JPWO2021224599A5 - - Google Patents
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Description
前出の参考文献および出願の各々は、参照により、それらの全体が、本明細書に組み込
まれる。本開示について、詳細に記載してきたが、付属の特許請求の範囲で規定された教
示の範囲から逸脱しない限りにおいて、改変および変更が可能であることが明らかであろ
う。
本出願は例えば以下の発明も提供する。
[１] イノシシ種（Sus scrofa）に、ＰＲＲＳｖ抵抗性を付与するように編集されたＣＤ１６３遺伝子であって、前記編集が、第７エクソンを切り出し、前記編集遺伝子が、配列番号４２６～４５８および５２０～５５５からなる群から選択される修復されたゲノム配列を含む、編集されたＣＤ１６３遺伝子。
[２] 前記編集が、配列番号２２９および２５６、配列番号２３０および２５６、配列番号２３１および２５６、配列番号２３７および２５６、配列番号２４１および２５６、配列番号２２９および２５８、配列番号２３０および２５８、配列番号２３１および２５８、配列番号２３７および２５８、配列番号２４１および２５８、配列番号２２９および２６１、配列番号２３０および２６１、配列番号２３１および２６１、配列番号２３７および２６１、配列番号２４１および２６１、配列番号２１９および２５６、配列番号２２１および２５６、配列番号２２４および２５６、配列番号２２７および２５６、配列番号２１９および２５８、配列番号２２１および２５８、配列番号２２４および２５８、配列番号２２７および２５８、配列番号２１９および２６１、配列番号２２１および２６１、配列番号２２４および２６１、配列番号２２７および２６１、配列番号２４９および２５６、配列番号２５０および２５６、配列番号２４９および２５８、配列番号２５０および２５８、配列番号２４９および２６１、ならびに配列番号２５０および２６１からなる群から選択される、第７エクソンの切出し部位のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）対を使用して創出される、上記[１]に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子。
[３] 前記編集が、配列番号２２９および２５６、配列番号２３０および２５６、配列番号２３１および２５６、配列番号２４１および２５６、配列番号２２９および２５８、配列番号２３１および２５８、配列番号２４１および２５８、配列番号２１９および２５６、配列番号２２１および２５６、配列番号２２４および２５６、配列番号２２７および２５６、配列番号２２７および２５８、配列番号２２１および２６１、配列番号２４９および２５６、配列番号２５０および２５６、配列番号２４９および２５８、ならびに配列番号２４９および２６１からなる群から選択される、第７エクソンの切出し部位のためのｇＲＮＡ対を使用して創出される、上記[１]に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子。
[４] 前記修復されたゲノム配列が配列番号４５３に示される、上記[１]に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子。
[５] 前記編集が配列番号２４９および２５６に示された配列を使用して創出される、上記[１]に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子。
[６] 前記修復されたゲノム配列が配列番号４５３に示され、前記編集が配列番号２４９および２５６に示された配列を使用して創出される、上記[１]に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子。
[７] 上記[１]～[６]のいずれか一項に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子を含むイノシシ種細胞。
[８] 上記[７]に記載の細胞を複数含む細胞株。
[９] 線維芽細胞株である、上記[８]に記載の細胞株。
[１０] ＰＩＣ系統２、ＰＩＣ系統３、ＰＩＣ系統１５、ＰＩＣ系統１９、ＰＩＣ系統２７、ＰＩＣ系統６２、またはＰＩＣ系統６５に由来する、上記[７]に記載の細胞。
[１１] イノシシ種（Sus scrofa）に、ＰＲＲＳｖ抵抗性を付与するように編集されたＣＤ１６３遺伝子であって、前記編集が、配列番号５０６～５１７からなる群から選択される、第７エクソンの予測アミノ酸配列をもたらす終止コドンを創出する、編集されたＣＤ１６３遺伝子。
[１２] 前記編集が、配列番号３５１および３６５、配列番号３５１および３８７、配列番号３４８および３９０、配列番号３４８および３８８、配列番号３４８および３９５、配列番号３５２および３６５、配列番号３５２および３８７、配列番号３５２および３９９、配列番号３５３および３６５、配列番号３５３および３８７、配列番号３５３および３９９、配列番号３５４および３９０、配列番号３５４および３８８、配列番号３５４および３９５、配列番号３５８および３６１、配列番号３５８および３６２、配列番号３５８および３６８、配列番号３５８および３８４、配列番号３５８および３９４、配列番号３５８および３９９、配列番号３５９および３９０、配列番号３５９および３８８、配列番号３５９および３９５、配列番号３６０および３６８、配列番号３６０および３８４、配列番号３６０および３８９、配列番号３６０および３９４、配列番号３６０および３９７、配列番号３６１および３６５、配列番号３６１および３８７、配列番号３６２および３９０、配列番号３６２および３８８、配列番号３６２および３９５、配列番号３６４および３６５、配列番号３６４および３８７、配列番号３６４および３９９、配列番号３６５および３６８、配列番号３６５および３８４、配列番号３６５および３８９、配列番号３６５および３９４、配列番号３６５および３９７、配列番号３６６および３６８、配列番号３６６および３８４、配列番号３６６および３８９、配列番号３６６および３９４、ならびに配列番号３６６および３９７からなる群から選択されるｇＲＮＡを使用して創出される、上記[１１]に記載のＣＤ１６３遺伝子。
[１３] 前記編集が、配列番号３５１および３６５、配列番号３４８および３９０、配列番号３４８および３８８、配列番号３５４および３９０、配列番号３５８および３９４、配列番号３６２および３９０、ならびに配列番号３６６および３９４からなる群から選択されるｇＲＮＡを使用して創出される、上記[１１]に記載のＣＤ１６３遺伝子。
[１４] 修復された遺伝子が、配列番号４５９～５０４からなる群から選択される核酸配列を含む、上記[１１]に記載のＣＤ１６３遺伝子。
[１５] ＣＤ１６３第７エクソンの前記予測アミノ酸配列が配列番号５１３に示される、上記[１１]に記載のＣＤ１６３遺伝子。
[１６] 修復された遺伝子が配列番号４８９に示された核酸配列を有する、上記[１１]に記載のＣＤ１６３遺伝子。
