KR100209783B1 - B형간염바이러스표면항원pres다이머단백질및트라이머단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스를 구성하는 4가지 단백질 중 바이러스 외피를 구성하는 표면항원 pre S 단백질의 아미노 말단 2번째 및 3번째 아미노산이 라이신으로 치환된 항원 변이단백질이 중복되어 있는 새로운 pre S 항원 단백질 및 이를 대장균에서 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 중복된 pre S 항원 단백질은 높은 항원성을 나타내므로 B형 간염 바이러스에 대한 효과적인 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스 표면항원 pre S 다이머 단백질 및 트라이머 단백질
본 발명은 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B Virus, 이하 HBV 라고 약칭함)의 표면항원 pre S 단백질이 중복되어 있는 새로운 pre S 항원 단백질 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 HBV 를 구성하는 4가지 단백질 중 바이러스의 외피를 구성하는 표면항원 pre S 단백질의 아미노 말단 2번째 및 3번째 아미노산이 라이신으로 치환된 변이단백질이 중복되어 있는 새로운 pre S 항원 단백질 및 이를 대장균에서 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 중복된 pre S 항원 단백질은 높은 항원성을 나타내므로 HBV 에 대한 효과적인 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.
B형 간염 바이러스 (HBV)는 전세계적으로 3억 정도의 인구가 감염되어 있는 바이러스로서, 감염이 되면 간염 또는 간경변이 유발되고 만성 간염으로 되는 경우간암으로 이행한다고 알려져 있다 (Tiollais and Buenda, Scientific American, 264: 48, 1991; Hu et al., PNAS, 87, 7140, 1990; Wei et al., J. Med. Virol., 45, 82, 1995). 특히 우리 나라의 경우 40대 이상인 남성 간암 환자의 상당수가 HBV 의 감염에 의해 이행된 간암으로 추정된다. 하지만 간염에서 간경화 또는 간암으로 이행되는 기작에 대해서는 정확히 알려져 있지 않다.
HBV 는 헤파드나바이러스 과 (Hepadnavirus family)에 속하는 피막을 갖고 있는 DNA 바이러스로서, 혈청학적으로 바이러스의 표면 항원 (HBsAg)에 따라 각 아형(subtype), ayw, ayw2, ayr, adw2, adw4, adr,으로 나뉜다. 그 중에서 adr, adw 및 ayw 아형은 전세계적으로 분포하며, 특히 adr 아형은 한국을 포함한 동아시아 지역에 주로 분포하는 것으로 나타난다 (Tiollais et al., Nature, 317: 489-495, 1985).
이러한 각 HBV 의 게놈은 핵산중합효소 유전자(P; polymerase), 표면항원 유전자(S; surface protein; pre-S1, pre-S2, S), 중심항원 유전자(C; core protein; pre-C, C), X 유전자 등의 4가지 유전자로 구성된다. 이들 중 P, S, C 유전자는 구조 단백질을 발현하고, X 유전자는 조절 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다.
상기 HBV 의 구조 단백질 중 하나인 표면항원은 주 단백질(major protein), 중 단백질(middle protein) 및 대 단백질(large protein)로 나누어지는데, 이 때 주 단백질은 S 항원으로, 중 단백질은 pre S2 와 S 항원들로 그리고 대 단백질은 pre S1, pre S2 및 S 항원들로 구성된다 (Neurath, A. R. and Kent, S. B. H., Adv. Vir. Res., 34: 65-142, 1988).
이들 3가지 표면항원에는 모두 바이러스의 감염성을 중화시킬 수 있는 에피토프(epitope)가 존재하는데, 특히 pre S 항원 아미노 말단의 56개 아미노산에 이들 작용을 갖는 에피토프와 B형 간염 바이러스가 간세포 수용체에 결합하는 부위가 함께 존재하는 것으로 보고되어 있다 (Iwarson, S. et al., J. Med. Virol., 16: 89-96, 1985; Itoh, Y. et al., PNAS, 84: 9174-9178, 1986; Neurath, A. R. et al., Vaccine, 7: 234-236, 1989; Neurath, A. R. et al., Cell, 46: 436-439, 1986; Pontisso, P. et al., Virology, 173: 522-530, 1989; Petit, M. A. et al., Mol. Immunol., 28: 517-530, 1989).
지금까지 HBV 감염을 예방하는 백신으로는 주로 사람의 혈장에서 순수하게 분리·정제한 바이러스 항원 또는 유전공학적 방법으로 재조합된 항원을 사용하였으나, 대부분이 HBV 의 S 항원 단백질만을 포함하므로 S 항원에 대해 반응하지 않는 사람의 경우는 사용에 어려움이 있었다.
