KR0148573B1 - 생체 내계의 시스테인 농도를 증가시키는 방법 및 아미노산 수액 - Google Patents
생체 내계의 시스테인 농도를 증가시키는 방법 및 아미노산 수액Info
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Abstract
본 발명은 Glu-Cys-Cys 및/또는 (Clu-Cys)2을 함유하는 영양조성물을 첨가하여 생체내 (in vivo) 계에 시스테인의 농도를 증가시키는 방법을 제공한다. 또한 가열 살균으로 제조된 액체 영양 조성물에 함유될 수 없는 시스테인 또는 시스틴을 본 발명의 아미노산 수액에 의해 영양성분으로서 공급할 수 있다.
Description
제1도는 생쥐에게 γ-Glu-Cys-Cys 을 주사한 후 시간 경과에 따른 혈액 내 γ-Glu-Cys-Cys 및 구성 아미노산의 농도 변화를 나타낸다. 기호 ○-○, □-□ 및 ●-● 은 각각 γ-Glu-Cys-Cys, 글루탐산 및 시스틴을 나타낸다.
제2도는 생쥐에게 (γ-Glu-Cys)2를 주사한 후 시간 경과에 다른 혈액 내 (γ-Glu-Cys)2, γ-Glu-Cys-Cys 및 그의 구성 아미노산의 농도 변화를 나타낸다. 기호 ○-○, ■-■, □-□, 및 ●-● 은 각각 (γ-Glu-Cys)2, γ-Glu-Cys-Cys, 글루탐산 및 시스틴을 나타낸다.
제3도는 생쥐에게 (Ala-Cys)2를 주사한 후 시간 경과에 따른 혈액 내 (Ala-Cys)2, 알라닐시스틴 [이하 Ala-(Cys)2로 약칭함]및 그의 구성 아미노산의 농도 변화를 나타낸다. 기호 ○-○, ■-■, □-□, 및 ●-● 은 각각 (Ala-Cys)2, Ala-(Cys)2, 알라닌 및 시스틴을 나타낸다.
제4도는 생쥐에게 γ-Glu-Cys-Cys, (γ-Glu-Cys)2및 (Ala-Cys)2를 주사한 후 시간 경과에 따른 신장 내 글루탐산 및 알라닌의 농도 변화를 나타낸다. 기호 □-□, ■-■ 및 ○-○ 은 각각 γ-Glu-Cys-Cys 로부터 유도된 글루탐산, (γ-Glu-Cys)2로부터 유도된 글루탐산 및 (Ala-Cys)2로부터 유도된 알라닌을 나타낸다.
본 발명은 수액(infusions) 및 스포오츠 음료와 같은 포유류용 영양 조성물 및 더 상세하게는 L-글루타밀-L-시스틴(이하 Glu-Cys-Cys 로 약칭함) 및/또는 L-글루타밀-L-시스테인 디설파이드[이하(Glu-Cys)2로 약칭함]를 함유하는 영양 조성물에 관한 것이다.
L-시스테인(이하, 시스테인으로 약칭함) 이 생체에서 L-메티오닌(이하, 메티오닌으로 약칭함)으로부터 합성되므로, 시스테인은 필수 아미노산으로 간주되지 않는다. 그러므로, 시스테인과 같은 황-함유 아미노산의 영양보충은 메티오닌을 사용하여 이루어진다. 그러나, 최근 메티오닌의 시스테인으로의 전환이 신생아 및 간경변증, 호모시스틴혈증 등의 환자 체내에서 충분히 일어나지 않는다고 밝혀져 있다. 그래서 황-함유 아미노산의 양양보충을 위해 메티오닌 뿐만 아니라 시스테인을 보충하는 것이 필요하다고 지적되고 있다.[Metabolism, 37, No. 8,796(1988)].
또한, 과도한 운동 또는 과음 후에 황-함유 아미노산에 대한 요구는 증가하며, 시스테인 또는 시스테인 잔기를 갖는 L-글루타티온 (γ-L-glutamyl-L-시스테이닐-글리신, 이하 글루타티온으로 약칭함)의 투여효과가 인정되는 것이 밝혀지고 있다.