[１７] 前記編集が、配列番号３６２および３９０に示された配列を使用して創出される、上記[１１]に記載のＣＤ１６３遺伝子。
[１８] 前記遺伝子の前記予測アミノ酸配列が配列番号５１３に示され、修復された遺伝子が配列番号４８９に示された核酸配列を有し、前記編集が、配列番号３６２および３９０に示された配列を使用して創出される、上記[１１]に記載のＣＤ１６３遺伝子。
[１９] 上記[１１]～[１８]のいずれか一項に記載のＣＤ１６３遺伝子を含むイノシシ種細胞。
[２０] 上記[１９]に記載の細胞を複数含む細胞株。
[２１] 線維芽細胞株である、上記[２０]に記載の細胞株。
[２２] ＰＩＣ系統２、ＰＩＣ系統３、ＰＩＣ系統１５、ＰＩＣ系統１９、ＰＩＣ系統２７、ＰＩＣ系統６２、またはＰＩＣ系統６５に由来する、上記[１９]に記載の細胞。
[２３] イノシシ種（Sus scrofa）ＣＤ１６３遺伝子を編集するためのｇＲＮＡ対であって、配列番号２２９および２５６、配列番号２３０および２５６、配列番号２３１および２５６、配列番号２３７および２５６、配列番号２４１および２５６、配列番号２２９および２５８、配列番号２３０および２５８、配列番号２３１および２５８、配列番号２３７および２５８、配列番号２４１および２５８、配列番号２２９および２６１、配列番号２３０および２６１、配列番号２３１および２６１、配列番号２３７および２６１、配列番号２４１および２６１、配列番号２１９および２５６、配列番号２２１および２５６、配列番号２２４および２５６、配列番号２２７および２５６、配列番号２１９および２５８、配列番号２２１および２５８、配列番号２２４および２５８、配列番号２２７および２５８、配列番号２１９および２６１、配列番号２２１および２６１、配列番号２２４および２６１、配列番号２２７および２６１、配列番号２４９および２５６、配列番号２５０および２５６、配列番号２４９および２５８、配列番号２５０および２５８、配列番号２４９および２６１、配列番号２５０および２６１、配列番号３５１および３６５、配列番号３５１および３８７、配列番号３４８および３９０、配列番号３４８および３８８、配列番号３４８および３９５、配列番号３５２および３６５、配列番号３５２および３８７、配列番号３５２および３９９、配列番号３５３および３６５、配列番号３５３および３８７、配列番号３５３および３９９、配列番号３５４および３９０、配列番号３５４および３８８、配列番号３５４および３９５、配列番号３５８および３６１、配列番号３５８および３６２、配列番号３５８および３６８、配列番号３５８および３８４、配列番号３５８および３９４、配列番号３５８および３９９、配列番号３５９および３９０、配列番号３５９および３８８、配列番号３５９および３９５、配列番号３６０および３６８、配列番号３６０および３８４、配列番号３６０および３８９、配列番号３６０および３９４、配列番号３６０および３９７、配列番号３６１および３６５、配列番号３６１および３８７、配列番号３６２および３９０、配列番号３６２および３８８、配列番号３６２および３９５、配列番号３６４および３６５、配列番号３６４および３８７、配列番号３６４および３９９、配列番号３６５および３６８、配列番号３６５および３８４、配列番号３６５および３８９、配列番号３６５および３９４、配列番号３６５および３９７、配列番号３６６および３６８、配列番号３６６および３８４、配列番号３６６および３８９、配列番号３６６および３９４、ならびに配列番号３６６および３９７からなる群から選択されるｇＲＮＡ対。
[２４] 配列番号２２９および２５６、配列番号２３０および２５６、配列番号２３１および２５６、配列番号２４１および２５６、配列番号２２９および２５８、配列番号２３１および２５８、配列番号２４１および２５８、配列番号２１９および２５６、配列番号２２１および２５６、配列番号２２４および２５６、配列番号２２７および２５６、配列番号２２７および２５８、配列番号２２１および２６１、配列番号２４９および２５６、配列番号２５０および２５６、配列番号２４９および２５８、配列番号２４９および２６１、配列番号３５１および３６５、配列番号３４８および３９０、配列番号３４８および３８８、配列番号３５４および３９０、配列番号３５８および３９４、配列番号３６２および３９０、ならびに配列番号３６６および３９４からなる群から選択される、上記[２３]に記載のｇＲＮＡ対。
[２５] イノシシ種（Sus scrofa）のＣＤ１６３遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ複合体であって、上記[２３]～[２４]のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ対を含むＣＲＩＳＰＲ複合体。
[２６] イノシシ種（Sus scrofa）のＣＤ１６３遺伝子を編集するための方法であって、上記[２３]～[２４]のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ対を含むＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ複合体を使用するステップを含む方法。
[２７] 上記[２３]～[２４]のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ対を含むＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ複合体を使用することにより、ＰＲＳＳｖ抵抗性イノシシ種（Sus scrofa）細胞を調製するための方法。
[２８] ＰＲＲＳｖ抵抗性イノシシ種（Sus scrofa）動物を作出する方法であって、
ａ）上記[２３]～[２４]のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ対を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、１つまたは複数のイノシシ種細胞のＣＤ１６３遺伝子を編集するステップと；
ｂ）前記細胞または複数の細胞から、動物を作出するステップと
を含む方法。
[２９] ＰＲＲＳｖ抵抗性動物の作出における、上記[８]に記載の細胞株の使用。
[３０] ＰＲＲＳｖ抵抗性動物の作出における、上記[１９]に記載の細胞株の使用。
[３１] 上記[７]～[１０]または[１９]～[２２]のいずれか一項に記載の細胞を複数含む胚、子ブタ、または成体。
[３２] 配列番号４５３に示された配列と９０％の同一性を有する編集配列の存在または非存在を決定する方法であって、
ａ）配列番号５６４および配列番号５５８または５６１に示された配列の、示差的に標識化されたプローブ；
ｂ）配列番号５６２および５６３に示されたプライマー対；ならびに
ｃ）配列番号５５６および５５７または配列番号５５９および５６０に示されたプライマー対
により、リアルタイムＰＣＲを実施するステップを含む方法。
[３３] 前記編集配列が配列番号４５３に示された配列と１００％の同一性を有する、上記[３２]に記載の方法。
