KR0156659B1

KR0156659B1 - 상황의 균사체 배양에 의한 항암 성분의 생산방법

Info

Publication number: KR0156659B1
Application number: KR1019950033680A
Authority: KR
Inventors: 소성; 박경목
Original assignee: 이능희; 주식회사태평양
Priority date: 1995-10-02
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 1998-10-15
Also published as: KR970021287A

Abstract

상황(Phellinus igniarus)의 균사체를 액체 배지에서 배양하는 제1공정; 상기 제1공정에서 얻은 배양액을 여과하여 배양액으로부터 균사체를 분리하는 제2공정; 제2공정에서 분리한 균사체를 열수 추출하여 여액을 얻는 제3공정; 제3공정에서 얻은 여액을 용매로 침전하여 침전물을 얻고 이를 증류수에 용해시켜 균사체 추출용액을 얻는 제4공정; 제4공정에서 얻은 균사체 추출용액 및 상기 제2공정에서 균사체를 분리하고 남은 배양액을 각각 분획분자량이 10,000인 초여과막에 통과시켜 막 위에 남는 분자량10,000이상의 침전몰을 얻은 제5공정을 포함함을 특징으로 하는 상황(Phellinus igniarus)의 액체배양에 의한 항암, 면역증강성분을 생상하는 방법이 제공된다.

Description

상황(Phellinus igniarus)의 균사체 배양에 의한 항암 성분의 생산방법

제1도는 본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라 상황의 균사체를 액체배양하여 다량증식한 후, 항암성분을 얻는 공정을 보여주는 공정도이다.

본 발명은 항암 성분의 생산 방법에 관한것이고, 보다 상세하게는 버섯의 균사체를 액체 배양하고 배양액으로부터 우수한 항암작용 및 면역증강 작용을 갖는 추출물을 얻는 방법에 관한 것이다.

종래 구멍장이버섯과(Polyporeceae)의 구름버섯속(Corioulus)에 속하는 운지버섯(Coriolus versicolor)에서 분리된 크레스틴(Krestin)이 항암작용을 갖는 다는 것이 알려져 있다.

한편, 말똥진흙버섯(펠리누스 이그니아루스; Phellinus igniarus)은 소나무비늘과 (Hymenochataceae),진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 버섯으로서, 활엽수의 고목에 기생하는 다년생 목재부후균으로 한방에서는 상황이라는 약재로 알려져있다. 본 발명에서는 주로 상황의 명칭을 사용한다.

한방에서 알려진 약리작용으로는 땀의 분비억제, 소량 투여시 평활근 흥분, 대량 투여시 평활근억제, 항암작용이 있다고 알려져 있으며 생식기 출혈, 대하증, 탈황, 부인허약, 임파선염, 장출혈, 설사, 이질에 사용된다고 보고되어 있다.

한방에서는 Phellinus igniarus의 자실체를 자연상태에서 채취하여 사용하여 왔는데, 상황은 주로 뽕나무 고목에서 발생하며 다년생이기 때문에 그 수가 극히 제한되어 수득하기가 어렵다.

인공적으로 목재나 톱밥등의 고형배지를 이용하여 버섯을 재배할 수 있으나 완전한 자실체를 형성시키는데 오랜 기간이 소용된다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 고체배지를 이용하여 다량증식시키고자 하는 시도가 있었으나 균사체를 약60일간 이상 배양하여야만 하는 문제점이 있었다.

본 발명자는 이를 개선하여 용이한 방법으로 단기간내에 상황의 유효성분을 수득하기 위한 연구를 한 결과로서, 상황(Phellinus igniarus)의 균사체가 액체배지에서 용이하게 배양이되며, 액체배양에 의해 수득한 균사체 또는 액체배양액에서 추출한 단백다당체가 뛰어난 항암효능을 가지고 있음을 확인하여 본 발명에 이르게 된다.

본 발명의 목적은 우수한 항암작용 및 면역증강작용을 나타내는 유효성분을 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 상황(Phellinus igniarus)의 균사체를 액체 배지에서 배양하는 제1공정; 상기 1공정에서 얻은 배양액을 여과하여 배양액으로부터 균사체를 분리하는 제2공정; 제2공정에서 분리한 균사체를 열수 추출하여 여액을 얻는 제3공정; 제3작용에서 얻은 여액로 용매로 침전하여 침전몰을 얻고 이를 증류수에 용해시켜 균사체 추출용액을 얻는 제4공정; 제4공정에서 얻은 균사체 추출용액 및 상기 제2공정에서 균사체를 분리하고 남은 배양액을 각각 분획분자량이 10,000인 초여과막에 통과시켜 막 위에 남는 분자량10,000이상의 침전물을 얻는 제5공정을 포함함을 특징으로 하는 상황(Phellinus igniarus)의 액체배양에 의한 항암, 면역증강성분을 생산하는 방법을 제공한다.