한편 HBV 의 pre S 항원 단백질은 HBV 를 중화시키고 항체를 유도하는 이외에도 바이러스의 제거(clearance) 및 급성 HBV 감염에서의 회복과 관련이 있으므로, pre S 항원 단백질을 HBV 에 대한 백신으로 사용하면 HBV 의 S 항원에 대한 무면역반응(non-responsiveness)을 극복하는데 유용하게 이용될 수 있다. 따라서 유전공학적 방법으로 S 항원 단백질 앞에 pre S 항원 부위를 연결시킴으로써 S 항원 단백질뿐만 아니라 pre S 항원 단백질에 대해서도 면역반응을 일으키는 HBV 백신을 개발하는 것이 바람직하다.
또한 백신에서 고려해야 할 가장 중요한 기능은 항원 단백질에 대해 높은 결합능과 특이성을 갖는 우수한 항체를 생산하도록 유도하는 것인데, 이러한 백신의 기능은 이들이 갖는 항원성이나 분자량 등의 특성에 의존한다. 구체적으로 항원의 분자량이 클수록 결합력이 큰 항체들이 잘 만들어지는 것으로 알려져있다. 따라서 항원의 분자량이 작은 경우에는 다양한 수용체 단백질(carrier protein)을 항원에 결합시켜 면역원으로 사용하는 방법을 고려할 수 있다. 그러나 백신은 인체에 투여하는 것이고 상기 방법은 수용체 단백질에 의해 부적합한 면역 반응 또는 부작용을 유발할 수 있으므로 그의 이용에는 어려움이 있다.
본 발명의 pre S 항원 단백질은 분자량이 약 25kDa 정도인 크기가 비교적 작은 단백질이므로. 이를 백신으로 사용하는 경우 항체 반응을 증진시키기 위하여 항원성을 보완하는 것이 필요하다.
지금까지 pre S 항원 단백질을 이용한 백신으로 pre S1 또는 pre S2 항원 부위를 포함하는 몇몇 융합 단백질이 개발되었으나, pre S 항원 단백질을 실제로 발현시켜 정제하는 면에 있어서는 그 연구가 미비하였다 (Lin, Y. et al., J. Med. Virol., 33: 181-187, 1991; Kim, H. S. and Hong, H. J., Biotech. Lett., 17: 871-876, 1995; Rhyum, S. B. et al., Biotech., 36: 221-230, 1994; Kumar, V. et al., Gene, 110: 137-144, 1992). 또한 본 발명자 등이 pre S 항원 단백질 아미노 말단을 돌연변이시켜 pre S1 또는 pre S2 항원을 변이단백질 형태의 모노머 (monomer) 단백질로 대장균에서 대량 생산하여 출원한 바 있었다 (대한민국 특허출원 제95-43662호).
이에 본 발명자들은 면역원성이 우수한 B형 간염 바이러스에 대한 백신을 개발하기 위하여, 상기 pre S 항원 단백질의 에피토프 부위의 갯수 및 분자량 등을 증가시킬 수 있도록 pre S 항원 유전자가 두 번 또는 세 번 이상 중복된 발현 플라스미드를 제조하고 이를 이용하여 대장균에서 pre S 다이머 단백질과 트라이머 단백질 등을 대량으로 생산하여 분리·정제함으로써 그 효과가 탁월한 새로운 HBV 백신을 얻어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 표면항원 pre S 단백질이 두 번 이상 중복된 새로운 pre S 항원 단백질을 제공함에 그 목적이 있다.
구체적으로 본 발명은 표면항원 pre S 단백질로서 아미노 말단 2번째 및 3번째 아미노산이 라이신으로 치환된 변이단백질을 이용한다. 또한 본 발명은 pre S1 및 pre S2 항원 부위가 포함된 표면항원 pre S 단백질을 사용한다.
또한, 본 발명은 HBV 의 pre S 항원 변이단백질이 두 번 중복되는 pre S 다이머 단백질을 제공한다. 본 발명의 pre S 다이머 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 HBV 의 pre S 항원 단백질이 세 번 중복되는 pre S 트라이머 단백질을 제공한다. 본 발명의 pre S 트라이머 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 pre S 다이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드를 제공함에 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 pre S 트라이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드를 제공함에 그 목적이 있다.
구체적으로 본 발명은 대장균 발현 플라스미드 pRSETpreSD 및 발현 플라스미드 pRSETpreST 를 제공한다. 본 발명의 발현 플라스미드는 서열번호 1 또는 서열번호 3 의 유전자 염기서열을 각각 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 플라스미드로 각각 대장균을 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 형질전환체들을 1996년 9월 4일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 8759P, KCTC 8760P).
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 중복된 표면항원 pre S 단백질을 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
본 발명의 중복된 표면항원 pre S 단백질은 B형 간염 바이러스에 대한 효과적인 백신으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 발현 플라스미드 pRSETpreSD 의 제조과정 및 그의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 발현 플라스미드 pRSETpreST 의 제조과정 및 그의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 발현 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)에서 pre S 다이머 단백질 및 트라이머 단백질이 발현되는 양상을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블럿으로 분석하여 나타낸 것이다.