[３４] 配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６２、および配列番号５６３からなる群から選択されるＰＣＲプライマー。
[３５] 配列番号５５８、配列番号５６１、および配列番号５６４からなる群から選択されるリアルタイムＰＣＲプローブ。
[３６] 配列番号４５３に示された編集ゲノム配列の存在または非存在を決定するための、ａ）配列番号５５６および５５７、ならびに配列番号５６２および５６３、またはｂ）配列番号５５９および５６０、ならびに配列番号５６２および５６３に示されたＰＣＲプライマーの使用。
[３７] 配列番号４５３に示された編集ゲノム配列の存在または非存在を決定するための、ａ）配列番号５５８および５６４、またはｂ）配列番号５６１および５６４に示されたＰＣＲプローブの使用。
[３８] ＰＲＲＳｖ抵抗性ブタを作出する方法であって、配列番号４５３に示されたゲノム配列を含むようにブタゲノムを編集するステップを含む、方法。
[３９] 前記ブタゲノムを編集するステップが、配列番号２４９および２５６に示された配列を有するｇＲＮＡを投与する工程を含む、上記[３８]に記載の方法。
[４０] 前記投与する工程が、前記ｇＲＮＡとＣＡＳタンパク質とを含む予め形成されたＲＮＰ複合体を、接合体、胚、またはＭＩＩ期卵母細胞へと注入することを含む、上記[３９]に記載の方法。
[４１] 前記ブタが、ＰＩＣ系統２、ＰＩＣ系統３、ＰＩＣ系統１５、ＰＩＣ系統１９、ＰＩＣ系統２７、ＰＩＣ系統６２、またはＰＩＣ系統６５のブタである、上記[３８]に記載の方法。
Each of the foregoing references and applications is incorporated herein by reference in its entirety. Although the present disclosure has been described in detail, it will be apparent that modifications and variations are possible without departing from the scope of the teachings as defined in the appended claims.
The present application also provides, for example, the following inventions.
[1] An edited CD163 gene to confer PRRSv resistance to Sus scrofa, wherein the edit excises exon 7, and the edited gene comprises a repaired genomic sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs:426-458 and 520-555.
[2] The edits are SEQ ID NO:229 and 256, SEQ ID NO:230 and 256, SEQ ID NO:231 and 256, SEQ ID NO:237 and 256, SEQ ID NO:241 and 256, SEQ ID NO:229 and 258, SEQ ID NO:230 and 258, SEQ ID NO:231 and 258, SEQ ID NO:237 and 258, SEQ ID NO:241 and 258, SEQ ID NO:229 and 261, SEQ ID NO:230 and 261, SEQ ID NO:231 and 261, SEQ ID NO:237 and 261, SEQ ID NO:241 and 261, SEQ ID NO:219 and 256, SEQ ID NO:221 and 256, SEQ ID NO:224 and 256, SEQ ID NO:227 and 256, SEQ ID NO: 219 and 258, SEQ ID NO: 221 and 258, SEQ ID NO: 224 and 258, SEQ ID NO: 227 and 258, SEQ ID NO: 219 and 261, SEQ ID NO: 221 and 261, SEQ ID NO: 224 and 261, SEQ ID NO: 227 and 261, SEQ ID NO: 249 and 256, SEQ ID NO: 250 and 256, SEQ ID NO: 249 and 258, SEQ ID NO: 250 and 258, SEQ ID NO: 249 and 261, and SEQ ID NO: 250 and 261. The edited CD163 gene described in [1] above is created using a guide RNA (gRNA) pair for the excision site of the 7th exon selected from the group consisting of:
[3] The edited CD163 gene according to the above [1], wherein the edit is created using a gRNA pair for the excision site of the 7th exon selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 229 and 256, 230 and 256, 231 and 256, 241 and 256, 229 and 258, 231 and 258, 241 and 258, 219 and 256, 221 and 256, 224 and 256, 227 and 256, 227 and 258, 221 and 261, 249 and 256, 250 and 256, 249 and 258, and 249 and 261.
[4] The edited CD163 gene according to [1] above, wherein the restored genomic sequence is represented by SEQ ID NO: 453.
[5] The edited CD163 gene described in [1] above, wherein the edit is created using the sequences shown in SEQ ID NOs: 249 and 256.
[6] The edited CD163 gene described in [1] above, wherein the repaired genomic sequence is shown in SEQ ID NO: 453 and the edit is created using the sequences shown in SEQ ID NOs: 249 and 256.
