해활성을 갖는 새로운 펩타이드를 생산하는 것을 특징으로 하는 균주이다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이 HY418이 카제인으로부터 생산하는 ACE 저해 펩타이드를 분리하여 동정함으로써 ACE 저해활성을 갖는 새로운 펩타이드를 제공하는데, 새로운 펩타이드는 N-말단으로 시작하여 리신(Lys)-트레오닌(Thr)-트레오닌(Thr)-메티오닌(Met)-프롤린(Pro)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩타이드이다. 본 발명의 새로운 유산균과 그 대사산물인 새로운 펩타이드는 앞으로 의약품, 동물약품, 기능성 식품 등에 다양하게 이용될 수 있다.

Description

ACE 저해 펩타이드를 생산하는 락토바실러스 카제이 HY418
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 새로운 유산균인 락토바실러스 카제이 HY418(Lactobacillus casei HY418) (기타기관: 한국종균협회, 기탁일자: 1997. 5. 26. 수탁번호: KFCC-10971)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유단백질인 카제인으로부터 안지오텐신전환효소(Angiotensin I Converting Enzyme : ACE) 저해활성을 갖는 펩타이드를 생산함으로써 앞으로 의약품, 동물약품 및 기능성 식품 등의 제조에 광범위하게 활용될 수 있는 새로운 유산균에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이 HY418이 카제인으로부터 생산하는 ACE 저해효과가 있는 새로운 펩타이드에 관한 것이다.
성인병의 하나인 고협압의 치료를 위해 현재 많은 항고혈압제가 개발되어 사용되고 있으며, 현재 사용되고 있는 항고혈압제는 작용기전과 작용점에따라 이뇨제, 교감신경계 작용약물(
Figure kpo00002
2
Figure kpo00003
-아드레날린성 길항제), 혈관확장제, 칼슘통로차단제(calcium channel blockers), 안지오텐신전환효소저해제(ACE Inhibitor : 이하 ACE 저해제라 함) 등으로 분류된다.
안지오텐신전환효소(이하 ACE라 함)는 일종의 펩티딜디펩티다제(peptidyl dipeptidase)로서 이 효소는 가장 강력한 승압물질로 알려진 안지오텐신 II의 생성을 촉매하며, 동시에 가장 강력한 혈관확장물질인 브라디키닌(bradykinin)의 분해를 촉매한다. ACE에 의해 불활성인 안지오텐신 I의 C말단 히스티딘-류신(His-Leu)이 절단되어 생성된 약리적 활성물질인 안지오텐신 II는 강력한 혈관 수축작용으로 혈압을 상승시키며, 부신피질에서 알도스테론(Aldosterone)의 유리를 자극함으로써 나트륨을 보존시키는 작용을 하여 혈관내 용적을 증가시킨다. 또한 안지오텐신 II의 구조중 C-말단의 6개의 아미노산이 약리작용에 필수적인 대부분의 정보를 가지고 있다고 알려져 있다. 이러한 안지오텐신전환효소(ACE)의 활성을 저해하는 ACE 저해제는 일관성 있는 혈압 강하 효과를 나타내게 되므로, 원발성 고혈압환자를 포함한 고혈압치료를 위해 넓은 영역에 걸쳐 사용될 수 있다. 또한 ACE 저해제는 현저한 혈압강하 효과를 나타낼 뿐만아니라 내약성이 좋고, 다른 항고혈압제와 달리 장기간 사용에 따른 부작용이 적으며, 심장질환, 당뇨, 천식 등이 있는 고혈압 환자에게도 사용할 수 있어 항고혈압제로서의 유용성이 매우 높다.
따라서, 현재 ACE 저해제에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. 처음 소개된 ACE 저해제로는 테프로타이드(Teprotide)가 있었으나 이는 작용시간이 짧고 혈관주사를 해야한다는 단점이 있었으며, 이에따라 캡토프릴(Captopril)과 에날라프릴(Enalapril) 같은 경구적으로 유용한 ACE 저해제가 개발되어 현재 새롭고 강력한 항고혈압제로서 사용되고 있다.
