KR0168724B1

KR0168724B1 - B형 감염 바이러스의 표면항원 preS

Info

Publication number: KR0168724B1
Application number: KR1019950043662A
Authority: KR
Inventors: 홍효정; 김희선; 김윤규
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-11-24
Filing date: 1995-11-24
Publication date: 1999-01-15
Also published as: KR970027105A

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, 이하 HBV라고 약칭함)의 표면 항원 preS 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 HBV의 표면 항원 preS1 단백질의 아미노 말단에서 2번째와 3번째 아미노산을 암호 하는 뉴클레오타이드 서열이 5'-GGAGGT-3'에서 5'-AAAAAA-3'로 돌연변이된 preS1 항원 변이단백질 및 이 단백질을 박테리아에서 수용성 형태로 다량으로 안정적으로 발현시키는 제조방법에 관한 것이다.

Description

B형 간염 바이러스의 표면항원 preS

제1도는 발현 플라스미드 pRSETpreS를 나타낸다.

제2도는 발현 플라스미드 pETpreS를 나타낸다.

제3도는 발현 플라스미드에 클론된 preS 부위의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 유도되는 아미노산 서열을 나타낸다. 화살표는 돌연변이된 뉴클레어타이드를 나타내고 밑줄은 역반복 서열을 나타낸다.

제4도는 대장균 BL21(DE3) 세포에서 preS 항원 단백질의 발현을 나타낸다. A는 12.5% SDS-PAGE, B는 preS2항원에 대한 생쥐 단일클론항체를 사용한 웨스턴 분석, C는 preS1 항원에 대한 생쥐 단일클론항체를 사용한 웨스턴 분석을 나타낸다.

레인 1: pRSETpreS를 지닌 유도되지 않은 재조합 세포.

레인 2: pRSETpreS를 지닌 유도된 재조합 세포.

레인 3: pRSETMpreS를 지닌 유도되지 않은 재조합 세포.

레인 4: pRSETMpreS를 지닌 유도된 재조합 세포.

레인 5: pETpreS를 지닌 유도되지 않은 재조합 세포.

레인 6: pETpreS를 지닌 유도된 재조합 세포.

레인 7: pETMpreS를 지닌 유도되지 않은 재조합 세포.

레인 8: pETMpreS를 지닌 유도된 재조합 세포.

레인 M: 표준단백질 분자량 기준(k=kDa).

화살표는 발현된 preS 항원 단백질을 나타낸다.

제5도는 정제된 preS 항원 단백질의 12.5% SDS-PAGE를 나타낸다.

레인 1: pRSETMpreS를 지닌 유도되지 않은 재조합 세포.

레인 2: pRESTMpreS를 지닌 유도된 재조합 세포.

레인 3: 세포 파쇄후의 수용성 분획.

레인 4: 20% 암모늄 설페이트 분획후의 시료.

레인 5: 세파크릴 S-200분석에서 얻은 시료.

화살표는 preS 항원 단백질을 나타낸다.

제6도는 preS 항원 단백질의 항원성을 나타낸다.

■: F35.25, preS1-특이 단일클론항체.

□: H8, preS2-특이 단일클론항체.

제7도는 preS 항원 단백질의 면역성을 나타낸다.

본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, 이하 HBV라고 약칭함)의 표면 항원 preS 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 HBV의 표면항원 preS1 단백질의 아미노말단에서 2번째와 3번째 아미노산을 암호하는 뉴클레오타이드 서열이 5'-GGAGGT-3'에서 5'-AAAAAA-3'로 돌연변이된 preS1항원변이 단백질 및 이 단백질을 박테리아에서 수용성형태로 다량으로 안정적으로 발현시키는 제조방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV)는 피막을 갖고 있는 DNA 바이러스로서 전세계적으로 3억 정도의 인구가 HBV에 감염되어 있다고 한다. HBV는 간염의 주된 병원체로 사람에 침입하여 급성 또는 만성간염을 일으키는데 이러한 간염이 악화될 경우 간경화나 간암으로 진행된다(Tiollais, P. and Buenda, M.A., Sci. Am. 264: 48-54, 1991).