[7] A boar seed cell comprising the edited CD163 gene according to any one of [1] to [6] above.
[8] A cell line comprising a plurality of cells according to [7] above.
[9] The cell line described in [8] above, which is a fibroblast cell line.
[10] The cell according to [7] above, which is derived from PIC line 2, PIC line 3, PIC line 15, PIC line 19, PIC line 27, PIC line 62, or PIC line 65.
[11] An edited CD163 gene to confer PRRSv resistance to Sus scrofa, wherein the edit creates a stop codon that results in a predicted amino acid sequence of exon 7 selected from the group consisting of SEQ ID NOs:506-517.
[12] The edits are SEQ ID NO:351 and 365, SEQ ID NO:351 and 387, SEQ ID NO:348 and 390, SEQ ID NO:348 and 388, SEQ ID NO:348 and 395, SEQ ID NO:352 and 365, SEQ ID NO:352 and 387, SEQ ID NO:352 and 399, SEQ ID NO:353 and 365, SEQ ID NO:353 and 387, SEQ ID NO:353 and 399, SEQ ID NO:354 and 390, SEQ ID NO:354 and 388, SEQ ID NO:354 and 395, SEQ ID NO:358 and 361, SEQ ID NO:358 and 362, SEQ ID NO:358 and 368, SEQ ID NO:358 and 384, SEQ ID NO:358 and 394, SEQ ID NO:358 and 399, SEQ ID NO:359 and 390, SEQ ID NO:359 and 388, SEQ ID NO:359 and 395, SEQ ID NO:360 and 368, SEQ ID NO:360 and 384, SEQ ID NO: 360 and 389, SEQ ID NO: 360 and 394, SEQ ID NO: 360 and 397, SEQ ID NO: 361 and 365, SEQ ID NO: 361 and 387, SEQ ID NO: 362 and 390, SEQ ID NO: 362 and 388, SEQ ID NO: 362 and 395, SEQ ID NO: 364 and 365, SEQ ID NO: 364 and 387, SEQ ID NO: 364 and 399, SEQ ID NO: 365 and 368, SEQ ID NO: 365 and 384, SEQ ID NO: 365 and 389, SEQ ID NO: 365 and 394, SEQ ID NO: 365 and 397, SEQ ID NO: 366 and 368, SEQ ID NO: 366 and 384, SEQ ID NO: 366 and 389, SEQ ID NO: 366 and 394, and SEQ ID NO: 366 and 397. The CD163 gene according to [11] above, which is created using a gRNA selected from the group consisting of:
[13] The CD163 gene according to [11] above, wherein the edit is created using a gRNA selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 351 and 365, 348 and 390, 348 and 388, 354 and 390, 358 and 394, 362 and 390, and 366 and 394.
[14] The CD163 gene according to [11] above, wherein the repaired gene comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 459 to 504.
[15] The CD163 gene described in [11] above, wherein the predicted amino acid sequence of CD163 exon 7 is shown in SEQ ID NO:513.
[16] The CD163 gene according to [11] above, wherein the repaired gene has the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO:489.
[17] The CD163 gene according to [11] above, wherein the editing is created using the sequences shown in SEQ ID NOs: 362 and 390.
[18] The CD163 gene according to [11] above, wherein the predicted amino acid sequence of the gene is set forth in SEQ ID NO:513, the repaired gene has the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO:489, and the edit is created using the sequences set forth in SEQ ID NOs:362 and 390.
[19] A boar seed cell comprising the CD163 gene according to any one of [11] to [18] above.
[20] A cell line comprising a plurality of cells according to [19] above.
[21] The cell line described in [20] above, which is a fibroblast cell line.
[22] The cell according to [19] above, which is derived from PIC line 2, PIC line 3, PIC line 15, PIC line 19, PIC line 27, PIC line 62, or PIC line 65.
[23] A gRNA pair for editing the Sus scrofa CD163 gene, comprising SEQ ID NOs:229 and 256, SEQ ID NOs:230 and 256, SEQ ID NOs:231 and 256, SEQ ID NOs:237 and 256, SEQ ID NOs:241 and 256, SEQ ID NOs:229 and 258, SEQ ID NOs:230 and 258, SEQ ID NOs:231 and 258, SEQ ID NOs:237 and 258, SEQ ID NOs:241 and 258, SEQ ID NOs:229 and 261, SEQ ID NOs:230 and 261, SEQ ID NOs:231 and 261, SEQ ID NOs:237 and 261, SEQ ID NOs:241 and 261, SEQ ID NOs:219 and 256, SEQ ID NOs:221 and 256, SEQ ID NOs:224 and 256, SEQ ID NOs:225 and 256, 27 and 256, SEQ ID NOs: 219 and 258, SEQ ID NOs: 221 and 258, SEQ ID NOs: 224 and 258, SEQ ID NOs: 227 and 258, SEQ ID NOs: 219 and 261, SEQ ID NOs: 221 and 261, SEQ ID NOs: 224 and 261, SEQ ID NOs: 227 and 261, SEQ ID NOs: 249 and 256, SEQ ID NOs: 250 and 256, SEQ ID NOs: 249 and 258, SEQ ID NOs: 250 and 258, SEQ ID NOs: 249 and 261, SEQ ID NOs: 250 and 261, SEQ ID NOs: 351 and 365, SEQ ID NOs: 351 and 387, SEQ ID NOs: 348 and 390, SEQ ID NOs: 348 and 388, SEQ ID NOs: 348 and 395, SEQ ID NOs: 352 and 365, Row numbers 352 and 387, SEQ ID NOs: 352 and 399, SEQ ID NOs: 353 and 365, SEQ ID NOs: 353 and 387, SEQ ID NOs: 353 and 399, SEQ ID NOs: 354 and 390, SEQ ID NOs: 354 and 388, SEQ ID NOs: 354 and 395, SEQ ID NOs: 358 and 361, SEQ ID NOs: 358 and 362, SEQ ID NOs: 358 and 368, SEQ ID NOs: 358 and 384, SEQ ID NOs: 358 and 394, SEQ ID NOs: 358 and 399, SEQ ID NOs: 359 and 390, SEQ ID NOs: 359 and 388, SEQ ID NOs: 359 and 395, SEQ ID NOs: 360 and 368, SEQ ID NOs: 360 and 384, SEQ ID NOs: 360 and 389, SEQ ID NOs: 360 and 369 94, SEQ ID NOs:360 and 397, SEQ ID NOs:361 and 365, SEQ ID NOs:361 and 387, SEQ ID NOs:362 and 390, SEQ ID NOs:362 and 388, SEQ ID NOs:362 and 395, SEQ ID NOs:364 and 365, SEQ ID NOs:364 and 387, SEQ ID NOs:364 and 399, SEQ ID NOs:365 and 368, SEQ ID NOs:365 and 384, SEQ ID NOs:365 and 389, SEQ ID NOs:365 and 394, SEQ ID NOs:365 and 397, SEQ ID NOs:366 and 368, SEQ ID NOs:366 and 384, SEQ ID NOs:366 and 389, SEQ ID NOs:366 and 394, and SEQ ID NOs:366 and 397.
