KR0134274B1 - 동물유전자를 이용한 형질전환된 식물세포 선별방법 - Google Patents

동물유전자를 이용한 형질전환된 식물세포 선별방법

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Abstract

이 발명은 특수한 성능을 가진 유전자가 도입된 형질 전환된 식물세포를 선별함에 있어서, 미생물 유래 표지 유전자를 사용하는데 따른 인체 안정성 문제와 여러 종류의 선별표지 유전자를 사용하여야하는 문제점을 해결하기 위한 것임.
본 발명은 동물 유전자를 이용하여 형질 전환된 식물세포를 선별하는 방법으로 구성됨. 동물 유전자로는 Ara-A, 코디세핀, Xyl-A, 2-디옥시아데노신 등을 포함하는 아데노신 탈아민 효소 유전자를 사용함.

Description

동물유전자를 이용한 형질전환된 식물세포 선별방법
본 발명은 동물유전자를 이용하여 형질전환된 식물세포를 선별하는 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게 설명하면 동물유래의 아데노신 탈아민효소 유전자를 선별표지로하여 코디세핀, 9-베타-디-아라비노푸라노실 아테노신(이하 Ara -A라함), 자이로푸라노실 아데노신(이하 Xyl-A라함)등 아데노신 유도체가 함유된 배지에서 형질전환된 식물세포를 선별하는 방법에 관한 것이다.
유전자재조합기술로 식물을 육종하는 기술분야에서는 내병성 유전자, 내충성 유전자, 중금속 내성 유전자, 바이러스 내성 유전자, 저온 및 고온등 장해에 대한 내성 유전자, 특별한 물질의 합성 또는 분해에 관한 물질대사 관련 유전자 등을 식물세포에 도입하기 위하여 선별표지 유전자를 사용하고 있는 바, 지금까지는 대부분 미생물유래의 표지유전자를 활용하고 있다.(헤러-에스트렐라등, 네이쳐, 303, 1983: 헤이포오드 등, 플란트피지오로지.,86, 1216, 1986)
또한 종래에는 선별표지로 하나의 유전자, 특히 단일 항생제에 대한 내성을 나타내는 하나의 유전자를 사용하였다. 따라서 2차 선별과정에서 새로운 유전자를 클로닝하기 위하여는 다른 유전자를 표지를 사용하여야 하므로 많은 종류의 선별표지유전자가 필요하였다. 특히 기존에 사용되어온 표지유전자들의 유래는 미생물이어서 이런 표지유전자에 의하여 형질전환된 식물체를 인간이 섭취하는 경우에는 안정성 문제가 발생할 수도 있으므로 사람들이 섭취를 기피하는 경향이 있다.
따라서 인간이 섭취하는 경우에도 안정성에 문제가 없어서 섭취를 기피하지 아니하는 형질전환된 식물체를 얻는 수단이 요구 되고 있다.
본 발명의 목적은 인간이 섭취하여도 안전성에 문제가 없는 형질전환된 식물체를 얻는데 이용될 수 있는 형질전환된 식물세포를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적은 식물에 존재하지 않는, 동물유래의 아데노신 탈아민효소(아데노신 디아미네이스 ; 이.시.3.5.4.4;이하 ADA로 약칭함)유전자를 선별표지로 사용하는 본 발명의 방법에 의하여 달성된다.
본 발명은 동물 유래의 아데노신 탈아민 효소 유전자를 형질전환된 식물세포의 선별표지로 사용하는 방법으로 구성된다.
본 발명은 특히 동물 유래의 아데노신 탈아민 효소 유전자를 함유하는 형질전환된 식물세포를 세포독성을 갖는 아데노신 유도체가 함유된 배지에서 배양하여 형질전환된 식물세포를 선별하는 방법에 관계된다.
본 발명에 사용되는 아데노신 탈아민 효소 유전자는 동물로부터 유래된 것을 사용 하는 바, 사람, 토끼, 돼지등 주위에서 구할 수 있는 동물, 특히 가축으로부터 얻을 수 있는 아데노신 탈아민 효소 유전자를 사용한다.