한편, 화학적인 합성을 통한 유도체의 제조뿐만 아니라 식물(食物) 유래의 ACE 저해 펩타이드에 대해서도 많은 연구가 진행되어 왔다. 식물(食物) 유래의 ACE 저해 펩타이드로는 카제인의 트립신 가수분해물, 돼지혈청에서 얻은 펩타이드, 참치 내장소화 분해물의 펩타이드, 쌀로 만든 식초의 펩타이드, 청주 및 그 부산물 중 잔기 펩타이드 등이 발견되었으며, 또한 락토바실러스 헬베티커스 CP 790(L. helveticus CP790)의 세포외 단백분해 효소를 분리하여 유단백질을 가수분해함으로써 생성시킨 펩타이드도 연구되었다. 락토바실러스 헬베티커스 CP 790을 이용한 ACE 저해 펩타이드로는
Figure kpo00004
S1-카제인유래 펩타이드로서 "알라닌(Ala)-티로신(Tyr)-페닐알라닌(Phe)-티로신(Tyr)-프롤린(Pro)-글루타민산(Glu)"의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드,
Figure kpo00005
-카제인유래 펩타이드로서 "아르기닌(Arg)-아스파르틱에시드(Asp)-메티오닌(Met)-프롤린(Pro)-이소로이신(Ile)-글루타민(Gln)-알라닌(Ala)-페닐알라닌(Phe)"의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 등이 발견된 바 있다.
이에 본 발명자들은 여러지방에서 수집한 원유로부터 분리한 유산균이 유단백질로 부터 ACE 저해 펩타이드를 생산하는 능력이 기존의 유산균보다 탁월하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 ACE 저해활성을 갖는 펩타이드를 생산함으로써 의약품, 동물약품 및 기능성 식품 등의 제조에 광범위하게 활용될 수 있는, 새로운 유산균인 락토바실러스 카제이 HY418 (기탁기관: 한국종균협회, 기탁일자: 1997. 5. 26. 수탁번호: KFCC-10971)을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이 HY418이 유단백질로 부터 생산하는 ACE 저해활성이 있는 새로운 펩타이드를 제공하고자 한다.
제1도는 10% 환원탈지유 배지에서 배양시간에 따른 락토바실러스 카제이 HY418의 생육 및 pH 변화를 나타내는 그래프이다.
제2도는 배양시간에 따른 펩타이드의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
제3도는 배양시간에 따른 ACE 저해율의 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 카제이 HY418 (기탁기관: 한국종균협회, 기탁일자: 1997. 5. 26. 수탁번호: KFCC-10971)은 원유에서 분리하여 버기스 매뉴얼(Bergy's manual)에 따라 동정한 것으로서 카제인으로부터 ACE 저해활성이 있는 펩타이드를 생산하는 새로운 유산균이다.
락토바실러스 카제이 HY418의 분리는 원유 중의 균을 배양하는 제1단계, 유산생성균주를 분리하는 제2단계, 유단백질 분해력이 높은 균을 선발하는 제3단계 및 최종적으로 ACE 저해 펩타이드를 생산하는 균주를 선발하는 제4단계로 이루어진다. 이하 락토바실러스 카제이 HY418의 분리방법에 대해 단계별로 상세하게 설명한다.
(1) 제1단계
여러 지방에서 집유한 원유를 채취하여 생리식염수에 연속적으로 희석한 후 유산균 배양배지인 엠알에스(MRS) 평판 배지에 도말하여 37
Figure kpo00006
의 배양기에 24시간 배양한다.
(2) 제2단계
상기 제1단계의 배양결과 형성된 균의 집락을 단일균주별로 분리한 후, 유산생성여부를 확인하여 유산생성균주를 순수하게 분리한다.
