JPWO2021108708A5 - - Google Patents
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Description
本明細書で引用したすべての特許、特許出願、ウェブサイト、その他の刊行物および書類、受託番号、および同様のものは、それぞれの別個の項目が参照により組み込まれると具体的かつ別個に指示されているかのように、同程度にあらゆる目的のために全体が参照により組み込まれる。異なるバージョンの配列が異なる時の受託番号に関連している場合には、本出願の有効な出願日における受託番号に関連するバージョンが意味される。有効な出願日は、実際の出願日、または適用される場合には受託番号に言及する優先出願の提出日のいずれか早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイト、または同様のものが異なる時に公開された場合には、他に指示されなければ、本出願の有効な出願日に最も近く公開されたバージョンが意味される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象における腫瘍の存在または非存在を検出する方法であって、
（ｉ）前記対象からポリヌクレオチド試料を得るステップ；
（ｉｉ）担体核酸分子のセットを前記ポリヌクレオチド試料に添加して、第１の試料を生成するステップであって、前記担体核酸分子のセットが、
（ａ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット；および／または
（ｂ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含み、前記担体核酸分子の少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、ステップ；
（ｉｉｉ）前記第１の試料を、メチル化ポリヌクレオチドに選択的に結合する捕捉剤を使用して、少なくとも２つの分配されたセットに分配し、それにより、分配された試料を生成するステップ；
（ｉｖ）前記分配された試料の少なくとも一部を処理して、処理された試料を生成するステップであって、前記処理は、以下：（ａ）タグ付けするステップ、（ｂ）増幅するステップ、および（ｃ）目的の特異的領域について分子を富化するステップのうち少なくとも１つを含む、ステップ；
（ｖ）前記処理された試料の少なくとも一部をシーケンシングして、シーケンシングリードのセットを生成するステップ；ならびに
（ｖｉ）前記シーケンシングリードのセットの少なくとも一部を解析して、腫瘍の存在または非存在を検出するステップを含む、方法。
（項目２）
前記担体核酸分子の長さが２５ｂｐと３２５ｂｐとの間である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目３または４に記載の方法。
（項目６）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置とは異なる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記ＣｐＧジヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のＣｐＧジヌクレオチドの数とは異なる、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドが、（ｉ）５－メチルシトシン、（ｉｉ）６－メチルアデニン、（ｉｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン、（ｉｖ）メチルウラシル、および（ｖ）任意の他のメチル化ヌクレオチドからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
メチル化ヌクレオチドの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドが、１つまたは複数のメチル化シトシンを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置とは異なる、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１７）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記メチル化ヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のメチル化ヌクレオチドの数とは異なる、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１８）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目１０に記載の方法。
（項目２０）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの、前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットに対する量が、約０：１、０．１：９９．９、０．５：９９．５、０．７５：９９．２５、１：９９、１：９５、１：９０、１：８０、１：７５、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．１５、１：１、１．１５：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１、９９：１、９９．２５：０．７５、９９．５：０．５、９９．９：０．１または１：０の比である、項目１０に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリヌクレオチド試料の、前記担体核酸分子のセットに対する量が、約１：０．１；１：０．２、１：０．３、１：４、１：０．５、１：６、１：７、１：８、１：０．９、１：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０の比、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００；１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：５０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１０ ６ 、１：１０ ７ 、１：１０ ８ または１：１０ ９ である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１μｇである、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ポリヌクレオチド試料が最大２００ｎｇである、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１５０ｎｇである、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１００ｎｇである、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記担体核酸分子のセットが、前記ポリヌクレオチド試料と前記担体核酸分子のセットとの総量が約１７５ｎｇ、２００ｎｇ、２２５ｎｇ、２５０ｎｇ、２７５ｎｇ、３００ｎｇ、３５０ｎｇ、４００ｎｇ、４５０ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、７５０ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、１．１μｇ、１．２５μｇまたは１．