아데노신은 ADA효소에 의하여 이노신으로 전환되는 한편, 아데노신 키나제에 의하여 아데노신 1인산(이하 에이엠피 : AMP라함)으로 변환된다. 따라서 ADA효소가 결핍된 상태에서는 대부분의 아데노신이 AMP로 변환된다. 반면 코디세핀(cordycepin), 2′-디옥시아데노신(2′-deoxyadenosine), Ara-A, Xyl-A등 세포독성을 갖는 아데노신 유도체(이하 아데노신 유도체로 약함)를 투여하면, 이들 유도체들은 코디세핀이나 Ara-ATP, Xyl-ATP로 전환되고, 이어서 DNA 폴리머레이스나 cAMP(사이클릭 에이엠피), RNA의 합성을 저해하여 세포독성을 나타낸다. 그러나 ADA가 존재하면 독성을 갖지 않는 이노신계통으로 분해되어 세포는 생존한다.(폭스 앤드 켈리, 앤뉴얼 리뷰 바이오케미스트리 ; 47, 655, 1978). 이상에서 ADA효소는 세포의 생장에는 직접 관여하지 않지만 아데노신 유도체로부터 세포를 보호하는 기능을 담당하고 있음을 알 수 있다.
식물세포는 ADA유전자를 갖고 있지 않으므로 식물세포에 아데노신 유도체를 투여하면 식물세포는 죽게된다. 그러나 본 발명자는 ADA유전자를 식물세포에 도입하여 형질전환시키면 식물세포가 생존한다는 사실을 알게 되었다. 이와 같은 아데노신 유도체는 여러 종류중에서 필요단계마다 다양하게 선택하여 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 구체적으로 이해할 수 있도록 형질전환된 담배를 얻는 방법을 상세하게 설명하는바, 다음의 설명은 본 발명의 범위를 담배에 국한시키기 위한 것이 아니고 이해를 돕기 위한 것이므로 본 발명의 범위도 담배 이외의 모든 식물체에 대하여 적용되는 것으로 이해되어야 한다.
ADA유전자는 쥐의 DNA로부터 클로닝한다. 이 유전자는 1056 bp를 오픈 리딩 프레임과 함께 pADA5-29(플라스미드 에이디에이5-29)에 함유하고 있다.(영등,저날 오브 바이오로지칼 케미스트리, 260,10299,1985), 524XbaI 카셋트 벡타(캐나다 식물유전공학연구소 다틀라 박사로부터 분양받음)를 제한효소 BamHI으로 절단하고, 클레나우로 필인(fillin)시킨 다음 NcoI으로 다시 절단하여 3.7kb크기의 DNA절편을 구하고, NcoI과 EcoRV로 절단시킨 pADA5-29의 1.3kb 크기 DNA절편을 T4 DNA 라이게이스(ligase)를 이용하여 결합시킨다.
얻어진 5.0kb 크기의 플라스미드를 35S-35S-AMV/ADA/Tnos라 명명한다. 35S-35S-AMV/ADA/Tnos를 XbaI으로 절단하여 얻은 2.1kb의 DNA조각을 식물형질전환용 플라스미드인 pRD400(캐나다 식물유전공학연구소 다틀라 박사로부터 분양받음)의 동일한 제한효소 부위에 끼워넣어, 13.8kb크기인 pDY18를 제조하고, pDy 18을 샘브룩 등의 열처리방법(분자 클로닝, 콜드스프링 하버사, 1989)으로 대장균 DH5α에 도입한다. 생성된 미생물은 대장균 DH5α/pDY18로 명명하고 1994. 9. 22일 한국과학기술연구원에 KCTC8617P로 기탁하였다.
플라스미드를 추출하여 제한효소 XbaI으로 절단하였을 때, pDR400의 11.7kb와 ADA유전자 절편 2.1kb를 확인하였다. 디타 등의 트리-페이렌탈 메이팅 (tri-parentalmating)방법(디타등, 프로시딩 내쇼날 아카데미 사이언스.,77, 7347, 1980)을 이용하여 대장균내 플라스미드를 아그로박테리움 투메패시언스 90(MP90)(캐나다 식물유전공학연구소 다틀라 박사로부터 분양받음)에 접합시켜 아그로박테리움 투메패시언스 pDY182을 얻고, 이 pDY182를 트립톤 1.6%, 효모 엑기스 1%, 소금 0.5%, 겐타마이신 25㎍/ml, 가나마이신 25㎍/ml로 조성된 배지(pH7.0)에서 배양한 다음, 원심분리하고 분리된 세포는 MS/B5(시그마 엠-0404)배지에 107cell/ml되도록 분산시킨다.
배양된 담배(니코티아나 타바쿰 컬티바 크산티)조직에 분산액을 접종하고, 5분간 배양한다. 멸균된 여과지(와트만 1호)를 사용하여 분산액을 희석시키고, 2,4-D를 2㎎/l첨가한 MS/B5 배지상에서 하루 배양한다. 담배조직을 카베니실린 500㎍/ml이 첨가된 재분화배지(BA 2.5㎎/l, NAA 0.1㎎/l을 MS/B5 배지에 첨가하여 제조함)에 옮기고, 5일후 Xyl-A 50㎍/ml과 카베니실린 500㎍/ml이 첨가된 재분화배지에 옮겨 6주간 배양하여 싹을 유도하고, 형성된 싹을 절단하여 발근배지(1/2로 희석한 BS/M5 배지에 Xyl-A 25μM, 카베니실린 500㎍/ml, NAA 0.1㎎/l 첨가한 것)에서 30일 배양하여 뿌리를 유도하고, 토양에 이식한다. 형질전환된 담배의 형태학적 특성은 정상 식물체와 동일하게 나타났다.