유산생성 여부는 균주를 브로모크레졸 퍼플이 함유되어 있는 비씨피(BCP) 평판배지에 도말한 후 37
Figure kpo00007
의 배양기에서 24시간 배양하고 배양결과 유산의 생성으로 배지가 자주색에서 노란색으로 변하는 것으로 확인한다.
(3) 제3단계
상기 제2단계의 순수하게 분리된 유산생성균을 환원탈지유(10%) 배지에서 24시간 배양하고 배양액 중 펩타이드의 농도를 측정하여 유단백질 분해력이 높은 균들을 선발한다. 펩타이드의 농도는 오르토-프탈데히드(o-phthaldehyde(OPA)) 시약을 이용하여 분석하는 방법으로 측정한다.
(4) 제4단계
상기 제3단계에서 선발된 유단백질 분해력이 높은 균들을 환원탈지유(10%) 배지에서 24시간 배양한 후 원심분리하고 상층액을 취하여 조펩타이드의 ACE 저해활성을 측정한 후 가장 저해 활성이 높은 균주를 최종적으로 선발함으로써, ACE 저해 펩타이드를 생산하는 균주를 분리한다. ACE 저해활성은 공지의 방법 (Cushman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, 1977, Biochemistry 16: 5484.)을 이용하여 측정한다.
상기와 같은 방법으로 분리된 락토바실러스 카제이 HY418이 락토바실러스 속의 유산균임을 확인하기 위하여 버기스 매뉴얼(Bergey's manual)의 락토바실러스속 균주의 특성에 따라 현미경 검경, 그람염색, 카탈라아제 생성여부 등을 검사하며, 또한 균주의 동정을 위해 버기스 매뉴얼(Bergey's manual)에 따라 10
Figure kpo00008
와 45
Figure kpo00009
의 배양기에서 배양하여 성장여부를 측정하고, 탄수화물의 자화성 등을 측정한다. 이와같이 분리된 균주의 균학적 특성을 검사한 후 버기스 매뉴얼의 락토바실러스속 균주의 특성과 비교하여 분리된 균주가 락토바실러스 카제이의 새로운 균주임을 확인함으로써 분리된 균주를 동정한다.
락토바실러스 카제이 HY418의 균학적 특성은 다음과 같다.
(1) 균의 형태
엠알에스(MRS)한천 평판배지에서 37
Figure kpo00010
, 2일간 배양했을 때의 균의 형태
1) 세포의 크기 : 2.0∼3.0
Figure kpo00011
2) 세포의 형상 : 막대형
3) 운동성 : 없음
4) 포자형성능 : 없음
5) 그람(Gram) 염색 : 양성
(2) 집락의 형태
엠알에스(MRS) 한천 평판배지에서 37
Figure kpo00012
, 2일간 배양했을 때의 집락의 형태
1) 크기 : 1.5∼2.0mm
2) 형상 : 원형
3) 융기 : 볼록
4) 색조 : 유백색
5) 표면 : 원활
(3) 생리적 성질
1) 생육온도 : 생육온도범위 : 15~45
Figure kpo00013
최적온도 : 35~40
Figure kpo00014
2) 생육 pH : 생육 pH범위 : 4.0~9.5
최적 pH : 5.5~7.0
3) 산소의 영향 : 통성 혐기성
Figure kpo00015
Figure kpo00016
Figure kpo00017
Figure kpo00018
상기 균학적 특성, 즉 그람양성, 통성혐기성, 무포자성, 카탈라아제 음성이며, 현미경상에서 막대형의 간균이고, 포도당으로부터 기체가 형성되지 않는 점 등으로부터 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY418이 동종발효형(homofermentative) 락토바실러스속 유산균인 락토바실러스 카제이의 새로운 균주임을 알 수 있다. 또한 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY418은 아미그달린(amygdalin), 셀로비오스(cellobiose), 에스쿨린(esculine), 과당, 람노오스(rhamnose) 등을 이용하며, 멜리비오스(melibiose), 라피노오스(raffinose) 등은 이용하지 못한다는 점을 비롯하여 여러가지면에서 락토바실러스 카제이 람노수스(L. casei subsp. rhamnosus)와 유사하나, 전형적인 락토바실러스 카제이 람노수스(L. casei subsp. rhamnosus)가 대체로 이용하지 못하는 이노시톨(inositol)을 자화한다는 점에서 차이를 보인다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY418 균주를 환원탈지유(10%) 배지에서 배양시킨 배양액으로부터 얻어진 조펩타이드 시료는 기존의 유산균과 비교할 때 현저히 높은 ACE 저해율을 나타낸다.