５μｇになるように十分な量で添加される、項目２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記担体核酸分子の配列が、（ｉ）ウイルスゲノム由来の配列、（ｉｉ）細菌ゲノム由来の配列、（ｉｉｉ）ラムダゲノム由来の配列、および（ｉｖ）非ヒトゲノム由来の配列からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記担体核酸分子が合成ＤＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、Ｃ３（プロピル基）スペーサーを含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ジデオキシヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ヒドロキシル基が求核試薬として作用することを阻止する任意の化学的改変を含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記担体核酸分子が、ウラシルヌクレオシドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記増幅するステップの前に、ウラシルデグリコシラーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼを添加するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記担体核酸分子の５’末端が、以下の改変：（ｉ）反転（５’－５’）、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記担体核酸分子の３’末端が、以下の改変：（ｉ）酵素的に、または合成の間に付加され得る任意のジデオキシ塩基、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、頬内スワブまたは胸腔穿刺から得られる、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織から得られる、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記組織から得られた前記ポリヌクレオチド試料が、酵素的手段または機械的手段によって断片化される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ポリヌクレオチド試料が、血液から得られる、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記血液由来の前記ポリヌクレオチド試料が、無細胞ＤＮＡ試料である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
（ｉ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット；および／または
（ｉｉ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含む担体核酸分子のセットであって、
前記担体核酸分子の少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、担体核酸分子のセット。
（項目４２）
前記担体核酸分子の長さが２５ｂｐと３２５ｂｐとの間である、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４３）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４４）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４５）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目４３または４４に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４６）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置とは異なる、項目４５に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４７）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記ＣｐＧジヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のＣｐＧジヌクレオチドの数とは異なる、項目４５に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４８）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目４５に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４９）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５０）
前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドが、（ｉ）５－メチルシトシン、（ｉｉ）６－メチルアデニン、（ｉｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン、（ｉｖ）メチルウラシル、および（ｖ）任意の他のメチル化ヌクレオチドからなる群より選択される、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５１）
メチル化ヌクレオチドの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０である、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５２）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５３）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５４）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目５２または５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５５）
前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドが、１つまたは複数のメチル化シトシンを含む、項目５４に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５６）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置とは異なる、項目５２または５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５７）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記メチル化ヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のメチル化ヌクレオチドの数とは異なる、項目５２または５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５８）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５９）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６０）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの、前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットに対する量が、約０：１、０．１：９９．９、０．５：９９．５、０．７５：９９．２５、１：９９、１：９５、１：９０、１：８０、１：７５、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．１５、１：１、１．１５：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１、９９：１、９９．２５：０．７５、９９．５：０．５、９９．９：０．１または１：０の比である、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６１）
前記担体核酸分子の配列が、（ｉ）ウイルスゲノム由来の配列、（ｉｉ）細菌ゲノム由来の配列、（ｉｉｉ）ラムダゲノム由来の配列、および（ｉｖ）非ヒトゲノム由来の配列からなる群より選択される、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６２）
前記担体核酸分子が合成ＤＮＡである、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６３）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、Ｃ３（プロピル基）スペーサーを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６４）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ジデオキシヌクレオチドを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６５）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ヒドロキシル基が求核試薬として作用することを阻止する任意の化学的改変を含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６６）
前記担体核酸分子が、ウラシルヌクレオシドを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６７）
