KR0131330B1

KR0131330B1 - 피브린 침착 또는 유착을 방지하기 위한 방법 및 치료 조성물

Info

Publication number: KR0131330B1
Application number: KR1019890700376A
Authority: KR
Inventors: 마죠리 에이. 몰러; 튜. 에이취. 노이엔
Original assignee: 맥스 디. 헨슬레이; 제넨테크, 인크.
Priority date: 1987-07-01
Filing date: 1988-06-30
Publication date: 1998-04-17
Also published as: NZ225260A; DE3883645T2; NO895338D0; WO1989000049A1; AU621305B2; PT87886B; IE882023L; DK175597B1; KR890701124A; DE3883645D1; FI103868B; JP2756131B2; EP0297860B1; DK675389D0; NO301748B1; PH26527A; IL86933A; FI103868B1; DK675389A; JPH04502753A

Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]

피브린 침착 또는 유착을 방지하기 위한 방법 및 치료 조성물

[도면의 간단한 설명]

제1도는 토끼에서 유착 형성 방지에 대한 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제의 투여량 효과를 나타낸 것이다. 반고상 부형제 2.5g 중에 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제를 다양한 양으로 함유시켜 복막내 조직의 외상 부위에 투여하였다. 1주일 후, 동물을 안락사시키고 유착 정도를 측정하였다. 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 0.125 및 0.25mg/겔(g)의 투여량에서 유착물을 갖는 토끼의 수는 만 화이트니(Mann Whitney) 비모수성(非母數性) 시험에 의해 결정된 바와 같이 대조 시료 및 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 0.062mg/겔(g)과는 매우 상이하였다.

제2도는 수술에 의해 제거된 후 유착물 재형성 방지에 대한 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제의 효과를 나타낸 것이다. 처리되지 않은 토끼에서 형성된 유착정도가 7일째에 나타나 있다. 형성된 유착물이 수술에 의해 제거된 후, 동물을 2군, 즉 부형제만을 주입한 대조 동물 및 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 0.25mg/겔(g)을 주입한 처리 동물로 분류하였다. 14일째에, 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제가 투여된 동물의 수가 재형성된 유착 정도에 있어서 현저하게 감소되었다.

제3도는 토끼에서 유착 형성 방지에 대한 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제의 투여량 효과이다. 히알루론산나트륨 2.8% 겔 2.5g중에 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제를 다양한 양으로 복막내 조직의 외상 부위에 투여하였다. 1주일 후, 동물을 안락사시키고, 유착 정도를 측정하였다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 외과적 수술, 감염, 염증 및 외상으로 인해 특히 복강 또는 골반강에서의 유착물의 형성 또는 재형성을 방지하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 인체 또는 수의학 용도에 적용된다.

[발명의 배경]

수술 후 복강내 유착물 형성, 기관 및 조직 표면의 병리학적 유착은 복부 수술 후 장(腸) 장애를 일으키는 주원인이다[에이취. 엘리스(H. Ellis), Surg. Gynec. Obst ec., 제133호(1971년) 참조]. 유착물은 전형적으로 대향(對向)하는 조직 또는 기관 표면을 연결하거나 유착시키는 장막 표면에 돌출된 유기 피브린 삼출물(渗出物)을 포함한다. 또한, 유착물은 재형성 관 수술 후 불임증을 유발하는 주요인이다[붓트람, 브이. 씨. (Buttram, V.C.), Fert. and Ster., 제40호, 제5페이지(1983년) 참조]. 복부 수술을 한 사람 중의 50-90%에서 유착물이 생성된다는 사실이 보고되어 왔다[콜레티, 엘.(Colleti, L.) 및 바싸르트, 비.(Bassart, B.), Arch. Surg. Fert. 제88호, 제774페이지(1964) 참조]. 유착물 형성은 복부 내 감염 후에도 역시 관찰되어 왔다[하우, 티.(Hau, T.)등의 Surg. Gyn. Ob. 제148호 제415-418페이지(1979년) 참조]. 또한, 유착물 형성은 건(腱) 수술 후에도 관찰되어 왔다[웨이쓰, 씨.(Weiss, Tl.)등의 Bull. Hosp. Joint Diseases, 제47(1)호, 제31페이지(1987년) 참조].

복부 수술의 초창기부터, 외과 의사들은 수술, 감염 또는 외상 후 수시간 내에 피브린 유착물들이 장 및 기타 복부 내장의 루프들(loop)과 서로 고착된다는 것을 알고 있었다. 이 피브린 삼출물은 완전히 재흡수되어 복강이 깨끗한 상태로 되거나 또는 모세관 및 섬유 아세포의 내적 성장물과 결합하여 안정한 피브린 유착물을 형성할 수 있다. 지금까지 해결되지 않고 있는 중요한 문제점은, 피브린 삼출액이 흡수되거나 또는 결합되는지 여부를 결정하는 인자가 무엇인가 하는 점이다. 유착물 형성은 복부 내피의 파괴에 의한 것이라는 이론이 전개되어 왔다. 이 이론을 반복하는 수많은 연구가 행하여져 왔다[예를 들면, 엘리스, 에이취.(Ellis, H.), Brit. J. Surg., 제50호, 제10페이지, (1962년) 참조].

복막 손상 또는 결함의 정상적인 치유에서는 피브린 매트릭스가 형성되고, 이어서 대식 세포, 단핵 세포, 임파구 및 다형 핵백혈구에 의한 피브린 매트릭스의 식작용이 일어나는 것으로 밝혀졌다. 섬유 아세포 및 콜라겐 속은 복막이 정상적인 형상을 갖기 전에 관찰된다. 정상적인 치유 과정은 약 3일이 소요된다[북크만, 알. 에프.(Buckma, R.F.)등의 J. Surg. Res. 제21호, 제67페이지(1976년) 참조]. 피브린 매트릭스가 재흡수되는지 여부는 조직의 허혈 여부와 관계 있는 것으로 보인다[루빈, 아이.씨.(Rubin, I.C.), Surg. Obstet., 제12호, 제117페이지(1911년) 참조]. 엘리스, 에이취. 등은 문헌[Brit. J. Surg. 제52호, 제471페이지(1965년)]에서 허혈성 복막 모델을 세워, 허혈 손상의 83%가 유착물을 형성시키는 반면, 비허혈성 모델의 약 9%만이 유착물을 형성시킨다는 것을 보여주었다. 전자 현미경을 사용함으로써, 섬유 아세포의 침입이 그 부위를 침윤시키고, 섬유 아세포, 거대 세포 및 유사 상피 세포로 발육되는 대식 세포로부터 유래된다는 것이 밝혀졌다[에스켈랜드, 쥐.(Eskeland, G.), Acta Path. Microbiol. Scand., 제62호, 제459페이지(1964년) 참조]. 엘리스 등에 의하면 유착 형성물은 맥관 이식체로서 작용한다. 엘리스와 유사한 모델을 사용하여, 전술한 북크만 등은 복막 결함이 허혈을 일으키는 복막에서는 상실된 높은 플라스미노겐 활성을 갖는다는 것을 밝혀 내었다.

복강 내 세균 침입 후의 피브린 침착은 패혈증을 방지하는 방어 기작이다[아렌홀츠, 디.에이치.(Ahrenholz, D.H.) 및 심몬스, 알.엘.(Simmons, R.L.)의 Surgery 제88호, 제41-47페이지(1980년), 진저, 에이취.에이취(Zinser, H.H.) 및 프리드, 에이-더불유.(Pryde, A.W.)의 Ann. Surg. 제136호, 제818페이지(1982년) 참조]. 세균이 포함되기는하나, 피브린 침착은 가끔 농양 형성을 유발한다(상기 아렌홀즈 및 심몬스, 참조. 피브린 침착은 복막염의 초기 단계에서 일어나는데, 이때 복강에서 피브리노겐이 풍부한 삼출물이 피브린으로 전환된다(상기 하우 참조). 수술 후의 복부내 농양은 감염 및 결국은 사망의 잠재적인 원인이다. 복막염 및 그의 합병증은 높은 사망률과 관련이 있다. 노년층의 사망률은 60~80%이다[하우, 티.등의 Curr. Prob. Surg. 제16호, 제1-65페이지(1979년) 참조].