형질전환된 담배 식물체의 잎을 절단하여 멸균한 뒤, 가나마이신 100㎍/ml이 첨가된 MS/B5 배지에서 배양한 결과, 생존율은 100%였다.
에드워즈 등의 방법(뉴콜레익 애시드 리서치, 19, 1349,1991)으로 DNA를 추출하고, 5-TACCGGGTCTGTGGGCG-3, 5-GTCTCTTATGGTTATC-3 프라이머를 사용하여 DNA 서모사이클러(Thermocycler)(퍼킨엘머사제품)를 사용하여 PCR방법으로 ADA유전자의 존재를 확인하였다. 형질전환된 담배 식물체의 DNA에서는 ADA유전자의 존재가 확인되었으나, 대조군으로 사용된 정상적인 담배 식물체로부터 얻은 DNA에서는 ADA유전자의 존재가 확인되지 않았다.
로게만 등의 방법(로즈만등, 아날리티칼 바이오 케미스트리, 163, 16, 1987)을 이용하여 형질전환된 담배 잎으로부터 RNA를 추출하고, 1.2%아가로스 겔로 전기영동한 뒤,32P로 라벨화된 35S-35S-AMV/ADA/Tnos탐침과 퀵 하이브리디제이션 용액(스트라겐사제품)을 이용하여 ADA전사체를 확인하였다. 대조군으로 사용된 정상적인 담배 식물체로부터 얻은 RNA에서는 ADA전사체의 존재를 확인할 수 없었다.
형질전환된 담배 잎으로부터 ADA단백질을 모노 Q HR16/10(파마시아사 제품)으로 추출하여 정제하고, 10% SDS-PAGE로 전기영동하여 얻은 겔을 트란스블로트 에스디(바이오라드사 제품)를 사용하여 건조시켰다. 핼로우 등의 방법(헬로등, 어 래보라트리 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 라보라토리스, 1988)에 따라 준비한 ADA단백질에 대한 항체와 반응시켜, 니트로블루 염화테트라졸리움과 5-브로모-4염화-3-인돌일 인산(바이오래드사 제품)으로 염색하였을 때, 분자량 39,000위치에서 밴드를 확인할 수 있었다. 그러나 대조군인 정상적인 담배 식물체로부터 얻은 단백질에서는 확인할 수 없었다.
형질전환된 담배를 토양에서 배양을 계속하여 종자를 얻었다. 채취한 종자와 대조군인 정상적인 담배의 종자를 2% 차아염소산액으로 소독하고, 치상 배지(1/2로 희석한 MS/B5 배지에 Ara-A 100μM, 가나마이신 100㎍/ml을 첨가한 것)에서 20일간 배양한다. 형질전환된 종자는 75% 생존하여 이론치와 일치하였으나, 정상적인 종자는 모두 고사하였다.
이상에서 알 수 있는바와 같이 동물세포 유래의 ADA유전자는 담배조직내에서 발현되고 그 형질이 유전됨을 확인할 수 있었다. 아데노신 유도체가 함유된 배지상에서 ADA유전자가 형질전환된 담배조직을 배양하였을 때, 형질전환된 담배조직은 생존하지만 형질전환되지 않은 정상적인 담배조직은 사멸함을 확인할 수 있었다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하는 바, 본 발명의 범위가 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
형질전환된 담배조직을 얻는 방법
524XbaI 카셋트 벡타를 제한효소 BamHI으로 절단하여 클레나우로 필인 시킨 다음, NcoI으로 다시 절단하여 3.7kb 크기의 DNA절편을 구하고, NcoI과 EcoRV로 절단시킨 쥐의 ADA유전자를 함유하고 있는 플라스미드 ADA5-29의1.3kb 크기 DNA절편을 T4 DNA리케이스를 이용하여 결합시키고 플라스미드 35S-35S-AMV/ DA/Tnos라 명명하였다.
35S-35S-AMV/ADA/Tnos를 XbaI으로 절단하여 얻은 2.1kb의 DNA조각을 식물형질전환용 플라스미드인 RD400의 동일한 제한효소 부위에 끼워넣어, 13.8kb크기인 DY18를 제조하고, 플라스미드 DY18을 샘브룩 등의 열처리방법으로 대장균 DH5α에 도입하여 새로운 미생물을 얻었다. 이 새로운 미생물은 대장균 DH5α/pDY18로 명명하고 1994. 9. 22일 한국과학기술연구원에 KCTC8617P로 기탁하였다.
