KR100189199B1 - 이원상고농도세포배양을활용한천연인디루빈(indirubin)의_생산방법. - Google Patents

Abstract

본 발명은 이원상 고농도 세포 배양을 활용한 천연 인디루빈(indirubin)의 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하기로는 쪽(Polygonum tinctorium)세포를 여과형 분리기가 설치된 생물반응기에서 고농도 배양하면서 이원상 물질을 활용하여 천연 인디루빈을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

이원상 고농도 세포 배양을 활용한 천연 인디루빈(indirubin)의 생산방법

본 발명은 이원상 고농도 세포 배양을 활용한 천연 인디루빈(indirubin)의 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하기로는 쪽(Polygonum tinctorium)세포를 여과형 분리기가 설치된 생물반응기에서 고농도 배양하면서 이원상 물질을 활용하여 천연 인디루빈을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근들어 식물세포에 의한 천연물의 생산에 관한 연구가 활발히 진행되고 있고, 특히 쪽세포 배양에 의한 천연색소를 생산하고자 하는 연구가 다각적으로 이루어지고 있다.

쪽은 마디풀과(polygonaceae)에 속하는 일년초로서 인디루빈을 비롯하여 16 ~ 18가지의 천연색소를 가지고 있고, 이들 색소는 고급직물의 염료로 오래전부터 사용되어 왔다.

쪽세포로부터 분리된 여러 색소성분중에서 인디루빈은 해독 강장 해열 작용이 우수하다하여 민간에서 약용으로 이용되어 왔으며, 항암효과도 가지고 있는 것으로 보고되어 있다(Rui Han, 1994, Highlight on the studies of anticancer drugs derived from plants in China, Stem Cells 12, 53 ~ 63). 인디루빈은 식물뿐만 아니라 미생물 그리고 사람의 오줌에서도 그 존재가 밝혀졌으나, 그 함량이 극소량이므로 대량생산에 적용하기에는 바람직하지 못하다.

식물세포 특히 쪽세포는 인돌을 인디루빈으로 전환할 수 있으므로 쪽세포로부터 인디루빈의 생산에 관한 연구가 일부 진척되어 있다. 그러나, 식물세포의 낮은 생산성 및 수율 등을 향상시키고 인디루빈의 산업화를 위한 대량생산에 관한 연구가 진행됨이 바람직하다.

본 발명에서는 종래에 연구되어온 성장배지의 최적화 자료를 기초로하여 인디루빈의 대량생산을 위한 공정 운영에 관해 연구하였다. 그 결과 여과형 분리기를 이용한 고농도 배양이 효과적임을 알게되었고, 또한 고농도 배양과 함께 고체 실리콘을 이원상 흡착제로 사용하여 인디루빈의 회수율 및 순도를 높이고, 배지에 또다른 이원상 흡착제인 액체 실리콘을 함유시켜 인디루빈의 생상성을 더욱 향상시킬 수 있음을 알게됨으로써 본 발명을 완성하였다.

도1은 본 발명에서 이용하고 있는 여과형 분리기를 개략적으로 도시한 것이다.

도2는 본 발명에 따른 여과형 분리기가 설치된 고체 이원상 고농도 배양기를 개략적으로 도시한 것이다.

도3은 흡착제 종류에 따른 인디루빈 흡착정도를 비교한 사진이다.

도4는 액체 실리콘 첨가에 따른 세포 성장율 및 인디루빈 생산성의 향상 효과를 나타낸 것이다.

도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 생물반응기2a : 배지유입관

2b, 4c : 배지배출관3 : 인돌유입관

4a : 체(mesh)4b : 지지관

5 : 배지순환관6 : 인디루빈 회수조

7 : 공기주입구

본 발명은 쪽(Polygonum tinctorium)세포로부터 천연 인디루빈을 생산하는 방법에 있어서, 여과형 분리기가 장착된 생물반응기에서 쪽세포를 고농도 이원상 배양하고, 여기에 인돌을 유입하여 인디루빈으로 전환시키는 천연 인디루빈의 생산방법을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 생산방법에서 인돌 첨가후 액체 실리콘 또는 고체 실리콘을 첨가하여 생산성 및 순도를 향상시키는 천연 인디루빈의 생산방법을 포함한다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 쪽세포로부터의 인디루빈의 생성을 극대화하기 위해 고농도 배양을 채택하고, 또한 인디루빈의 순도를 높이기 위해 고체 실리콘, 액체 실리콘을 사용하는 이원상 배양법을 병행한다.