레인 1 : 발현 유도되지 않은 대장균 형질전환체(pRSETpreSD),
레인 2 : 발현 유도된 대장균 형질전환체(pRSETpreST),
레인 3 : 발현 유도되지 않은 대장균 형질전환체(pRSETpreST),
레인 4 : 발현이 유도된 대장균 형질전환체(pRSETpreST),
화살표 a : pre S 트라이머 단백질,
화살표 b : pre S 다이머 단백질.
도 4는 본 발명의 pre S 다이머 단백질 및 트라이머 단백질을 세파크릴 S-200 으로 정제하여 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 나타낸 것이다.
레인 1 : 정제된 pre S 모노머 ; 레인 2 : 정제된 pre S 다이머,
레인 3 : 정제된 pre S 트라이머 ; 화살표 a : 정제된 pre S 트라이머, 화살표 b : 정제된 pre S 다이머 ; 화살표 c : 정제된 pre S 모노머.
도 5는 본 발명의 pre S 다이머 단백질 및 트라이머 단백질 상의 pre S1 부위가 갖는 면역원성을 나타낸 것이다.
KLH-pre S-1 : pre S 단백질과 KLH 의 접합체를 주사한 생쥐 1,
KLH-pre S-2 : pre S 단백질과 KLH 의 접합체를 주사한 생쥐 2,
pre SM-1 : pre S 단백질을 주사한 생쥐 1,
pre SM-2 : pre S 단백질을 주사한 생쥐 2,
pre SD-1 : pre S 다이머 단백질을 주사한 생쥐 1,
pre SD-2 : pre S 다이머 단백질을 주사한 생쥐 2,
pre ST-1 : pre S 트라이머 단백질을 주사한 생쥐 1,
pre ST-1 : pre S 트라이머 단백질을 주사한 생쥐 2,
□ : 3차 주사후 얻은 항혈청의 항체역가,
■ : 4차 주사후 얻은 항혈청의 항체역가.
도 6은 본 발명의 pre S 다이머 단백질 및 트라이머 단백질 상의 pre S2 부위가 갖는 면역원성을 나타낸 것이다.
각 레인의 설명은 상기 도 5와 동일함.
본 발명은 B형 간염 바이러스 표면항원 pre S 단백질이 중복된 새로운 pre S 항원 단백질을 제조하기 위하여, 이미 출원된 바 있는 pre S 항원 변이단백질을 이용한다 (대한민국 특허출원 제95-43662호). 이 때 pre S 항원 변이단백질은 HBV의 pre S1 항원 및 pre S2 항원을 함께 포함한다.
HBV 의 표면항원 pre S 유전자는 5'-말단에서 헤어핀 구조를 형성하므로 대장균에서 그 유전자의 발현이 저해된다고 보고되어 있다. 따라서 표면항원 pre S 단백질의 아미노 말단의 아미노산이 치환될 수 있도록 그의 유전자를 돌연변이시키는 것이 대장균에서 이를 대량 생산하는데 유용하다. 구체적으로 본 발명은 아미노 말단 2번째 및 3번째 아미노산이 글리신에서 라이신으로 치환되도록 그의 유전자를 5'-GGAGGT-3'에서 5'-AAAAAA-3' 으로 돌연변이시킨다.
우선 본 발명은 상기 돌연변이된 유전자를 이용하여 HBV 의 pre S 항원 변이 단백질이 두 번 이상 중복되도록 이를 생산할 수 있는 새로운 발현 플라스미드를 제조한다.
구체적으로 본 발명은 표면항원 pre S 유전자가 두 번 중복되어 있어 pre S 다이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드를 제조한다. 또한 본 발명은 동일한 방법으로 본 유전자가 세 번 중복된 pre S 트라이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드를 제조한다.
본 발명의 발현 플라스미드를 제조하기 위하여, HBV 의 pre S1 항원 유전자 및 pre S2 항원 유전자를 발현 플라스미드 pRSETpreS (대한민국 특허출원 제95-43662호)를 사용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 으로 다른 제한효소 부위를 가지도록 합성한다. 이들 유전자를 다시 발현 플라스미드 pRSETpreS 상의 pre S 유전자의 5'-말단에 연결하여 pre S 다이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pRSETpreSD 를 제조한다.(도 1 참조). 본 발명의 발현 플라스미드는 서열번호 1의 유전자 염기서열을 포함한다. 이외에도 상기 제조과정에 따라 달라지는 유전자 서열도 본 발명의 범위에 포함시킬 수 있다.
