KR0173086B1 - 연속배양용 고정화세포 분리기 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연속배양시 고정화 세포의 분리를 위한 효율적인 고정화세포 분리기(decanting system)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 규조토성분의 셀라이트 담체를 이용한 곰팡이나 방선균의 고정화 연속배양시, 효과적으로 고정화 세포를 분리하여 반응기 내에 고농도 세포를 유지시킴으로서 생산성을 극대화할 수 있는 고정화세포 분리기에 관한 것이다. 본 발명의 고정화세포 분리기는 내부에 분리관 및 공기 유출관이 설치되어, 바른 유속 및 고점도의 유체에서도 고형물의 분리 효율이 개선될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포분리기를 이용하면, 곰팡이나 방선균의 고정화 연속배양시 효과적으로 고정화 세포를 분리하여 반응기 내에 고농도 세포를 유지시킴으로써 생산성을 극대화할 수 있을 것이다.

Description

연속배양용 고정화세포 분리기

본 발명은 연속배양시 고정화 세포의 분리를 위한 효율적인 고정화세포 분리기(decanting system)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 규조토성분의 셀라이트 담체를 이용한 곰팡이나 방선균의 고정화 연속배양시, 효과적으로 고정화 세포를 분리하여 반응기 내에 고농도 세포를 유지시킴으로서 생산성을 극대화할 수 있는 고정화세포 분리기에 관한 것이다.

고정화 배양은 연속배양시 세포 재순환이나 회수 공정없이 높은 희석속도에서도 높은 균체 농도를 유지할 수 있다는 장점 때문에, 여러 공정에 응용되고 있다. 특히, 균사 형성 미생물을 고정화시킬 경우, 배양액의 유변학적 특성과 고정상 세포의 형태학적 특성으로 인해 배양액의 점도를 상당히 낮출 수 있어, 결과적으로 물질전달 계수가 크게 증대된다.

고정화 배양의 장점은 회분식 배양에서보다 연속배양에서 두드러지게 나타나는데, 상술한 일반적인 장점들 이외에도 여러 가지 공정상의 이점이 있다. 예를 들어, 생물공정에 의해 생산되는 여러 항생제, 의약품 원료, 건강 식품의 첨가제들이 미생물의 이차 대사에 의해 생산되는 경우가 많은데, 대부분의 이차 대사산물들은 세포의 성장이 느린 상황에서 많이 생산된다는 점을 감안할 때, 이차 대사산물의 생산을 위한 고정화 연속공정은 희석속도와 비성장속도를 분리시켜 낮은 비성장속도에서도 높은 희석속도를 가능하게 함으로써, 생산을 극대화시키는 동시에 희석속도의 증가로 인한 생산성 향상 역시 함께 도모할 수 있으므로, 일반 회분배양이나 현탁 연속배양에 비해 탁월한 공정개선 효과를 나타낸다.

그러나, 미세한 입자에 세포를 고정화시켜 사용하는 고정화 연속공정은 공정 조작시에 여러 가지 문제점을 노출시켜 왔는데, 그 중 가장 문제가 되는 것은 균체가 고정화된 담체(이후 고정화 세포)를 유출되는 발효액으로부터 분리하여 반응기 내에 유지하는 것이 쉽지 않다는 것이다.

일반적으로, 고정화 세포의 유출 방지를 위해서는, 막이나 필터를 이용하거나 세포 분리기를 사용해 왔다. 그러나, 막이나 필터 이용법은 균사형성 미생물, 예를 들면, 곰팡이나 스트렙토마이세스 계통의 방선균 배양시에는 이들의 균사가 막이나 필터를 막거나 손상을 주기 때문에 효과적이지 못하며, 세포 분리기 역시 배양액의 점도 및 유속에 크게 영향을 받아 배양이 진행될수록 분리효율이 급격히 감소하는 문제점을 갖고 있다.

