KR100207935B1 - 견피브로인을 함유하는 인슐린 비의존형 당뇨병치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 견피브로인 펩티드 수용액의 혈당강하제로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 견피브로인을 가용화한 후 효소분해시켜 가소화물로 변형시킨 피브로인 펩티드 수용액을 혈당강하제로 이용한 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제에 관한 것이다.

Description

견피브로인을 함유하는 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제

본 발명은 견피브로인 펩티드 수용액의 혈당강하제로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 견피브로인을 가용화한 후 효소분해시켜 가소화물로 변형시킨 피브로인 펩티드 수용액을 혈당강하제로 이용한 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린 의존형(제1형)과 인슐린 비의존형(제2형)으로 구분된다.

제1형 당뇨병은 췌장의 베타(β)세포가 선택적으로 손상 또는 파괴되어 인슐린의 양이 부족하게 되며, 심한 고혈당증과 케톤산증, 다갈, 다음, 다뇨, 체중감소 및 피로감을 나타내며, 소아에서 흔히 발생하게 되므로, 이의 치료방법은 인슐린의 투여이다.

제2형 당뇨병은 유전적 감수성이 높으며, 성인에 많이 발생하나 그 원인은 다양하다. 이들 원인중 가장 많은 것은 환자들이 인슐린에 대하여 저항성을 나타낸다는 것이며, 당에 대한 인슐린의 작용부전으로 인하여 인슐린의 생산은 과다하나 과혈당 상태가 지속되는 것이 보통이다. 따라서 만성으로 경과되면 망막증, 신증, 신경장해, 동맥경화증, 감염증 및 골감소증 등의 합병증이 나타난다. 현재 제2형 당뇨병의 치료는 식이요법과 운동요법이 일반적이고, 심하면 혈당조절을 위하여 경구 혈당강하제를 투여한다.

최근에는 제2형 당뇨병 치료를 위하여 천연 추출물을 혈당강하제로 개발하려는 연구들이 진행되고 있다. 누에를 비롯하여 뽕잎, 뽕나무 뿌리는 각각 당뇨와 중풍에 효과가 있고, 누에와 누에똥은 당뇨에 효과가 있다는 것들이 고전의서에 전해지고 있어, 이에 관한 연구들이 성행되고 있다.

그러나 최근의 연구 결과에 의하면, 누에의 최종 산물인 견피브로인은 알코올대사의 촉진, 혈중 콜레스테롤의 조절에 관한 사항들은 보고되고 있으나, 당뇨병에 관한 전임상실험, 즉 동물실험에 관한 사항은 보고되어 있지 않다.

견섬유의 주성분인 견피브로인은 무색, 무미, 무취의 단백질로서, 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 티로신(tyrosine)등의 18가지의 아미노산으로 이루어지고, 회수율이 높으며 생체적 합성이 우수하여 견피브로인 펩티드 수용액의 제조법(소화 59-31520)이 확립된 후, 견섬유을 의류용으로 이용하는 이외에 섬유가공제, 화장품용, 건강식품, 의약재 및 바이오 소재로 이용하려는 새로운 발상에 근거하여 기능성 소재의 개발이 강조되고 있는 실정이다. 한편, 성급하게 발표되는 자료에 의하면, 「견피브로인은 인슐린 분비를 촉진한다」라고 기재하고 있어, 제1형 당뇨병 치료에 대한 가능성을 시사하고 있다. 그러나, 이러한 성급한 발표는 전임상실험 결과를 동반하지 않은 것으로, 노령화와 더불어 당뇨병이 날로 증가하고 있는 실정에서 보면 매우 위험한 일이다.

이에, 본 발명자들은 1992년부터 견피브로인(Silk Fibroin)의 겔(gel)화와 그 이용에 관한 연구를 진행시키는 동안, 구전에 의해 잠사 물질이 성인병에 이용되어 오고 있고, 실험적으로 견피브로인이 알코올 대사 촉진과 할당량을 감소시키는 효과가 연구된 사실에 기초하여, 자연 발생적으로 당뇨병이 일어난 마우스에 견피브로인 수용액을 투여하여 혈당강하 효과를 검색하게 되었으며, 제2형 당뇨병에 대한 내당능의 개선 효과를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 견피브로인 펩티드 수용액의 혈당강하제로서의 새로운 용도에 관하여 규명하는 것이며, 나아가서 인슐린 비의존형(제2형) 당뇨병 치료제를 개발하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 의하면, 견피브로인을 사용화한 후 효소분해시켜 가소화물로 변형시켜서 얻은 피브로인 펩티드 수용액을 혈당강하제로 이용한 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제를 제공한다. 견피브로인 수용액 중의 피브로인 농도는 2~20%(w/v)이다.