보다 상세하게 설명하면, 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY418 균주를 환원탈지유(10%) 배지를 이용하여 배양한 후 배양액을 취하여 원심분리하고, 상등액을 취한 후, 유산균체와 입자가 큰 물질들을 제거하기 위한 막여과를 하고, 분자량 500 이하의 당, 유기산, 무기물 등의 저분자물질들을 제거하기 위한 한외여과를 한다. 이렇게 얻어진 조펩타이드 시료 50
Figure kpo00019
에 대해 공지의 방법 (Cushman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, 1977, Biochemistry 16: 5484.)으로 ACE 저해율을 측정할 경우 60%이상의 ACE 저해율을 나타내는데, 이는 기존의 유산균과 비교할 때 현저하게 높은 것이며, 이로써 락토바실러스 카제이 HY418이 ACE 저해 펩타이드를 생산하는 능력이 탁월하다는 것을 알 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY418은 기존의 균주와 균학적 성질이 다른 신균주이며, 카제인 유래의 ACE 저해 펩타이드를 생산하는 능력이 탁월한 유산균이다.
또한, 락토바실러스 카제이 HY418이 카제인으로부터 생산하는 ACE 저해활성이 있는 펩타이드는 다음과 같은 방법으로 분리하여 동정한다.
본 발명의 균주인 락토바실러스 카제이 HY418을 환원탈지유(10%)에서 배양한 후, 배양물을 취하여 원심분리를 하고, 상등액을 분리하여 동결건조 한 후, 동결건조된 시료에 대해 펩타이드를 분리하기 위한 역상 크로마토그래피를 수행하여 ACE 저해활성이 높은 분획을 분리한 후, ACE 저해율을 측정하기 위한 상기 조펩타이드 시료와 IC50을 비교하여 조펩타이드 시료 보다 ACE 저해활성이 높음을 확인한다. 여기서 IC50이란 50%의 ACE 저해율을 나타내는데 필요한 ACE 저해제의 농도를 말한다. ACE 저해율이 확인된 상기 분획에 대해 겔 크로마토그래피를 수행하여 단일 분획을 얻음으로써 ACE 저해 펩타이드를 분리하고, 자동 아미노산 배열 분석기를 이용하여 분석함으로써, ACE 저해활성이 있는 새로운 펩타이드의 아미노산 서열을 알 수 있다. 그 결과 밝혀진 락토바실러스 카제이 HY418이 카제인으로부터 생산하는 ACE 저해활성이 있는 펩타이드의 아미노산 서열은 N-말단으로 시작하여 리신(Lys)-트레오닌(Thr)-트레오닌(Thr)-메티오닌(Met)-프롤린(Pro)이다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 범위내에서 당업자에 의해 통상적인 변화가 가능함을 물론이다.