増幅するステップの前に、ウラシルデグリコシラーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼを添加するステップをさらに含む、項目６６に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６８）
前記担体核酸分子の５’末端が、以下の改変：（ｉ）反転（５’－５’）－ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６９）
前記担体核酸分子の３’末端が、以下の改変：（ｉ）酵素的に、または合成の間に付加され得る任意のジデオキシ塩基、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目７０）
（ｉ）
（ａ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット；および／または
（ｂ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含む担体核酸分子のセットであって、前記担体核酸分子のセットの少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、担体核酸分子のセット；
（ｉｉ）対象から得られたポリヌクレオチド試料
を含む、核酸の集団。
（項目７１）
前記担体核酸分子の長さが２５ｂｐと３２５ｂｐとの間である、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７２）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７３）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７４）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目７２または７３に記載の核酸の集団。
（項目７５）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置とは異なる、項目７２または７３に記載の核酸の集団。
（項目７６）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記ＣｐＧジヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のＣｐＧジヌクレオチドの数とは異なる、項目７２または７３に記載の核酸の集団。
（項目７７）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目７４に記載の核酸の集団。
（項目７８）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７９）
前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドが、（ｉ）５－メチルシトシン、（ｉｉ）６－メチルアデニン、（ｉｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン、（ｉｖ）メチルウラシル、および（ｖ）任意の他のメチル化ヌクレオチドからなる群より選択される、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目８０）
メチル化ヌクレオチドの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０である、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８１）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８２）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８３）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目８１または８２に記載の核酸の集団。
（項目８４）
前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドが、１つまたは複数のメチル化シトシンを含む、項目８３に記載の核酸の集団。
（項目８５）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置とは異なる、項目８１または８２に記載の核酸の集団。
（項目８６）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記メチル化ヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のメチル化ヌクレオチドの数とは異なる、項目８１または８２に記載の核酸の集団。
（項目８７）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目８２に記載の核酸の集団。
（項目８８）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８９）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの、前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットに対する量が、約０：１、０．１：９９．９、０．５：９９．５、０．７５：９９．２５、１：９９、１：９５、１：９０、１：８０、１：７５、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．１５、１：１、１．１５：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１、９９：１、９９．２５：０．７５、９９．５：０．５、９９．９：０．１または１：０の比である、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目９０）
前記ポリヌクレオチド試料の、前記担体核酸分子のセットに対する量が、約１：０．１；１：０．２、１：０．３、１：４、１：０．５、１：６、１：７、１：８、１：０．９、１：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０の比、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００；１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：５０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１０ ６ 、１：１０ ７ 、１：１０ ８ または１：１０ ９ である、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９１）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１μｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９２）
前記ポリヌクレオチド試料が最大２００ｎｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９３）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１５０ｎｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９４）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１００ｎｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９５）
前記担体核酸分子のセットが、前記ポリヌクレオチド試料と前記担体核酸分子のセットとの総量が約１７５ｎｇ、２００ｎｇ、２２５ｎｇ、２５０ｎｇ、２７５ｎｇ、３００ｎｇ、３５０ｎｇ、４００ｎｇ、４５０ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、７５０ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、１．１μｇ、１．２５μｇまたは１．５μｇになるように十分な量で添加される、項目９１から９４のいずれか一項に記載の核酸の集団。
（項目９６）
前記担体核酸分子の配列が、（ｉ）ウイルスゲノム由来の配列、（ｉｉ）細菌ゲノム由来の配列、（ｉｉｉ）ラムダゲノム由来の配列、および（ｉｖ）非ヒトゲノム由来の配列からなる群より選択される、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９７）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ジデオキシヌクレオチドを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９８）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ヒドロキシル基が求核試薬として作用することを阻止する任意の化学的改変を含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９９）