고정화 세포의 침전속도와 분리효율은 담체와 배양액의 밀도차, 배양액의 점도, 세포 분리기 내의 유출액 선속도 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 고정화 담체의 분리에 있어서의 더 큰 문제점은 연속조업시 발생하는 공기가 세포 분리기 내로 유입된다는 점이다. 일반적으로, 연속공정에서는 넘침(overflow) 방식으로 조업부피를 조절하며, 조업부피 조절의 안정성을 위해 통상 원료공급 펌프속도에 비해 빠른 속도로 유출 펌프를 작동시키는데, 이때 이 차이만큼의 공기가 세포 분리기 내로 유입되는 것이 불가피하다. 이러한 공기의 유입으로 인해 배양액과 고정화 담체의 분리가 방해받게 되며, 결국 반응기 내의 고정화 세포 농도의 감소로 고정화 공정의 장점을 반감시키는 결과를 초래하게 된다. 따라서, 종래의 고정화세포 분리기는 유출시에 동반하는 공기방울의 영향으로 내부의 배양액과 고정화 담체와의 혼합이 가중되어 효과적인 분리가 어려우므로, 새로운 고정화세포 분리기의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

본 발명자들은 내부에 관이 구비된 신규한 고정화세포 분리기를 고안하고, 최근 산업적으로 많이 연구 또는 이용되고 있는 규조토성분의 셀라이트 담체를 이용한 곰팡이나 방선균의 고정화 연속배양시 효과적으로 고정화 세포를 분리하여 반응기 내에 고농도 세포를 유지시킴으로서 생산성을 극대화할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 분리효율이 개선된 고정화세포 분리기를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 세포 분리기를 이용하여 균사형성 미생물을 효과적으로 고정화한 연속배양방법을 제공하는 것이다.

제1도는 본 발명 및 종래의 고정화세포 분리기들의 구조를 모식적으로 나타낸 그림이다.

제2도는 제1도에 나타낸 Ⅰ-1형 세포 분리기의 유속과 CMC의 농도가 유출되는 담체의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

제3도는 제1도에 나타낸 Ⅱ-1형 세포 분리기의 유속과 CMC의 농도가 유출되는 담체의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

제4도는 제1도에 나타낸 Ⅲ형 세포 분리기의 유속과 CMC의 농도가 유출되는 담체의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

제5도는 제1도에 나타낸 Ⅰ-2형 세포 분리기의 유속과 CMC의 농도가 유출되는 담체의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

제6도는 제1도에 나타낸 Ⅱ-형 세포 분리기의 유속과 CMC의 농도가 유출되는 담체의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

제7도는 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum)의 연속 배양시 고정화 세포의 유출 농도를 나타낸 그래프이다.

제8도는 유속이 유출되는 고정화 세포의 유출 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

제9도는 분리기 내에서의 관찰된 공기, 배양액 및 고정화 세포의 흐름을 모식적으로 나타낸 그림이다.

본 발명자들은 균사형성 미생물의 고정화 세포의 분리에는 중력에 의해 침전시켜 반응기 내로 되돌리는 방법이 효과적일 것으로 가정 하에 세포 분리기를 설계 고안하였다. 본 발명의 고정화세포 분리기는 그 내부에서 분리관과 공기유출관을 구비하여 공기방울과 유출되는 배양액의 흐름을 분리시킴으로서, 고정화 세포가 효율적으로 분리되어 반응기 내로 되돌려질 수 있도록 설계하였다. 이렇게 설계된 고정화세포 분리기는 배양액 유출관에 부착되며 유출액이 고정화세포 분리기를 거치는 동안 고정화 세포가 배양액과의 밀도차에 의해 침강하여 반응기 내로 되돌려진다.

이러한 본 발명의 세포 분리기와 종래의 세포 분리기의 분리기능을 비교하기 위하여, 본 발명자들은 우선 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)를 증류수에 용해시킨 다음, 배양액 중 세포농도의 영향을 모사하기 위해 이 용액을 배양액 대신 이용하여 연속적으로 반응기 내로 공급하였다. 이때, 고정화 담체로서는 셀라이트(celite)를 100 내지 500μm입자 크기로 고른 후 증류수로 세척하고 500 내지 700℃에서 소각하여 휘발성 물질을 제거한 다음, 120℃ 이상에서 멸균하고 건조하여 이용하였다. 내부에 관들이 설치되어 있지 않은 종래의 세포 분리기는 열악한 분리 성능을 보였으며, 이러한 현상은 CMC의 농도가 증가할수록 그리고 유량이 증가할수록 심화되었으므로, 이러한 세포 분리기는 고정화 세포의 지속적인 유실로 인해 실제 고정화 연속발효 공정에는 적용하기 어렵다고 할 수 있다. 반면, 본 발명의 세포 분리기는 종래의 세포 분리기에 비해 높은 유속과 고농도의 CMC에서도 효과적으로 담체의 유출이 억제되었다. 아울러, 본 발명의 세포 분리기는 상승하는 유체의 속도를 줄이고자 윗부분의 지름이 더 크도록 설계하였는데, 이러한 세포 분리기의 넓은 윗부분과 좁은 아랫부분의 비가 분리기능에 영향을 비침을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 세포 분리기 빠른 유속 및 고점도의 유체에서도 셀라이트 담체의 분리에 매우 우수함을 알 수 있었는 바, 이를 이용할 경우 성공적인 균사형성 균주의 고정화 연속배양을 기대할 수 있었다.