상기와 동일한 방법으로 pre S 항원 유전자를 얻어, 이를 다시 본 발명의 발현 플라스미드 pRSETpreSD 상의 pre S 다이머 유전자의 5'-말단에 연결하여 pre S 트라이머 단백질을 생산할 수 있는 본 발명의 발현 플라스미드 pRSETpreST 를 제조한다 (도 2 참조). 본 발명의 발현 플라스미드는 서열번호 3의 유전자 염기서열을 포함한다. 이외에도 상기 제조과정에 따라 달라지는 유전자 서열도 본 발명의 범위에 포함시킬 수 있다
또한, 본 발명은 발현 플라스미드 pRSETpreSD 및 발현 플라스미드 pRSETpreST을 이용하여 pre S 다이머 유전자 및 pre S 트라이머 유전자 부위의 염기 서열과 이로부터 유추한 아미노산 서열을 각각 제공한다.
또한, 본 발명은 발현 플라스미드 pRSETpreSD 및 발현 플라스미드 pRSETpreST 로 대장균을 각각 형질전환시켜 형질전환체들을 얻는다 (수탁번호 : KCTC 8759P, KCTC 8760P).
또한, 본 발명은 상기의 발현 플라스미드를 이용하여 대장균에서 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질을 대량으로 제조한다.
구체적으로 본 발명은 상기 대장균 형질전환체에 중복된 pre S 항원 변이단백질의 발현을 유도한 다음, 생산된 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE ) 및 웨스턴 블럿 등으로 분석한다.
그 결과, 본 발명의 발현 플라스미드로부터 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질 등이 총 세포 단백질의 20-40% 정도를 차지할 만큼 많이 생산됨을 확인한다 (도 3 참조). 본 발명의 발현 플라스미드는 파이지 T7 프로모터를 이용하여 높은 농도로 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질을 안정적으로 발현한다. 이외에도 대장균에서 사용할 수 있는 모든 종류의 프로모터를 본 발명의 항원 단백질을 생산하는데 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현 플라스미드를 이용하여 대장균에서 생산된 pre S다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질을 효과적으로 분리 정제한다. 구체적으로 본 발명은 상기 형질전환체에서 생산된 본 발명의 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질을 암모늄 설페이트 분획 및 겔 침투 크로마토그래피 등을 수행하여 고농도로 얻는다. 이 때 본 발명의 pre S 트라이머 단백질은 불안정하여 일부가 분해되므로 pre S 다이머 단백질에 비하여 그 수율이 조금 떨어진다 (도 4 참조).
또한, 본 발명은 상기에서 얻은 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질을 이용하여 그들의 면역원성을 조사한다 (도 5 및 도 6 참조).
이 때 정제한 pre S1 펩타이드 (Kim, H. S. and Hong, H. j., Biotech. Lett., 17: 871-876, 1995) 및 pre S2 펩타이드 (아미노산 번호 120-145 에 해당, 시그마사 제품) 등으로 플레이트를 코팅하여 간접 엘리자 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 방법 등을 수행한다. 또한 비교군으로 수용체 단백질인 KLH (Keyhole limpet hemocyanin, Piece 사 제품)가 결합된 pre S 모노머 단백질 또는 정제된 pre S 모노머 단백질(도 4, 레인 1 참조)을 사용한다.
그 결과, 정제된 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질은 모두 pre S 모노머 단백질보다 면역원성이 크게 나타나고, 이는 KLH 수용체 단백질 접합체의 면역원성과 비슷하다. 또한 pre S 다이머 단백질은 pre S2 항원에 대한 항체를 유도하는 면역원성이 특히 탁월함을 확인한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 본 발명의 발현 플라스미드 pRSETpreSD 의 제조
본 발명의 발현 플라스미드를 제조하기 위하여, 플라스미드 pHBV315(adr 아형, Kim, Y. S. and Kang, H. S., Kor. Biochem. J., 17: 70-79, 1984)를 주형으로 하여 pre S 항원 전사체의 5'-말단에 헤어핀 2차 구조가 형성되지 못하도록 pre S1 항원 아미노 말단의 2번째와 3번째 아미노산에 해당하는 염기 서열이 5'-GGAGGT-3'에서 5'-AAAAAA-3'으로 돌연변이된 pre S 항원 유전자를 포함하는 발현 플라스미드 pRSETpreS 를 사용하였다.
본 발명은 pre S 다이머 유전자와 pre S 트라이머 유전자를 얻기 위하여, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머 1과 프라이머 2를 각각 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다 (서열표 5 및 서열표 6 참조). 상기와 같이 제조한 pre S 유전자를 Bg1 Ⅱ와 Bam HⅠ 으로 절단한 다음, Bg1 Ⅱ로 절단한 발현 플라스미드 pRSETpreS 의 pre S 유전자 5'-말단 앞쪽에 삽입하였다. 그 결과, pre S 다이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pRSETpreSD를 제조하였다.
본 발명의 발현 플라스미드를 대장균에 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 1996년 9월 4일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8759P).