시스테인은 용액 내에서 불안정하여 시스테인을 수액과 같은 액체 영양 조성물에 직접 가하는 것은 어렵다. 시스테인 대신 N-아세틸-L-시스테인을 사용하는 것이 연구되고 있고 부분적으로 실행되고 있다. 그러나, 그의 안정성 문제가 지적되고 있다. 더욱이, 시스테인 잔기를 갖는 글루타티온은 시스테인보다 더 안정하지만 가열살균시 상기 문제는 해결되지 않은 채로 남는다. 한편, L-시스틴(이하, 시스틴으로 약칭함)은 영양학적 관점에서 시스테인과 동등한 것으로 간주되며, 이것은 시스테인의 산화된 형태로 매우 안정하다. 그러나, 시스틴은 물에서의 저용해도(25℃ 에서 0.11 g/ℓ 미만)때문에 수액 등에 사용될 수 없다. 최근, 이 목적을 위해 시스틴잔기를 갖는 글루타티온 디설파이드(글루타티온의 산화된 형태)을 조사하였지만 아직 샐행용으로 제공되고 있지 않다.
시스테인의 안정성을 향상시키는 방법으로 상술된 바와 같이 시스테인을 아세틸화하는 방법이 공지되어 있다. 이 방법은 수액의 처방전에 실제 부분적으로 사용되고 있다. 영양학적 관점에서 시스테인과 동일한 것으로 간주되는 시스틴에 대해, 시스틴 잔기를 갖는 글루타티온 디설파이드를 사용하고 시스틴을 펩티드로 전환시킴으로써 용해도를 향상시키는 방법이 연구되고 있다. 시스틴-함유 펩티드를 함유하는 영양 조성물로, N,N'-비스-α-L-아스파르틸-L-시스틴[이하 (Asp-Cys)2로 약칭함]을 함유하는 조성물 (일본국 특허 공개 제 151156/87호), N2-시스테이닐-N6-L-시스테이닐-L-리신[이하, Cys-Lys(Cys)로 약칭함]을 함유하는 조성물 (DE 3206810), (X-Cys)2(식 중, X는 Gly, Ala, Leu, Ile 또는 Phe 이다)로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물 (EP 264953), 비스(아세틸글리실)-L,L-시스틴을 함유하는 조성물 (일본국 특허 공개 제 233999/88호)등이 공지되어 있다. 또한, L-시스테이닐-비스-L-알라닌[이하(Cys-Ala)2로 약칭함]의 용해도가 Clin. Nutr., Spec. Suppl. 4, 116∼123(1985)에 보고되어 있고, 혈액 내 비스-α-L-알라닐-L-시스틴[이하 (Ala-Cys)2로 약칭함]및 비스-글리실-L-시스틴[이하 (Gly-Cys)2로 약칭함]의 작용이 J. Nutrition 118, 1470(1988)에 보고되어 있다.
가열살균으로 제조된 액체 형태의 영양 조성물로 불안정한 시스테인 또는 영양학적으로 시스테인과 동일한 시스틴을 제공하는 기술의 개발이 소망되고 있다.
본 발명은 Glu-Cys-Cys 및/또는 (Glu-Cys)2을 함유하는 생체내(in vivo)계에 시스테인을 상기 계내 시스테인의 농도를 증가시키기에 충분한 양으로 도입하기 위한 비-시스테인 함유 영양 조성물을 제공한다. 본 발명 영양 조성물에 의해 가열 살균으로 제조된 액체 영양 조성물에 함유될 수 없는 시스테인 또는 시스틴을 영양성분으로 공급할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 펩티드(들)을 경구적으로, 비경구적으로 또는 장내로 투여함으로써 시스테인을 생체내 계로 도입하는 방법을 제공한다.
본 발명은 이하에 자세히 기술된다.
Glu-Cys-Cys 및 (Glu-Cys)2은 α 및 γ 두 타입으로 분류된다. 두 타입 모두 본 발명에 사용될 수 있지만, 바람직하게는 γ 타입이 사용된다.