이러한 HBV의 피막은 3개의 표면 항원 단백질로 구성되는데, 구체적으로 S항원을 포함하는 주(major) 단백질, S항원과 preS2항원을 포함하는 중(middle) 단백질 및 S항원, preS2항원과 preS1항원을 포함하는 대(large) 단백질로 구성된다(Neurath, A. R. and Kent, S. B. H., Adv. Vir. Res. 34: 65-142, 1988). 피막 단백질의 발현과 관련하여 작은 분자량을 갖는 주단백질 또는 중단백질은 진핵세포에서 22-nm 구형결정으로 발현된다. 그러나 대단백질은 S단백질의 분비(secretion)가 preS1서열에 의해 억제되므로 세포막에 결합된 형태로만 발현된다(Valenzuela, P. et al., Biotechnology 3: 317-320, 1985; Itoh, Y. and Fujisawa, Y., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141: 942-948, 1986; Imamura, T. et al., J. Virol. 61: 3543-3549, 1987; Kitano, K. et al., Biotechnology 5: 281-283, 1987; Kuroda, S., et al., Gene 78: 297-308, 1989).

HBV의 표면항원 단백질인 S항원 단백질 또는 preS(preS1와 preS2) 항원 단백질은 모두 HBV를 중화시키고 무력화하는 항체를 유도하며, 특히 preS 부위에 의해 유도되는 항체는 바이러스의 제거(clearance) 및 급성 HBV 감염에서의 회복과 관련이 있다(Iwarson, S. et al., J. Med. Viro. 16: 89-96, 1985; Itoh, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9174-9178, 1986; Neurath, A. R. et al., Vaccine 7: 234-236,1989; Budkowska, A. et al., J. Med. Virol. 20: 111-125, 1986; Milich, D. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8168-8172, 1985; Neurath, A. R. et al., J. Med. Virol. 17: 119-125, 1985; Milich, D. R. et al., J Immunol. 137: 315-322, 1986). 또한 preS에 의해 유도되는 항체는 S항원에 대한 무면역반응(non-responsiveness)을 극복할 수 있다. 종래 사용되고 있는 HBV에 대한 백신은 혈장에서 순수분리 정제된 항원을 사용하거나 유전공학 방법으로 재조합된 항원을 사용하며 대부분 S항원 단백질만을 포함하고 있는데, 사람에 따라서는 S항원에 대해 반응하지 않는 경우가 보고되고 있다.

따라서 효과적인 백신을 개발하기 위해서는 재조합에 의한 HBV 백신에 preS 부위를 포함시켜 S항원 단백질 뿐만 아니라 preS 항원 단백질에 대해서도 반응을 일으킴으로서 항체 반응을 증진시키는 것이 필요하다.

또한 표면 항원 preS 단백질은 HBV가 간 세포간의 수용체에 부착하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러므로 박테리아에서 preS 단백질을 효율적으로 생산하는 시도는 더욱 효과적인 백신의 개발을 위해서 뿐만 아니라 수용체의 확인 및 분리와 관련된 연구를 위해서도 필요하다(Machida, A. et al., Gastroenterology 86: 910-918, 1984; Neurath, A. et al., Cell 46: 429-436, 1986; Pontisso, P. et al., Virology 173: 522-530, 1989).

이와같이 preS항원 단백질에 대한 적용범위가 확대됨에 따라 preS항원 단백질의 대량생산의 필요성이 대두되고 있으나 지금까지 preS1 또는 preS2 부위를 포함하는 몇몇의 융합단백질과 그 유도체에 대한 연구가 있을 뿐, 대량생산을 위한 필수과정인 박테리아에서 preS항원 단백질의 발현 및 정제에 대한 연구는 미미하였다(Lin, Y. et al., J. Med. Virol. 33: 181-187, 1991; Kim, H. S. and Hong, H. J., Biotech. Lett. 17: 871-876, 1995; Rhyum, S. B. et al., J. Biotechnology 36: 221-230, 1994; Kumar, V. et al., Gene 110: 137-144, 1992).

이에 본 발명자들은 preS 항원 단백질을 박테리아에서 직접 발현시키고자, 우선 preS 항원 단백질의 뉴클레오타이드 서열을 밝히고, 이로부터 preS 항원단백질이 박테리아에서 직접 발현되지 않는 이유를 밝히고자 하였다. 연구 결과 preS 항원 단백질의 전사체(transcript)가 5'-말단에서 헤어핀(hairpin)의 2차 구조를 형성할 수 있는 서열을 갖음을 확인하였고, 이 헤어핀의 구조가 박테리아에서 preS 항원 단백질의 발현을 방해할 것으로 가정하였다. 따라서 preS1부위의 N-말단에서 2번째와 3번째 아미노산을 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 5'-GGAGGT-3'에서 5'-AAAAAA-3'로 돌연변이시켜 대장균에서 발현시킨 결과, 새로운 preS1항원 단백질을 얻었으며, 이 preS1항원 단백질은 대장균에서 수용성 형태로 다량으로 안정적으로 발현되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은 N-말단에서 2번째와 3번째 아미노산을 암호하는 뉴클레오타이드 서열이 5'-GGAGGT-3'에서 5'-AAAAAA-3'로 돌연변이된 preS1항원 단백질 및 그의 제조방법을 제공하는 것이며, 이 preS1 항원 단백질은 대장균에서 수용성의 형태로 다량으로 안정적으로 발현된다.