견피브로인의 활용에 있어서 무엇보다 우선되어야 하는 것은, 소화 흡수가 가능하도록 변형시키는 것이며, 이는 견피브로인이 본래 섬유상의 단백질로 불용성 고분자 화합물이기 때문이다. 따라서, 소화 흡수가 가능하도록 저분자의 가소화 수용액으로 변형시킬 필요가 있으며, 본 발명에서는 염화칼슘을 용매로 하여 정련견사를 용해한 다음, 탈염 농축한 후 단백질 분해 효소를 작용시켜 인체에 해가 없는 소화 흡수가 가능한 피브로인 수용액을 제조한다. 견피브로인 가수분해물을 얻기 위해 사용되는 단백질 분해효소는 그의 종류가 제한되어 있지 않으며, 공지된 것으로부터 당업자가 용이하게 그 종류와 양을 선정할 수 있다.

견피브로인 수용액을 얻을 수 있는 원료로는, 누에의 생체로부터 실샘(Silk Gland)을 적출하여 제조할 수 있지만, 본 실험에 있어서는 생사 제조가 불가능한 누에고치층과 생사 가공 공정에서 발생하는 피사(Waste Silk)를 정제하여 사용하는 것이 부가가치를 높일 수 있다고 생각되어 잠사·견직업계에서 폐기되는 각종 견사를 사용하였다.

이하, 본 발명의 기초가 되는 전임상 실험을 기재한다.

[참고예]

실험에 앞서, 견피브로인의 수용액을 얻는 방법을 보가 구체적으로 설명한다.

(1) 피브로인의 정체

견사로부터 색소, 지방질 및 기타 불순물을 추출 분리하고, 통상의 방법으로 정련처리하여 세리신을 제거하고 순수한 피브로인을 얻었다.

(2) 용해, 탈염, 농축

정제된 피브로인은 중성염액(염화칼슘(CaCl₂) : 물 : 에탄올 = 1 : 8 : 2, 몰비)을 사용하여 용해시켜 탈염, 농축시켰다.

① 가용화 조건

욕비 1:50

용해 온도 약 60℃

용해시간 약 60분

② 투석

피브로인 수용액을 투석막에 넣어 초기에는 흐르는 물에(72시간), 말기에는 증류수에(24시간) 투석하였다.

③ 농축

폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 이용하여 20%로 농축하였다.

(3) 가수분해

농축된 피브로인 수용액을 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin)을 작용시켜 저분자량의 펩티드로 가수분해시켰다.

[가수분해 조건과 피브로인의 평균 분자량]

·피브로인 수용액 : 1%의 암모니아수를 넣어 pH를 7.5로 조절하였다.

·효소 농도 : 견피브로인 중량에 대해 0.1%.

·반응 온도 및 시간 : 40℃에서 24시간.

·피브로인의 회수율 : 85~91%.

·피브로인의 평균 분자량 : 4,000~4,300

[실험예 1]

참고예에서 얻은 견피브로인 펩티드 수용액을 2%로 희석하여 4주~6주 동안 실험동물에 경구 투여하였다.

실험군은 다음과 같이 4개군으로 나누어 실험하였다.

인슐린 비의존형 당뇨병 모델 동물은 6주령의 C57BL/6J-ob/ob 마우스(이하 OB라 한다)를 사용하였으며, 정상군으로는 OB마우스의 동일 산자인 C57BL/6J-ob/+마우스(이하 LE라 한다)를 사용하였다.

OB마우스는 고혈당(150㎎/㎗)을 나타내는 개체를 선발하여 내당능(glucose tolerance)을 측정하였으며, 실험기간 동안 각 처리군당 5마리를 사용하였다. 이들 실험동물은 마우스 케이지(cage)에 넣어 인공조명 환경(22±2℃, 55±5%, 12L 12D)하에서 사육하였다.

1. 체중의 변화

하기 표에서 보는 바와 같이, LE군의 경우에는, 피브로인의 투여 여부와 투여전·후에 체중은 연령에 의한 변화 이외의 다른 변화를 관찰할 수 없었다. OB군의 경우에는 피브로인 투여 후에도 비투여군과 같이 체중이 증가하였다.

따라서, 피브로인의 투여는 체중에는 영향을 미치지는 않음을 확일할 수 있었다.

2. 혈당량의 변화

혈당치는 글루코스 옥시다제법(glucose oxidase method)에 의하여 측정하였다. 하기 표2에서 보는 바와 같이, 당뇨 증상이 없는 LE군의 혈당치는 피브로인의 투여 여부와 관계없이 혈당치의 변화는 관찰되지 않았다. OB군의 경우, 비투여군에서는 약 83%의 증가를 보인 반면, 피브로인 투여군에서는 실험 개시일의 163.0±23.8(㎎/㎗)에서 실험 종료일에는 121.5±18.7(㎎/㎗)로 유의성 있게 감소하였다.