본 발명에서 이용하고 있는 쪽세포는 쪽의 잎으로부터 유합조직(callus)을 유기하여 확립한 세포주이며, 이는 현탁배양하여 사용한다. 현탁배양시 기본 배지로는 2,4-디클로로페녹시아세트산 2 ㎎/ℓ, 슈크로스 30 g/ℓ, 그리고 이스트 추출물 1 g/ℓ를 첨가시킨 B5(Gamborg Miller, 1968) 배지를 사용한다.

첨부한 도1은 본 발명에서 이용하고 있는 여과형 분리기를 개략적으로 도시한 것으로서, 이는 세포와 배양액을 분리하는 체(mesh; 4a), 체를 지지하는 지지관(4b), 그리고 배지의 유출을 유도하는 배지배출관(4c)으로 구성되어 있다. 여과형 분리기는 항상 배양액 수위를 유지하기 때문에 배출속도에는 크게 제약을 받지 않는다. 다만 체(4a)의 사이즈가 중요한데 대체로 100 ~ 500 메쉬(mesh)가 적당하다. 체의 사이즈가 100 메쉬 미만이면 세포와 배양액의 분리가 제대로 되지 않아 세포가 생물반응기내에서 재순환이 되지 않으며, 500 메쉬를 초과하면 배양액이 지지관(4b)안으로 자유로이 유입되지 않는 문제가 있다.

도2는 여과형 분리기가 설치된 고체 이원상 고농도 배양기이다. 도1과 도2는 각각 본 발명에서 새롭게 개발한 장치이다.

본 발명에 따른 천연 인디루빈의 생산방법은

가) 생물반응기(1)내로 배지관(2a, 2b)을 통하여 계속적으로 배지를 공급 및 배출하면서 고농도 배양조건으로 쪽세포를 배양하는 과정;

나) 고농도 세포에서 배지공급 및 배출을 중단하고, 인돌유입관(3)을 통하여 인돌을 투입하는 과정; 그리고

다) 이원상 배양을 적용하여 쪽세포로부터 인디루빈을 회수하는 과정

으로 이루어져 있다.

본 발명에 따른 고농도 배양법을 첨부한 도2를 중심으로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

생물반응기(1)에는 여과형 분리기가 장착되어 있어 세포와 배양액의 분리가 가능하고, 쪽세포의 고농도 유지가 가능하다.

고농도 배양을 위해 배지유입관(2a)을 통하여 배지를 계속 유입하고, 배지배출관(2b)은 여과형 분리기를 통과하도록하여 생물반응기(1) 밖으로 배출되는 배지중에는 세포가 함께 배출되는 것을 방지한다. 이때 배지의 공급속도는 0.2 ~ 0.3 day-1 로 유지하며, 온도는 26.5 ~ 27 ℃을 유지하고, 멸균전 초기 배지 pH는 5.7로 한다.

쪽세포가 고농도를 유지하게 되면 배지공급 및 배출을 중단하고 인돌유입관(3)을 통하여 인돌을 투입한다. 이에 쪽세포내에서는 인돌이 인디루빈으로 전환되고, 인디루빈의 농도가 어느 정도 증가하게되면 세포밖으로 유출하여 배양액중에 함유된다. 전구물질로 사용된 인돌은 15 ~ 30 mM 범위에서 사용하는 것이 바람직한데, 그 사용량이 상기 범위를 벗어나면 인디루빈의 생성율이 저하되는 문제가 있다.

또한 본 발명에서는 상기에서 설명한 고농도 배양기와 함께 고체 실리콘, 액체 실리콘을 이원상 흡착제로서 투입하여 쪽세포내에 저장되어 있는 인디루빈을 효과적으로 회수하는 고농도 이원상 배양법을 포함한다. 따라서, 인디루빈을 함유하고 있는 배양액은 여과형 분리기내의 배지배출관을 통하여 생물반응기의 외부에 설치되어 있는 인디루빈 회수조로 이송한다. 그리고 배지순환관을 통하여 인디루빈이 제거된 배지를 생물반응기로 재순환한다.