다음으로, 실제 곰팡이 세포를 셀라이트 담체에 흡수시킨 후 배양하는 방법에 의해 고정화하고 연속배양에 적용하여 균체의 담체 내 성장에 의한 담체의 밀도감소에 대한 영향을 알아보았다. 그 결과, 종래의 세포 분리기의 경우 초기부터 약 3~5g/L의 담체가 유출액 내에 존재하였으며 연속배양이 진행된 후 약 50시간이 지난 뒤부터 점점 증가하는 균체량에 의해 담체의 밀도가 낮아짐에 따라 그 농도가 급격히 증가하여 8~10g/L의 담체가 유출되었으므로, 실험이 비교적 낮은 유속에서 행해졌음을 감안할 때 심각한 담체의 손실을 가져올 것으로 예상되었으며, CMC 용액에 의한 실험에서와 마찬가지로 실제 배양에 이용하기에 부적절하다는 결론을 얻을 수 있었다. 한편, 본 발명의 세포 분리기의 경우에는, 약 100여 시간까지는 거의 담체가 유출되지 않았으며, 이 결과로부터 분리관과 공기유출관의 설치로 인해 분리효율이 월등하게 개선되었음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 세포 분리기가 CMC 용액에서의 결과에서 예측된 것과 같이 연속배양에서도 우수한 성능을 지님을 알 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[실시예 1]

카르복시메틸 셀룰로오스용액을 이용한 분리기의 성능 실험

배양액 중 세포 농도의 영향을 모사하기 위해 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC, 중간 점도, Sigma Chemical Co., USA)를 각각 0, 3, 5g/L의 농도로 증류수에 용해시킨 다음, 이 용액들을 배양액 대신 이용하여 연속적으로 반응기 내로 공급하였다. 조업부피는 2L로서 세포 분리기 부피(약 200mL)의 10배가 되게 하였다. 고정화 담체로서 사용하기 위해 셀라이트 R-560(Manville Co., USA)을 가는체(sieve)를 이용하여 100 내지 500μm 입자 크기로 고른 후 증류수로 여러 번 세척하고 600℃에서 소각하여 휘발성 물질을 제거한 다음, 준비된 셀라이트 담체를 121℃에서 멸균하고 다시 건조하여 이용하였다. 담체는 170g/L(50%, v/v)의 농도로 첨가하였으며, 용액의 유입 및 유출속도는 100 내지 4,000mℓ/hr 사이로 하였는데, 이는 세포 분리기 단위부피당 처리 가능한 유입량을 조사함으로써 되도록 작은 세포 분리기로 고정화 세포의 분리효율을 극대화하기 위함이었다. 제1도에 종래의 세포 분리기(Ⅰ-2,Ⅱ-2,Ⅲ형) 및 본 발명의 세포 분리기(Ⅰ-1,Ⅱ-1형)를 각각 나타내었다.

제2 내지 6도에는 제1도에 나타낸 본 발명 및 종래의 고정화세포 분리기를 채용하여 연속 배양하였을 경우, CMC의 농도와 분리기로의 유입량에 다라 유출 손실되는 담체의 농도를 나타내었다(●:CMC 0g/L; ■:CMC 3g/L; ▲:CMC 5g/L).

이중, 제4 내지 6도에서 볼 수 있듯이, 내부에 관들이 설치되어 있지 않은 종래의 세포 분리기는 CMC 0g/L(순수 물)의 경우를 제외하고는, 열악한 분리성능을 보였으며, 이러한 현상은 CMC의 농도가 증가할수록, 그리고 유량이 증가할수록 심화되었다. 또한, 점도(또는 CMC 농도)의 증가에 따른 세포 분리기능의 저하는 입자의 침강속도가 주위 액체의 점도에 반비례하는 현상에서 비롯되는 것으로 추측되었다. 특히, 이들 세포 분리기들은 전술한 공기방울의 혼합 영향에 의해 입자와 용액간의 비중 차에 의한 입자의 침강이 방해받으므로, 더욱 분리효율이 저하되는 것으로 볼 수 있었다. 육안 관차에 의하면, 이러한 현상이 뚜렷이 나타나는데, 아래로 침강하던 상당량의 담체들이 기포에 의해 다시 상승하여 혼합되어 세포 분리기 윗부분까지 도달하게 됨으로서 담체의 유출이 불가피하였다. 이러한 세포 분리기는 고정화 세포의 지속적인 유실로 인해 실제 고정화 연속발효 공정에는 적용하기 어렵다고 할 수 있었다.