前記担体核酸分子が、ウラシルヌクレオシドを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１００）
増幅するステップの前に、ウラシルデグリコシラーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼを添加するステップをさらに含む、項目９９に記載の核酸の集団。
（項目１０１）
前記担体核酸分子の５’末端が、以下の改変：（ｉ）反転（５’－５’）－ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０２）
前記担体核酸分子の３’末端が、以下の改変：（ｉ）酵素的に、または合成の間に付加され得る任意のジデオキシ塩基、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０３）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、頬内スワブまたは胸腔穿刺から得られる、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０４）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織から得られる、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０５）
前記組織から得られた前記ポリヌクレオチド試料が、酵素的手段または機械的手段によって断片化される、項目１０４に記載の核酸の集団。
（項目１０６）
前記ポリヌクレオチド試料が、血液から得られる、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０７）
前記血液から得られた前記ポリヌクレオチド試料が、無細胞ＤＮＡ試料である、項目１０６に記載の核酸の集団。
（項目１０８）
前記担体核酸分子が二本鎖分子である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記第１の試料が、変性させるステップに供されない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記第１のサブセットおよび／または前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧヌクレオチドまたはメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記１つまたは複数のＣｐＧヌクレオチドまたはメチル化ヌクレオチドに隣接する１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドの配列であり得る、上記項目のいずれか一項に記載の方法または担体核酸分子のセット。
（項目１１１）
前記シーケンシングするステップが、少なくとも２つの分配されたセット由来の前記処理された試料のうちの少なくとも一部をシーケンシングするステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
（ｉ）
（ａ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット、および／または
（ｂ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含む担体核酸分子のセットであって、前記担体核酸分子のセットの少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、担体核酸分子のセット；および
（ｉｉ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的に結合する捕捉剤
を含む、キット。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象における腫瘍の存在または非存在を検出する方法であって、
（ｉ）前記対象からポリヌクレオチド試料を得るステップ；
（ｉｉ）担体核酸分子のセットを前記ポリヌクレオチド試料に添加して、第１の試料を生成するステップであって、前記担体核酸分子のセットが、
（ａ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット；および／または
（ｂ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含み、前記担体核酸分子の少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、ステップ；
（ｉｉｉ）前記第１の試料を、メチル化ポリヌクレオチドに選択的に結合する捕捉剤を使用して、少なくとも２つの分配されたセットに分配し、それにより、分配された試料を生成するステップ；
（ｉｖ）前記分配された試料の少なくとも一部を処理して、処理された試料を生成するステップであって、前記処理は、以下：（ａ）タグ付けするステップ、（ｂ）増幅するステップ、および（ｃ）目的の特異的領域について分子を富化するステップのうち少なくとも１つを含む、ステップ；
（ｖ）前記処理された試料の少なくとも一部をシーケンシングして、シーケンシングリードのセットを生成するステップ；ならびに
（ｖｉ）前記シーケンシングリードのセットの少なくとも一部を解析して、腫瘍の存在または非存在を検出するステップを含む、方法。
（項目２）
前記担体核酸分子の長さが２５ｂｐと３２５ｂｐとの間である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目３または４に記載の方法。
（項目６）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置とは異なる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記ＣｐＧジヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のＣｐＧジヌクレオチドの数とは異なる、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドが、（ｉ）５－メチルシトシン、（ｉｉ）６－メチルアデニン、（ｉｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン、（ｉｖ）メチルウラシル、および（ｖ）任意の他のメチル化ヌクレオチドからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
メチル化ヌクレオチドの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドが、１つまたは複数のメチル化シトシンを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置とは異なる、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１７）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記メチル化ヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のメチル化ヌクレオチドの数とは異なる、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１８）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目１０に記載の方法。