본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

다음과 같은 방법에 의하여 preS 부위의 뉴클레오타이드 서열을 밝혔다. HBV의 preS1과 preS2을 암호하는 DNA조각을 PCR(polymerase chain reaction)방법으로 합성하고 pRSET3B 또는 pET22b 발현벡터의 T7 프로모터에 연결시켜 발현 플라스미드 pRSETpreS(제1도 참조)와 pETpreS(제2도 참조)를 얻는다. 발현 플라스미드 pRSETpreS와 pETpreS에서 preS 부위의 뉴클레오타이드 서열과 preS 유전자에서 유도되는 아미노산 서열은 제3도와 같다.

발현 플라스미드 pRSETpreS와 pETpreS로 대장균을 형질전환시킨 후 발현 플라스미드를 함유하는 대장균을 IPTG로 유도한 후 12.5% SDS-PAGE(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)와 웨스턴 분석을 통해 보면 preS 항원 단백질은 발현되지 않는 것을 알 수 있다(제4도, 레인 2와 레인 6). 또한 preS 유전자는 tac 프로모터의 조절하에서도 발현되지 않는다.

이와같이 preS 항원 단백질이 대장균에서 발현되지 않는 이유는 5'-말단에 존재하는 5번째에서 10번째까지 뉴클레오타이드 서열(GAGGTT)이 20번째에서 25번째 까지의 뉴클레오타이드 서열(AACCTC)의 역반복(inverted repeat)서열이므로 RNA가 헤어핀(hairpin)구조를 형성하여 전사와 해독(translation)이 중지되기 때문인 것으로 추측된다.

이에 따라 preS 항원 단백질(preS1+preS2)의 2번째와 3번째 0아미노산의 5'-암호 서열을 PCR 방법을 이용하여 GGAGGT(Gly-Gly)에서 AAAAAA(Lys-Lys)로 바꾸어 새로운 발현 플라스미드 pRSETMpreS와 pETMpreS를 제조하고, 이들 발현 플라스미드로 대장균을 형질전환시킨 후 이를 동일한 유도조건에서 발현시켜 돌연변이 preS 항원 단백질을 얻는다. 또한 상기 방법으로 preS(preS1+preS2) 대신 preS1을 이용하여 발현 플라스미드 pRSETMpreS1과 pETMpreS1을 제조하고, 이들 발현 플라스미드로 대장균을 형질전환시킨 후 발현시키면, preS1 항원 단백질이 고농도로 얻어진다. 본 발명의 preS 또는 preS1 항원 단백질은 preS1 특이 단일클론항체 또는 preS2 특이 단일클론항체에 의해서도 인식된다. 그러나 pETMpreS로부터 발현되는 preS 단백질은, preS1 특이 단일클론항체에 대해 pRSETMpreS에서 나온 단백질에 비해 결합친화도(binding affinity)가 약한데, 이는 preS의 C-말단에 있는 덧붙여진 30 아미노산 잔기와 His 꼬리가 preS 단백질의 적절한 접힘(folding)에 영향을 주기 때문인 것으로 사료된다.

pRSETMpreS로 형질전환된 대장균을 배양하여 IPTG로 유도한 후 단백질 추출물을 분획하여 보면 단백질은 수용성 형태로 발현된다(제5도, 레인3). 발현된 단백질은 IMAC(immobilized metal affinity chromatography) 또는 암모늄 설페이트 분획과 겔침투 크로마토그래피에 의해 정제한다. preS1과 preS2 항원 단백질의 아미노산 서열에 긴 소수성(gydrophobic) 조각이 있는 것으로 보아 preS 항원 단백질은 비교적 소수성을 지니며, 따라서 20% 암모늄 설페이트로 포화시켜 원심분리하면 preS 항원단백질을 65%까지 얻을 수 있다(제5 도, 레인 4).