반면, 제2 내지 3도에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 세포 분리기에서는 종래의 분리기에 비해 높은 유속과 고농도의 CMC에서도 효과적으로 담체의 유출이 억제되는 것이 관찰되었다. 육안 관찰에 의하면, 세포 분리기 내의 담체들이 매우 원활하게 움직여 세포 분리기 아래쪽으로 빠르게 이동함을 볼 수 있었는데, 이는 입자 자체의 침강속도에 분리관에 의해 야기된 공기유출관 바깥쪽 유체의 아랫방향 흐름이 가세했기 때문으로 추정되었다. 또한, 분리관과 공기유출관 사이의 공간으로 침강하는 담체나 유체가 공기방울의 영향을 받지 않으므로, 담체의 분리가 방해받지 않는 현상 역시 높은 분리효율을 나타내는 중요한 요건이라 볼 수 있었다.

여기서 주목할 것은 세포 분리기의 넓은 윗부분과 좁은 아랫부분의 비로소, 세포 분리기를 나타낸 그림에서 알 수 있듯이, 상승하는 유체의 속도를 줄이고자 윗부분의 지름이 더 크도록 설계하였는데, 이의 아랫부분과의 비가 분리효율에 영향을 미친다는 것을 제2도와 제3도를 비교함으로써 알 수 있었다. 넓은 부분과 좁은 부분의 길이의 비는 Ⅰ-1과 Ⅱ-1형 세포 분리기의 경우 각각 2.13:1과 0.67:1이었다. 낮은 농도의 CMC용액에서는 분리효율이 크게 다르지 않으나, 고농도 CMC용액에서는 Ⅰ-1형이 크게 우수함을 알 수 있었다. 이는 넓은 부분의 유체의 상승속도(유체의 부피속도를 면적으로 나눈 값)가 좁은 부분의 1/3 수준이므로, 이 부분의 비가 크면 클수록 분리효율이 증가하기 때문인 것으로 추측되었다.

위의 결과로부터, 본 발명의 Ⅰ-1형 세포 분리기가 빠른 유속 및 고점도의 유체에서도 셀라이트 담체의 분리에 매우 우수함을 알 수 있었는 바, 이를 이용할 경우 균사형성 균주의 성공적인 고정화 연속배양을 기대할 수 있을 것이다.

[실시예 2]

곰팡이 세포의 실제 고정상 연속배양을 통한 분리기의 성능 실험

실시예 1의 실험에서는 균체의 담체 내 성장에 의한 담체의 밀도감소에 대한 영향은 조사할 수 없었으므로, 실제 곰팡이세포의 연속배양에 적용하여 그 성능을 알아보았다. 사용 균주는 균사형성 곰팡이인 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum(ATCC 34921))이었으며, 사용한 배지조성은 표 1과 같았다.

톨리포클라디움 인플라툼의 포자 현탁액(spore suspension solution)을 이용하여 셀라이트 담체에 흡수시킨 후 배양하는 방법에 의해 세포를 고정화하였다. 담체인 셀라이트 R-560은 실시예 1과 동일한 방법으로 준비하였다. 연속조업시의 희석속도(dilytion rate)는 0.1hr-1이었으며, 배양온도 및 pH는 각각 24℃ 및 5.7이었다. 세포 분리기에 유입되는 발효액의 속도는 200mL/hr이었는데, 이는 실시예 1에서 사용한 유속에 비하면 작은 값이지만, 전술한 바와 같이 고정화 담체에 붙어 자라는 곰팡이 세포에 의한 담체 전체의 밀도 감소에 따라 분리효율이 크게 저하되는 것을 고려할 때 적절한 값으로 생각되었다. 유출되는 담체의 농도는 85℃에서 고정화 세포를 건조한 후, 이 시료를 600℃의 소각로(furnace)에서 6시간 동안 소각하여 구하였다. 실시예 1에서 시험한 다섯 가지의 세포 분리기 중 본 발명에서 제시된 Ⅰ-1, Ⅱ-1형과 대조군의 하나인 Ⅱ-2형을 사용하였다.