이때 인디루빈 회수조에는 고체 실리콘과 B5배지가 담겨져 있어 이송된 배양액내의 인디루빈이 고체 실리콘에 흡착되도록 한다. 배양액내의 인디루빈의 함량이 감소됨에 따라 쪽세포내에 저장된 인디루빈은 계속적으로 세포밖으로 유출된다. 즉, 쪽세포밖의 인디루빈 농도를 감소시키고 이로써 쪽세포 밖으로 유출되는 인디루빈의 양이 계속적으로 증가됨으로써 생산성은 크게 향상된다.

본 발명에서 인디루빈의 흡착제로 사용하는 고체 실리콘은 인디루빈에 대한 특이한 흡착능을 가지고 있어 일반적으로 사용되는 XAD 흡착제를 사용한 경우와 비교하여 고순도로 인디루빈을 회수하게된다. 이에 대해서는 표1과 도3에 의해 쉽게 알 수 있다. 표1은 흡착제로서 고체 실리콘 또는 XAD를 사용했을 때 회수된 인디루빈의 순도를 비교하기 위한 것이다. 고체 실리콘에 흡착된 인디루빈은 λmax가 534 ~ 539.5 ㎚로서 순수한 인디루빈이 가지는 λmax값 539.5 ㎚와 일치하는데 반하여, XAD에 흡착된 인디루빈은 514.5 ~ 521 ㎚으로서 인디루빈 이외에도 기타 불순물이 흡착되어 있음을 알 수 있다.

[표 1]

본 발명에서 흡착제로 사용되는 고체 실리콘의 크기 및 함량에 따라 인디루빈의 회수율 및 순도는 변화될 수 있는 바, 2~5×2~5×2~5 ㎣ 크기의 입방체를 사용하는 것이 바람직하고, 그 사용량은 전체 배양액에 대하여 1 ~ 2.5%(W/V) 범위가 바람직하다.

상기와 같은 배양법에 의해서도 인디루빈의 생산성 및 순도는 크게 향상되나, 보다 바람직하기로는 세포로부터 인디루빈의 효율적인 유출을 유도하기 위해 생물반응기(1)내에 고체 실리콘을 첨가하는 것이 바람직하다. 그러나 생물반응기(1)내에 고체 실리콘을 직접 첨가하는 경우, 고체 실리콘과 쪽세포의 충돌로 인하여 세포가 파괴되고 또 그 생장이 억제되는 것을 방지하는 것이 중요하다. 이에 본 발명에서는 액체 실리콘을 배지에 함유시켜 충돌에 의한 세포 손상을 완화하여 세포생장과 인디루빈 생산에 유리한 작용을 하도록 하였다.

액체 실리콘은 인돌이 첨가된 후 곧바로 투입하는 것이 바람직하다. 액체 실리콘은 전체 배양액 부피에 대하여 20 ~ 90% 범위내에서 투입하고, 바람직하기로는 30 ~ 70% 범위내에서 투입하는 것이 가장 효과적이다. 본 발명에서는 점도가 5 ~ 100 C.S(centistockes) 범위의 액체 실리콘인 디메틸폴리실록산을 사용하는 것이다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명에서는 고농도 배양을 채택하여 쪽세포로부터의 인디루빈의 생성을 극대화하고, 또한 이원상 물질로서 고체 실리콘, 액체 실리콘을 사용하여 인디루빈의 생산성 향상과 함께 효율적인 분리효과를 얻고 있다.

이와같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 고체 이원상 고농도 배양

2,4-디클로로페녹시아세트산 2 ㎎/ℓ, 슈크로스 30 g/ℓ와 이스트 추출물 1 g/ℓ를 첨가시킨 B5(Gamborg Miller, 1968) 배지를 기본 배지로하여 쪽세포를 현탁 배양하였다.

도2에 도시한 고농도 배양기를 사용하였다. 생물반응기(1)의 하단부에는 공기주입구(7)가 있어 생물반응기내에서 배지가 계속 순환하도록 하였다. 흡착제로서 3×3×3 ㎣의 고체 실리콘(고려 에이스)을 생물반응기 외부에 별도로 설치되어 있는 인디루빈 회수조(6)에 첨가하였으며, 그 양은 배양액에 대하여 2.5%이었다.