상기한 본 발명의 목적, 그외의 목적, 특징 및 장점은 하기 발명의 상세한 설명란에 의해 당업자에세 명백하게 드러날 것이다.

상황은 야생에서 재취 할 수 있으며 다음과 같은 형태학적 특성이나 분류학적 기준에 의거하여 확인 할 수 있다.

상황(Phellinus igniarus)은 형태학상 다년생이며, 말굽형으로 지름이 50㎝에 이르는 경우도 있으며, 두께가 10-25㎝이다, 표면에는 털이 없으며, 회갈색-회흑색이다. 환문에는 종횡으로 균일이 있으며, 유질은 짙은 암갈색이다. 갓의 아래 부분은 암갈색으로 관공은 다층으로 형성되고 각층의 두께가 1-5㎜이다. 관공구는 미세하며4-5㎜정도이다.

포자는 유구형으로 무색이며, 평활하소 5-6 X 4-5미크론 정도이다. 뽕나무, 오리나무, 자작나무의 고목에서 기생한다. 이의 모양은 원색일본균류도감(1965, 로쿠야 이마제끼 저, 호이쿠사 발행)에 상세하게 기재되어 있다.

상황(Phellinus igniarus)의 균사체는 야생에서 채취한 자실체에서 포자를 얻어 발아시킴으로 수득할 수 있다. 즉, 포자를 멸균된 증류수로 수회 세척한 후 맥아즙 한천배지(맥아즙 20g , 펩톤5g, 한천15g, 증류수1L)에 도말하여 24℃에서 7일간 배양하여 균사체를 얻는다. 균사체는 맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여4℃에 보관하고 1O개월마다 계대배양하여 사용한다.

사면배지에서 자란 균사체를 무균으로 균질화하여 이를 액체배지에 접종한다.

액체배지로는 포도당 3-6%, 바람직하게는 약4%, 전분3-6%, 바람직하게는 약4%, 효모엑기스1.0-1.5%, 바람직하게는 약 1.2%, 맥아즙0.5-2%바람직하게는 약1%를 함유하는 영양배지가 균사체의 성장이 양호한 측면에서 바람직하다.

균사체의 액체배양은 발효조에서 온도 20-28℃, 바람직하게는 약24℃, 회전수150-250rpm, 통기량 약 0.5vvm의 조건으로 약4일 이상, 바람직하게는 약 5-7일간 배양한다.

배양액을 여과하여 얻은 균사체는 수세한 후 약 2-5배량, 바람직하게는 약3배량의 증류수를 가하여 80-150℃, 바람직하게는 약100℃에서 약4시간동안 추출한 후 여과한다. 진사를 제거한 여과액을 감압농축기로 약1/10량으로 농축한후, 농출물에 대해 약3배량의 알콜, 바람직하게는 에칠알콜을 가하여 저온,약4℃에서 하룻밤 방치한다. 생성된 침점물은 약12,000rpm에서 약30분간 원심분리하여 수거하고 이르 소량의 증류수에 녹인후 분자량10,000의 초여과막에 여과하여 분자량10,000이하의 저분자 물질을 제거하고, 동격건조하여 시료 P-1을 얻는다.

균사체를 제거한 배양액을 분자량10,000의 초여과막에 여과하여 저분자 물질을 제거한 후 3배의 에칠알콜을 가해 침전시킨다. 침전을 제거한 여액을 농축건조하여 시료 P-21을 얻고, 침전물만을 건조하여 시료P-22를 얻는다.

본 발명자들을 이와 같이 수득한 상황(Phellinus igniarus)의 균사체 추출물의 분획이 면역세포를 활성화시켜 항체생성을 촉진하며 복수암과 고형암이 유발된 실험동물에서 생존율을 크게 증가시키고 고형암의 크기를 줄여주는 효과가 매우 뛰어나 탁월한 항암력을 갖는 것이 실험에 의해 확인되었다.