제7도에 Ⅰ-1, Ⅱ-1 및 Ⅱ-2형 등 세 가지 세포 분리기를 이용한 연속배양시 유출되는 고정화 담체의 농도를 나타내었다. Ⅱ-2형(-■-)의 경우, 초기부터 약 3~5g/L의 담체가 유출되었다. 제7도에는 나타나지 않았으나, 반응기 내의 고정화 담체 및 세포 농도도 이에 따라 급격하게 감소함을 알 수 있었다. 실험이 비교적 낮은 유속에서 행하여졌음을 감안할 때, Ⅱ-2형의 경우 이 유속 이상에서는 더욱 심각한 담체의 손실을 가져올 것으로 예상되었으며, CMC 용액에 의한 실험에서와 마찬가지로, 실제 배양에 이용하기에 부적절하다는 결론을 얻을 수 있었다. 한편, Ⅰ-1형(-●-) 및 Ⅱ-1형(-▲-)의 경우, 약 100여 시간까지는 거의 담체가 유출되지 않았음을 볼 수 있었으며, 이 결과로부터 분리관과 공기유출관의 설치로 인해 분리효율이 월등하게 개선되었음을 알 수 있었다. 연속배양이 계속되어 담체 내의 균체 부하량이 증가됨에 따라, Ⅱ-1의 경우 낮아진 담체 밀도의 한계에 100여 시간 후부터는 3~5g/L의 담체가 유출되었으나, Ⅰ-1형의 경우에는 완벽한 분리기능을 보였다. 이는 CMC 용액에서의 경우와 마찬가지 이유, 즉 넓은 부분과 좁은 부분의 길이의 비가 다름에 기인하는 것으로 추측되었다.

이상의 결과로부터, 본 발명에서 고안된 Ⅰ-1 및 Ⅱ-1형 세포 분리기가 CMC 용액에서의 결과에서 예측된 것과 같이 연속배양에서도 우수한 성능을 지니며, 그 중에서도 Ⅰ-1형이 더욱 우수함을 알 수 있었다.

[실시예 3]

실제 배양액과 세포가 부하된 담체를 사용한 분리기의 성능 실험

연속배양에서 얻은 실제 배양액과 0.5g-세포/g-셀라이트의 세포가 고정화된 담체를 이용하여, 각각의 유속에 따른 분리능력을 실험하였다. 유속은 100 내지 5,000mL/hr의 범위에서 정하였다. 실험에 사용한 세포 분리기들은 이상의 실시예에서 가장 우수한 것으로 나타난 Ⅰ-1형과 Ⅱ-1형이었다. 제8도에 나타낸 바와 같이, 약 1,000mL/hr까지는 유출되는 고정화 세포가 Ⅰ-1형과 Ⅱ-1형 두 경우 모두 적었으나, 그 이상부터는 유속에 따라 크게 증가하였다. 주목할 것은 유속이 약 2,500mL/hr일 때에는 Ⅰ-1형(-●-)의 경우 Ⅱ-1형(-○-)의 유출담체 농도의 1/3수준이었으며, 이는 고정화 세포의 밀도가 낮은 것을 감안할 때 매우 큰 성능차임을 알 수 있었다. 세포 분리기 내에서 관찰된 고정화 세포, 배양액 및 공기의 흐름을 제9도에 나타내었는데, 분리관에 의해 공기, 담체, 배양액이 자연스럽게 분리됨을 보여준다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 종래의 세포 분리기보다 빠른 유속 및 고점도의 유체에서도 세포의 분리에 매우 우수한 세포분리기를 제공한다. 본 발명의 세포 분리기를 이용하면, 곰팡이나 방선균의 고정화 연속배양시 효과적으로 고정화 세포를 분리하여 반응기 내에 고농도 세포를 유지시킴으로써, 생산성을 극대화할 수 있을 것이다.

Claims (5)

1. 원통형의 상부 및 하부구조를 갖는 세포 분리기에 있어서, 상부에서의 유체 상승속도가 하부에서의 유체 상승속도의 약 1/3이 되도록 상부 및 하부의 직경을 유지하며, 내부에 분리관과 공기유출관이 구비된 것을 특징으로 하는 고정화세포 분리기.
2. 제1항에 있어서, 분리관은 상부에 설치되는 것을 특징으로 하는 고정화세포 분리기.
3. 제1항에 있어서, 공기유출관은 하부에 설치되는 것을 특징으로 하는 고정화세포 분리기.
4. 제1항의 고정화세포 분리기를 이용하여 균사형성 미생물을 고정화하는 공정을 포함하는 연속배양방법.
5. 제4항에 있어서, 균사형성 미생물은 곰팡이 또는 방선균인 것을 특징으로 하는 연속배양방법.