또한, pre S 다이머 유전자의 염기 서열을 상기 프라이머들과 시쿼네이즈(sequenase)를 이용한 디데옥시 사슬정지 방법에 의해 결정하였다 (서열표 1 및 서열표 2 참조).
실시예 2 본 발명의 발현 플라스미드 pRSETpreST 의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 pre S 유전자를 준비하여 본 발명의 발현 플라스미드 pRSETpreSD 의 5'-말단에 이를 다시 삽입시키고 pre S 트라이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pRSETpreST을 제조하였다.
본 발명의 발현 플라스미드를 대장균에 형질전환시켜 그 형질전환체를 1996년 9월 4일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8760P).
또한, pre S 트라이머 유전자의 염기 서열을 상기 프라이머들과 시쿼네이즈를 이용한 디데옥시 사슬정지 방법에 의해 결정하였다(서열표 3 및 서열표 4 참조).
실시예 3 대장균에서 pre S 다이머 단백질 및 트라이머 단백질의 발현
본 발명의 중복된 pre S 항원 단백질을 제조하기 위하여, 상기 실시예 1 또는 실시예 2에서 제조한 발현 플라스미드 pRSETpreSD 또는 발현 플라스미드 pRSETpreST 로 대장균을 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 배양하여 그 배양액에 0.1mM IPTG (isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside)를 가하고 37℃에서 2시간 동안 각각 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질의 발현을 유도하였다.
유도된 세포 및 유도되지 않은 세포를 수확하여 세포를 용출시킨 다음 발현된 단백질의 농도를 12.5% SDS-PAGE 방법으로 측정하고 이를 다시 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 웨스턴 블럿은 pre S1 항원 단백질의 에피토프를 인지하는 생쥐 단일클론항체 7H8 을 사용하여 반응시킨 다음 염소의 항마우스 IgM-홀스레디쉬 퍼옥시데이즈 결합체 (goat anti-mouse IgM horseradish peroxidase conjugate, 1:1000 v/v, 시그마사 제품)를 탐침으로 이용하여 수행하였다 (도 3 참조).
그 결과, 상기에서 발현된 pre S 다이머 단백질의 양이 총 세포내 단백질의 40% 정도에 해당하였고(도 3, 레인 2 참조), pre S 트라이머 단백질의 양은 총 세포내 단백질의 20% 정도에 해당함을 확인하였다(도 3, 레인 4 참조).
실시예 4 pre S 다이머 단백질과 트라이머 단백질의 분리·정제
실시예 3의 과정을 통하여 발현된 수용성 단백질을 분리·정제하기 위하여, 암모늄 설페이트 분획과 겔 침투 크로마토그래피를 수행하였다.
상기에서 얻은 수용성 단백질을 20% 암모늄 설페이트로 포화시키고 7600×g에서 10분간 원심분리하여 65% 의 pre S 다이머 단백질과 트라이머 단백질을 얻었다. 이들 침전된 단백질을 각각 컬럼 로딩 완충용액(50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.5M NaCl, 2mM EDTA, 0.5mM PMSF)으로 투석하고 세파크릴 S-200(sephacryl S-200) 칼럼을 이용한 겔 침투 크로마토그래피를 수행하였다. 이러한 정제과정을 통하여 유도된 1L 대장균 배양액으로부터 최종적으로 pre S 다이머 단백질 10mg 및 pre S트라이머 단백질 2mg 을 각각 얻었다.
또한 상기에서 얻은 단백질로 12.5% SDS-PAGE 를 수행한 결과, pre S 다이머 단백질은 거의 균일하게 (homogeneity) 정제되었고 (도 4, 레인 2 참조), pre S 트라이머 단백질은 그의 일부가 분해된 형태의 단백질과 함께 정제됨이 확인되었다 (도 4, 레인 3 참조). 이 때 단백질의 농도는 BCA 단백질 정량 키트(BCA kit, Pierce 사 제품)를 사용하여 측정하였다.
실시예 5 pre S 다이머 단백질과 트라이머 단백질의 면역원성
본 발명의 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질의 면역원성을 조사하기 위하여, 정제된 pre S 다이머 단백질과 트라이머 단백질 20μg을 각각 6주된 수컷 Balb/c 생쥐에 1달 간격으로 3번 주사하여 면역화시킨 다음, 1주일 후에 채혈하여 항체역가(titer)를 측정하였다.
정제한 pre S1 펩타이드(아미노산 번호 1-56에 해당) 또는 pre S2 펩타이드(아미노산 번호 120-145에 해당, 시그마사 제품)로 코팅된 각 웰에 1:3200 으로 희석시킨 생쥐 항혈청을 가하고, 간접 엘리자(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 수행하였다. 또한 KLH (Keyhole limpet hemocyanin, Pierce 사 제품)를 수용체 단백질을 사용하여 pre S 모노머 단백질을 결합시킨 접합체 또는 정제된 pre S 모노머 단백질(도 4, 레인 1 참조)도 상기와 동일한 방법으로 각각 주사한 다음 생쥐 혈청의 항체역가를 조사하여 비교군으로 사용하였다.