위와 같은 방법으로 분리된 preS 단백질은 preS1항원과 preS2항원의 항원성과 면역성을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[HBV 표면항원 preS의 발현 플라스미드 pRSETpreS와 pETpreS의 제조]

야생형 preS를 암호하는 유전자는 pHBV315(adr subtype, Kim, Y. S. and Kang, H. S., Kor. Biochem. J. 17: 70-79, 1984)를 주형으로 하여 프라이머 1과 프라이머 2를 사용하여 PCR 방법을 수행하여 제조하였다.

프라이머 1(5'-CGAGAATTCATGGGAGGTTGGTCTTCC-3'),

프라이머 2(5'-CGAGGATCCCAGGTAGGAGTGGGAGCA-3'),

상기와 같이 제조한 preS 유전자를 EcoR I과 BamH I으로 소화하여, 링커(linker) 전환을 통해 발현벡터 pRSET3B(Invtrogen) 또는 pET22b(Novagen)의 EcoR I - Hind III 또는 Nde I-BamH I 부위에 삽입하였다. 그 결과 생성된 발현벡터를 pRSETpreS와 pETpreS로 각각 명명하였다. preS 부위의 뉴클레어타이드 서열은 PCR 프라이머들과 시쿼네이즈(Sequenase, USB)를 이용한 디데옥시 사슬정지 방법에 의해 결정되었다(제3도 참조).

[실시예 2]

[HBV표면항원 preS 변이단백질의 발현 플라스미드 pRSETMpreS와 pETMpreS의 제조]

돌연변이 preS를 암호하는 유전자는 pHBV315를 주형으로 하여 프라이머 2와 프라이머 3를 이용한 PCR 방법을 수행하여 제조하였다.

프라이머2(5'-CGAGGATCCCAGGTAGGAGTGGGAGCA-3'),

프라이머3(5'-CGAGAATTCATGAAAAAAGGTCTTCCAAACCTCGA-3')

상기와 같이하여 제조한 preS 유전자를 EcoR I과 BamH I으로 소화하여, 링커 전환을 통해 발현벡터 pRSET3B(Invitrogen) 또는 pET22b(Novagen)의 EcoR I-HindIII 또는 Nde I- BamH I 부위에 삽입하였다. 그 결과 생성된 발현벡터를 pRSETMpreS와 pETMpreS로 각각 명명하였다.

[실시예 3]

[preS 항원 변이단백질을 생산하는 형질전환체의 제조]

실시예 2에서 얻은 발현 플라스미드 pRSETMpreS 또는 pETMpreS로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. pRSETMpreS로 형질전환된 대장균을 1995년 11월 17일에 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 8706P 호).

[실시예 4]

[대장균에서 preS 항원 변이단백질의 발현]

실시예 3에서 얻은 대장균을 배양하여 그 배양액에 0.1mM IPTG(isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside)를 가하고 37℃에서 3시간동안 preS항원 변이단백질의 발현을 유도하였다. 유도된 세포 및 유도되지 않은 세포를 수확하여 세포를 용출시킨 후 12.5% SDS-PAGE에 의해 농도를 측정하고 웨스턴 분석을 한 결과, preS 항원 변이단백질의 량이 총세포내 단백질의 25-28% 정도에 해당하였다(제4도, 레인 4와 레인 8). 웨스턴 분석에는 preS1 위의 에피토프(epitope)을 인지하는 생쥐 단일클론 항체 F35.25(1:1000 v/v, Immunotech) 또는 preS2 위의 에피토프를 인지하는 H8을 사용하여 반응시킨 후 염소의 항마우스 IgG 알칼라인 포스파테이즈 결합체(goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate, 1:1000 v/v, Sigma사 제품)을 탐침으로 이용하였다(제4도 참조).

[실시예 5]

[preS 항원 변이단백질의 정제]

유도된 세포에서 발현된 수용성 단백질을 20% 암모늄 설페이트로 포화시켜 7600×g에서 10분간 원심분리하여 65%의 preS 항원 변이단백질을 얻었다. 단백질 펠렛은 녹여서 GPC 로딩 완충용액 [50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.5M NaCl, 2mM EDTA, 0.5mM PMSF]으로 투석하고 Sephacryl S-200 칼럼위에서 겔침투 크로마토그래피를 하여 정제하였다. 1L 배양액에서 최종적으로 정제된 preS 항원 단백질 10mg을 얻었다. preS 항원 단백질이 포함된 분획은 12.5% SDS-PAGE와 웨스턴 분석을 통해 그 단백질의 정제정도를 확인한 결과 거의 균일하게(homogeniety) 정제되었음을 확인하였다(제5도, 레인 5). 단백질의 농도는 소의 혈청 알부민을 기준으로 한 브래드 포트(Bradford)방법으로 결정하였다.