[24] SEQ ID NOs: 229 and 256, 230 and 256, 231 and 256, 241 and 256, 229 and 258, 231 and 258, 241 and 258, 219 and 256, 221 and 256, 224 and 256, 227 and 256, 227 and 258, 221 and 261, 249 and 256, 250 and 256, 249 and 258, 249 and 261, 351 and 365, 348 and 390, 348 and 388, 354 and 390, 358 and 394, 362 and 390, and 366 and 394. The gRNA pair according to [23] above.
[25] A CRISPR complex for editing the CD163 gene of Sus scrofa, comprising the gRNA pair according to any one of [23] to [24] above.
[26] A method for editing the CD163 gene of Sus scrofa, comprising using a CRISPR-CAS complex comprising a gRNA pair according to any one of [23] to [24] above.
[27] A method for preparing PRSSv-resistant Sus scrofa cells by using a CRISPR-CAS complex comprising the gRNA pair according to any one of [23] to [24] above.
[28] A method for producing a PRRSv-resistant Sus scrofa animal, comprising:
a) editing the CD163 gene of one or more boar species cells using a CRISPR complex comprising a gRNA pair according to any one of [23] to [24] above;
b) generating an animal from said cell or a plurality of cells;
The method includes:
[29] Use of the cell line described in [8] above in the production of a PRRSv-resistant animal.
[30] Use of the cell line described in [19] above in the production of a PRRSv-resistant animal.
[31] An embryo, a piglet, or an adult comprising a plurality of cells according to any one of [7] to [10] or [19] to [22] above.
[32] A method for determining the presence or absence of an edited sequence having 90% identity to the sequence set forth in SEQ ID NO:453, comprising:
a) differentially labeled probes of the sequences shown in SEQ ID NO: 564 and SEQ ID NO: 558 or 561;
b) the primer pair set forth in SEQ ID NOs: 562 and 563; and
c) the primer pair set forth in SEQ ID NOs: 556 and 557 or SEQ ID NOs: 559 and 560
The method comprises the step of performing real-time PCR by
[33] The method according to [32] above, wherein the edited sequence has 100% identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 453.
[34] A PCR primer selected from the group consisting of SEQ ID NO:556, SEQ ID NO:557, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:560, SEQ ID NO:562, and SEQ ID NO:563.
[35] A real-time PCR probe selected from the group consisting of SEQ ID NO:558, SEQ ID NO:561, and SEQ ID NO:564.
[36] Using PCR primers set forth in a) SEQ ID NOs:556 and 557, and SEQ ID NOs:562 and 563, or b) SEQ ID NOs:559 and 560, and SEQ ID NOs:562 and 563, to determine the presence or absence of the edited genomic sequence set forth in SEQ ID NO:453.
[37] Use of the PCR probes set forth in a) SEQ ID NOs:558 and 564, or b) SEQ ID NOs:561 and 564 to determine the presence or absence of the edited genomic sequence set forth in SEQ ID NO:453.
[38] A method for producing a PRRSv-resistant pig, comprising editing a pig genome to include a genomic sequence set forth in SEQ ID NO:453.
[39] The method according to [38] above, wherein the step of editing the pig genome comprises administering a gRNA having a sequence as set forth in SEQ ID NOs: 249 and 256.
[40] The method according to [39] above, wherein the administering step comprises injecting a preformed RNP complex comprising the gRNA and a CAS protein into a zygote, embryo, or MII stage oocyte.
[41] The method according to [38] above, wherein the pig is a PIC line 2, PIC line 3, PIC line 15, PIC line 19, PIC line 27, PIC line 62, or PIC line 65 pig.