그 결과, 정제된 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질은 모두 pre S 모노머 단백질의 경우보다 pre S1 항원에 특이한 항체의 생산을 크게 증가시켰으며, 그 정도가 KLH 수용체 단백질의 접합체의 결과와 비슷한 수준으로 나타났다. 또한 pre S 다이머 단백질은 pre S2 항원에 대한 항체의 생산도 크게 증가시켰으며, KLH 수용체 단백질 접합체의 경우보다 그 효과가 매우 탁월하였다.
본 발명의 pre S 다이머 단백질 및 트라이머 단백질은 pre S1 항원 및 pre S2 항원 모두에 대해 높은 면역원성을 나타내고, 그 면역원성은 KLH 수용체 단백질이 결합된 항원 단백질보다 훨씬 더 탁월하다.
또한, 본 발명의 발현 플라스미드는 pre S 다이머 단백질 또는 pre S 트라이머 단백질을 대장균에서 안정적으로 발현시킬 수 있으며, 특히 pre S 다이머 단백질은 전체 세포 단백질의 약 40% 를 차지할 정도로 대량으로 생산된다. 또한 이렇게 얻어진 pre S 다이머 단백질 및 pre S 트라이머 단백질은 암모늄 설페이트 분획 및 겔 침투 크로마토그래피 등에 의해 용이하게 분리·정제될 수 있다.
따라서 본 발명의 pre S 다이머 단백질과 pre S 트라이머 단백질은 경제적이면서 그 효과가 탁월한 B형 간염 바이러스에 대한 백신으로 널리 사용되는 것이 기대된다.
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 1
서열의 길이 : 1218
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 핵산
[서열표 1a]
ATGCGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT GGTATGGCTA GCATGACTGG TGGACAGCAA 60
ATGGGTCGGG ATCTGTACGA CGACCATGAC GATAAGGATC CGAGCTCGAG ATCTGCAGCT 120
GGTACCATGG AATTCATGAA AAAATGGTCT TCCAAACCTC GACAAGGCAT GGGGACGAAT 180
CTTTCTGTTC CCAATCCTCT GGGATTCTTT CCCGATCACC AGTTGGACCC TGCGTTCGGA 240
GCCAACTCAA ACAATCCAGA TTGGGACTTC AACCCCAACA AGGATCACTG GCCAGACGGA 300
AATCAGGTAG GAGTGGGAGC ATTCGGGCCA GGGTTCACCC CACCACACGG CGGTCTTTTG 360
GGGTGGAGCC CTCAGGCTCA GGGCATATTG ACAACAGTGC CAGCAGCGCC TCCTCCTGCC 420
TCCACCAATC GGCAGTCAGG AAGACAGCCT ACTCCCATCT CTCCACCTCT AAGAGACAGT 480
CATCCTCAGG CCATGCAGTG GAACTCCACC ACATTCCACC AAGCTCTGCT AGATCCCAGA 540
GTGAGGGGCC TATATTTTCC TGCTGGTGGC TCCAGTTCCG GAACAGTAAA CCCTGTTCCG 600
ACTACTGCCT CACCCATATC GTCAATCTTC TCGAGGACTG GGGACCCTGC ACCGAACGGA 660
[서열표 1b]
TCTGCAGCTG GTACCATGGA ATTCATGAAA AAATGGTCTT CCAAACCTCG ACAAGGCATG 720
GGGACGAATC TTTCTGTTCC CAATCCTCTG GGATTCTTTC CCGATCACCA GTTGGACCCT 780
GCGTTCGGAG CCAACTCAAA CAATCCAGAT TGGGACTTCA ACCCCAACAA GGATCACTGG 840
CCAGACGGAA ATCAGGTAGG AGTGGGAGCA TTCGGGCCAG GGTTCACCCC ACCACACGGC 900
GGTCTTTTGG GGTGGAGCCC TCAGGCTCAG GGCATATTGA CAACAGTGCC AGCAGCGCCT 960
CCTCCTGCCT CCACCAATCG GCAGTCAGGA AGACAGCCTA CTCCCATCTC TCCACCTCTA 1020
AGAGACAGTC ATCCTCAGGC CATGCAGTGG AACTCCACCA CATTCCACCA AGCTCTGCTA 1080
GATCCCAGAG TGAGGGGCCT ATATTTTCCT GCTGGTGGCT CCAGTTCCGG AACAGTAAAC 1140
CCTGTTCCGA CTACTGCCTC ACCCATATCG TCAATCTTCT CGAGGACTGG GGACCCTGCA 1200
CCGAACGGAT CAGCTTGA 1218
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 2
서열의 길이 : 405
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
[서열표 2a]
M R G S H H H H H H G M A S M 15
T G G Q Q M G R D T L M D D D 30
D K D P S S R S A A G T M G F 45
M K K W S S K P R Q G M G T N 60
L S V P N P L G F F P D H Q L 75
D P A F G A N S N N P D H Q L 90
N P N K D H W P D G N Q V G V 105
G A F G P G F T P P H G G L L 120
G W S P Q A Q G I L T T V P A 135
A P P P A S T N R Q S G R Q P 150
T P I S P P L R D S H P Q A M 165
