KR0177298B1

KR0177298B1 - B형 간염 표면항원을 생산하는 재조합 효모의 배양 방법

Info

Publication number: KR0177298B1
Application number: KR1019960000488A
Authority: KR
Inventors: 김세훈; 한규범; 박은숙
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1996-01-12
Filing date: 1996-01-12
Publication date: 1999-04-01
Also published as: KR970059270A

Abstract

본 발명은 재조합 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 B형 간염 바이러스의 전표면항원(preS2+S Ag) 및/또는 표면항원(S Ag)의 단위세포당 발현량을 증가시킬 수 있는 배양방법에 관한 것으로, B형 간염 바이러스 표면항원을 발현할 수 있는 재조합 효모를 배양하여 B형 간염 바이러스 표면항원을 생산하는 데 있어서, 아미노산이 보강된 기본 YPD 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 배양 방법에 의하면, 아미노산을 바람직하게는 30 내지 150% 보강하는 것에 의하여 발현량을 1.2 배 정도 증가시킬 수 있다.

Description

B형 간염 표면항원을 생산하는 재조합 효모의 배양 방법

제1도는 기본 YPD 배지에서 D(포도당) 양을 일정하게 하고 YP(효모 추출물과 효모펩톤)양을 변화시키면서 재조합 효모를 배양할때, 단위세포당 B형 간염 표면항원의 발현량을 비교한 그래프이다.

제2도는 기본 YPD 배지에 아미노산, 비타민, 미네랄 또는 무기염류를 보강한 배지에서 재조합 효모를 배양할 때, 단위세포당 B형 간염 표면항원의 발현량을 비교한 그래프이다.

본 발명은 재조합 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 B형 간염 바이러스의 전표면항원(preS2+S Ag) 및/또는 표면항원(S Ag)의 단위세포당 발현량을 증가시킬 수 있는 배양방법에 관한 것이다.

재조합 미생물을 이용하여 외래 단백질을 발현시킬 때 발현율에 영향을 미치는 인자들로는 발현 벡터, 프로모터, 숙주 세포, 플라스미드 복제 효율(plasmid copy number), 배양조건(pH, 온도, 용존 산소 농도, 배지 성분) 및 배양방법(회분식, 유가 회분식, 연속식 등)등을 들 수 있다. 이러한 각 인자들의 차이에 따라 발현율이 좌우되며, 각 인자들간에도 상호 관련성이 중요하게 작용하는데, 숙주 세포와 발현벡터의 종류가 정해진 경우에는 배양조건과 배양방법을 적절히 조절하는 것이 외래 단백질의 생산성 향상에 매우 중요하다.

이와 같이 재조합 미생물을 이용하여 목적하는 외래 단백질을 높은 수율로 얻기 위해 세포의 고농도 배양을 목적으로 하는 여러가지 방법들이 알려져 있다(Bitter et al., J. Med. Virol., 25, 123-140(1988) 및 Fieschko et al., Biotechnology and Bioengineering, 29, 1113-1121(1987)). 예를 들어, 본 발명자에 의한 과량 기질 공급식 유가 배양방법(대한민국 특허출원 제93-29980호)은 B형 간염 표면항원을 생산하는 재조합 효모의 배양방법에 관한 것이다.

재조합 효모를 이용하여 B형 간염 표면항원의 발현량을 증가시키기 위한 방법의 일환으로, 카티 등(C. E. Carty et al., Journal of Industrial Microbiology, 2, 117-121(1987))이 최소 선택배지(selective media)와 복합배지(complex media)를 사용한 배양효과를 비교한 결과, 선택배지보다 복합배지를 사용하였을 때 B형 간염 표면항원의 생산성을 수배 이상 증가시킬 수 있었으며, 슐만 등(Cheryl A. Schulman et al., Journal of Biotechnology, 21, 109-126(1991))도 preS2+S Ag 생산에 대하여 유사한 보고를 한 바 있다.