따라서, 본 발명은 종래 장기간의 시간이 소요되었던 구체배양과 달리 액체배양을 채택하여 균사체를 배양함으로써 약5일정도의 단시간 내에 배양을 완료 할 수 있고, 나아가 분자량10,000이상의 뛰어난 항암효능을 갖는 단백다당체를 얻을 수 있게 한다.

이하 각종 예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

야생에서 채취한 상황(Phellinus igniarus)의 자실체에서 포자를 얻고, 이를 멸균된 증류수로 수회 세척한 후 맥아즙 한천배지(맥아즙20g, 펩톤5g, 한천15g, 증류수1L)에 도말하여 24℃에서 7일간 배양하여 균사체를 얻었다. 균사체는 맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다.

이렇게 하여 균사체를 포도당 약4%, 전분약4%, 효모액기스약1.2%, 맥아즙약1%를 함유하는 영양배지가 든 발효조에서 온도약24℃, 회전수 약200rpm, 통기량 약0.5vvm의 조건으로 5일간 배양하였다.

배양 완료후, 배양액을 여과하여 얻은 균사체는 수세한 후 약 3배량의 증류수를 가하여 약100℃에서 4시간동안 추출한 후 여과하였다. 잔사를 제거한 여과액을 감압농축기로 약1/10량으로 농축한 후, 농축물에 대해 약3배량의 에칠알콜을 가하여 4℃에서 하룻밤 방치한다. 생성된 침점물을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 수거하고 이를 소량의 증류수에 녹인 후 분자량10,000의 초여과막에 여과하여 분자량 10,000이하의 저분자 물질을 제거하고, 동결건조하여 시료P-1을 얻었다.

균사체를 제거한 배양액을 분자량 10,000의 초여과막에 여과하여 저분자 물질을 제거 한 후 3배의 에칠알콜을 가해 침전시켰다. 침전을 제거한 여액을 농축건조하여 P-21을 얻고, 침점물만을 건조하여 시료P-22를 얻었다. P-1과 P-22시료는 단백다당체 성분이다.

이상의 공정을 제1도에 도시화하여 도시하였다.

[실험예]

상기 실시예1에 의해 조제된 상황(Phellinus igniarus)의 균사체 또느 배양액 추출물은 현재 항암제로서 상용화된 운지버섯 다당체인 크레스틴(krestin)과 효능을 비교하여 본 결롸 월등한 효과를 보여 매우 효과적인 항암제 및 면역증강제로 사용될 수 있음을 시사하였다.

[실험예1-B-세포의 항체생성의 측정]

1. T-세포와 B-세포의 분리

정상 성인 자원자의 정맥피를 체혈하여 HBSS(Hanks' balanced salt solution)와 같은 양으로 섞어 피콜 하이파크(Ficoll hypaque)위에 얹은후 2,000rpm에서 20분간 원심분리하여 계면층에서 단핵시포를 얻었다.

HBSS로 두번 세척한 후, HBSS 4ml, 우태아 형청 1.2ml와 뉴라미니다제(Neuraminidase)를 처리한 면양 적혈구와 섞었다. 면양 적혈구와 섞은 단핵세포를 2,000rpm에서 2분간 원심분리하여 30 분간 정체시켰다.

침전된 세포를 피콜 하이파크위에 얹고 2,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 계면층에서 대식세포와B-세표를 얻었다.

이 세포를 우태아 혈청이1%들어있는 RPM1 1640배지에 현탁하여 37℃,습도5%의 CO₂배양기에서 1시간 배양시켜 흡착성 세포인 대식세포를 제거하고 B-세포만을 분리하였다.

2. B-세포의 항체생산능의 측정

10%우태아 형청, 0.02%의 스타필로코커스 아우레스(Staphylococcus aureus Cowan l:SAC)를 첨가한 RPMI 1640배지에 B-세포를 1×10⁶세포/MI의 농도가 되게한 후, 96웰 플레이트에서 10시간 배양한후, 하기 표 1에 나타낸 본 발명 시료및 비교용 물질로서 크레스틴을 가하여 6일간 배양을 계속하였다.

시험시료는 건조된 시료를 RPMI 1640배지에 용해시켜 여과제균시킨 후 배지의 1%와 5%의 농도로 되게 가하였다.

B-세포에서 생성된 항체의 양은 효소면역활성측정법(Emzyme linked immuno sorbent assay: ELISA)에 의해 측정하였다.

96-웰 플레이트의 각 웰에 0.05M 탄산염 완충액으로 0.1μl/ml농도로 조정된 항-인간 lg 항혈청(anti-human lg antiserum)50μl를 넣어 실온에서 15시간 정치시켰다.