（項目２０）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの、前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットに対する量が、約０：１、０．１：９９．９、０．５：９９．５、０．７５：９９．２５、１：９９、１：９５、１：９０、１：８０、１：７５、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．１５、１：１、１．１５：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１、９９：１、９９．２５：０．７５、９９．５：０．５、９９．９：０．１または１：０の比である、項目１０に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリヌクレオチド試料の、前記担体核酸分子のセットに対する量が、約１：０．１；１：０．２、１：０．３、１：４、１：０．５、１：６、１：７、１：８、１：０．９、１：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０の比、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００；１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：５０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１０ ６ 、１：１０ ７ 、１：１０ ８ または１：１０ ９ である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１μｇである、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ポリヌクレオチド試料が最大２００ｎｇである、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１５０ｎｇである、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１００ｎｇである、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記担体核酸分子のセットが、前記ポリヌクレオチド試料と前記担体核酸分子のセットとの総量が約１７５ｎｇ、２００ｎｇ、２２５ｎｇ、２５０ｎｇ、２７５ｎｇ、３００ｎｇ、３５０ｎｇ、４００ｎｇ、４５０ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、７５０ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、１．１μｇ、１．２５μｇまたは１．５μｇになるように十分な量で添加される、項目２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記担体核酸分子の配列が、（ｉ）ウイルスゲノム由来の配列、（ｉｉ）細菌ゲノム由来の配列、（ｉｉｉ）ラムダゲノム由来の配列、および（ｉｖ）非ヒトゲノム由来の配列からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記担体核酸分子が合成ＤＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、Ｃ３（プロピル基）スペーサーを含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ジデオキシヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ヒドロキシル基が求核試薬として作用することを阻止する任意の化学的改変を含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記担体核酸分子が、ウラシルヌクレオシドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記増幅するステップの前に、ウラシルデグリコシラーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼを添加するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記担体核酸分子の５’末端が、以下の改変：（ｉ）反転（５’－５’）、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記担体核酸分子の３’末端が、以下の改変：（ｉ）酵素的に、または合成の間に付加され得る任意のジデオキシ塩基、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、頬内スワブまたは胸腔穿刺から得られる、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織から得られる、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記組織から得られた前記ポリヌクレオチド試料が、酵素的手段または機械的手段によって断片化される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ポリヌクレオチド試料が、血液から得られる、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記血液由来の前記ポリヌクレオチド試料が、無細胞ＤＮＡ試料である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
（ｉ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット；および／または
（ｉｉ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含む担体核酸分子のセットであって、
前記担体核酸分子の少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、担体核酸分子のセット。
（項目４２）
前記担体核酸分子の長さが２５ｂｐと３２５ｂｐとの間である、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４３）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４４）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４５）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目４３または４４に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４６）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置とは異なる、項目４５に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４７）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記ＣｐＧジヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のＣｐＧジヌクレオチドの数とは異なる、項目４５に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４８）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目４５に記載の担体核酸分子のセット。
（項目４９）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５０）
前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドが、（ｉ）５－メチルシトシン、（ｉｉ）６－メチルアデニン、（ｉｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン、（ｉｖ）メチルウラシル、および（ｖ）任意の他のメチル化ヌクレオチドからなる群より選択される、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５１）
メチル化ヌクレオチドの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０である、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５２）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５３）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５４）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目５２または５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５５）
前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドが、１つまたは複数のメチル化シトシンを含む、項目５４に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５６）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置とは異なる、項目５２または５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５７）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記メチル化ヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のメチル化ヌクレオチドの数とは異なる、項目５２または５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５８）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目５３に記載の担体核酸分子のセット。