디타 등의 트리-페이렌탈 메이팅 방법을 이용하여 대장균내 플라스미드를 아그로박테리움 투메패시언스 MP90에 접합시켜 아그로박테리움 투메패시언스 DY182을 얻고, 플라스미드 DY182를 트립톤 1.6%, 효모 엑기스 1%, 소금 0.5%, 겐타마이신 25㎍/ml, 가나마이신 25㎍/ml로 조성된 배지(pH7.0)에서 배양한 다음, 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 세포를 MS/B5(시그마 M-0404)배지에 107cell/ml되도록 분산시키고, 생성된 분산액을 배양된 담배(니코티아나 타바쿰 컬티바 크산티)조직에 분산액을 접종하고, 5분간 배양한 다음, 멸균된 여과지(와트만 1호)를 사용하여 분산액을 제거하고, 2,4-D를 2㎎/l첨가한 MS/B5 배지상에서 하루 배양하였다.
이어서 담배조직을 카베니실린 500㎍/ml이 첨가된 재분화배지(BA 2.5㎎/l, NAA 0.1㎎/l을 BS/M5 배지에 첨가한 것)에 옮기고, 5일후 Xyl-A 50㎍/ml과 카베니실린 500㎍/ml이 첨가된 재분화배지에 옮겨 6주간 배양하여 싹을 유도하였다.
형질전환된 식물체의 생육
직경 6mm의, 형질전환된 담배잎조직 0.02g을 이노신 40, 80, 160, 320μM이 함유된 네 개의 재분화배지에 이식하고, 빛을 조사하는 군과 암처리한 군으로 구분하여 배양하였다. 3주후 조직을 채취하여 무게를 측정하고, 21개의 시료에 대한 평균치를 구하였다.
결과는 표1과 같다. 무처리구에 비하여 생장량의 감소는 없었다.
[실시예 2]
실시예 1에서, 이노신 대신에 2-이옥시이노신을 40, 80, 160, 320μM 대체하였다. 결과는 표1과 같다. 무처리구에 비하여 생장량의 감소는 없었다.
[실시예 3]
실시예 1에서, 이노신 대신에 아데노신을 40, 80, 160, 320μM 대체하였다. 결과는 표2과 같다. 무처리구에 비하여 생장량의 감소는 없었다.
[실시예 4]
실시예 1에서, 이노신 대신에 2-디옥시아데노신을 40, 80, 160, 320, 640μM 대체하였다. 결과는 표2과 같다. 무처리구에 비하여 생장량의 감소는 없었으나 160μM이상에서는 감소되었다.
[실시예 5]
실시예 1에서, 이노신 대신에 Ara-A을 5, 10, 20, 40, 80, 160μM 을 사용하였다. 결과는 표2과 같다. 10μM 이상일 때에는 무처리구에 비하여 생장량이 현저히 감소 되었다.
[실시예 6]
실시예 1에서, 이노신 대신에 코디세핀을 5, 10, 20, 40, 80, 160μM 을 대체하였다. 결과는 표2과 같다. 무구처리구에 비하여 10μM 이상일 때에 생장량은 현저히 감소되었다.
[실시예 7]
실시예 1에서, 이노신 대신에 Xyl-A를 5, 10, 25, 50, 100μM 을 대체하였다. 결과는 표3과 같다. 무구처리구에 비하여 10μM에서 생장량은 감소되었으나, 형질전환된 조직에서는 100μM의 고농도에서도 생장이 양호하였다.
전술한 실험에 의하여 세포독성을 갖는 Ara-A, 코디세핀, Xyl-A등 아데노신 유도체로 형질전환된 세포를 선별할 수 있었다.

Claims (3)

  1. 동물 유래의 아데노신 탈아민 효소 유전자를 형질전환된 식물세포의 선별표지로 사용하는 방법.
  2. 동물 유래의 아데노신 탈아민 효소 유전자를 포함하는 형질전환된 식물세포를 세포독성을 갖는 아데노신 유도체가 함유된 배지에서 배양하여 형질전환된 식물세포를 선별하는 방법.
  3. 청구범위 2항에서, 세포독성을 갖는 아데노신 유도체가 Ara-A, 코디세핀, Xyl-A, 2-디옥시아데노신중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
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