복막의 중피 및 하중피 혈관에 모두 존재하는 플라스미노겐 활성화제는 복막내 피브린 침착물을 분해하고 제거한다[포터, 제이.엠(Porter, J.M.)등의 L. Surg. Forum 제20호, 제80페이지(1969년), 북크만, 알.에프.등(Buckman, R.F.) et al., J. surg. Res, 제20호, 제1페이지(1976년) 참조]. 염증 또는 외상과 같은 장막 또는 복막의 손상은 외상 부위의 작은 정맥의 파열을 통해 세포 성분 및 피브린 삼출물을 형성시킬 뿐만 아니라[오로라, 에이,엘.(Aurora, A.L.)등의 Indian J. Med. Res.(1972년) 참조], 피브린 용해 활성을 국부적으로 감소시킨다(상기 북크만, 일.에프. 참조). 국부적인 피브린 용해 활성이 50% 이상 감소될 때 피브린은 제거될 수 없으며 영구적 유착물로 형성되는 것으로 나타났다[저빈, 에이.에스.(Gervin, A.S.)등의 Am. J. Surg. 제125호(1973년) 참조].

유착물 형성을 방지하는 것에 관한 수많은 연구 논문이 발표되어 왔다. 다양한 예방법들이 피브린 침착 및 유착을 방지하기 위하여 시도되어 왔다. 복막 삼출물에서 피브린 침착을 방지하기 위하여 시트르산 나트륨, 헤파린 및 다른 항응고제가 사용되어 왔다. 이미 형성된 피브린을 제거하기 위해 다양한 효소, 예를 들면 트립신, 펩신, 파파인, 히알루로니다제, 스트렙토키나제 및 스트렙토도르나제가 사용되어 왔다. 피브린 제거를 위한 다른 시도에서는 리신올레산 나트륨과 같은 염을 사용하거나 또는 기계적으로 피브린을 제거하기 위해 세정제를 사용한다.

헤파린과 디큐마롤이 피브린 침착을 방지하기 위해 최초로 사용되었다[레만, 이.피(Lehman, E.P.) 및 보이즈, 에프.(Boys, F.), Ann. Sur., 제112호, 제969페이지(1940년), 화이트, 비.에이취.(White, B.H.), Ann. Surg., 제130호, 제942페이지(1949년) 참조]. 헤파린을 투여받은 환자에서 사망 및 수술 후 출혈이 보고되었다. 아주 최근에는 혈전 형성 억제 성질을 갖는 덱스트란이 유착을 방지하기 위하여 사용되었다[쵸에이트, 더블유.에이취(Choate, W.H.)등의 Arch., Surg., 제88호, 제249페이지(1964년) 참조]. 복막내 덱스트란은 유착의 심각한 정도를 감소시키는 것으로 발견되었으나 유착 형성을 방지하지는 못하였다[카퍼, 비.엠.엘(Kapur, B.M.L.)등의 Indian J. Med. Res., 제56호, 제1406페이지(1968년) 참조]. 유착 형성을 감소시키기 위하여 소염제인 옥시펜부타존도 역시 경구 투여하였다[카퍼, 비.엠.엘 등의 Arch. Surg., 제98호, 제301페이지(1969년) 참조].

식염수, 덱스트로오스, 또는 특히 고장(高張) 덱스트로오스 용액을 사용한 세정법이 제안되었으나, 이와 같은 용액은 신속히 흡수되기 때문에 비효과적이었다[부크빈더, 제이.알.(Buchbinder, J.R.), Surg. Gynec. Obstet., 제45호, 제769페이지(1927년), 토튼, 에이취.피.(Totten, H.P.), Surgery, 제8호, 제456페이지(1940년) 참조]. 펩신 및 트립신과 같은 소화 효소는 피브린을 파괴하는 것으로 알려져 있었다. 그러나 이러한 물질들은 모두 복막 삼출물에 의해 급히 중화되어 비효과적인 것으로 나타났다[쿠보타, 티.(Kubota, T.), Japan M. World, 제11호, 제226페이지(1922년) 참조]. 단백질 분해 효소인 파파인도 역시 시도되었으나, 복막 삼출물에 의해 중화되는 것으로 밝혀졌다. 파파인 역시 경구 투여되었을 때, 유착의 심각도를 감소시키지만 유착의 출현을 감소시키지는 않는 것으로 밝혀졌다[카퍼, 비.엠.엘.등의 Arch, Surg., 제98호, 제301페이지(1969년) 참조]. 쥐에서 파파인의 복막내 투여는 유착물 형성에 아무런 영향을 미치지 못하였다[스티븐스, 엘.이.(Stevens, L.E.), Amer. J. surg., 제115호, 제535페이지(1968년) 참조].

유착을 방지하기 위해 수많은 피브린 용해제가 시험되어 왔다. 피브린 용해 시스템은 전형적으로는 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는데 관여하는 혈액내 시스템을 의미하는 것으로 이해된다. 천연 플라스미노겐 활성화제는 플라스미노겐과 반응하여 이 전구체를 플라스민으로 전환시키고, 이어서 이 플라스민이 가교된 피브린을 용해시킨다. 스트렙토키나제 및 유로키나제와 같은 외생(外生) 활성화제도 역시 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 활성화시킨다. 혈전 용해제에는 플라스민, 및 스트렙토키나제, 스트렙토도르나제 및 유로키나제와 같은 플라스미노겐 활성화제가 포함된다. 이들 혈전용해제 및 피브린 용해제 뿐만 아니라 다른 제형도 피브린 침착을 방지하고 유착을 제거하기 위해 사용되어 왔다. 초기 연구는 스트렙토키나제 및 스트렙토도르나제가 토끼에서는 외상에 의해 유도된 유착을 방지하나 개에서는 방지하지 못하는 것을 보여 주었다[라이트, 엘.티(Wright, L.T.)등의 Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 제75호, 제602페이지(1950년) 참조]. 어떤 연구에서는, 연속 3일간의 복막내 치료가 단일 주사보다 더 효과적인 것으로 관찰되었다[나이틀리, 제이.제이.(Knightly, J.J)등의 Surgery, 제 52호, 제250페이지(1962년) 참조]. 다른 연구들은 덜 적절하였다. 다양한 피브린 용해효소를 개, 토끼 및 쥐에게 정맥내 및 복막내 투여 뿐만 아니라, 다른 기술을 사용하여 유착물을 생성시키는 일련의 실험에서는 어떠한 중요한 예방 또는 치료 효과도 관찰되지는 않았다[제윗트, 티.씨.(Jewett, T.C.)등의, Surgery, 제57호, 제280페이지(1965년) 참조]. 쥐에게 단일 투여 또는 3일간 연속으로 수회 주사된 고순도 스트렙토키나제 제조물은 유착 형성을 억제하지 못하였다[제임스, 디.씨.오.(James, D.C.O.)등의 J. Path. Bact. 제90호, 제279페이지(1965년) 참조]. 정제된 스트렙토키나제를 토끼에 사용하는 부가적인 연구에 따르면, 벽(壁)의 손상부에 대한 유착은 용액 상태의 스트렙토키나제를 복막내로 연속 2 또는 3일 동안 수회 주사함으로써 억제될 수 있는 것으로 나타났다. 혈전 용해 요법은 토끼를 모델로 한 심내막염 중의 피브린 참착을 방지하기 위해 사용되어 왔다[듀로그, 디.티.(Duraug, D.T.), J. Path. 제129호, 제537페이지(1975년) 참조]. 피브린 용해제는 기니아 피그 피부 절개 부위에서 감염된 혈장 응괴에 의해 유도된 상처 감염을 감소시키는데 사용되어 왔다[로데호이어, 쥐(Rodeheauer, G.)등의 Am. J. Surg., 제129호, 제537-제544페이지(1975년) 참조].

피브린 용해 효과를 갖는 것으로 관찰된 다른 화합물도 역시 유착을 방지하기 위해 사용되어 왔다. 피브린 용해 작용을 갖는 프로토포피린이 쥐에서 개복술로 발달되어 가는 유착의 백분률을 감소시키는 것으로 밝혀졌다[이이지마, 엔.(Iijima, N.)등의 Postgrad. Med. J. 제46호, 제278페이지(1970년) 참조]. 세포내 기초 물질을 구성하는 다당류 중 하나인 히알루론산을 가수 분해하는 효소인 히알루로니다제는 유착 형성을 유발시키기 위하여 활석을 투여하는 것과 동시에 복막내로 투여된 경우, 개에서 유착물 형성을 방지하였다[콘놀리, 제이.이.(Connolly, J.E.) 및 리챠드, 브이.(Richards, V.), surg. Forum, 제2호, 제85페이지(1951년) 참조]. 쥐에서 맹장 파열 후 행한 다른 연구는 히알루로니다제의 복막내 투여 후 유착물 출현이 감소되지 않음을 보여 주었다[토마스, 제이(Thomas, J.)등의 Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 제74호, 제497페이지(1950년) 참조].

덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 숙신산 나트륨, 프로마타진 염산염 및 인체 피브리노리신 단독 및 조합물을 유착 형성을 방지하기 위하여 쥐에 근육내 또는 복막내로 투여하였다[가지니가, 에이.쥐.(Gazziniga, A.G.)등의 Arch. Surg. 제110호, 제429페이지(1975년) 참조]. 이 제형들 중 어느 것도 단독으로는 유착 형성을 제거하지 못하였다. 메틸프레드니솔론, 프로메타진 및 인체 피브리노리신을 조합하여 단일 투여량으로 복막내 투여하면 유착물의 형성이 제거되는 것으로 나타났다.

전술한 물질들 이외에도, 분쇄된 황소의 복막, 올리브유, 에피네프린 용액, 양수 및 리신올레산 나트륨을 비롯한 다른 물질들의 유착 형성을 방지하기 위하여 복강내로 투여되었다. 이들 물질 중 어느 것도 유착물 형성 또는 재형성을 방지하는 것으로 보이지 않았다.

본 발명의 목적은, 복부 수술 및 골반 수술, 건(腱) 수술, 척추궁 절제술, 복부 감염, 염증 또는 외상을 포함한, 침착 또는 유착 형성을 방지하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 부위에 적용하기가 쉽고 편리한 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 피브린이 침착될 수 있거나 유착물이 형성될 수 있는 기관 및(또는) 주변 조직에 국소 투여하여 피브린 침착 또는 유착 형성을 방지하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 피브린 침착 또는 유착 형성을 방지하는 약품을 전달하기 위한 수단으로써 분해되지 않는 고상물을 도입하지 않는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 피브린 침착 또는 유착 방지를 위한 효소를 생체액 중의 물질에 의해 불활성화되지 않는 형태로 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 효소를 외생 매트릭스 또는 장치를 요하지 아니하고도 연속 방출할 수 있는 제형으로 제공하는 것이다.

[발명의 요약]

본 발명의 목적은 난용성 효소를 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 자리에 연속적으로 적용할 수 있도록 이 효소를 국소 투여함으로써 달성된다. 피브린 용해 또는 혈전 용해에 효과적인 난용성 효소는 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 부위에 국소 투여되어 이들 효소가 적어도 약 3일 동안 상기 부위에서 연속적으로 이용 가능할 때, 특히 수술, 감염, 외상, 또는 염증 후 유착을 치료하는데 유용하다. 난용성 효소는 바람직하게는 장기간 동안 효소 전달을 촉진시키는 불활성 유착 증강 부형제 중에 현탁된 고상 입자로 전달된다. 난용성 고상 효소를 어떤 부위에 1회 국소 투여하면 이 효소가 연속적으로 전달되어 피브린 침착 또는 유착 형성이 방지된다는 것은 본 발명 후에야 인식되었다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 효소는 침강 조직 플라스미노겐 활성화제이다. 그러므로, 일측면에서 볼 때, 본 발명은 수술 또는 감염과 같은 다양한 원인에서 유착 형성을 방지하기 위하여 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 난용성 효소를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 임상적인 피브린 침착을 치료하는 방법 및 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본 명세서에 사용된 바와 같이, 난용성 효소는 체액 중에서 바람직한 속도로 용해되며, 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 자리에 단일 국소 투여함으로써 피브린 침착 또는 유착 형성을 방지할 수 있는 분자 형태의 효소이다. 이 효소는 고상물, 예컨대, 분말, 슬러리 또는 현탁액으로서 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 자리에 투여된다. 난용성이라는 용어는 생체액, 예를 들면 혈장, 간질(間質) 또는 복막 중에서 효소의 용해도가 비교적 낮은 것을 의미한다. 용해속도는 효소가 목표 부위에서 피브린 침착 또는 유착 형성 또는 재형성을 방지하기 위해 충분한 시간 동안, 전형적으로는 약 3 내지 14일 동안 생체액 중에 용해될 수 있도록 선택된다. 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 자리에서 일정 기간 동안 난용성 효소가 용해되는 것은 비교적 낮은 용해도 때문이다. 일정 기간 동안 지연된 용해에 의해서 활성 효소가 단일 국소 투여로 목적하는 시간 동안 연속적으로 방출될 수 있다. 난용성 효소는 투여시에 고상물인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 효소에는 혈전 용해 또는 피브린 용해 효소, 예를 들면 플라스민, 스트렙토키나제, 유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제 및 스트렙토도르나제가 있다. 피브린 용해 효소에는 스트렙토키나제, 유로키나제 및 플라스미노겐 활성화제를 비롯하여 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키거나 또는 피브린을 직접 분해시키는 효소가 있다. 혈전 용해제에는 피브린 용해 효소 뿐만 아니라 다른 단백질 분해 효소가 있다. 이러한 단백질 분해 효소는 브리나제이다. 바람직한 난용성 고상 효소는 조직 플라스미노겐 활성화제인데, 이 효소는 천연 공급원으로부터 추출 및 정제되거나(미합중국 특허 제4,752,603호 참조) 또는 재조합 수단을 사용하여 얻을 수 있는(EPO 특허 출원 공고 제093,619호 참조) 효소를 의미한다. 따라서, 본 발명의 효소는 포유 동물, 세균 또는 효모로부터 얻을 수 있다. 처리되는 종과 동종인 효소가 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명에 따르면, 개에서 유착 형성을 방지하기 위하여 개의 효소를 사용한다. 고상 효소의 범위에는 또한 조직 플라스미노겐 활성화제의 아미노산 치환 및(또는) 결실 및(또는) 첨가 변이체, 그의 유기 및 무기염 및 공유 결합에 의해 변형된 유도체가 포함된다.

고상이라는 용어는 잠재적인 유착 형성 자리에 투여시에 바람직한 효소의 상태를 의미한다. 효소는 일정 기간 동안에 걸쳐 효소를 방출하기 위해 효소에 공유 또는 비공유 결합된 제형이 없는 실질적으로 동종형으로 존재한다. 고상 효소는 조직 플라스미노겐 활성화제의 경우에 백색의 무정형 분말로서 존재한다. 효소의 고체 상태는 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들면 투석, 침전 또는 동결 건조법을 사용하여 얻어진다. 효소 침전은 예를 들면 pH, 공용매 조성물, 온도 및 염을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 효소의 동결 건조는, 예를 들면 3급-부탄올을 사용한 비수용성 동결 건조, 예를 들면 물 승화 또는 휘발성 완충액(예, 아세트산 암모늄 또는 중탄산 암모늄 및 물)을 사용한 수용성 동결 건조와 최종적으로 수용성/비수용성 동결 건조에 의해 달성될 수 있다. 수용성 동결 건조가 바람직하다. 중탄산암모늄 및 물을 사용하는 수용성 동결 건조가 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물은 예를 들면 분말 형태의 유효 치료량의 난용성 효소를 함유한다. 조성물은 추가로 불활성 부착 증강 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일정 기간 동안 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 부위에서 효소의 연속 방출을 위하여 그 부위에 직접 투여된다. 불활성인 비독성 부착 증강 부형제에 현탁된 효소 현탁액은 내생 프로테아제에 의해 분해될 가능성을 감소시킨다. 불활성 부형제의 부착 성질에 의해 고상 효소가 투여 부위에서 보유될 수 있다. 이로 인해, 투여 부위에서 국소적으로 일정 기간 동안에 걸쳐 효소가 연속적으로 방출될 수 있다. 연속이라는 용어는 목적하는 기간 동안 투여 부위에서 효소가 중단되지 않고 끊임없이 방출되는 것을 의미한다. 따라서, 신규 제형은 체액에 대한 고상 효소의 용해를 조절하고 분해로부터 이를 보호한다.

난용성 효소는 수술, 감염, 외상 또는 염증 후 피브린 침착 또는 유착 형성을 방지하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 유효 치료량의 난용성 효소가 본 발명의 지침에 따라 투여될 것이다. 예를 들면, 난용성 형태의 스트렙토키나제의 유효 치료량은 약 300단위/겔(g) 내지 12,500,000단위/겔(g)이다. 스트렙토키나제의 바람직한 치료량은 약 10,000단위/겔(g) 내지 약 375,000단위/겔(g)이다. 고상 형태의 조직 플라스미노겐 활성화제의 경우, 유효 치료량은 약 0.02mg/겔(g) 내지 25mg/겔(g)이다. 조직 플라스미노겐 활성화제의 바람직한 치료량은 약 0.125mg/겔(g) 내지 2.5mg/겔(g)이다. 조직 플라스미노겐 활성화제의 가장 바람직한 치료량은 약 0.25mg/겔(g) 내지 약 1.0mg/겔(g)이다.