Claims (16)
(a) 配列番号２２９および２５６、配列番号２３０および２５６、配列番号２３１および２５６、配列番号２３７および２５６、配列番号２４１および２５６、配列番号２２９および２５８、配列番号２３０および２５８、配列番号２３１および２５８、配列番号２３７および２５８、配列番号２４１および２５８、配列番号２２９および２６１、配列番号２３０および２６１、配列番号２３１および２６１、配列番号２３７および２６１、配列番号２４１および２６１、配列番号２１９および２５６、配列番号２２１および２５６、配列番号２２４および２５６、配列番号２２７および２５６、配列番号２１９および２５８、配列番号２２１および２５８、配列番号２２４および２５８、配列番号２２７および２５８、配列番号２１９および２６１、配列番号２２１および２６１、配列番号２２４および２６１、配列番号２２７および２６１、配列番号２４９および２５６、配列番号２５０および２５６、配列番号２４９および２５８、配列番号２５０および２５８、配列番号２４９および２６１、ならびに配列番号２５０および２６１からなる群から選択される、第７エクソンの切出し部位のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）対；
(b) 配列番号２２９および２５６、配列番号２３０および２５６、配列番号２３１および２５６、配列番号２４１および２５６、配列番号２２９および２５８、配列番号２３１および２５８、配列番号２４１および２５８、配列番号２１９および２５６、配列番号２２１および２５６、配列番号２２４および２５６、配列番号２２７および２５６、配列番号２２７および２５８、配列番号２２１および２６１、配列番号２４９および２５６、配列番号２５０および２５６、配列番号２４９および２５８、ならびに配列番号２４９および２６１からなる群から選択される、第７エクソンの切出し部位のためのｇＲＮＡ対；または
(c) 配列番号２４９および２５６に示された配列
を使用して創出される、請求項１に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子。 The edit comprises :
(a) SEQ ID NOs: 229 and 256, SEQ ID NOs: 230 and 256, SEQ ID NOs: 231 and 256, SEQ ID NOs: 237 and 256, SEQ ID NOs: 241 and 256, SEQ ID NOs: 229 and 258, SEQ ID NOs: 230 and 258, SEQ ID NOs: 231 and 258, SEQ ID NOs: 237 and 258, SEQ ID NOs: 241 and 258, SEQ ID NOs: 229 and 261, SEQ ID NOs: 230 and 261, SEQ ID NOs: 231 and 261, SEQ ID NOs: 237 and 261, SEQ ID NOs: 241 and 261, SEQ ID NOs: 219 and 256, SEQ ID NOs: 221 and 256, SEQ ID NOs: 224 and 256, a guide RNA (gRNA) pair for the excision site of exon 7 selected from the group consisting of SEQ ID NOs:227 and 256, SEQ ID NOs:219 and 258, SEQ ID NOs:221 and 258, SEQ ID NOs:224 and 258, SEQ ID NOs:227 and 258, SEQ ID NOs:219 and 261, SEQ ID NOs:221 and 261, SEQ ID NOs:224 and 261, SEQ ID NOs:227 and 261, SEQ ID NOs:249 and 256, SEQ ID NOs:250 and 256, SEQ ID NOs:249 and 258, SEQ ID NOs:250 and 258, SEQ ID NOs:249 and 261, and SEQ ID NOs:250 and 261;
(b) a gRNA pair for the excision site of exon 7 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 229 and 256, SEQ ID NOs: 230 and 256, SEQ ID NOs: 231 and 256, SEQ ID NOs: 241 and 256, SEQ ID NOs: 229 and 258, SEQ ID NOs: 231 and 258, SEQ ID NOs: 241 and 258, SEQ ID NOs: 219 and 256, SEQ ID NOs: 221 and 256, SEQ ID NOs: 224 and 256, SEQ ID NOs: 227 and 256, SEQ ID NOs: 227 and 258, SEQ ID NOs: 221 and 261, SEQ ID NOs: 249 and 256, SEQ ID NOs: 250 and 256, SEQ ID NOs: 249 and 258, and SEQ ID NOs: 249 and 261; or
(c) the sequences set forth in SEQ ID NOs: 249 and 256
2. The edited CD163 gene of claim 1, created using the method of claim 1 .
場合により、前記修復されたゲノム配列が配列番号４５３に示され、前記編集が配列番号２４９および２５６に示された配列を使用して創出される、
請求項１に記載の編集ＣＤ１６３遺伝子。 The repaired genomic sequence is set forth in SEQ ID NO: 453 ;
Optionally, the repaired genome sequence is set forth in SEQ ID NO: 453, and the edit is created using the sequences set forth in SEQ ID NOs: 249 and 256.
The edited CD163 gene of claim 1.