배지를 배지유입관(2a)을 통하여 계속 주입하고, 배지배출관(2b)은 여과형 분리기내의 체(mesh, 4a; 200메쉬)를 통과하고 배지배출관(2b)를 통해 생물반응기 밖으로 배출되도록 하였다. 이때 B5배지의 공급속도는 0.29 day-1 이었고, 생물반응기(1) 내부의 온도는 26±5 ℃를 유지되도록 하였고, 멸균전 초기 배지의 pH는 5.7로 하였다.

세포의 농도가 50%(PCV, %V/V)이상이되면, 배지관(2a, 2b)을 차단하고, 인돌유입관(3)을 통하여 인돌 20 mM을 투입하였다. 쪽세포로부터 인디루빈이 생성되기 시작하면 여과형 분리기를 이용하여 쪽세포와 분리된 배양액만을 배지배출관(4c)과 배지순환관(5)을 통하여 고체 실리콘이 있는 인디루빈 회수조(6)를 순환하게하여 인디루빈이 고체 실리콘에 흡착되도록 하였다.

인디루빈의 회수방법은 인돌 첨가 14일 후, 세포 배양액은 여과지(whatman paper #2)를 이용하여 세포와 배양액을 분리하였다. 분리된 세포를 건조하고 세포배양액과 동일량의 클로로포름에 침지하여 냉암소에서 48시간 보관한 뒤, UV흡광기기를 이용하여 534 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포외의 인디루빈은 세포를 여과한 배양액과 동일부피의 클로로포름을 첨가하여 5분간 격렬하게 교반시킨 다음, 48시간동안 방치한 후 원심분리하여 인디루빈을 회수하였다.

고체 실리콘에 흡착된 인디루빈은 여과지(whatman paper #2)를 이용하여 실리콘을 분리회수한 다음, 증류수로 3회이상 씻어준 후 건조하고 조업용량과 동일한 부피의 클로로포름에 침지시켜 인디루빈을 회수하였다.

실시예 2 : 액체 이원상 고농도 배양

생물반응기(1)의 하단부에는 공기유입구(7)가 있어 반응기내에서 배지가 계속 순환하도록 하였다.

배지는 배지유입관(2a)을 통하여 계속 유입한 후 200 메쉬의 체(4a)를 통과하여 배지배출관에서 생물반응기 밖으로 배출되도록 하였다. 이때 B5배지의 공급속도는 0.29 day-1 이었다.

세포농도가 50% 이상이되면, 배지관(2a, 2b)을 차단하고, 인돌유입관(3)을 통하여 인돌 20 mM 및 50%(V/V)에 해당하는 디메틸폴리실록산(DMPS, 시그마사, 20 centistockes)을 투입하였다. 기타 배양조건은 상기 실시예1과 동일한 조건하에서 수행하였다.

인돌 첨가 14일 이후부터 생물반응기(1)내에서 세포와 배양액, 그리고 액체 실리콘에 흡착된 인디루빈을 회수하였다.

세포내의 인디루빈과 배양액내의 인디루빈 회수과정은 상기 실시예1과 동일하였다.

엑체 실리콘에 흡착된 인디루빈은 원심분리하여 세포배양액과 액체 실리콘을 분리한 후, 충분한 에탄올로 48시간 추출한 다음 감압증발하고 다시 조업 용량과 동일한 부피의 클로로포름에 녹인 후, 흡광도를 측정하였다.

실험예 1:

쪽세포를 배양함에 있어서, 본 발명의 고체 이원상 고농도 배양법, 액체 이원상 고농도 배양법, 그리고 종래의 유가식 배양법(정인식 등, Biotechnology Letters)을 각각 채택하였다. 인돌 첨가하고 14일, 21일 경과 후 인디루빈의 생성량을 측정하여 다음 표 2에 나타내었다.

[표 2]

본 발명에 따른 고농도 이원상 배양법에 의해 인디루빈을 생산한 경우 종래의 유가식 배양법에 비교하여 생산량이 현저하게 증가하였다.