부착 증강 부형제는 난용성 효소를 잠재적인 유착 형성 부위에 도입하기 위한 반고상이고 점질(粘質)인 제약상으로 불활성인 담체로 정의된다. 이 부형제는 불활성이고 비독성이고 비자극성이며, 생리학적 및 제약상 허용 가능하다. 이 부형제는 일반적으로 생체내 부식 가능한데 이는 이들이 활성 효소를 방출하기 위하여 부형제를 화학적으로 분해시켜야 하는 생분해 가능한 부형제에 비해 투여 자리에서 소모되기 때문이다. 불활성 부착 증강 부형제는 바람직하지 않은 부위(예, 혈액내)에서 효소의 출현을 감소시키는 한편 투여 부위에서의 고상 효소의 연속적인 전달을 확실하게 하여 준다. 난용성 효소의 형태는 불활성 부착 증강 부형제가 사용될 필요가 없을 정도의 부착 성질을 가질 수 있다. 포화 및 불포화 지방산 글리세리드 혼합물 또는 개질된 포화 및 불포화 지방산 글리세리드 혼합물로 구성된 장쇄 탄화수소 또는 식물유 및 왁스가 불활성 부착 증강 부형제 또는 담체로서 사용될 수 있다. 이러한 부형제 또는 담체에는 연성 파라핀 또는 반합성 글리세리드와 같은 반고상 부형제, 글리세롤과 같은 폴리히드록시 용매, 장쇄 탄화수소, 생분해 가능한 중합체 또는 리포좀이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 생분해 가능한 중합체에는 반고상 형태로 제형화될 수 있는 저분자량 중합체가 포함된다. 이와 같이 제형화된 반고상 중합체에는 폴리에스테르류, 폴리아미드류, 아미노산 중합체, 폴리아세탈류, 무수물 중합체, 오르토 에스테르 중합체 및 다당류(예, β-D-글루쿠론산 및 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코오스가 교대로 구성된 히알루론산으로 공지된 천연 탄수화물)가 포함된다. 다당류는 불활성 부착 증강 부형제로 사용되기에 바람직하다. 히알루론산이 가장 바람직하다. 본 발명의 불활성인 비독성 부형제는 난용성 효소 이외의 생분해 가능하거나 또는 분해될 수 없는 고상물을 포함하지 않는데, 이는 규산 마그네슘, 활석 및 전분과 같은 분말을 사용하면 유착 형성이 유발되는 것으로 관찰되었기 때문이다[코슨, 에스.엘.(Corson, S.L.), J. Reprod, Med., 제29(3)호, 제143페이지(1984년)참조].

난용성 형태의 효소는 제약상 불활성인 부착 증강 부형제 중에 분산되어 투여 부위에서 용해율을 얻을 수 있다. 난용성 효소 형태는 생체액 중으로의 방출을 조절하여 목적하는 기간 동안 활성이 유지되도록 한다. 이는 즉시 사용될 수 있는 가용성 효소의 형태와 대조적이다. 효소의 방출은 하기하는 바와 같이 그의 용해도 및 입도로부터 예상될 수 있다. 단일 부형제의 경우, 효소가 불활성 매트릭스내에 고상 입자로 분산될 경우, 효소의 방출 속도는 하기 식으로 나타내며,

투여 후 임의의 시점에서 방출된 양은 하기 식으로 계산될 수 있다.

이들 식에서, M은 방출된 효소의 양이고, A는 부형제 단위 질량당 약물 부하량이며, Cs는 부형제 중에서 효소의 용해도이고, D는 효소의 확산 계수이며, t는 시간이고 dx는 매트릭스내에서 효소가 고갈된 부위의 두께이다[티. 히구치(T. Higuchi), J. Soc. Cosmetic Chemists 제11호, 제85페이지(1960년), 티. 히구치, J. Pharm, Sci, 제50호, 제874페이지(1961년) 참조]. 결과적으로, 이러한 유형의 제형의 방출율은 Cs, 즉 효소의 용해도를 변화시키거나(예를 들면, 상이한 유형의 부형제 사용) 또는 부형제 중에 약물 부하량을 조절함으로써 변형시킬 수 있다.

효소를 수용성 부형제 중에 고상 입자로서 현탁시킬 경우, 단백질의 방출 속도는 고전적인 노이즈 식(Noyes-equation)으로 나타낼 수 있다.

여기에서, M은 방출 또는 용해된 양이고, t는 시간이며, D는 배지 중에서 약물 분자의 확산 계수이고, A는 노출된 표면적이며, h는 확산층의 두께이고, Cs 및 C는 투여 부위에서 효소의 용해도 및 농도이다. 신속하게 용해될 수 있는 부형제 중에 도입된 고상 입자 효소의 경우, 간질 공간에서 부형제가 용해되고 그 공간에서 효소가 분산될 것이다. 비교적 불용성인 효소는 그의 용해도 및 입도에 좌우되어 목적하는 기간 동안 용해될 것이다.

이 식에 따르면, 수용성 부형제로부터 난용성 효소의 방출 속도는 A, 즉 노출된 입자 표면적에 의해 조절될 수 있다. 이는 입도를 조절함으로써 달성될 수 있다. 보다 큰 입자는 보다 작은 표면적 및 저속 방출 속도를 가져오는 반면, 작은 입자는 총노출 표면적을 증가시키고 고속 방출 속도를 초래한다.

난용성 효소는 극히 장기간 동안 생체액 중에서 매우 낮은 활성을 가지고 존재할 정도로 불용성인 것은 아니다. 저용해도 형태는 목적하는 기간 동안에 연속적인 방출이 가능하게 하여 준다. 이 연속적인 방출은 또한 불활성 부형제를 사용함으로써 촉진될 수 있다. 바람직한 부형제는 목적하는 시간 동안 효소를 방출시키는 것들이다. 효소가 연속적으로 방출되는 기간은 적어도 약 3일 내지 약 2주이다. 바람직하게는, 효소가 방출되는 기간은 적어도 약 4일 내지 약 10일간이다.

난용성 효소를 잠재적인 유착 형성 자리에 전달하기에 적합한 분산계(分散系)는 두 용기의 내용물을 혼합하기 위한 수단이 있는 용기 혼합계를 함유한다. 전달계는 살균된 부착 증강 부형제를 분리하여 저장하기에 적합한 제1가요성(可撓性) 용기와 난용성 효소를 저장하기에 적합한 제2가요성 용기를 포함한다. 제1가요성 용기에는 관통 가능한 격판(隔板)이 있는 포트(port) 부재가 있다. 제2가요성 용기에는 살균액과 난용성 효소를 혼합하기 위하여 제1용기의 상기 포트와 같은 위치에 있는 상호적인 포트가 있다. 각각의 용기, 또는 적어도 한 쪽 용기의 가요성에 의해서 용기의 내용물이 혼합될 수 있다. 또한, 가요성 용기는 겔상의 약제가 잠재적인 유착 형성 부위에서 분산되는데 도움을 주는 작용도 하게 된다. 제2용기에는 밀폐시키기 위한 가요성 봉입 수단이 있다. 이 가요성 봉입 수단은 출입 포트를 가지며, 이를 통하여 유효 치료량의 난용성 효소 및 희석제 또는 불활성 부착 증강 부형제를 함유하는 겔 약제가 잠재적인 유착 형성 자리로 전달된다.

본 발명의 효소 조성물은 수술 봉합하기 전에 투여될 수 있다. 복부 수술의 경우, 난용성 효소 단독으로 구성된 또는 불활성 유착 증강 부형제와 혼합된 형태인 본 발명의 조성물이 봉합 전에 기관위의 복막을 끌어당기기 전에 복부 기관위의 박막내로, 손 또는 맛사지 또는 다른 적합한 방법, 예를 들면, 복강경에 의해 가해질 수 있다. 이 조성물이 사용되어야 하는 기관들은 통상의 지식을 가진 외과 의사들에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 복부 수술의경우, 유착 형성을 초래하는 장애 부위일 수 있는 소장이 가능한 적용 부위의 하나일런지 모른다. 가해지는 조성물의 양은 전술한 바와 같으며, 손상 정도, 수술의 종류, 환자의 상태, 효소의 혈전 용해 활성과 같은 임상 경험 및 통상적으로 숙련된 내과 의사들이 인식하는 기타 인자들에 의해 영향을 받는다.