（項目５９）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６０）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの、前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットに対する量が、約０：１、０．１：９９．９、０．５：９９．５、０．７５：９９．２５、１：９９、１：９５、１：９０、１：８０、１：７５、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．１５、１：１、１．１５：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１、９９：１、９９．２５：０．７５、９９．５：０．５、９９．９：０．１または１：０の比である、項目５０に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６１）
前記担体核酸分子の配列が、（ｉ）ウイルスゲノム由来の配列、（ｉｉ）細菌ゲノム由来の配列、（ｉｉｉ）ラムダゲノム由来の配列、および（ｉｖ）非ヒトゲノム由来の配列からなる群より選択される、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６２）
前記担体核酸分子が合成ＤＮＡである、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６３）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、Ｃ３（プロピル基）スペーサーを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６４）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ジデオキシヌクレオチドを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６５）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ヒドロキシル基が求核試薬として作用することを阻止する任意の化学的改変を含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６６）
前記担体核酸分子が、ウラシルヌクレオシドを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６７）
増幅するステップの前に、ウラシルデグリコシラーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼを添加するステップをさらに含む、項目６６に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６８）
前記担体核酸分子の５’末端が、以下の改変：（ｉ）反転（５’－５’）－ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目６９）
前記担体核酸分子の３’末端が、以下の改変：（ｉ）酵素的に、または合成の間に付加され得る任意のジデオキシ塩基、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目４１に記載の担体核酸分子のセット。
（項目７０）
（ｉ）
（ａ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット；および／または
（ｂ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含む担体核酸分子のセットであって、前記担体核酸分子のセットの少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、担体核酸分子のセット；
（ｉｉ）対象から得られたポリヌクレオチド試料
を含む、核酸の集団。
（項目７１）
前記担体核酸分子の長さが２５ｂｐと３２５ｂｐとの間である、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７２）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７３）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７４）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目７２または７３に記載の核酸の集団。
（項目７５）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置とは異なる、項目７２または７３に記載の核酸の集団。
（項目７６）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記ＣｐＧジヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のＣｐＧジヌクレオチドの数とは異なる、項目７２または７３に記載の核酸の集団。
（項目７７）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目７４に記載の核酸の集団。
（項目７８）
前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目７９）
前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドが、（ｉ）５－メチルシトシン、（ｉｉ）６－メチルアデニン、（ｉｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン、（ｉｖ）メチルウラシル、および（ｖ）任意の他のメチル化ヌクレオチドからなる群より選択される、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目８０）
メチル化ヌクレオチドの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０である、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８１）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８２）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８３）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、項目８１または８２に記載の核酸の集団。
（項目８４）
前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドが、１つまたは複数のメチル化シトシンを含む、項目８３に記載の核酸の集団。
（項目８５）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置とは異なる、項目８１または８２に記載の核酸の集団。
（項目８６）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記メチル化ヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のメチル化ヌクレオチドの数とは異なる、項目８１または８２に記載の核酸の集団。
（項目８７）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、項目８２に記載の核酸の集団。
（項目８８）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目８９）
前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの、前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットに対する量が、約０：１、０．１：９９．９、０．５：９９．５、０．７５：９９．２５、１：９９、１：９５、１：９０、１：８０、１：７５、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．１５、１：１、１．１５：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１、９９：１、９９．２５：０．７５、９９．５：０．５、９９．９：０．１または１：０の比である、項目７９に記載の核酸の集団。