Glu-Cys-Cys 및 (Glu-Cys)2를 Method in Enzymology, 113, 555-564(1985)에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
펩티드를 통상적으로 용액, 페이스트, 분말 등의 형태로 아미노산 및 영양소와 같은 기타 성분과 함께 사용하지만, 다른 성분 없이 용액으로 사용하기도 한다.
Glu-Cys-Cys 및 (Glu-Cys)2를 단독으로 또는 혼합물로 가하기도 한다. 영양 조성물은 상기 화합물 또는 그의 혼합물 둘 중 하나를 0.005∼30 중량%의 양으로 함유하기도 한다.
시스틴 또는 시스테인 보충을 위해 영양학적으로 바람직한 영양 조성물의 예에는 아미노산 수액, 경구 영양 보충용 영양제 및 젤리형 영양제와 같은 영양첨가물, 아미노산 또는 단백질 가수 분해물(펩티드)과 함께 Glu-Cys-Cys 및/또는 (Glu-Cys)2를 함께 함유하는 조성물 뿐만 아니라 물, 생리식염수 또는 완충 용액에 용해시킨 Glu-Cys-Cys 및/또는 (Glu-Cys)2의 용액이 포함된다.
경구 또는 장내 투여의 경우, 쉽게 소화할 수 있는 탄수화물, 지방 비타민 및 무기질과 같은 영양첨가물을 조성물에 가하여 영양 균형을 맞추기도 한다. 또한 가(假)감미제, 감미료, 조미료 및 염료와 같은 감미제, 향미제, 외관-향상제 등도 경구 투여용 조성물의 풍미를 향상시키기 위해 첨가할 수 있다. 영양첨가제의 구체적인 예에는 녹말, 덱스트린, 글루코오즈, 말토오즈, 락토오즈, 탈지유, 난황 분말, 난황 기름, 맥아엑스, 매개 사슬 지방산, 비타민 A, 티아민, 리보플라빈, 피리독신, 니아신, 판토텐산, 시아노코발아민, L-아스코르빈산, α-토코페롤, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 유산철이 포함된다.
상술된 성분을 혼합하고, 물과 혼합하고, 분산시키고, 음료 또는 페이스트로 수득된 조성물을 습윤보강백, 병, 캔 등에 밀폐시킨 후, 저장, 분배 및 사용을 위해 가열살균한다. 한편, 성분을 분말상태로 잘 혼합하고 분말 조성물을 물과 혼합하고 저장 또는 분배하는 동안 또는 사용 직전에 분산시킨다. Glu-Cys-Cys 및(Glu-Cys)2는 가열에 매우 안정하며 용액 내에서 장시간에 걸쳐 안정하므로, 이들을 가열조리 및 살균과 같은 처리를 자유롭게 수행할 수 있다.
Glu-Cys-Cys 및/또는 (Glu-Cys)2를 함유하는 아미노산 수액은 예를 들어, 하기 조성을 가지며, 이때 단위는 mg/dℓ 이다.
본 발명의 아미노산 수액을 통상적인 아미노산 수액의 제조 방법, 예를 들어 하기 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 상술된 아미노산 조성물로부터 수득할 수 있다.
Glu-Cys-Cys 및 (Glu-Cys)2는 비교예 1 에 기재된 바와 같이 시스틴에 비해 매우 높은 용해도를 가지며 영양 조성물의 형태로 가열 살균 또는 장기간에 걸친 저장 동안에도 매우 안정하다는 것을 확인한다. 예를 들어, 이 물질은 pH 6.5의 10 mM 농도에서 110℃, 20분간의 가열처리에 의해 거의 분해되지 않는다. 또한, 이 물질은 pH 6.5 의 10mM 농도에서 40℃로 60일간 방치하여도 분해되지 않는다.
[비교예 1]
γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)2의 용해도를 시스틴 및 공지된 시스틴-함유 펩티드의 용해도와 비교한다. γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)2의 용해도가 시스틴과 비교하여 현저하게 향상된 것을 확인한다.
γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)는 천연에 존재하는 펩티드이므로, 생체내에서 효율적으로 이용된다. 사실, 상기 화합물이 독립적으로 생쥐에게 피하 투여될 경우, 이들을 신장 글루타티온 합성에서 이용할 수 있다 [M.E. Anderson and A. Meister, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 80, pp. 707(1983). 게다가, γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)는 생체 내에서 γ-글루타밀 전이효소에 대한 기질이 될 수 있고 생체 내에서 효과적으로 이용될 수 있다고 추측된다.
γ-글루타밀 전이 효소에 의한 γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)의 가수 분해, 이들의 사람 및 생쥐 혈장 내에서의 시험관내 (in vitro) 가수분해, 및 주사후 이들의 혈액으로부터 소멸과 신장 내 흡수는 비교예 2∼6을 참고로 하기에 기술된다.
[비교예 2]
γ-글루타밀 전이효소에 의한 γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)의 가수분해를 하기에 기술되는 시험 방법에 따라 (Asp-Cys), (Gly-Cys)및 (Ala-Cys)의 가수분해와 비교한다. 본 발명에 사용되는 전자 두 화합물은 거의 완전하게 가수분해되는 반면, 공지된 후자 세 개의 화합물은 가수분해되지 않는다. 그래서, 생체 내 이용에 대한 이들 펩티드 사이에 차이점이 인식된다.
[시험방법]
펩티드를 5mM 농도로 트리스-히드로클로라이드 완충용액(pH7)에 용해시키고, 돼지 신장으로부터 제조된 γ-글루타밀 전이효소를 상기 용액에 가한다. 37℃에서 120분간 반응시킨 후, 잔존하는 펩티드의 양을 측정한다.
[비교예 3]
사람 혈장내 γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)의 시험관 내 가수분해를 하기에 기술되는 시험 방법에 따라 표 2 에 기재된 공지된 시스틴-함유 펩티드의 시험관 내 가수분해와 비교한다. 표 2 에 기재된 바와 같이, 본 발명에 사용된 전자 두 개의 화합물은 혈장 내에서 공지된 후자 세 개의 화합물과 반대로 어렵게 가수분해된다. 그래서, 생체 내 이용에 대한 이들 펩티드 사이에 명백한 차이점이 인식된다.
[시험방법]
사람으로부터 수거 및 제조된 플라스마 100㎕에 생리식염수에 용해시킨 24mM 펩티드 용액 10㎕을 가한다. 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 잔존하는 펩티드의 양을 측정한다.
[비교예 4]
생쥐 혈장 내 γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)의 시험관 내 가수분해를 하기 기술되는 시험 방법에 따라 (Ala-Cys)의 시험관 내 가수분해와 비교한다.
표 3 에 나타나 바와 같이, 본 발명에 사용된 전자 두 화합물은 혈장 내에서 (Ala-Cys)와 반대로 어렵게 가수분해된다.
[시험방법]
C3H/He 생쥐 (6 주령, 수컷, 22g 중량)로부터 수거 및 제조된 50 ㎕의 혈장에 생리식염수에 용해시킨 27.1mM 펩티드 용액 5㎕을 가한 후, 37℃ 에서 30분간 반응시킨다. 하나의 시험군에 5마리의 생쥐를 사용하고, 그 결과는 평균치로 나타낸다.
[비교예 5]
생쥐 혈액으로부터의 γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)의 소멸을 하기 기술될 시험 방법에 따라 (Ala-Cys)의 것과 비교한다. (Al-Cys)는 투여 후 매우 빠르게 혈액으로부터 소멸되고, 동시에 알라닌이 혈액 내로 빠르게 방출되는 것이 관찰된다. 한편, γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)를 수용한 군에서 펩티드 양의 감소 및 글루탐산 양의 증가는 적절하다. 그래서, 혈액 내 펩티드 소멸에서의 큰 차이점이 인식된다.