[실시예 1]
[락토바실러스 카제이 HY418의 분리 및 동정]
여러 지방에서 집유한 원유를 채취하여 생리식염수에 연속적으로 희석한 후 유산균 배양배지인 엠알에스(MRS) 평판배지에 도말하여 37
Figure kpo00020
의 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 결과 형성된 균의 집락으로부터 단일 균주별로 분리한 후, 유산의 생성 여부를 확인하기 위하여 브로모크레졸 퍼플이 함유되어 있는 비씨피(BCP) 평판배지에 도말하고 위와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양결과 유산의 생성으로 배지가 자주색에서 노랑색으로 변한 집락을 순수하게 분리하였다. 순수하게 분리된 유산생성균을 환원탈지유(10%) 배지에서 24시간 배양하고 배양액 중 펩타이드의 농도를 측정하여 유단백질 분해력이 높은 균들을 선발하였다. 펩타이드의 농도는 오르토-프탈데히드(o-phthaldehyde(OPA)) 시약을 이용하여 분석함으로써 측정하였다. 선발된 균들을 환원탈지유(10%) 배지에서 24시간 배양한 후 원심분리하고 상층액을 취하여 조펩타이드의 ACE 저해 활성을 측정하였다. 측정은 공지의 방법(Cushman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, 1977, Biochemistry 16: 5484.)을 이용하였으며, 이때 가장 저해활성이 높은 균주를 최종적으로 선발하였다. 선발된 균주가 락토바실러스 속의 유산균임을 확인하기 위하여 버기스 매뉴얼(Bergy's manual)의 락토바실러스 속 균주의 특성에 따라 현미경 검경, 그람염색, 카탈라아제 생성여부 등을 검사하였다. 또한 균주의 동정을 위해 버기스 매뉴얼(Bergy's manual)에 따라 10
Figure kpo00021
와 45
Figure kpo00022
의 배양기에서 배양하여 성장여부를 측정하였으며 탄수화물의 자화성을 측정하였다. 탄수화물의 자화성 측정은 엠알에스 배지중 육엑기스와 포도당을 제외하고 자화여부를 확인할 각각의 탄수화물을 1∼2% 첨가하여 실시하였으며, 지시약으로 클로로페놀레드를 0.05% 첨가하여 배지중 균의 성장에 따라 생성된 유산에 의해 지시약의 색깔이 자주색에서 황갈색으로 변한 것은 자화한 것으로 인정하였다. 이상과 같이 분리된 균주의 균학적 특성을 검사하여 버기스 매뉴얼의 락토바실러스 속 균주의 특성과 비교한 결과, 분리된 균주가 락토바실러스 카제이의 새로운 균주임을 확인할 수 있었다.
[실시예 2]
[균주의 생장특성]
(i) 산생성능력 및 균증식능력
본 발명의 락토바실러스 카제이 HY418을 환원탈지유(10%)에 1%(v/v) 접종하고 37
Figure kpo00023
의 배양기에서 배양하면서 4시간 간격으로 pH미터를 사용하여 48시간까지 pH를 측정함으로써 산생성능력을 확인하였으며, 또한 엠알에스 한천배지를 이용하여 배양중 생균수를 측정함으로써 균의 증식능력을 확인하였다(제1도 참조). 실험 결과 본 균주는 배양 16시간까지 급속도로 증식하다가 이후 증식속도가 낮아져 배양 24시간만에 최고 3.6
Figure kpo00024
109cfu/
Figure kpo00025
에 이른 후 서서히 생균수가 감소함을 알 수 있었다. 또한 본 균주는 배양 8시간부터 16시간 사이에 상대적으로 강한 유산생성능력을 보였으며, 배양 20시간 이후에는 pH의 저하가 미미한 것으로 보아 유산생성능력이 약화되었음을 알 수 있었다.
(ii) 유단백질 분해능력
상기 (i)의 배양과정중의 배양액 즉, 락토바실러스 카제이 HY418을 환원탈지유(10%)에 1%(v/v) 접종하고 37
Figure kpo00026
의 배양기에서 배양한 배양액을 일부 취하여 원심분리한 후 상등액 중의 유리 펩타이드 농도를 오르토-프탈데히드(o-phthaldehyde(OPA)) 시약을 이용하여 분석함으로써 본 균주의 유단백질 분해능력을 측정하였다(제2도 참조). 실험결과 배양액 중의 유리 펩타이드 농도는 배양후 8시간부터 24시간까지 급격히 증가하여 550
Figure kpo00027
/
Figure kpo00028
수준까지 도달한 후 증가율이 현저히 둔화되는 것으로 나타났다. 따라서, 실험결과에서 본 균주를 이용하여 다량의 펩타이드를 생산하기 위한 배양시간은 20시간부터 32시간까지임을 알 수 있었다.