（項目９０）
前記ポリヌクレオチド試料の、前記担体核酸分子のセットに対する量が、約１：０．１；１：０．２、１：０．３、１：４、１：０．５、１：６、１：７、１：８、１：０．９、１：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０の比、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００；１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：５０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１０ ６ 、１：１０ ７ 、１：１０ ８ または１：１０ ９ である、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９１）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１μｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９２）
前記ポリヌクレオチド試料が最大２００ｎｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９３）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１５０ｎｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９４）
前記ポリヌクレオチド試料が最大１００ｎｇである、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９５）
前記担体核酸分子のセットが、前記ポリヌクレオチド試料と前記担体核酸分子のセットとの総量が約１７５ｎｇ、２００ｎｇ、２２５ｎｇ、２５０ｎｇ、２７５ｎｇ、３００ｎｇ、３５０ｎｇ、４００ｎｇ、４５０ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、７５０ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、１．１μｇ、１．２５μｇまたは１．５μｇになるように十分な量で添加される、項目９１から９４のいずれか一項に記載の核酸の集団。
（項目９６）
前記担体核酸分子の配列が、（ｉ）ウイルスゲノム由来の配列、（ｉｉ）細菌ゲノム由来の配列、（ｉｉｉ）ラムダゲノム由来の配列、および（ｉｖ）非ヒトゲノム由来の配列からなる群より選択される、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９７）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ジデオキシヌクレオチドを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９８）
前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、ヒドロキシル基が求核試薬として作用することを阻止する任意の化学的改変を含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目９９）
前記担体核酸分子が、ウラシルヌクレオシドを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１００）
増幅するステップの前に、ウラシルデグリコシラーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼを添加するステップをさらに含む、項目９９に記載の核酸の集団。
（項目１０１）
前記担体核酸分子の５’末端が、以下の改変：（ｉ）反転（５’－５’）－ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０２）
前記担体核酸分子の３’末端が、以下の改変：（ｉ）酵素的に、または合成の間に付加され得る任意のジデオキシ塩基、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０３）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、頬内スワブまたは胸腔穿刺から得られる、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０４）
前記ポリヌクレオチド試料が、組織から得られる、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０５）
前記組織から得られた前記ポリヌクレオチド試料が、酵素的手段または機械的手段によって断片化される、項目１０４に記載の核酸の集団。
（項目１０６）
前記ポリヌクレオチド試料が、血液から得られる、項目７０に記載の核酸の集団。
（項目１０７）
前記血液から得られた前記ポリヌクレオチド試料が、無細胞ＤＮＡ試料である、項目１０６に記載の核酸の集団。
（項目１０８）
前記担体核酸分子が二本鎖分子である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記第１の試料が、変性させるステップに供されない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記第１のサブセットおよび／または前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧヌクレオチドまたはメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記１つまたは複数のＣｐＧヌクレオチドまたはメチル化ヌクレオチドに隣接する１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドの配列であり得る、上記項目のいずれか一項に記載の方法または担体核酸分子のセット。
（項目１１１）
前記シーケンシングするステップが、少なくとも２つの分配されたセット由来の前記処理された試料のうちの少なくとも一部をシーケンシングするステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
（ｉ）
（ａ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット、および／または
（ｂ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含む担体核酸分子のセットであって、前記担体核酸分子のセットの少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、担体核酸分子のセット；および
（ｉｉ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的に結合する捕捉剤
を含む、キット。
Claims (16)
- ポリヌクレオチド試料を解析する方法であって、
（ｉ）担体核酸分子のセットを前記ポリヌクレオチド試料に添加して、第１の試料を生成するステップであって、前記担体核酸分子のセットが、
（ａ）非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット；および
（ｂ）メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセット
を含み、前記担体核酸分子の少なくとも一方の末端が、ライゲーションを防止するように改変され、前記非メチル化担体核酸分子が、メチル化ヌクレオチドを含まず、前記メチル化担体核酸分子が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、ステップ；
（ｉｉ）前記第１の試料を、メチル化ポリヌクレオチドに選択的に結合する捕捉剤を使用して、少なくとも２つの分配されたセットに分配し、それにより、分配された試料を生成するステップ；
（ｉｉｉ）前記分配された試料の少なくとも一部を処理して、処理された試料を生成するステップであって、前記処理は、以下：（ａ）タグ付けするステップ、（ｂ）増幅するステップ、および（ｃ）目的の特異的領域について分子を富化するステップのうち少なくとも１つを含む、ステップ；ならびに
（ｉｖ）前記処理された試料の少なくとも一部をシーケンシングして、シーケンシングリードのセットを生成するステップを含む、方法。 - 前記担体核酸分子の長さが２５ｂｐと３２５ｂｐとの間である、請求項１に記載の方法。
- ａ）前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む；
ｂ）前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む；または