[실시예 1]

재료 및 방법

1) 토끼 모델

유착 형성을 일으키는 가장 강한 자극은 압착된 복막 표면보다는 복막 결함을 봉합 또는 패칭(patching)함으로서 생성되는 허혈성 조직의 존재인 것으로 밝혀졌다. 체중이 약 3.0kg인 뉴질랜드산 백토끼를 플루아니존(Fluanizone) 및 펜타닐(Fentanyl)로 안락사시키고, 깨끗한 수술 기구를 사용하여 중앙을 개복시켰다. 9cm²면적의 복막벽을 제거하고, 모서리를 견사로 봉합하여 복막 조직의 허혈성 패치를 만들었다. 맹장 주변부위(약 75cm²)를 건조된 가아제로 출혈 반점이 나타날 때까지 문질렀다. 혈전 용해 활성 또는 피브린 용해 활성을 갖는 불용성 또는 비교적 불용성인 효소를 박막으로 또는 세정제(조직 플라스미노겐 활성화제 0.5mg/등장성 식염 용액 150ml)로서 본 발명의 방법에 의해, 또는 제형(조직 플라스미노겐 활성화제 0.25mg/제형 1g을 함유하는 겔 2.5g)을 상기 부위에 외부로부터 투여함으로서 약물 용액을 재봉합시킨 복막 조직에 직접 전달하는 맥관 출입 포트를 통해 허혈성 조직에 전달하였다. 맹장을 복강내로 재배치시킨 후, 복부의 근육층을 1.0프롤린으로 봉합하고, 피부층을 2.0프롤린으로 봉합하였다. 7일 후, 토끼를 안락사시키고, 개복하여 유착 형성 정도를 조사하였다. 양성 유착에 대한 기준은 복막벽에서 허혈성 조직 패치에 맹장의 유착이었다. 하기 등급 체계가 유착의 심도를 평가하기 위하여 사용되었다.

등급 0=유착이 관찰되지 않음

등급 1= 허혈성 패치의 10% 미만이 유착물로 덮힘

등급 2= 허혈성 패치의 25%가 유착물로 덮힘

등급 3= 허혈성 패치의 50%가 유착물로 덮힘

등급 4= 허혈성 패치의 100%가 유착물로 덮힘

등급 5= 허혈성 패치보다 큰 면적이 유착물로 덮힘

2) 조직 플라스미노겐 활성화제 벌크 분말

스톡(stock) 용액으로부터 용해성 완충액을 투석시켜 제거하므로써 조직 플라스미노겐 활성화제 분말 벌크(bulk)를 제조하였다. 따라서, 조직 플라스미노겐 활성화제 2.5mg/ml, L-아르기닌 87.1mg/ml, 인산 26.8mg/ml(85% w/w), 및 폴리소르베이트 80 0.1mg/ml를 함유하는 용액 1000ml를 100ml씩 나누어 투석막관(Spectrapor membrane tubing, 분획치 6000-8000)으로 옮겼다. 각 분율을 5℃에서 정제한 멸균수 1000ml로 투석하였다. 투석물을 4회 교체한 후, 관 내부의 단백질 침전물을 수집하였다. 원심분리(Beckman Accu-spin 냉동 원심 분리기로 5℃에서 4000rpm으로 15분 동안)한 후, 상징액을 버리고 정제된 멸균수를 관에 첨가하였다. 단백질을 믹서(Vortex mixer)를 사용하여 세척하고, 다시 원심 분리하여 분리하였다. 이 조작을 3회 더 반복하였다. 얻은 생성물은 백색의 무정형 분말이었다. 최종 세척 후, 조직 플라스미노겐 활성화제를 모으고, 단위 투여량 형태의 살균 분말로서 제조하였다.

3) 단위 투여량 분말 제조

a) 물 침전

t-PA 벌크를 물 및 아르기닌 인산염을 한외 여과시켜 20배 농축시켰다. 농축된 생성물을 살균 여과하였다. t-PA에 물을 첨가하여 농축된 벌크로 침전시켰다. 아르기닌 인산염 및 잔류 가용성 t-PA를 물로 연속 세척하여 침전된 현탁액으로부터 제거하였다. 세척된 현탁액을 바이알에 슬러리로 충전시켰다. 바이알의 내용물을 동결 건조시켜 t-PA 분말을 얻었다.

b) pH 침전

t-PA 벌크의 pH를 인산으로 pH 4로 조정하였다. t-PA 벌크 중의 아르기닌 인산염을 투석 여과하여 염산 용액(pH 4)으로 대체하였다. 이어서 t-PA/염산 벌크를 살균 여과하였다. 여과된 벌크를 묽은 수산화나트륨 용액으로 pH 6으로 조정하여 t-PA를 침전시켰다. 염화나트륨 및 잔류 가용성 t-PA를 물로 연속적으로 세척하여 침강 현탁액으로부터 제거하였다. 세척된 현탁액을 바이알에 슬러리로 충전시켰다. 바이알의 내용물을 동결 건조시켜 t-PA 분말을 얻었다.

c) 중탄산암모늄 동결 건조

pH 7.2인 0.5M 아르기닌 인산염 및 트윈(Tween) 80(0.19mg/ml)을 함유하는 t-PA 벌크 용액을 G-25 컬럼을 사용하여 2 내지 28℃의 온도에서, pH가 7.0 내지 10.5이고 농도가 0.2 내지 0.8M, 바람직하게는 0.25 내지 0.5M인 중탄산암모늄과 같은 휘발성 완충액으로 교체하였다. 중탄산암모늄 및 트윈 80 중의 t-PA 용출액을 모으고, 선택된 중탄산암모늄 완충액 및 공정 온도에서 t-PA의 용해도에 기초하여 중탄산암모늄 농도에서 이를 한외 여과하여 농축시켰다. 이어서, t-PA/중틴산 암모늄 벌크를 살균 여과하였다. 여과된 벌크를 바이알에 충전시켰다. 바이알의 내용물을 동결 건조시켜 t-PA 분말을 얻었다.

4) 투여량 형태 제조

또한, 당업계에서 사용된 것과 유사한 다양한 수용액을 제조하고, 예를 들면 덱스트란 또는 개질된 고무상 셀룰로오스(4)항목의 제형 1 및 2), 개질된 콜라겐 또는 플록사머(4)항목의 제형 3 및 4)와 같은 콜로이드성 다당류 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 첨가하여 농후화된 글리세롤(4)항목의 제형 5)을 사용하여 검사하였다. 제형 1 내지 4는 두 범주로 분류된다. 즉, 수용성 겔 중에 용해된 조직 플라스미노겐 활성화제(제형 1과 3) 및 수용성 겔 중에 난용성 입자로 현탁된 조직 플라스미노겐 활성화제(제형2와 4)이다.

제형 1 :

L-아르기닌을 정제수 90ml 중에 용해시켰다. 인산(1.54g)을 서서히 첨가하여 pH 6.0인 용액을 얻었다. 정제수로 용액의 용적이 100ml가 되게 하였다. 이 용액을 필터의 소공(小孔) 크기가 0.22μm인 살균필터를 통과시키고(Millex-GV 또는 등가물), 5℃에 보관하였다.

B 최종 제형 :

조직 플라스미노겐 활성화제를 첨가하고 완충 용액 A 중에 용해시켰다. 이어서, 격렬하게 혼합시키면서 텍스트란을 서서히 첨가하고 균질 용액을 얻을 때까지 중합체를 용해시켰다.

제형 2 :

덱스트란을 균질 용액을 얻을 때까지 격렬하게 혼합시키면서 물 중에 용해시켯다. 조직 플라스미노겐 활성화제를 이 용액에 첨가하여 혼합하고, 단백질을 균질하게 분산시켰다.

제형 3 :

L-아르기닌을 정제수 90ml 중에 용해시켰다. 인산을 서서히 첨가하여 pH 6.0인 용액을 얻었다. 그 양은 약 1.54g이었다. 정제수로 용액의 용적이 100ml가 되게 하였다. 이 용액을 필터 소공 크기가 0.22μm인 살균 필터(Millex-GV 또는 등가물)에 통과시켰다. 이어서, 이 용액을 5℃에 보관하고 최종 제형 제조에 사용하였다.

B 최종 제형 :

완충 용액 A를 5℃까지 냉각시키고, 조직 플라스미노겐 활성화제를 첨가하여 용해시켰다. 이어서 플록사머를 첨가하고 균질 용액을 얻을 때까지 격렬하게 혼합하면서 용해시켰다. 이 용액을 소공 크기가 0.22μm인 살균 필터(Millex-GV 또는 등가물)에 통과시켰다.

제형 4 :

물을 5℃까지 냉각시키고, 플록사머 407을 첨가하고 균질 용액을 얻을 때까지 격렬하게 혼합하면서 용해시켰다. 조직 플라스미노겐 활성화제를 첨가하고 균질하게 분산시켰다.