(a) 配列番号３５１および３６５、配列番号３５１および３８７、配列番号３４８および３９０、配列番号３４８および３８８、配列番号３４８および３９５、配列番号３５２および３６５、配列番号３５２および３８７、配列番号３５２および３９９、配列番号３５３および３６５、配列番号３５３および３８７、配列番号３５３および３９９、配列番号３５４および３９０、配列番号３５４および３８８、配列番号３５４および３９５、配列番号３５８および３６１、配列番号３５８および３６２、配列番号３５８および３６８、配列番号３５８および３８４、配列番号３５８および３９４、配列番号３５８および３９９、配列番号３５９および３９０、配列番号３５９および３８８、配列番号３５９および３９５、配列番号３６０および３６８、配列番号３６０および３８４、配列番号３６０および３８９、配列番号３６０および３９４、配列番号３６０および３９７、配列番号３６１および３６５、配列番号３６１および３８７、配列番号３６２および３９０、配列番号３６２および３８８、配列番号３６２および３９５、配列番号３６４および３６５、配列番号３６４および３８７、配列番号３６４および３９９、配列番号３６５および３６８、配列番号３６５および３８４、配列番号３６５および３８９、配列番号３６５および３９４、配列番号３６５および３９７、配列番号３６６および３６８、配列番号３６６および３８４、配列番号３６６および３８９、配列番号３６６および３９４、ならびに配列番号３６６および３９７からなる群から選択されるｇＲＮＡ；
(b) 配列番号３５１および３６５、配列番号３４８および３９０、配列番号３４８および３８８、配列番号３５４および３９０、配列番号３５８および３９４、配列番号３６２および３９０、ならびに配列番号３６６および３９４からなる群から選択されるｇＲＮＡ；または
(c) 配列番号３６２および３９０に示された配列
を使用して創出される、請求項４に記載のＣＤ１６３遺伝子。 The edit comprises:
(a) SEQ ID NOs: 351 and 365, SEQ ID NOs: 351 and 387, SEQ ID NOs: 348 and 390, SEQ ID NOs: 348 and 388, SEQ ID NOs: 348 and 395, SEQ ID NOs: 352 and 365, SEQ ID NOs: 352 and 387, SEQ ID NOs: 352 and 399, SEQ ID NOs: 353 and 365, SEQ ID NOs: 353 and 387, SEQ ID NOs: 353 and 399, SEQ ID NOs: 354 and 390, SEQ ID NOs: 354 and 388, SEQ ID NOs: 354 and 395, SEQ ID NOs: 358 and 361, SEQ ID NOs: 358 and 362, SEQ ID NOs: 358 and 368, SEQ ID NOs: 358 and 384, SEQ ID NOs: 358 and 394, SEQ ID NOs: 358 and 399, SEQ ID NOs: 359 and 390, SEQ ID NOs: 359 and 388, SEQ ID NOs: 359 and 395, SEQ ID NOs: 360 and and 368, SEQ ID NOs:360 and 384, SEQ ID NOs:360 and 389, SEQ ID NOs:360 and 394, SEQ ID NOs:360 and 397, SEQ ID NOs:361 and 365, SEQ ID NOs:361 and 387, SEQ ID NOs:362 and 390, SEQ ID NOs:362 and 388, SEQ ID NOs:362 and 395, SEQ ID NOs:364 and 365, SEQ ID NOs:364 and 387, SEQ ID NOs:364 and 399, SEQ ID NOs:365 and 368, SEQ ID NOs:365 and 384, SEQ ID NOs:365 and 389, SEQ ID NOs:365 and 394, SEQ ID NOs:365 and 397, SEQ ID NOs:366 and 368, SEQ ID NOs:366 and 384, SEQ ID NOs:366 and 389, SEQ ID NOs:366 and 394, and SEQ ID NOs:366 and 397;
(b) a gRNA selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 351 and 365, 348 and 390, 348 and 388, 354 and 390, 358 and 394, 362 and 390, and 366 and 394; or
(c) SEQ ID NOs: 362 and 390
The CD163 gene of claim 4 , created using the method.
(a) 配列番号４５９～５０４からなる群から選択される核酸配列；または
(b) 配列番号４８９に示された核酸配列
を含む、請求項４に記載のＣＤ１６３遺伝子。 The repaired gene is
(a) a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 459-504 ; or
(b) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 489
The CD163 gene of claim 4 .
場合により、前記修復された遺伝子が配列番号４８９に示された核酸配列を有し、前記編集が、配列番号３６２および３９０に示された配列を使用して創出される、
請求項４に記載のＣＤ１６３遺伝子。 The predicted amino acid sequence of CD163 exon 7 is shown in SEQ ID NO:513 ;
Optionally, the repaired gene has a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 489, and the edit is created using the sequences as set forth in SEQ ID NOs: 362 and 390.
The CD163 gene described in claim 4 .
場合により、ＰＩＣ系統２、ＰＩＣ系統３、ＰＩＣ系統１５、ＰＩＣ系統１９、ＰＩＣ系統２７、ＰＩＣ系統６２、またはＰＩＣ系統６５に由来する、前記ブタ細胞。 A porcine cell comprising the CD163 gene according to any one of claims 1 to 7 ,
Optionally, the porcine cell is derived from PIC line 2, PIC line 3, PIC line 15, PIC line 19, PIC line 27, PIC line 62, or PIC line 65 .
場合により、線維芽細胞株である、前記細胞株。 A cell line comprising a plurality of cells according to claim 8 ,
Optionally, the cell line is a fibroblast cell line .