이에 본 발명자 들은 복합배지의 구성성분을 구체적으로 분석하고 각각의 영향을 조사한 결과, 질소원인 효모 추출물 또는 효모 펩톤이 보강될 수록 단위세포당 생산성이 증가된다는 것을 발견하였으며, 이러한 결과를 토대로 하여 보강된 배지중에서 특히 아미노산에 의한 효과가 크게 작용하고 있음을 밝혀 내어 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 재조합 효모를 배양하여 B형 간염 표면항원을 생산하는데 있어서, 단위세포당 생산성을 증가시키기 위한 재조합 효모의 개선된 배양방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 배양방법은, B형 간염 바이러스 표면항원을 발현할 수 있는 재조합 효모를 배양하여 B형 간염 바이러스 표면항원을 생산하는 데 있어서, 아미노산이 보강된 기본 YPD 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

상기 B형 간염 표면항원에는 전표면항원(preS2+S ag) 및 표면항원(S Ag)의 적어도 하나가 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, B형 간염 표면항원을 생산하는 재조합 효모를 배양하는데 사용되는 기본 YPD 배지는 효모 추출물 3%, 효모 펩톤 1% 및 포도당 3% 포함된 것이 바람직하다.

본 발명자들은 상기와 같은 기본 YPD 배지 성분중 탄소원인 포도당 농도를 고정하고 질소원(효모 추출물과 효모 펩톤)의 양을 변화시키면서 회분식 배양을 실시할 경우, 질소원이 기본 사용량 이하로 내려가면 세포 성장이 제대로 이루어지지 않고 B형 간염 표면항원의 발현량도 기본 발현량의 10% 이하로 매우 낮은 반면, 기본 사용량 이상으로 질소원을 포함하게 되면 세포 성장이 정상으로 이루어지고 발현량도 증가하게 되는 것을 발견하였다. 즉, 질소원이 기본 사용량 이상, 바람직하게는 30 내지 150% 과량으로 포함될 경우 B형 간염 표면항원 발현량은 기본 발현량보다 적어도 20% 이상 증가시킬 수 있음을 알았다.

본 발명에서 질소원으로 사용한 효모 추출물과 효모 펩톤 질소원들은 복합 배지의 일종으로, 필수아미노산, 미네랄, 각종 무기염류, 비타민 및 재(ash) 성분을 포함한다. 따라서, 질소원의 과량 사용으로 발현량이 증가하는 현상을, 효모 추출물과 효모 펩톤에 포함되어 있는 필수아미노산, 미네랄, 각종 무기염류 및 비타민 성분들 중 하나 이상의 성분의 보강에 의한 것으로 보고, 이들 각각의 보강에 따른 발현율 증가를 계속해서 시험하였다.

먼저 기본 YPD 배지에 포함된 필수아미노산의 양을 분석하고 이 결과를 토대로 기본 배지의 필수아미노산 보다 30 내지 150% 보강된 아미노산 혼합액을 제조하고, 같은 방식으로 나머지 미네랄, 무기염류 및 비타민 성분 들에 대해서도 기본 배지에 포함된 양보다 각각 30% 이상 보강된 혼합액을 제조한다. 이어서, 이들 각 성분의 보강에 따른 B형 간염 표면항원의 발현량을 조사한 결과, 아미노산 보강에 따른 효과의 증진이 나머지 다른 성분의 보강에 따른 효과보다 월등함을 확인할 수 있었다.

즉, 상기에서 질소원이 기본 사용량 이상으로 포함된 YPD 배지를 사용할 경우 B형 간염 표면항원 발현량이 기본 발현량보다 증가한 것은, 질소원에 포함된 아미노산 함량의 보강에 따른 효과가 가장 큰 영향을 미친 것으로 보인다. 즉, 아미노산 함량을 바람직하게는 기본 배지에서의 30 내지 150% 만큼 보강하는 것에 의하여 B형 간염 표면항원의 단위세포당 발현량을 20% 이상 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

이와 같이 효모 추출물이나 효모 펩톤과 같은 질소원의 보강, 더 나아가 필수 아미노산의 보강에 의해 B형 간염 표면항원의 발현량을 증가시키는 본 발명의 배양 방법은, B형 간염 표면항원을 생산할 수 있는 모든 재조합 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 배양하여 B형 간염 표면항원을 생산하는 경우에 적용할 수 있다.