[서열표 2b]
Q W N S T T F H Q A L L D P R 180
V R G L Y F P A G G S S S G T 195
V N P V P T T A S P I S S I F 210
S R T G D P A P N G S A A G T 225
M E F M K K W S S K P R Q G M 240
G T N L S V P N P L G F F P D 255
H Q L D P A F G A N S N N P D 270
H Q L N P N K D H W P D G N Q 285
V G V G A F G P G F T P P H G 300
G L L G W S P Q A Q G I L T T 315
V P A A P P P A S T N R Q S G 330
R Q P T P I S P P L R D S H P 345
Q A M Q W N S T T F H Q A L L 360
D P R V R G L Y F P A G G S S 375
S G T V N P V P T T A S P I S 390
S I F S R T G D P A P N G S A 405
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 3
서열의 길이 : 1767
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 핵산
[서열표 3a]
ATGCGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT GGTATGGCTA GCATGACTGG TGGACAGCAA 60
ATGGGTCGGG ATCTGTACGA CGACCATGAC GATAAGGATC CGAGCTCGAG ATCTGCAGCT 120
GGTACCATGG AATTCATGAA AAAATGGTCT TCCAAACCTC GACAAGGCAT GGGGACGAAT 180
CTTTCTGTTC CCAATCCTCT GGGATTCTTT CCCGATCACC AGTTGGACCC TGCGTTCGGA 240
GCCAACTCAA ACAATCCAGA TTGGGACTTC AACCCCAACA AGGATCACTG GCCAGACGGA 300
AATCAGGTAG GAGTGGGAGC ATTCGGGCCA GGGTTCACCC CACCACACGG CGGTCTTTTG 360
GGGTGGAGCC CTCAGGCTCA GGGCATATTG ACAACAGTGC CAGCAGCGCC TCCTCCTGCC 420
TCCACCAATC GGCAGTCAGG AAGACAGCCT ACTCCCATCT CTCCACCTCT AAGAGACAGT 480
CATCCTCAGG CCATGCAGTG GAACTCCACC ACATTCCACC AAGCTCTGCT AGATCCCAGA 540
GTGAGGGGCC TATATTTTCC TGCTGGTGGC TCCAGTTCCG GAACAGTAAA CCCTGTTCCG 600
ACTACTGCCT CACCCATATC GTCAATCTTC TCGAGGACTG GGGACCCTGC ACCGAACGGA 660
[서열표 3b]
TCTGCAGCTG GTACCATGGA ATTCATGAAA AAATGGTCTT CCAAACCTCG ACAAGGCATG 720
GGGACGAATC TTTCTGTTCC CAATCCTCTG GGATTCTTTC CCGATCACCA GTTGGACCCT 780
GCGTTCGGAG CCAACTCAAA CAATCCAGAT TGGGACTTCA ACCCCAACAA GGATCACTGG 840
CCAGACGGAA ATCAGGTAGG AGTGGGAGCA TTCGGGCCAG GGTTCACCCC ACCACACGGC 900
GGTCTTTTGG GGTGGAGCCC TCAGGCTCAG GGCATATTGA CAACAGTGCC AGCAGCGCCT 960
CCTCCTGCCT CCACCAATCG GCAGTCAGGA AGACAGCCTA CTCCCATCTC TCCACCTCTA 1020
AGAGACAGTC ATCCTCAGGC CATGCAGTGG AACTCCACCA CATTCCACCA AGCTCTGCTA 1080
GATCCCAGAG TGAGGGGCCT ATATTTTCCT GCTGGTGGCT CCAGTTCCGG AACAGTAAAC 1140
CCTGTTCCGA CTACTGCCTC ACCCATATCG TCAATCTTCT CGAGGACTGG GGACCCTGCA 1200
CCGAACGGAT CTGCAGCTGG TACCATGGAA TTCATGAAAA AATGGTCTTC CAAACCTCGA 1260
CAAGGCATGG GGACGAATCT TTCTGTTCCC AATCCTCTGG GATTCTTTCC CGATCACCAG 1320
TTGGACCCTG CGTTCGGAGC CAACTCAAAC AATCCAGATT GGGACTTCAA CCCCAACAAG 1380
GATCACTGGC CAGACGGAAA TCAGGTAGGA GTGGGAGCAT TCGGGCCAGG GTTCACCCCA 1440
CCACACGGCG GTCTTTTGGG GTGGAGCCCT CAGGCTCAGG GCATATTGAC AACAGTGCCA 1500
GCAGCGCCTC CTCCTGCCTC CACCAATCGG CAGTCAGGAA GACAGCCTAC TCCCATCTCT 1560
CCACCTCTAA GAGACAGTCA TCCTCAGGCC ATGCAGTGGA ACTCCACCAC ATTCCACCAA 1620
GCTCTGCTAG ATCCCAGAGT GAGGGGCCTA TATTTTCCTG CTGGTGGCTC CAGTTCCGGA 1680
ACAGTAAACC CTGTTCCGAC TACTGCCTCA CCCATATCGT CAATCTTCTC GAGGACTGGG 1740