[실시예 3]
[ACE 저해율의 측정 및 비교]
본 발명의 락토바실러스속 HY418 균주와 기존의 유산균의 ACE 저해율을 측정하여 비교하였다. 각 균주를 환원탈지유(10%) 배지를 이용하여 균주에 따라 37
Figure kpo00029
와 42
Figure kpo00030
의 배양기에서 24시간 배양한 후 배양액을 취하여 원심분리하였다. 이때 상등액을 취하여 유산균체와 입자가 큰 물질들을 제거하기 위한 0.45
Figure kpo00031
막여과를 하고, 분자량 500 이하의 당, 유기산, 무기물 등의 저분자물질들을 제거하기 위한 한외여과를 한 후, 이를 ACE 저해율을 측정하기 위한 조펩타이드 시료로 사용하였으며, ACE 저해율의 측정은 공지의 방법 (Cuslman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, 1977, Biochemistry 16: 5484.)을 이용하였다. 즉, 시료 50
Figure kpo00032
에 기질 용액(히푸릭에시드-히스티딘-류신 보레이트 완충액(Hip-His-Leu borate buffer): 3.8mM 히푸릭에시드-히스티딘-류신(Hip-His-Leu), 0.1M 보레이트(borate) 및 0.3M
염화나트륨: pH8.3)을 250
Figure kpo00033
가한 후 37
Figure kpo00034
에서 5분간 방치하였다. 여기에 ACE 2 milliunits를 가하고 다시 37
Figure kpo00035
에서 30분간 반응시킨 후, 1N 염화수소를 250
Figure kpo00036
가하여 반응을 정지시켰다. ACE 1 unit는 pH 8.3과 37
Figure kpo00037
의 조건에서 히푸릭에시드-히스티딘-류신으로부터 분당 1μM 히푸릭에시드(hippuric acid)를 생성하는 효소량이다. 공실험은 시료용액 대신 증류수 50
Figure kpo00038
를 사용하였으며 대조구는 염화 수소를 가한 후 효소액을 가하였다. 생성된 히푸릭에시드(hippuric acid)가 추출되도록 에틸아세테이트 1.5
Figure kpo00039
를 가하여 15초간 섞어주고 2800rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 1
Figure kpo00040
취하였다. 이 상등액에서 에틸아세테이트를 제거하고 증류수 1
Figure kpo00041
를 가하여 용해시킨 후 228nm에서 흡광도를 측정하여 다음식에 의하여 ACE 저해율을 산정하였다.
저해율 (%) = (가-나) / (가-다)
Figure kpo00042
100
가 = 시료대신 증류수 첨가시의 흡광도
나 = 시료 첨가시의 흡광도
다 = 반응정지 후 시료 첨가시의 흡광도
측정된 균주별 ACE 저해율을 아래의 표 1에 나타내었다.
Figure kpo00043
표 1에 기재된 바와같이 기존의 유산균의 ACE 저해율은 23∼29%로 나타났으나 본 발명의 균주인 락토바실러스 카제이 HY418은 이보다 월등히 높은 65%의 저해율을 나타내었다. 실험결과 배양과정중에 유단백질의 분해에 의해 생성되는 펩타이드가 ACE의 활성을 효과적으로 저해하는 물질임을 확인할 수 있었으며, 균주에 따라 ACE 저해율이 현저히 다르고, 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY418이 공지균에 비해 ACE 저해 펩타이드를 생산하는 능력이 탁월하다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 4]
[배양시간에 따른 ACE 저해율의 변화]
본 발명의 균주인 락토바실러스 카제이 HY418을 환원탈지유(10%)를 사용하여 37
Figure kpo00044
배양기에서 배양하면서 4시간 간격으로 배양액을 취하여, 상기 실시예 3과 같은 방법 즉, 공지의 방법 (Cushman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, 1977, Biochemistry 16: 5484.)으로 ACE 저해율을 측정하였다. 실험결과 배양 8시간부터 20시간까지 ACE 저해율이 급격히 증가하였으며, 이후 36시간까지 완만하게 증가하여 최고 69%의 ACE 저해율을 나타내었다. 이상의 결과에서 배양 20시간부터 32시간까지의 ACE 저해 펩타이드를 생산하기 위한 적합한 시간임을 확인할 수 있었다 (제3도 참조).