이하 실시예 및 비교예를 참고로 하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

[참고예]

[효모 추출물 및 펩톤류의 아미노산 분석]

B형 간염 표면항원을 생산하는 재조합 효모의 배양에 사용되는 YPD 배지 성분중 질소원에 해당하는 효모 추출물 또는 효모 펩톤의 분말 적당량을 증류수에 녹인 다음, 각 시료와 내부 표준 물질(internal standard ; 노르-류신)을 일정 비율로 혼합하고 한계 분자량 10,000으로 한외 여과하여 통과된 여액만 따로 모았다. 표준 물질은 농도를 알고 있는 아미노산 표준 물질과 내부 표준 물질을 일정 비율로 혼합하여 준비하였다.

준비된 시료와 표준 물질을 아미노산 자동 분석기(Perkin-Elmer사의 Applied Biosystems Model 420AH, USA)에 주입하였다. 이때 분석기 내부에서는 아미노산과 PITC(Phenylisothiocyanate)가 반응하여 PTC-아미노산(Phenylthiocarbamyl-amino acid)이 만들어지며, 만들어진 PTC-아미노산은 LC(liquid chromatography)로 주입된다.

이상의 단계를 거쳐 만들어진 시료와 표준 물질에 대한 각각의 크로마토그램을 비교하는데, 지체 시간(retention time)을 비교하여 아미노산의 피크를 알아내고 내부표준물질에 대한 상대적인 피크면적 비율을 계산하여 각 아미노산의 양을 계산하였다.

효모 추출물(YE ; Difco사), 효모 추출물(YE ; 제일, 대한민국) 박토-펩톤(BP ; Difco 사), 및 효모 펩톤(YP ; Biospringer사, 프랑스) 각각에 대하여 상기 과정을 동일하게 실시하여, 각 질소원에 포함된 아미노산의 양을 전체 질소원의 단위 중량(g)에 대한 % 비율로 계산하여 [표 1]에 나타내었다.

[실시예 1]

[배지성분 중 질소원의 보강에 따른 발현량의 증가]

-80℃ 냉동고에 보관된 B형 간염 표면항원을 생산하는 재조합 효모 균주(Saccharomyces cerevisiae; 대한민국 유전자 은행에 1993년 12월 14일자 기탁번호 KCTC 0098BP로 기탁된 것) 1 바이알(1㎖)을 50㎖의 루이신 결핍 배지(0.67g/ℓ아미노산 없는 효모 질소원, 0.04g/ℓ아데닌, 0.03g/ℓ우리딘, 0.02g/ℓ트립토판, 0.03g/ℓ티로신, 0.03g/ℓ라이신, 0.05g/ℓ페닐알라닌, 0.02g/ℓ아르기닌, 0.02g/ℓ히스티딘, 0.02g/ℓ메티오닌, 60g/ℓ포도당)에 접종하여 진탕 교반기에서 30℃, 200rpm으로 24시간 배양한 후, YPD 배지(효모 추출물 10g/ℓ, 효모펩톤 20g/ℓ, 포도당 80g/ℓ)에 5%(v/v)의 비율로 접종하여 진탕 교반기에서 30℃, 200rpm으로 12 내지 15시간 동안 배양하였다.

기본 YPD 배지(효모 추출물 30g/ℓ, 효모 펩톤 10g/ℓ, 포도당 30g/ℓ)를 기준으로 하여 YP 성분의 양을 다음 [표 2]와 같이 기본량의 1/10, 1/5, 1/2, 1.3, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0 배로 제조한 8가지 YPD 배지를 사용하여 배양을 실시하면서 B형 간염 표면항원의 생산성 변화를 관찰하였다. 배양은 배지 3ℓ에 상기 종배양액을 5%(v/v)의 비율로 접종하여 pH 4.5 내지 5.5, 27℃, 500 내지 900rpm, 1vvm 통기속도의 조건에서 48시간 동안 실시하였다.

제1도는 이와 같이 기본 YPD 배지에서 D(포도당) 양을 일정하게 하고 YP(효모추출물과 효모헵톤)양을 변화시켜 재조합 효모를 배양할 때 단위세포당 B형 간염 표면항원의 발현량을 비교한 그래프이다. 발현량 상대치(%)는 애보트 키트(Abbott monoclonal assay kit)를 사용하여, 기본 YPD 배지일 때 B형 간염 표면항원의 발현량을 100%로 하고 각각의 보강 비율에 따른 발현량을 이에 대한 상대값으로 나타낸 것이다.