[서열표 3c]
GACCCTGCAC CGAACGGATC AGCTTGA 1767
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 4
서열의 길이 : 588
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
[서열표 4a]
M R G S H H H H H H G M A S M 15
T G G Q Q M G R D T L M D D D 30
D K D P S S R S A A G T M G F 45
M K K W S S K P R Q G M G T N 60
L S V P N P L G F F P D H Q L 75
D P A F G A N S N N P D H Q L 90
N P N K D H W P D G N Q V G V 105
G A F G P G F T P P H G G L L 120
G W S P Q A Q G I L T T V P A 135
A P P P A S T N R Q S G R Q P 150
[서열표 4b]
T P I S P P L R D S H P Q A M 165
Q W N S T T F H Q A L L D P R 180
V R G L Y F P A G G S S S G T 195
V N P V P T T A S P I S S I F 210
S R T G D P A P N G S A A G T 225
M E F M K K W S S K P R Q G M 240
G T N L S V P N P L G F F P D 255
H Q L D P A F G A N S N N P D 270
H Q L N P N K D H W P D G N Q 285
V G V G A F G P G F T P P H G 300
G L L G W S P Q A Q G I L T T 315
V P A A P P P A S T N R Q S G 330
R Q P T P I S P P L R D S H P 345
Q A M Q W N S T T F H Q A L L 360
D P R V R G L Y F P A G G S S 375
S G T V N P V P T T A S P I S 390
S I F S R T G D P A P N G S A 405
A G T M E F M K K W S S K P R 420
[서열표 4c]
Q G M G T N L S V P N P L G F 435
F P D H Q L D P A F G A N S N 450
N P D H Q L N P N K D H W P D 465
G N Q V G V G A F G P G F T P 480
P H G G L L G W S P Q A Q G I 495
L T T V P A A P P P A S T N R 510
Q S G R Q P T P I S P P L R D 525
S H P Q A M Q W N S T T F H Q 540
A L L D P R V R G L Y F P A G 555
G S S S G T V N P V P T T A S 570
P I S S I F S R T G D P A P N 585
G S A 588
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 5
서열의 길이 : 18
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)
[서열표 5]
GATAAGGATC CGAGCTCG
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 6
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)
[서열표 6]
GCTGGATCCG TTCGGTGCAG GGTCCCC

Claims (10)

  1. B형 간염 바이러스 표면항원 pre S 단백질이 중복된 새로운 pre S 항원 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 표면항원 pre S 단백질은 pre S1 및 pre S2 항원이 함께 포함되는 것을 특징으로 하는 pre S 항원 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 표면항원 pre S 단백질은 아미노 말단 2번째 및 3번째 아미노산이 라이신인 pre S 항원 변이단백질인 것을 특징으로 하는 pre S 항원 단백질.
  4. 제 3항에 있어서, 표면항원 pre S 단백질이 두 번 중복된 pre S 다이머인 것을 특징으로 하는 pre S 항원 단백질.
  5. 제 3항에 있어서, 표면항원 pre S 단백질이 세 번 중복된 pre S 트라이머인 것을 특징으로 하는 pre S 항원 단백질.
  6. 제 4항의 pre S 다이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pRSETpreSD.
  7. 제 6항의 발현 플라스미드를 포함하는 대장균 형질전환체 BL21DE3/pRSETpreSD (수탁번호 : KCTC 8759P호).
  8. 제 5항의 pre S 트라이머 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pRSETpreST.
  9. 제 8항의 발현 플라스미드를 포함하는 대장균 형질전환체 BL21DE3/pRSETpreST ( 수탁번호 : KCTC 8760P호).
  10. 제 7항 또는 제 9항의 대장균 형질전환체를 배양하여 단백질의 발현을 유도하고 이로부터 pre S 다이머 단백질 또는 pre S 트라이머 단백질을 생산하는 pre S 항원 단백질의 제조방법.
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