[실시예 5]
[안지오텐신 I-전환효소 저해물질의 동정]
본 발명의 균주인 락토바실러스 카제이 HY418을 환원탈지유(10%)에 1%(v/v) 접종한 뒤 37
Figure kpo00045
에서 24시간 동안 배양하였다. 배양물의 pH를 4.6으로 조정하여 8000rpm에서 10분간 원심분리하여 카제인을 분리
Figure kpo00046
제거한 후, 상등액을 모아 pH를 8.3으로 재조정한 뒤에, 상기 조건과 동일하게 원심분리한 후 상등액을 분리하여 동결건조하였다. 동결건조된 시료에 대해 펩타이드를 분리하기 위한 역상 크로마토그래피를 수행하여 ACE 저해활성이 높은 분획을 분리한 후, 이 분획을 상기 실시예 3에서 얻어진 조펩타이드 시료와 IC50을 비교하여 조펩타이드 보다 ACE 저해활성이 높음을 확인하였고, 그 결과를 아래의 표 2와 같다. 상기 분획에 대해 겔 크로마토그래피를 수행하여 단일분획을 얻고, 이를 자동 아미노산 배열 분석기(ABI protein sequencer Model 476A)를 이용하여 분석하였다. 분석결과, ACE 저해활성이 있는 펩타이드가 다섯 개의 아미노산으로 구성된 올리고펩타이드이며, 그 서열은 N-말단으로 시작하여 리신(Lys)-트레오닌(Thr)-트레오닌(Thr)-메티오닌(Met)-프롤린(Pro)임을 확인하였다.
Figure kpo00047
상기 실시예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이 HY418은 기존의 유산균에 비해 카제인으로부터 ACE 저해 펩타이드를 생산하는 능력이 탁월하며 따라서 의약품, 동물약품 및 기능성 식품 등의 제조에 광범위하게 활용될 수 있는 새로운 유산균이다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이 HY418이 카제인으로부터 생산하는 ACE 저해 펩타이드를 분리
Figure kpo00048
동정함으로써 식품유래의 ACE 저해활성이 있는 새로운 펩타이드를 제공하여 그 자체로서 광범위하게 이용될 수 있도록 하고 있다.

Claims (2)

  1. 그람양성, 통성혐기성, 무포자성, 카탈라아제 음성이며; 카제인으로부터 60% 이상의 ACE 저해율(Cushman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, 1977, Biochemistry 16: 5484.)을 나타내는 조펩타이드를 생산하며; 상기 조펩타이드에는 N-말단으로 시작하여 리신(Lys)-트레오닌(Thr)-트레오닌(Thr)-메티오닌(Met)-프롤린(Pro)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩타이드가 포함되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 카제이 HY418 (기탁기관: 한국종균협회, 기탁일자: 1997. 5. 26. 수탁번호: KFCC-10971).
  2. 락토바실러스 카제이 HY418 (기탁기관: 한국종균협회, 기탁일자: 1997. 5. 26. 수탁번호: KFCC-10971)이 카제인으로부터 생산되는 펩타이드로서, N-말단으로 시작하여 리신(Lys)-트레오닌(Thr)-트레오닌(Thr)-메티오닌(Met)-프롤린(Pro)의 아미노산 서열로 이루어지는 안지오텐신전환효소 저해 펩타이드.
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