또, 비투여군과 투여군에서의 실험 종료일의 혈당치는 통계적으로 유의성이 인정되었다.

특히, 피브로인 투여시에는 혈당치가 현저하게 감소하였다가 투여을 중단하게 되면 혈당치가 다시 상승하였으며(성적생략), 다시 투여하면 혈당치가 감소하여, 피브로인 투여에 의해 혈당치가 감소된다는 사실이 인정되었다.

3. 혈장 인슐린 농도의 변화

인슐린의 측정은 안와정맥총에서 채혈하고, 혈장을 분리하여 방사면역측정법(radioimmunnoassay)으로 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 보는 바와 같이, LE군에서는 피브로인 투여 여부에 관계없이 인슐린 양에는 유의성 있는 변화가 없었다. 그러나, OB군의 경우에는, 비투여군에서는 약 17%의 증가를 보인 반면, 피브로인 투여군에서는 실험 개시일의 159.2±46.2(μlu/㎖)에서 실험 종료일에는 52.5±22.7(μlu/㎖)로 감소하여, 피브로인 투여에 의해 혈당치 감소와 더불어 인슐린도 감소하는 결과를 얻었다.

4. 내당능의 변화

포도당 용액(LE군 : 20%, OB군 : 30%)을 체중 1kg당 2.5mg씩 복강내로 투여한 후, 시간 경과에 따른 혈당치를 측정함으로써 내당능을 판단하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 보는 바와 같이, LE군에서는 피브로인 투여 여부에 관계없이 정상적인 내당능을 나타내었지만, OB군의 경우에는, 비투여군에서는 341.4±36.0(㎎/㎗)에서 439±102.2(㎎/㎗)로서 내당능의 이상을 나타내었다. 한편, 피브로인 투여군에서는 혈당치가 121.5±18.7(㎎/㎗)에서 117±19.2(㎎/㎗)로 정상적으로 회복되었으며, 내당능이 매우 개선되었음을 확인할 수 있었다.

[실험예 2]

참고예에서 얻은 견피브로인 펩티드 수용액은 2%로 희석하여 4주~6주 동안 실험동물에 경구 투여하였다.

실험군은 다음과 같이 4개군으로 나누어 실험하였다.

인슐린 의존형 당뇨병 모델 동물(Non-obese diabetic)(이하 NOD라 한다)에 시클로포스파미드(cyclophosphamine; CY)를 체중 kg당 250mg씩을 복강에 주사하여 당뇨병을 유발한 6주령의 NOD마우스와 동시에 피셔(Fisher)-344랫드(이하, F-344라 한다)에 스트렙토조토신(streptozotocin; SZ)을 체중 kg당 45mg씩을 복강에 주사하여 췌장의 β-세포를 선택적으로 파괴시킨 6주령의 F-344를 사용하였다. 이 실험의 비교 정상군으로는 6주령의 ICR 마우스의 암컷을 사용하였다.

이들 실험동물은 마우스 케이지(cage)에 넣어 인공조명 환경(22±2℃, 55±5%, 12L 12D)하에서 사육하였다.

1. 체중의 변화

상기 표 5에서 보는 바와 같이, ICR의 피브로인 비투여군과 투여군의 체중은 통계적으로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 그리고 NOD마우스의 경우는 비투여군과 투여군에서 각각 개시일 보다는 실험 중료일에서 체중의 감소 현상이 인정되기는 하지만, 통계적으로 유의성의 차이는 없었다. F-344랫드의 경우도 각군에서 실험 개시일과 종료일에는 감소현상을 보이지만 통계적으로는 유의성있는 차이는 나타나지 않았다

이와 같이, NOD군과 F-344군에서는 피브로인 투여 여부와 관계없이 체중이 감소하였으며, 제1형 당뇨 증상을 완화시키지 못하였다.

2. 혈당량의 변화

혈당치는 글루코스 옥시다제법(glucose oxidase method)에 의하여 측정하였다. 그 결과는 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에서 보는 바와 같이, ICR군에서는 피브로인의 투여와는 관계없이 혈당량에 큰 변화를 찾아볼 수 없었다. 그러나 NOD 마우스와 F-344랫드의 경우에는 피브로인 비투여군과 투여군은 고혈당 상태가 증가하는 것으로 미루어 혈당 강하 효과가 없는 것으로 생각된다.

Claims (2)

1. pH 7.5로 조절한 견피브로인 수용액과 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin)을 처리하여 얻은 평균분자량 4,000~4,300인 피브로인 펩티드 수용액을 유효성분으로 함유하는 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제.
2. 제1항에 있어서, 피브로인 펩티드 수용액 중의 피브로인 농도는 2~20%임을 특징으로 하는 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제.