JPWO2021131261A5

JPWO2021131261A5 -

Info

Publication number: JPWO2021131261A5
Application number: JP2021566846A
Authority: JP
Filing date: 2020-10-08
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2040-10-08

Description

国際公開ＷＯ２０１４／０５１１５４に示されるように、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球画分から血管内皮前駆細胞又は抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群を増幅させる方法（以下、本明細書において、「ＱＱ－ＭＮＣ法」）と呼称する場合がある）を記載している。当該方法は、（１）幹細胞因子（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ），（２）インターロイキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６；ＩＬ－６），（３）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＭＳ－ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３ｌｉｇａｎｄ；ＦＬ），（４）トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）及び（５）血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）の５つの因子を含む無血清培地で、単核球を培養することにより、ＥＰＣを含む細胞群を生体外で増幅する、というものである。

［特許文献１］国際公開ＷＯ２００６／０９０８８２
［特許文献２］国際公開ＷＯ２００６／０９０８８６
［特許文献３］国際公開ＷＯ２００６／０９３１７２
［特許文献４］国際公開ＷＯ２０１４／０５１１５４

本発明はさらに、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物を提供することを目的とする。本発明の組成物は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる細胞群を含む。

非限定的に、単核球の培養に用いる培養培地は、従って本発明の培養方法で用いられる培養培地は例えば、ｉ）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子の組み合わせ、あるいは、ｉｉ）幹細胞因子、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、及び血管内皮細胞増殖因子の組み合わせを含む。培地は、より好ましくは、約８０～１２０ｎｇ／ｍｌのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、約１５～２５ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン及び約４０～６０ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子の組み合わせを含む。

抗炎症性マクロファージＭ２を含むＣＤ２０６陽性が増加する；
血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含むＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞が増加する；
Ｔ細胞、特にＨｅｌｐｅｒＴ細胞やＡｎｇｉｏｇｅｎｉｃＴ細胞などのＣＤ３陽性細胞が増加する。

上記治療用組成物は、血管新生及び／又は創傷治癒を促進する。よって、血管新生及び／又は創傷治癒により治療できる疾患に適用することができる。「血管新生及び／又は創傷治癒により治療できる疾患」としては、例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症等の下肢虚血、バージャー（Ｂｕｅｒｇｅｒ）病）、血管損傷が挙げられる。また、皮膚潰瘍等の創傷を治癒するため、あるいは人工血管の作製に使用できる。治療用組成物の適用の効果は、自体公知の方法により確認できる。例えば血管新生により治療できる疾患が下肢虚血性疾患である場合には、移植後の治療効果を例えば下肢血流量及び壊死改善率を調べることによって評価することができる。血流量の増加の測定はレーザドップラーイメージング解析の値を測定することによって行うことができる。また壊死改善率はリムサルベージスコアとして目視により測定することができる。

比較例として、ＲＥ－０１細胞と同様に単核球を単離したのち、ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）ＩＩＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＥｘｐａｎｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（シグマ－アルドリッチ社製、ＣａｔＮｏ．Ｓ０１９２）を用いた。血清は添加せず、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンに５０ｎｇ／ｍＬＶＥＧＦ_１６５、２０ｎｇ／ｍＬＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬＦｌｔ－３リガンド、１００ｎｇ／ｍＬＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬＩＬ－６の５種類の各因子を無菌的に添加することにより調製した。得られた細胞を増殖培地で１ｘ１０^６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種し、通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ_２）で７日間培養した。７日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（～１０００ｒｐｍ）で７－１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ、２．５％ヒトアルブミン血清に懸濁して８ｘ１０^５細胞／ｍＬの濃度になるように調製した。以下、得られた細胞群を「ＭＮＣ－ＱＱ」と呼称する場合がある。

（４）血管形成能
本実施例では、健常人の血液から採取した単核球について、実施例１と同様の方法で血清培地を用いて培養して得られた細胞群（ＲＥ－０１）を用いて、その血管形成能を検討した。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ－ＱＱ）を用いた。管腔形成能を持つヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ社、スイス、バーゼルより入手）を、８～１０継代で使用し、各群の細胞とＨＵＶＥＣと共培養した。９６ウェルのプレートに基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，米国、ＮＹ））５０μｌ／ウェルを分注し、３７℃、３０分コーティングした。一方、各細胞群を、ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬで標識するために、ＩＭＤＭ５００μｌ＋ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬ５μｌに懸濁し、３７℃、１時間インキュベートした。