각 웰에 1% PBSA(우혈청 알부민을 1% 포함한 인산완충생리식염수)100μl를 넣고 실온에서 1시간 반응시킨후, 항체 생성을 유도한 B-세포 배양액을 100μl씩 각 웰에 넣고 37℃에서 2시간 반응하였다.

0.05%의 트윈(tween)-20을 넣은 PBS(TPBS)로 세척하고나서 항-인간 면역글로블린-양고추냉이 퍼옥시다제(antk-human lg-HRP(Horseraddish peroxida

-se): PBS로 1:1000의 회석)50μl를 넣고 37℃에서 2시간 반응하였다.

0.05%의 TPBS로 세척한후 50㎕의 OPD(O-phenylenediamine)용액을 넣어 발색시킨후 1N 황산을 100㎕넣어 반응를 중지시켰다.

발색도를 ELISA reader로 파장 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 하기 표1에 나타내었다.

상기의 결과를 본 발명에 따라 얻어진 시료 P-1,P-21과 P-22는 미처리군에 비해 월등하게 항체생성을 촉진하였고, 특히 시료 P-1과 P-22는 상용화된 항암제Krestin(일본국 산쿄제약)에 비해서도 높은 항체생성 촉진 효과를 보였다.

[실험예2 복수암 억제 효과]

Sarcoma 180 세포1×10개를 ICR생쥐(6주령, 25±2g)숫컷을 복강에 접종하였다.

측정시료는 멸균시료는 멸균생리식염수에 현탁하여 생쥐의 체중㎏당 10㎎씩 매일 1회10일간 복강주사하였다. 각 군당 실험동물 수는 15마리로 하고 암세포 주사후 50일간 관찰하여 생존율을 측정하였다.

상기 결과에서 본 발명의 시료 P-01, P-21 및 P-22는 아무것도 투여하지 않은 대조군에 비해 209%의 높은 생존율을 보여 주었고, 특히 P-01과 P-22는 크레스틴의 178%에 비해서도 높거나 뛰어난 복수암 억제효과를 보였다.

[실험예3 고형암 억제효과]

Sarcoma 180 ICR생쥐(6주령, 25±2g)숫컷의 우측 서혜부에 1×10개씩 피아이식하였다.

동결건조한 측정시료를 멸균생리식염수에 현탁하여 생쥐의 체중㎏당 10㎎씩 매일1회10일간 복강주사하였다.

각군당 실험동물 수는 15마리로 하고 암세포 이식후 21일에 치사시켜 암조직을 적출한 후 크기를 측정하여 저해율을 계산하였다. 결과를 하기 표3에 나타내었다.

상기의 결과에서 상황(Phellinus igniarus)의 추출물 P-01과 P-22는 고형암을 21일만에 각각92%및 93%수준으로 저해해, 크레스틴89%에 비해 월등히 뛰어난 고형암 저해효과를 보였다.

Claims

상황(Phellinus igniarus)의 균사체를, 포도당3∼6%, 전분3∼6%, 효모엑기스1.0∼1.5%및 맥아즙0.5∼2%를 함유하는 영양배지에서, 20∼28℃의 호기성 건조하에서 5℃6일간 액체배양하는 제1공정; 상기 1공정에서 얻은 배양액을 여과하여 배양액으로부터 균사체를 분리하는 제2공정; 제2공정에서 분리한 균사체를 열수 추출하여 여액을 얻는 제3공정; 제3공정에서 얻은 여액을 용매로 침전시켜 침전물을 얻고, 이를 증류수에 용해시켜 균사체 추출용액을 얻는 제4공정; 재4공정에서 얻은 균사체 추출용액 및 상기 제2공정에서 균사체를 분리하고 남은 배양액을 각각 분획분자량이 10,000인 초여과막에 통과시켜 막 위에 남는 분자량 10,000이상의 침전물을 얻는 제5공정을 포함하는 특징으로 하는 상황(Phellinus igniarus)의 액체배양에 의한 항암, 면역증강 성분을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제5공정에서 배약액을 초여과막에 통과시켜 얻은 침전물을 용매로 침전시켜 침전물을 얻은 공정을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1공정에서 사용되는 영양배지는 포도당 약4%, 전분 약4%, 효모엑기스 약1.2%및 맥아즙 약1%를 함유하는 영양배지임을 특징으로 하는 방법.