제1도에서 보듯이, YP 질소원이 기본량보다 적은 양으로 포함될 때에는 질소원의 극심한 부족 현상으로 인하여 세포 성장이 제대로 이루어지지 않았으며, 사용한 YP 양에 비례하여 B형 간염 표면항원의 생산성이 증가하지만 기본 발현량의 10% 수준에도 미치지 못하는 것을 알 수 있었다. 반면에 YP 양을 30% 이상 보강할 때에는 기본 YPD 배지를 사용한 경우보다 단위 세포당(O.D. 10) B형 간염 표면항원의 생산성이 1.2배 이상 증가하는 것을 알 수 있었다.

[실시예 2]

[질소원의 구성성분 각각의 보강에 따른 발현량의 증가]

효모 추출물과 효모 펩톤의 성분중에서 먼저 아미노산을 보강해 주기 위해, 참고예에 따라 분석된 각 아미노산 성분의 양을 기준으로 하여 기본 YPD 배지에 포함된 전체 아미노산의 양을 추정 계산한 다음, 이 값의 50%를 더 보강할 수 있도록 준비한 [표 3]의 아미노산 용액(AA solution)을 기본 YPD 배지에 첨가 보강하여 발현율을 조사하였다.

무기염류, 비타민 및 미네랄 성분에 대해서는 Difco 사에서 구입한 효모 추출물과 박토-펩톤의 성분 분석표를 참조하여 기본 YPD 배지에 포함된 각각의 양을 추정 계산하였고, 각 성분군을 50% 이상 보강하기 위한 비타민 용액(Vit solution; 표 4), 미네랄 용액(TM solution; 표 5) 및 무기염류 용액(IS solutioin; 표 5)을 각각 준비하여 기본 YPD 배지에 첨가하여 발현율을 측정하였다.

제2도는 이와 같이 기본 YPD 배지에 아미노산, 비타민, 미네랄 및 무기염류를 보강한 배지에서 재조합 효모를 배양할 때 단위세포당 B형 간염 표면항원의 발현량을 비교한 그래프이다. 여기에서, 첫번째는 기본 YPD 배지에서 배양한 경우이고, 두번째 AA로 표시된 것은 기본 YPD 배지에 아미노산을 보강한 경우, 세번째 Vit로 표시된 것은 비타민을 보강한 경우, 네번째 TM으로 표시된 것은 미네랄을 보강한 경우, 그리고 다섯번째 IS로 표시된 것은 무기염류를 보강하여 배양한 경우를 나타낸다. 발현량 상대치(%)는 애보트 키트(Abbott monoclonal assay kit)를 사용하여 기본 YPD 배지일 때 B형 간염 표면항원의 발현량을 100%로 하고 각각의 보강 비율에 따른 발현량을 이에 대한 상대값으로 나타낸 것이다.

제2도에서 보듯이, B형 간염 표면항원 발현량에 가장 큰 영향을 미치는 성분은 아미노산 성분으로, 아미노산 성분 군을 기본 사용량 보다 보강해 주되, 바람직하게는 30 내지 150% 범위에서 보강해 줌으로써 B형 간염 표면항원의 단위세포당 생산성을 1.2배 이상 증가시킬 수 있다.

Claims

B형 간염 바이러스 표면항원을 발현할 수 있는 재조합 효모를 기본 YPD 배지에서 배양하여 B형 바이러스 간염 표면항원을 생산하는데 있어서, 적어도 필수 아미노산을 포함하는 혼합 아미노산이 기본 YPD 배지에 포함된 아미노산에 대해 30 내지 150%로 더 첨가된 것을 특징으로 하는 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 B형 간염 표면항원에 전표면항원(preS2+S Ag) 및 표면항원(S Ag)의 적어도 하나가 포함되는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 기본 YPD 배지가 효모 추출물 3%, 효모 펩톤 1% 및 포도당 3%를 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.