[실시예 6]

[preS 항원 변이체의 항원성]

각기 다른 농도(10-200ng)의 정제된 preS 항원 변이단백질, preS1-특이 단일클론 항체인 F35.25(20ng) 또는 preS2-특이 단일클론항체인 H8(20ng), 그리고 염소 항마우스 IgG 과산화효소 결합체(goat anti-mouse IgG peroxydase conjugate, 1:1000 v/v, Sigma사 제품)를 사용하여 간접 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 방법을 행하였다. 세척후 o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine, 0.04%, Gibco사 제품)와 H₂O₂를 포함하는 기질용액을 각 웰에 넣고, H₂SO₄(2.5M)로 반응을 정지시킨 후, ELISA 해독기로 흡광도(OD)를 492nm에서 측정하였다.

정제된 preS 항원 변이단백질은 preS1- 특이 단일클론 항체 또는 preS2-특이 단일클론 항체와 양의존적(dose-dependent)으로 반응하였다(제6도 참조).

[실시예 7]

[preS 항원 변이단백질의 면역성]

10주된 암컷 Balb/c 생쥐를 정제된 preS 변이단백질(20μg)로 1주일 간격으로 4번 면역시킨 후, 각 부스트(boost)전에 혈청 시료를 꼬리에서 채취하였다. 먼저 정제된 preS1 펩타이드 또는 preS2 펩타이드로(아미노산 120-145, Sigma사 제품)로 미리 코팅된 각 웰에, 희석시킨(1:1000 v/v) 생쥐 항혈청을 가하고, 간접 ELISA를 행하였다.

정제된 preS 항원 변이단백질은 preS1과 preS2 항원에 특이한 항체를 증가시켰다.(제7도 참조).

상기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 preS1부위 유전자의 5'-말단 암호 서열을 돌연변이시킴으로써 B형 간염 바이러스의 preS(preS1와 preS2) 항원 변이단백질 또는 preS1 항원 변이 단백질이 대장균에서 직접적으로 발현된다. 돌연변이된 preS 항원 단백질 또는 preS1 항원 단백질은 수용성 형태로 다량이 안정적으로 발현되며 전체 세포 단백질 중 28% 정도를 차지하며 20% 암모늄 설페이트 분획과 겔침투 크로마토그래피에 의해 효과적으로 정제할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 preS 항원 변이단백질 또는 preS1 항원 변이단백질은 고도의 항원성과 면역성을 갖고 있다.

이들 항원 변이단백질은, HBV의 더욱 효과적인 백신과 정확한 진단 방법은 개발뿐만 아니라, HBV에 대한 간 세포 수용체의 분리와 확인같은 연구에도 유용한 것이다.

Claims

B형 간염 바이러스 표면항원 preS의 N-말단 2번째 및 3번째 아미노산을 암호하는 염기 서열(GGA GGT; 아미노산 서열 글리신-글리신)에 돌연변이가 유발된 전사체로부터 발현된 preS 항원 변이단백질.
제1항에 있어서, preS 항원 변이단백질은 preS1 항원 변이단백질인 것을 특징으로 하는 preS 항원 변이단백질.
제1항에 있어서, preS 항원 변이단백질은 preS1+preS2 항원 변이단백질인 것을 특징으로 하는 preS 항원 변이단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 preS1 항원의 N- 말단 2번째와 3번째 아미노산이 리신-리신(Lys-Lys; 염기 서열 AAA AAA)으로 치환된 것을 특징으로 하는 preS 항원 변이단백질.
제3항의 preS1 + preS2 항원 변이단백질의 유전자를 포함하는 대장균 발현 플라스미드 pRSETMpreS 또는 pETMpreS.
제5항의 발현 플라스미드 pRSETMpreS로 대장균 BL21(DE3) 균주를 형질전화시켜 얻은 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물(수탁번호 : KCTC 제 8706P호).
제1항의 preS 항원 변이단백질 유전자를 포함하는 발현 플라스미드로 형질전환시켜 얻은 미생물을 배양하여 preS 항원 변이단백질을 대량생산하는 제1항의 preS 항원 변이단백질의 제조방법.