제형 5 내지 9는 본 발명의 신규 조성물에 대한 부가적인 예이며, 넓게 세 범주, 즉 난용성 입자로서 무수 수용성 겔 중에 현탁된 조직 플라스미노겐 활성화제(제형 5). 난용성 입자로서 장쇄 탄화수소 기재 중에 현탁된 조직 플라스미노겐 활성화제(제형 6), 및 난용성 입자로서 불포화 및 포화 지방산 글리세리드로 구성된 생분해 가능한 반합성 오일 및 왁스 중에 현탁된 조직 플라스미노겐 활성화제(제형 7,8 및 9)로 분류할 수 있다.

제형 5 :

글리세롤을 약 35 내지 45℃까지 가온시켰다. 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하고 균질 용액을 얻을 때까지 혼합하였다. 조직 플라스미노겐 활성화제를 첨가하고 균질하게 분산시켰다. 제형을 냉각시키고, 실온에서 연속 교반시키면서 응결시켰다.

제형 6 :

와셀린을 약 35°내지 45℃에서 용융시켰다. 여기에 조직 플라스미노겐 활성화제를 첨가하고 균질하게 분산시켰다. 제형을 냉각시키고, 실온에서 계속 혼합하면서 응결시켰다.

제형 7 :

제형 8 :

제형 9 :

제형 7, 8 및 9는 다음과 같은 방법으로 제조되었다. 즉, 오일을 약 35 내지 45℃까지 가온시키고, 고상 지방산 글리세리드를 첨가하여 용융시키고, 조직 플라스미노겐 활성화제를 첨가하고 혼합물 중에서 균질하게 분산시켰다. 제형을 냉각시키고 실온에서 계속 혼합하면서 응결시켰다.

제형 10과 11은 본 발명의 신규 조성물의 부가적인 예이다.

제형 10 :

t-PA 분말을 글리콜산염 전분과 건식 혼합하였다. 이 건식 혼합물을 습한 생체 표면에 직접 부어 그 자리에서 겔을 형성할 수 있었다.

제형 11 :

글리세롤과 인산나트륨을 물 중에 용해시키고 pH를 6.0으로 조정하였다. 히알루론산 나트륨을 균질 겔을 얻을 때까지 완충 용액 중에 용해시켰다(겔 프리믹스).

겔을 살균 주사기와 같은 제1가요성 용기 내로 적하시켰다. t-PA 분말을 전술한 바와 같은 제2가요성 용기내로 적하하였다. 사용 직전에, 주사용수, 일반적인 식염수, 또는 5% 덱스트로스와 같은 혼합 용액을 일정 용적으로 첨가하여 제1가요성 용기내의 겔 프리믹스와 혼합하기 위하여 t-PA 분말을 제조하였다. 혼합 용액을 제2가요성 용기 중의 t-PA 분말에 겔 4g에 대해 1g의 양으로 첨가하고, 완전히 혼합하였다. 혼합 용액의 일정 용적을 투여될 겔 t-PA의 양에 기초하여 변화시킬 수 있다. 제2가요성 용기를 살균 포트를 통해 겔 프리믹스가 함유된 제1가요성 용기와 연결하였다[예, 부론(Burron)의 유체 분산 연결기].

t-PA와 겔 프리믹스를 두 용기 사이에서 겔을 앞 뒤로 밀어 균질하게 될 때까지 혼합하였다.

[실시예 2]

복막 유착에 대한 난용성 조성물의 효과

유착 형성

동물을 조직 플라스미노겐 활성화제를 고상 효소 형태 또는 가용성 형태로 하여 전술한 바와 같이 처리하였다. 가용성 효소의 경우, 절개부를 봉합하기 전에 복강을 1회 세정하였다. 형성된 유착 정도를 14일 후 평가하였다. 별법으로서, 맥관 출입 포트를 통하여 허혈 자리에 상기 용액을 외부로부터 반복 투여하였다. 5일 후, 출입 포트를 통한 투여에 따른 유착 형성 정도를 조사하였다. 모든 경우에 대조용으로 식염수를 사용하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

처리되지 않은 모든 동물의 유착 형성 정도가 높은 것으로 보아 수술 후 유착은 이 모델로 재현될 수 있음을 입증하였다. 1회 세정된 토끼는 대조 동물보다 평균 유착 횟수가 더 적음을 보였다. 그러나, 조직 플라스미노겐 활성화제를 5일 동안에 걸쳐 1일 2회 허혈 부위에 직접 도포할 경우 더욱 개선되었다. 3마리 모두 유착 증세를 보이지 않았다. 대조군의 동물들은 모두 각각 등급 4 및 5의 유착을 보였다.

조직 플라스미노겐 활성화제를 본 발명에 따른 신규 반고상 제형 중에 첨가하고, 절개 및 재봉합한 복강벽 부위 및 연마시킨 맹장 부분에 국소 투여하였다. 조직 플라스미노겐 활성화제의 투여량은 겔 1g당 조직 플라스미노겐 활성화제 0.25mg으로 일정하였다. 본 발명의 신규 조성물 약 2.5mg을 잠재적인 유착 형성 자리의 표면 위에 있는 박막에 손 및 맛사지로 투여하였다.

대부분의 연구에서, 조직 플라스미노겐 활성화제가 함유되지 않은 위약(僞藥) 제형으로 처리한 대조 동물은 전체 외상 부위에서 광범위한 유착 증세를 보였다. 수용성 겔로서 용해되어 가해진 조직 플라스미노겐 활성화제(제형 1 및 3)는, 대조군에 비교하여 볼 때 유착 형성 억제에서 거의 진전이 없었다. 세정제 처리에서처럼, 용해된 조직 플라스미노겐 활성화제는 생체내에서 쉽게 불활성화될 수 있고, 그 활성은 유착 형성을 완전히 방지할 수 있을 정도로 충분한 지속성이 없었다. 유착 형성 억제는 본 발명의 조성물을 사용한 다른 모든 처리 군에서 관찰되었다. 제형 5, 6, 7, 8 및 9에 기재된 신규 조성물을 사용하여 시험된 29마리의 동물 중 3마리에서만 유착이 형성되었다. 수용성 부형제 중에 현탁된 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 고상의 비교적 불용성인 효소(제형 5)도 유착 형성 방지에 효과적이어서, 조직 플라스미노겐 활성화제에 한정된 고유한 용해도가 또한 치료 효과를 위해 요구되는 생체내의 제제의 안정성 및 지연된 피브린 용해 활성에 기여하는 인자라는 것을 암시한다.

조직 플라스미노겐 활성화제의 양을 다양하게 하여 추가 실험을 행하였다. 체중이 3kg인 24마리의 토끼를 4군으로 분류하였다. 수술 후, 총 투여량 0, 0.16, 0.31 또는 0.63mg의 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제가 함유된 부형제 2.5g을 각 토끼의 외상 조직에 가하였다. 생성된 유착 정도의 결과는 제1도에 요약되어 있다. 본 발명의 신규 조성물 중의 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제에 의한 유착 형성 정도에 대한 효과는 최저 투여량으로는 명백하지 않았고, 0.31 및 0.63mg에서 유착 형성이 극히 감소되었다.

형성된 유착의 심도는 나아가 유착성 조직을 분리하기 위해 필요한 기계적인 힘의 정도를 결정함으로써 특정화된다. 예를 들면, 유착성 조직을 분리하기 위하여 봉합 가위를 사용한 블런트 절단(blunt dissection)이 사용되거나 또는 심한 유착의 경우 실제 절단에는 기계적인 힘이 사용된다. 이 결과를 하기 표 3에 요약하였다. 조직 플라스미노겐 활성화제 0.31 및 0.63mg으로 처리한 동물에서 형성된 유착물을 분리하기 위해서는 단순 블런트 절단이 필요하였다. 적은 투여량의 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 이 활성화제를 사용하지 않고 형성시킨 유착물은 종종 이를 분리하기에 시간이 더 소요되는 날카로운 절단이 필요하였다.

제형 11에 기재된 바와 같이, 히알루론산 중의 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제의 양을 다양하게 하여 시험하였다. 체중이 3kg인 24마리의 토끼를 4군으로 분류하였다. 수술 후, 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제를 총 투여량 0, 0.168, 0.225 또는 0.70mg으로 함유하는 부형제 2.8g을 각 토끼의 외상 조직에 도포하였다. 형성된 유착 정도의 결과를 제3도에 요약하였다. 모든 피검 토끼에서 본 발명의 신규 조성물 중의 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제에 의해 유착 형성이 사실상 억제되었다.