실시예 1과 실시예 2는 세포내에서 생성된 인디루빈을 세포 밖으로 유도하기 위해 고체 또는 액체 실리콘(DMPS)을 첨가하여 고농도 이원상 배양한 경우로서, 종래의 유가식 배양법 보다 각각 121, 166% 향상된 생산성을 가진다.

실험예 2: 흡착제에 따른 인디루빈 흡수도 비교

흡착제의 인디루빈 흡수도를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

B5배지(50 ㎖)에 고체 실리콘과 XAD-2, XAD-4, XAD-7(Sigma)을 각각 1.0%(g/㎖)씩 넣고, 정제되지 않은 인디루빈 추출물을 에탄올에 녹인 후 동일하게 첨가하였다. 14일 후 이들 흡착제를 회수한 다음 흡광도를 측정하였다.

표1에 의하면, 고체 실리콘의 흡광도가 0.256으로 낮았지만 λmax는 534 ~ 539.5 ㎚로 정제된 인디루빈의 λmax와 거의 동일하였다. 그리고 도3에 나타낸 바와 같이 고체 실리콘에 흡착된 인디루빈은 투명한 분홍색을 띄는데 반하여, XAD에 흡착된 인디루빈은 진한 자주색을 띄는데 이는 인디루빈외에 다른 불순물이 많이 함유되어 있기 때문이다. 이로써 고체 실리콘은 인디루빈을 특이적으로 흡착하는 성질을 가지고 있음을 알 수 있다.

또한, 고체 실리콘 또는 XAD에 흡착된 색소들을 TLC 플레이트(silica gel 60 F254, Merck)을 이용하여 전개하였다. 고체 실리콘에 흡착된 색소는 비교적 단순한 띠(band)를 형성하였다.

따라서 고체 실리콘을 흡착제로 사용하므로써 인디루빈의 1차적인 분리가 가능함을 알 수 있으며, 이는 인디루빈 순수분리를 위한 여러 공정을 생략할 수 있고 분리 정제에 대한 경비를 삭감하는 효과를 가진다.

실험예 3: 액체 실리콘의 유입 효과

쪽세포로부터 인디루빈의 생산시 세포와 고체 실리콘의 충돌로 인한 세포파괴를 억제하고 세포성장을 향상시키는 효과를 얻기 위해 액체 실리콘을 첨가 하였다. 도4에 의하면 액체 실리콘을 첨가한 배양액에서 세포의 농도(PCV)가 높았고, 또한 인디루빈의 생산성이 향상되었다.

본 발명에 따른 인디루빈 생산방법은 그 생산성 및 순도가 높아 염료 또는 항암제를 비롯한 의약품의 대량 생산에 특히 유용하다.

Claims (9)

1. 쪽(Polygonum tinctorium)세포로부터 천연 인디루빈을 생산하는 방법에 있어서,

   여과형 분리기가 장착된 생물반응기에서 쪽세포를 고농도 이원상 배양하고, 여기에 인돌을 유입하여 인디루빈으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 고농도 배양은 생물반응기에 배지를 공급하고 배출시 여과형 분리기를 통과시키는 과정을 계속적으로 반복하여 쪽세포의 농도를 고농도로 유지시키면서 배양하는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 여과형 분리기는 세포와 배양액을 분리하는 100 ~ 500 메쉬의 체(4mesh; a), 체를 지지하는 지지관(4b), 그리고 배지의 유출을 유도하는 배지배출관(4c)으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 인돌은 15 ~ 30 mM 범위에서 유입하는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 인돌 유입 후 곧바로 액체 실리콘을 유입하는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 액체 실리콘으로는 점도 5 ~ 100 C.S(centistockes) 범위의 디메틸폴리실록산을 사용하는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 액체 실리콘은 전체 배양액에 대하여 20 ~ 90%(V/V) 범위내에서 유입하는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 생성된 인디루빈은 고체 실리콘을 사용하여 분리 및 회수하는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 고체 실리콘으로는 2~5×2~5×2~5 ㎣ 크기의 것을 전체 배양액에 대하여 1 ~ 2.5%(W/V) 범위내에서 사용하는 것을 특징으로 하는 천연 인디루빈의 생산방법.