場合により、以下：
配列番号２２９および２５６、配列番号２３０および２５６、配列番号２３１および２５６、配列番号２４１および２５６、配列番号２２９および２５８、配列番号２３１および２５８、配列番号２４１および２５８、配列番号２１９および２５６、配列番号２２１および２５６、配列番号２２４および２５６、配列番号２２７および２５６、配列番号２２７および２５８、配列番号２２１および２６１、配列番号２４９および２５６、配列番号２５０および２５６、配列番号２４９および２５８、配列番号２４９および２６１、配列番号３５１および３６５、配列番号３４８および３９０、配列番号３４８および３８８、配列番号３５４および３９０、配列番号３５８および３９４、配列番号３６２および３９０、ならびに配列番号３６６および３９４からなる群から選択される、前記ｇＲＮＡ対。
A gRNA pair for editing the porcine CD163 gene, comprising SEQ ID NOs:229 and 256, SEQ ID NOs:230 and 256, SEQ ID NOs:231 and 256, SEQ ID NOs:237 and 256, SEQ ID NOs:241 and 256, SEQ ID NOs:229 and 258, SEQ ID NOs:230 and 258, SEQ ID NOs:231 and 258, SEQ ID NOs:237 and 258, SEQ ID NOs:241 and 258, SEQ ID NOs:229 and 261, SEQ ID NOs:230 and 261, SEQ ID NOs:231 and 261, SEQ ID NOs:237 and 261, SEQ ID NOs:241 and 261, SEQ ID NOs:219 and 256, SEQ ID NOs:221 and 256, SEQ ID NOs:224 and 256, SEQ ID NOs:227 and and 256, SEQ ID NOs:219 and 258, SEQ ID NOs:221 and 258, SEQ ID NOs:224 and 258, SEQ ID NOs:227 and 258, SEQ ID NOs:219 and 261, SEQ ID NOs:221 and 261, SEQ ID NOs:224 and 261, SEQ ID NOs:227 and 261, SEQ ID NOs:249 and 256, SEQ ID NOs:250 and 256, SEQ ID NOs:249 and 258, SEQ ID NOs:250 and 258, SEQ ID NOs:249 and 261, SEQ ID NOs:250 and 261, SEQ ID NOs:351 and 365, SEQ ID NOs:351 and 387, SEQ ID NOs:348 and 390, SEQ ID NOs:348 and 388, SEQ ID NOs:348 and 395, SEQ ID NOs:352 and 365, SEQ ID NOs:3 52 and 387, SEQ ID NO:352 and 399, SEQ ID NO:353 and 365, SEQ ID NO:353 and 387, SEQ ID NO:353 and 399, SEQ ID NO:354 and 390, SEQ ID NO:354 and 388, SEQ ID NO:354 and 395, SEQ ID NO:358 and 361, SEQ ID NO:358 and 362, SEQ ID NO:358 and 368, SEQ ID NO:358 and 384, SEQ ID NO:358 and 394, SEQ ID NO:358 and 399, SEQ ID NO:359 and 390, SEQ ID NO:359 and 388, SEQ ID NO:359 and 395, SEQ ID NO:360 and 368, SEQ ID NO:360 and 384, SEQ ID NO:360 and 389, SEQ ID NO:360 and 394, A gRNA pair selected from the group consisting of sequence numbers 360 and 397, SEQ ID NOs:361 and 365, SEQ ID NOs:361 and 387, SEQ ID NOs:362 and 390, SEQ ID NOs:362 and 388, SEQ ID NOs:362 and 395, SEQ ID NOs:364 and 365, SEQ ID NOs:364 and 387, SEQ ID NOs:364 and 399, SEQ ID NOs:365 and 368, SEQ ID NOs:365 and 384, SEQ ID NOs:365 and 389, SEQ ID NOs:365 and 394, SEQ ID NOs:365 and 397, SEQ ID NOs:366 and 368, SEQ ID NOs:366 and 384, SEQ ID NOs:366 and 389, SEQ ID NOs:366 and 394, and SEQ ID NOs:366 and 397 ;
Optionally, the following:
The gRNA pair is selected from the group consisting of SEQ ID NOs:229 and 256, SEQ ID NOs:230 and 256, SEQ ID NOs:231 and 256, SEQ ID NOs:241 and 256, SEQ ID NOs:229 and 258, SEQ ID NOs:231 and 258, SEQ ID NOs:241 and 258, SEQ ID NOs:219 and 256, SEQ ID NOs:221 and 256, SEQ ID NOs:224 and 256, SEQ ID NOs:227 and 256, SEQ ID NOs:227 and 258, SEQ ID NOs:221 and 261, SEQ ID NOs:249 and 256, SEQ ID NOs:250 and 256, SEQ ID NOs:249 and 258, SEQ ID NOs:249 and 261, SEQ ID NOs:351 and 365, SEQ ID NOs:348 and 390, SEQ ID NOs:348 and 388, SEQ ID NOs:354 and 390, SEQ ID NOs:358 and 394, SEQ ID NOs:362 and 390, and SEQ ID NOs:366 and 394 .
ａ）配列番号５６４および配列番号５５８または５６１に示された配列の、示差的に標識化されたプローブ；
ｂ）配列番号５６２および５６３に示されたプライマー対；ならびに
ｃ）配列番号５５６および５５７または配列番号５５９および５６０に示されたプライマー対
により、リアルタイムＰＣＲを実施するステップを含み、場合により、前記編集配列が配列番号４５３に示された配列と１００％の同一性を有している、方法。 A method for determining the presence or absence of an edited sequence having 90% identity to the sequence set forth in SEQ ID NO: 453, comprising:
a) differentially labeled probes of the sequences shown in SEQ ID NO: 564 and SEQ ID NO: 558 or 561;
b) the primer pair set forth in SEQ ID NOs: 562 and 563; and c) performing real-time PCR with the primer pair set forth in SEQ ID NOs: 556 and 557 or SEQ ID NOs: 559 and 560 , wherein optionally the edited sequence has 100% identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 453 .
配列番号５５８、配列番号５６１、および配列番号５６４からなる群から選択されるリアルタイムＰＣＲプローブ。 A PCR primer selected from the group consisting of SEQ ID NO:556, SEQ ID NO:557, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:560, SEQ ID NO:562, and SEQ ID NO:563; or a real-time PCR probe selected from the group consisting of SEQ ID NO:558, SEQ ID NO:561, and SEQ ID NO:564.
(i) ａ）配列番号５５６および５５７、ならびに配列番号５６２および５６３、またはｂ）配列番号５５９および５６０、ならびに配列番号５６２および５６３に示されたＰＣＲプライマー、または
(ii) ａ）配列番号５５８および５６４、またはｂ）配列番号５６１および５６４に示されたＰＣＲプローブ
の使用。 To determine the presence or absence of the edited genomic sequence set forth in SEQ ID NO: 453,
(i) a) the PCR primers set forth in SEQ ID NOs: 556 and 557, and SEQ ID NOs: 562 and 563; or b) the PCR primers set forth in SEQ ID NOs: 559 and 560, and SEQ ID NOs: 562 and 563 ; or
(ii) a) the PCR probes set forth in SEQ ID NOs: 558 and 564, or b) SEQ ID NOs: 561 and 564.
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