유착 재형성

유착 방지를 위해 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 혈전 용해제 또는 피브린 용해제와 부형제를 포함하는 본 발명의 제형을 사용할 수 있지만, 이 제형을 또한 유착물 분리 후의 유착물 재형성 방지를 위해 사용할 수도 있다. 하기 실험은 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제가 유착물 용해 후 유착 재형성에 영향을 미치는가의 여부를 정하기 위해 고안되었다. 10마리의 토끼를 안락사시키고, 중앙 개복술을 행하였다. 허혈성 복막판을 전술한 바와 같이 맹장 앞의 우측 옆구리에 만들었다. 복부를 봉합하기 전에 외상 조직에 어떠한 부형제도 가하지 않았다. 7일 후, 재개복하였다. 지사(識査)에서, 유착물을 분리하고, 전기 소작기로 출혈을 조절하였다. 10마리 중 9마리의 토끼가 3등급 이상의 유착 형성을 보였다. 1마리는 유착 형성이 나타나지 않아서 연구에서 제외되었다. 4마리의 토끼에서, 분리된 피브린 피복 표면은 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 0.63mg이 함유된 부형제 2.5g으로 덮었다. 5마리의 대조용 토끼에 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제가 함유되지 않은 부형제를 동량 투여하였다. 토끼를 두 층으로 봉합하고, 7일 후 재개복하였다. 존재하는 유착의 제거 정도 및 수술 후 유착의 재형성 정도에 관한 결과(제2도)는, 약물이 연속 방출되도록 선행 유착 형성 자리에 가해진 본 발명의 신규 조성물에 있는 재조합 조직 플라스미노겐과 같은 혈전 용해제 또는 피브린 용해제가 초기 유착 형성 방지에서처럼 수술 후 유착물의 제거 및 재형성 방지에서도 효과적이라는 것을 나타내는 것이다.

혈전 용해제 또는 피브린 용해제로 투여된 다량의 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제는 전신계의 피브리노겐에 있어서 어느 정도 감소를 일으킨다[라오, 에이.케이.(Rao, A.K.)등의 Clin. Res. 제34호, 제337A호(1986년) 참조]. 유착 형성 방지에 있어서, 전신계의 피브리노겐 분해에 기여하는 겔 중의 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제의 사용 여부는 복강 내 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 0.63mg이 함유된 부형제 2.5g을 투여한 후, 0, 2, 3, 4 및 24시간에서 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 억제제, 즉 D-Phe-Pro-Arg-클로로메틸케톤을 사용하여 4마리 토끼에서 얻은 혈액 시료를 분석함으로써 평가하였다[몰러, 엠.에이(Mohler, M.A.)등의 Thromb. Heam. 제56호, 제2페이지(1986년) 참조]. 혈장 1ml당 새조합 조직 플라스미노겐 활성화제 15ng의 민감도를 갖는 특정 ELISA에 의해, 혈장 시료를 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제에 대해 분석하였다. 임의의 시간에서 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제가 순환한다는 어떤 증거도 없었다. 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제는 간에서 신속하게 제거되므로, 동일한 혈장 시료를 트롬빈 의존성 방법에 의해 피브리노겐에서의 변화에 관하여 측정하였고, 피브리노겐 순환에 감소가 없음이 명백한 것으로 보아 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제가 토끼에서 응혈 시스템에서 변화가 일어날 수 있는 속도로 신속하게 복강에서 혈류내로 흡수되지 않음을 나타내었다.

북크만, 알.에프.등은 문헌[J.Surg. Res. 제20호, 제1페이지(1976년)]에서 복막 표면에 대한 허혈성 장애를 갖는 외상에 의한 플라스미노겐 활성화제의 지속적인 활성 억제가 유착 형성을 자극하는 주 요인이라고 주장하였다. 반대로, 본래의 피브린 용해 시스템이 유지되어 피브린이 용해되므로 영구적인 유착이 유발될 수 없었다. 억제된 플라스미노겐 활성화제 활성의 시간적 경로가 피브린 유착 형성의 발병학에서는 공지되지 않았다 할지라도, 전술한 바와 같은 용해성 피브린 용해제의 수술 후 단일 복강내 투여량은 불충분하였다. 본 발명은 최초로 제형화된 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 난용성 혈전 용해제가 잠재적인 유착 형성 자리에 직접 가해져, 가장 적당하기로는 효소의 서방형 지속정 방출에 의해, 억제된 내생 혈전 용해 시스템을 보충하여 유착 형성을 방지하여 준다는 사실을 확립하였다.

재조합 조직 플라스미노겐 활성화제의 복막내 사용으로 일어날 수 있는 합병증, 예를 들면 전신계 피브리노게노라이시스(fibrinogenolysis) 및 상처 치유 작용은 관찰되지 않았다. 상기 동물 연구에서 복막내 출혈은 나타나지 않았다.

투여량 반응 연구에서 형성된 유착의 심도는 유착 조직을 분리하기 위해 필요한 외과적인 노력으로 평가하였다(제1도). 수술에 의한 제거가 팔요한 유착물이 있는 동물의 수가 기재되어 있다.

[실시예 3]

난용성 조성물

골반 유착에 대한 효과

체중이 3.0kg인 암컷 뉴질랜드산 백색 토끼를 케타민, 롬푼 및 아쎄프로마진으로 안락사시키고, 개복시켰다. 자궁각(角)의 표면을 전부 노출시키고, 전기 소작기로 각에 심각한 조직 손상을 주어 출혈 반점이 생길 때까지 문질렀다. 본 발명의 신규 조성물 중의 조직 플라스미노겐 활성화제를 겔 제형로서 외상 자궁각에 투여하였다[Amogel, 상기 제형 5 참조]. 자궁각을 골반강으로 교체한 후, 복부의 근육층을 봉합하고, 피부층을 외과용 스태플(staples)로 봉합하였다. 14일 후에, 토끼를 상기한 바와 같이 안락사시키고, 재개복하여 형성된 유착 정도를 정하였다. 자체 내에서 유착된 자궁각의 표면적을 정량하여 유착 정도를 측정하였다.

* mg/gr-조직 플라스미노겐 활성화제(mg)/겔(g)

** 겔이 없는 경우와 비교하여 발명자의 시험관 실험에 의해 결정됨 P0.05

외과적으로 붕괴시킬 수 있는 유착물이 있는 동물을 조직의 평균 유착율이 약 25%가 되는 방식으로 분류하였다. 유착물을 분리하고, 조직 플라스미노겐 활성화제가 함유된 신규 조성물을 상기한 바와 유사한 방법으로 투여하였다. 14일 후에,토끼를 안락사시키고, 조직의 유착율을 자궁의 거시적 조사에 의해 측정하였다.

*mg/gr-조직 플라스미노겐 활성화제(mg)/겔(g)

[실시예 4]

난용성 조성물

안(眼) 유착에 대한 효과

백내장 수술의 합병증은 사시 수술을 초래하는 유착 형성이다. 눈 수술을 초래하는 유착 형성을 방지하기 위하여 히알루론산을 사용하여 왔다. 히알루론산은 β-D-글루쿠론산 및 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코오스가 교대로 이루어진 천연 탄수화물이다. 눈 수술 및 건 재생 수술에서의 수술 후 유착을 감소시키기 위하여 히알루론산, 또는 이 화합물의 화학적 변형 형태가 사용된 사실이 보고되었다[설, 에스.에스.(Searl, S.S.), 메타, 에이치.에스(Meta, H.S.) 및 린달, 케이.제이(Lindahl, K.J), Ann. Ophtalmo. 제19(7)호, 제259페이지(1979년), 웨이스, 씨.(Weiss, C.), 레비, 에이치.(Levy, H.), 덴링거, 제이.(Denlinger, J.), 슈로스, 제이.(Suros, J.) 및 웨이스, 에이취., Bull, Hosp. Jt. Dis. Orthop, Inst., 제46호, 제9-제15페이지(1986년), 웨이스, 씨., 슈로스, 제이., 미칼로우, 에이.(Michalow, A.), 덴링거, 제이., 무어, 엠.(Moore, M.), 테제이로, 더블유.(Tejeiro, W.), Bull, Hosp. Jt. Dis. Orthop. Inst., 제 47호, 제31-제39페이지(1987년) 참조]. 유착 방지에 대한 이들 물질의 효능은 이들 연구에서는 확실히 증명되지 않았다.

그러나, 히알루론산 용액은 그의 생체 적합성 때문에 t-PA와 같은 난용성 효소를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 하기 제형은 히알루론산과 같은 생분해 될 수 있는 점성 담체에 현탁된 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 난용성 효소를 함유하는 본 발명의 신규 조성물 중 한 예이다.