ｃ）前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、請求項１または請求項２に記載の方法。 - 前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、例えば：
ａ）前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの位置とは異なる；
ｂ）前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記ＣｐＧジヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のＣｐＧジヌクレオチドの数とは異なる；または
ｃ）前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、請求項３に記載の方法。 - ａ）前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドが、（ｉ）５－メチルシトシン、（ｉｉ）６－メチルアデニン、（ｉｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン、（ｉｖ）メチルウラシル、および（ｖ）任意の他のメチル化ヌクレオチドからなる群より選択される；かつ／または
ｂ）メチル化ヌクレオチドの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。 - ａ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、同じヌクレオチド配列を含む；
ｂ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なるヌクレオチド配列を含む；または
ｃ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの第１のサブセットおよび第２のサブセットが、異なる長さのものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。 - ａ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットが、ヌクレオチド配列中に、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、例えば、前記１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドが、１つまたは複数のメチル化シトシンを含む；
ｂ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドの位置とは異なる；
ｃ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記メチル化ヌクレオチドの数が、前記第２のサブセット中のメチル化ヌクレオチドの数とは異なる；または
ｄ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの前記第１のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列とは異なる、請求項６に記載の方法。 - ａ）前記メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットの、前記非メチル化担体核酸分子の少なくとも１つのサブセットに対する量が、約０：１、０．１：９９．９、０．５：９９．５、０．７５：９９．２５、１：９９、１：９５、１：９０、１：８０、１：７５、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．１５、１：１、１．１５：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１、９９：１、９９．２５：０．７５、９９．５：０．５、９９．９：０．１または１：０の比である；かつ／または
ｂ）前記ポリヌクレオチド試料の、前記担体核酸分子のセットに対する量が、約１：０．１；１：０．２、１：０．３、１：４、１：０．５、１：６、１：７、１：８、１：０．９、１：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０の比、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００；１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：５０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１０ ６ 、１：１０ ７ 、１：１０ ８ または１：１０ ９ である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。 - ａ）前記ポリヌクレオチド試料が最大１μｇである；
ｂ）前記ポリヌクレオチド試料が最大２００ｎｇである；
ｃ）前記ポリヌクレオチド試料が最大１５０ｎｇである；または
ｄ）前記ポリヌクレオチド試料が最大１００ｎｇである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記担体核酸分子のセットが、前記ポリヌクレオチド試料と前記担体核酸分子のセットとの総量が約１７５ｎｇ、２００ｎｇ、２２５ｎｇ、２５０ｎｇ、２７５ｎｇ、３００ｎｇ、３５０ｎｇ、４００ｎｇ、４５０ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、７５０ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、１．１μｇ、１．２５μｇまたは１．５μｇになるように十分な量で添加される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
- ａ）前記担体核酸分子の配列が、（ｉ）ウイルスゲノム由来の配列、（ｉｉ）細菌ゲノム由来の配列、（ｉｉｉ）ラムダゲノム由来の配列、および（ｉｖ）非ヒトゲノム由来の配列からなる群より選択される；かつ／または
ｂ）前記担体核酸分子が合成ＤＮＡである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記担体核酸分子の前記少なくとも一方の末端が、
ａ)Ｃ３（プロピル基）スペーサーを含む；
ｂ）ジデオキシヌクレオチドを含む；または
ｃ）ヒドロキシル基が求核試薬として作用することを阻止する任意の化学的改変を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。 - 前記担体核酸分子が、ウラシルヌクレオシドを含み；
前記方法が、必要に応じて、前記増幅するステップの前に、ウラシルデグリコシラーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼを添加するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。 - ａ）前記担体核酸分子の５’末端が、以下の改変：（ｉ）反転（５’－５’）、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む；かつ／または
ｂ）前記担体核酸分子の３’末端が、以下の改変：（ｉ）酵素的に、または合成の間に付加され得る任意のジデオキシ塩基、例えば、ジデオキシチミン、ジデオキシシトシン、ジデオキシグアニンまたはジデオキシアデニン；（ｉｉ）プロピル基、または（ｉｉｉ）例えば、ベンジル、エチルもしくはメチルであるがこれらに限定されない他の有機官能基のうち少なくとも１つを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。 - ａ）前記担体核酸分子が二本鎖分子である；
ｂ）前記第１の試料が、変性させるステップに供されない；
ｃ）前記第１のサブセットおよび／または前記第２のサブセット中の前記１つまたは複数のＣｐＧヌクレオチドまたはメチル化ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの配列が、前記１つまたは複数のＣｐＧヌクレオチドまたはメチル化ヌクレオチドに隣接する１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドの配列であり得る；かつ／または
ｄ）前記シーケンシングするステップが、少なくとも２つの分配されたセット由来の前記処理された試料のうちの少なくとも一部をシーケンシングするステップを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ポリヌクレオチド試料が、血液から得られたものであり、必要に応じて、前記血液由来の前記ポリヌクレオチド試料が、無細胞ＤＮＡ試料である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
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