[시험방법]
γ-Glu-Cys-Cys, (γ-Gly-Cys)및 (Ala-Cys)의 생리식염수 용액을 각각 C3H/He 생쥐 (6 주령, 수컷, 22g 중량)의 군에게 250μ몰/kg 체중의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 주사한 후, 혈액을 30분간 수거한다. 시간 경과에 따른 혈액 내 펩티드 및 그의 구성 아미노산의 농도 변화를 측정한다. 하나의 시험군에 5마리의 생쥐를 사용하고, 그 결과를 표 4에 평균 ±SEM으로 나타낸다.
[비교예 6]
생쥐 신장에 의한 γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)2의 흡수를 하기 기술된 시험 방법에 따라 (Ala-Cys)2의 것과 비교한다.
γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)2를 각각 수용한 군에서 글루탐산의 농도는 매우 높고, 이것은 신장에 의한 펩티드의 흡수 및 그의 효과적 이용을 제안한다. 한편, 시스틴은 시험된 임의의 펩티드에 대해 신장에서 검출되지 않는다.
[시험방법]
γ-Glu-Cys-Cys, (γ-Glu-Cys)2및 (Ala-Cys)2의 생리식염수 용액을 각각 C3H/He 생쥐 (6 주령, 수컷, 22g 중량)의 군에게 250 μ몰/kg 체중의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 투여한지 1분, 5분 및 20분 후에 신장 내의 글루탐산, 알라닌, 시스틴을 측정한다. 하나의 시험군에 5마리의 생쥐를 사용하고, 그 결과를 표 5 에 평균 ±SEM으로 나타낸다.
상기와 같이, γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)는 혈장 내에서 기타 시스틴-함유 펩티드와 비교하여 거의 가수분해되지 않고, γ-글루타밀 전이효소에 의해 특이하게 가수분해된다. γ-글루타밀 전이효소는 신장, 소장, 간 등의 생체 조직에 넓게 분포되어 있다. γ-Glu-Cys-Cys 및/또는 (γ-Glu-Cys)가 혈액에 투여되는 경우, 이것은 공지된 시스틴-함유 펩티드와 반대로 혈액 내에서 거의 가수분해되지 않은 채 신장, 간 등에서 이용된다. 한편, γ-Glu-Cys-Cys 및/또는 (γ-Glu-Cys)를 경구로 또는 장내로 투여하는 경우, 이것은 γ-글루타밀 전이효소에 의해 소장에서 가수분해되고, 장결로를 통해 효과적으로 이용된다고 생각된다. 더욱이, γ-Glu-Cys-Cys 및 (γ-Glu-Cys)는 또한 자체가 세포 내로 흡수된다고 생각된다.
본 발명의 명확한 구체화를 하기 대표적인 실시예로 나타낸다.
[실시예 1]
하기에 기재되는 아미노산 조성물에 약 70℃의 주사용 증류수 1ℓ를 가하여, 성분을 용해시킨다. pH를 NaOH 용액을 사용하여 6.5로 조절한다. 용액을 밀리포어 필터를 통해 여과하고, 여과액을 유리병에 200mℓ 분량으로 채운후, 30초간 살균한 질소 기체를 송풍시킨다. 밀폐시킨 후, 유리병을 110℃에서 60분간 가열살균하여 아미노산 수액을 제조한다.
[실시예 2]
하기에 기재되는 아미노산 조성물에 약 70℃의 주사용 증류수 1ℓ를 가하여 성분을 용해시킨다. pH를 NaOH 용액으로 6.5로 조절한다. 용액을 밀리포어 필터로 여과하고, 여과액을 유리병에 200mℓ 분량으로 채운후, 30초간 살균한 질소 기체를 송풍시킨다. 밀패한 후, 유리병을 110℃에서 60분간 가열살균하여 아미노산 수액을 제조한다.
[실시예 3]
상기 조성물을 100℃에서 30분간 가열 및 분산시킨 후, 분산액을 냉각시켜 젤리형 영양제를 수득한다. γ-Glu-Cys-Cys는 처리조건하에서 안정하게 유지된다.
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