히알루론산을 멸균수 중에 용해시키고, 이 용액을 NaOH로 바람직한 pH(바람직하기로는 6.0)까지 적정하고, 균질하게 분산된 t-PA 분말을 첨가하였다. 점성 겔을 얻을 때까지 조성물을 교반시켰다. 본 발명의 점성 t-PA 제형을 백내장 수술 또는 사시 수술 직후 잠재적 피브린 침착 또는 유착 형성 자리에 투여하였다.

[실시예 5]

피브린 침착에 대한 난용성 조성물의 효과

일반적으로 피브린 침착은 복부내 감염 부위에서 나타나고, 세균이 증식되는 고립된 부분을 형성한다. 이 구획화는 감염 부위를 격리시키는 한편, 이 감염 부위를 숙주 방어 메카니즘으로부터 격리시킨다. 유사한 세균성 복막염 문제가 계속해서 외래 통원 복막 투석 치료(CAPD)를 받은 환자에서 관찰되었다[노리스, 케이.디.(Norris, K.D)등의 Am. J. of Kidney Disease, 제10(1)호, 제62-65페이지(1987년) 참조]. CAPD에서 피브린 응괴내의 세균 격리는 세균 병소 중심으로 작용하는 것으로 생각되어 이들을 항생제 및 백혈구에 의해 분해되는 것으로부터 보호하였다. 헤파린과 스트렙토키나제를 용액으로서 이 CAPD 환자에 투여하였다.

피브린 응괴 복막염 모델이 감염된 응괴를 쥐에 복막내 접종하기 위해 발전되어 왔다[웰즈, 씨.엘.(Wells C.L.)등의 J. Antimicrob. Chemoth. 제15(Supplic)호, 제199-제206페이지(1985년) 참조]. 본 발명의 신규 조성물을 외과 수술 후 피브린 침착 및 농양 형성이 가능한 자리에 또는 그 근처에 투여하였다. 개복하고, 복강을 농양 형성에 대해 조사하였다.

[실시예 6]

건유착(腱癒着)에 대한 난용성 조성물의 효과

굴근건(屈筋腱) 재생 수술 후의 유착 형성은 손상된 건의 재생을 억제하는 것으로 발견되었다[마테즈, 피.(Mattews, P.)등의 J. of Bone and Surgeny 제58B호, 제230-제236페이지(1976년) 참조]. 건에 대한 초기 손상은 그 자체만으로는 유착 형성에 대한 자극이 아님을 발견하였다. 굴근건을 손가락으로 분리할 경우, 그 말단이 퇴축(退築)되고, 부드러운 원형으로 되어 피포 내에서 유리되었다. 유착 형성은 일어나지 않았고, 주위 조직에서의 반응은 없었다. 건의 종단이 수술에 의해 보완된 경우에만 유착 형성 반응이 일어났다.

연구를 위해 완전히 생장한 뉴질랜드산 백색 토끼를 선택하였다. 초기 제조물은 모든 실험에서 동일하였다. 넴부탈(Nembutal)을 정맥내에 투여하여 쥐를 안락사시킨 후, 앞발 중 하나의 털을 깍고 사혈(瀉血) 압박대를 장치하였다. 이어서 피부를 에틸알코올 중의 히비탄(Hibitane) 용액 1%를 사용하여 제조하고, 멸균 드레이프(drapes)를 적용하였다.

발가락이 아닌 발바닥 부분에서 피부를 절개하고, 이어서 피포와 접하는 부분에서 굴근건을 동정하고 활액 반전부(反轉部)를 개봉하였다. 가운데 발가락을 완전히 구부려 중심으로 당김으로써, 건의 활액 부분을 상처 부위로 당겨 낼 수 있었다. 건을 작은 칼로 횡방향으로 저란하여 가능한 말초 부위에 외상을 입혔다. 거의 완전히 절개하여 연속성을 유지하기에 충분히 손상되지 않은 건 섬유 조직만을 남겼다. 이어서, 견인물을 방출시키고, 건의 외상부를 근접 지절에서 3번째 통상적인 피포 중에 거꾸로 집어 넣었다. 본 발명의 t-PA겔을 외상부에 투여하였다. 가는 장선(腸線)으로 봉합하여 폐부를 폐쇄하고, 상처 부위에 에어로졸산 콜로이돈 드레싱을 분무하였다.

상처 부위를 폐쇄한 후, 꼭 맞는 소석고 부목을 사용하여 상처입은 사지를 모두 봉합하고 움직이지 못하게 하였다. 석고를 24일 동안 그대로 유지하였고, 그 후 사지를 자유롭게 하였다.

모든 수술 과정을 무균 상태에서 행하였다. 건을 가능한 조심스럽게 취급하고, 날카로운 작은 칼만을 사용하였다.

토끼를 최대로 12주의 간격으로 죽였다. 해부용 현미경으로 움직이는 발가락을 먼저 주의깊게 조사하고, 건의 치유 상태, 상처 부근에서 조직의 반응 및 유착 존재 여부를 기록하였다. 이어서 주위의 부드러운 조직을 제거하고, 10% 포르몰 식염수 중에 고정시켰다. 프로세싱(processing) 및 임베딩(embedding) 후, 세로로 절개한 절편을 현미경으로 관찰하였다. 이 절편을 헤마톡실린 및 에오신, 제임스(James)의 은 염색 및 헤일(Hale)의 콜로이드 철/PAS 염색 물질로 염색하였다.

Claims

잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 부위에서 약 3일 내지 2주 동안 연속적으로 방출되는 유효 치료량의 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제를 함유하는 조성물을 상기 부위에 국소 투여하는 것을 특징으로 하는 피브린 침착 또는 유착 형성 또는 재형성을 방지하기 위한 인간을 제외한 동물의 치료 방법.
제1항에 있어서, 조성물을 불활성 부착 증강 부형제를 함유하는 것을 특징인 방법.
제2항에 있어서, 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제의 유효 치료량은 불활성 부착 증강 부형제의 g당 약 0.125mg 내지 약 2.5mg인 것이 특징인 방법.
제2항에 있어서, 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제의 유효 치료량은 불활성 부착 증강 부형제의 g당 약 0.25mg 내지 약 1.0mg인 것이 특징인 방법.
제2항에 있어서, 불활성 부착 증강 부형제는 수용성 겔인 것이 특징인 방법.
제2항에 있어서, 불활성 부착 증강 부형제는 반고상 부형제인 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 반고상 부형제는 연성 파라핀인 것이 특징인 방법.
제2항에 있어서, 부형제는 생체내 분해 가능한 중합체인 것이 특징인 방법.
제2항에 있어서, 부형제는 히알루론산인 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 기간은 약 3일 내지 약 10일인 것이 특징인 방법.
제2항에 있어서, 기간은 약 3일 내지 약 10일인 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 피브린 침착은 복막염이 있는 인간을 제외한 동물에서 유도된 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 유착 형성은 수술을 받는 인간을 제외한 동물에서 유도된 것이 특징인 방법.
유효 치료량의 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제를 함유하는 것을 특징으로 하는, 국소 투여 가능하고 효소를 약 3일 내지 2주 동안 전달할 수 있는 피브린 침착 또는 유착 형성을 방지하기 위한 제약 조성물.
제14항에 있어서, 불활성 부착 증강 부형제가 함유된 것인 제약 조성물.
제15항에 있어서, 불활성 부착 증강 부형제는 반고상 부형제것인 제약 조성물.
제16항에 있어서, 반고상 부형제는 연성 파라핀인 것인 제약 조성물.
제15항에 있어서, 불활성 부착 증강 부형제는 생체내 분해 가능한 중합체인 것인 제약 조성물.
제15항에 있어서, 불활성 부착 증강 부형제는 히알루론산인 것인 제약 조성물.
a) 유효 치료량의 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제가 함유된 관통 가능한 격판(隔板)이 있는 포트(port) 부재를 갖는 제1가요성 용기와, b) 살균액과 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제를 혼합하기 위하여 제1용기의 포트와 같은 위치에 있는 상호적인 포트를 갖는 부착 증강 부형제가 함유된 제2가요성 용기로 구성되는 것을 특징으로 하는 피브린 침착 또는 유착 형성을 방지하기 위한 제약 조성물 투여용 분배기.
제20항에 있어서, 제2가요성 용기 중의 부착 증강 부형제는 히알루론산인 것이 특징인 분배기.
제1항에 있어서, 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제는 고상물인 것이 특징인 방법.
제14항에 있어서, 난용성 조직 플라스미노겐 활성화제는 고상물인 것이 특징인 제약 조성물.