JPWO2021046243A5 - - Google Patents

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JPWO2021046243A5
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国際出願時の請求の範囲の記載は以下のとおりである。
〔項１〕
核酸配列を細胞のゲノムに組み込む方法であって、組換えｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードするベクターを細胞に導入するステップを含み、ｍＲＮＡが、
（ａ）挿入配列であって、
（ｉ）外来配列、または
（ｉｉ）外来配列の逆相補鎖である配列
を含む、挿入配列、
（ｂ）５’ＵＴＲ配列および該５’ＵＴＲ配列の下流にある３’ＵＴＲ配列であって、５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列がヒトＯＲＦタンパク質のための結合部位を含む、５’ＵＴＲ配列および３’ＵＴＲ配列
を含み、
挿入配列が細胞のゲノムに組み込まれる、方法。
〔項２〕
５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列がヒトＯＲＦ２ｐのための結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
〔項３〕
核酸配列を免疫細胞のゲノムに組み込むための方法であって、組換えｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードするベクターを導入するステップを含み、ｍＲＮＡが、
（ａ）挿入配列であって、（ｉ）外来配列または（ｉｉ）外来配列の逆相補鎖である配列を含む、挿入配列、
（ｂ）５’ＵＴＲ配列および該５’ＵＴＲ配列の下流にある３’ＵＴＲ配列であって、５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列がエンドヌクレアーゼ結合部位および／または逆転写酵素結合部位を含む、５’ＵＴＲ配列および３’ＵＴＲ配列
を含み、
導入遺伝子配列が免疫細胞のゲノムに組み込まれる、方法。
〔項４〕
核酸配列を細胞のゲノムに組み込むための方法であって、組換えｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードするベクターを導入するステップを含み、ｍＲＮＡが、
（ａ）挿入配列であって、（ｉ）外来配列または（ｉｉ）外来配列の逆相補鎖である配列を含む、挿入配列、
（ｂ）５’ＵＴＲ配列、該５’ＵＴＲ配列の下流にあるヒトレトロトランスポゾンの配列、および該ヒトレトロトランスポゾンの配列の下流にある３’ＵＴＲ配列であって、５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列がエンドヌクレアーゼ結合部位および／または逆転写酵素結合部位を含む、５’ＵＴＲ配列、ヒトレトロトランスポゾンの配列、および３’ＵＴＲ配列
を含み、
ヒトレトロトランスポゾンの配列が、２つのＯＲＦを含有する単一ＲＮＡから翻訳される２つのタンパク質をコードし、
挿入配列が細胞のゲノムに組み込まれる、方法。
〔項５〕
５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列がＯＲＦ２ｐ結合部位を含む、請求項３または４に記載の方法。
〔項６〕
ＯＲＦ２ｐ結合部位が３’ＵＴＲ配列におけるポリＡ配列である、請求項２または５に記載の方法。
〔項７〕
ｍＲＮＡがヒトレトロトランスポゾンの配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
〔項８〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列が５’ＵＴＲ配列の下流にある、請求項７に記載の方法。
〔項９〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列が３’ＵＴＲ配列の上流にある、請求項７または８に記載の方法。
〔項１０〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列が、２つのＯＲＦを含有する単一ＲＮＡから翻訳される２つのタンパク質をコードする、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
〔項１１〕
２つのＯＲＦが非重複ＯＲＦである、請求項４または１０に記載の方法。
〔項１２〕
２つのＯＲＦがＯＲＦ１およびＯＲＦ２である、請求項４、１０、または１１に記載の方法。
〔項１３〕
ＯＲＦ１がＯＲＦ１ｐをコードし、ＯＲＦ２がＯＲＦ２ｐをコードする、請求項１２に記載の方法。
〔項１４〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列が非ＬＴＲレトロトランスポゾンの配列を含む、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
〔項１５〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列がＬＩＮＥ－１レトロトランスポゾンを含む、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
〔項１６〕
ＬＩＮＥ－１レトロトランスポゾンがヒトＬＩＮＥ－１レトロトランスポゾンである、請求項１５に記載の方法。
〔項１７〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列が、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする配列を含む、請求項４から１６のいずれか一項に記載の方法。
〔項１８〕
エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素がＯＲＦ２ｐである、請求項１７に記載の方法。
〔項１９〕
逆転写酵素がグループＩＩイントロン逆転写酵素ドメインである、請求項１７に記載の方法。
〔項２０〕
エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素がミンククジラエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素である、請求項１７に記載の方法。
〔項２１〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列がＯＲＦ２ｐをコードする配列を含む、請求項４から１６または２０のいずれか一項に記載の方法。
〔項２２〕
挿入配列が、ＯＲＦ２ｐのエンドヌクレアーゼドメインの特異性を使用して、ポリＴ部位においてゲノムに組み込まれる、請求項２１に記載の方法。
〔項２３〕
ポリＴ部位が配列ＴＴＴＴＴＡを含む、請求項２２に記載の方法。
〔項２４〕
（ｉ）ヒトレトロトランスポゾンの配列がＯＲＦ１ｐをコードする配列を含むか、（ｉｉ）ｍＲＮＡがＯＲＦ１ｐをコードする配列を含まないか、または（ｉｉｉ）ｍＲＮＡが、相補遺伝子由来の５’ＵＴＲ配列を有する、ＯＲＦ１ｐをコードする配列の置換配列を含む、請求項４から２３のいずれか一項に記載の方法。
〔項２５〕
ｍＲＮＡが、ＯＲＦ１ｐをコードする第１のｍＲＮＡ分子とエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする第２のｍＲＮＡ分子とを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
〔項２６〕
ｍＲＮＡが、ＯＲＦ１ｐをコードする第１の配列とエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする第２の配列とを含むｍＲＮＡ分子である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
〔項２７〕
ＯＲＦ１ｐをコードする第１の配列とエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする第２の配列とがリンカー配列によって分離される、請求項２６に記載の方法。
〔項２８〕
リンカー配列が内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を含む、請求項２７に記載の方法。
〔項２９〕
ＩＲＥＳがＣＶＢ３またはＥＶ７１由来のＩＲＥＳである、請求項２８に記載の方法。
〔項３０〕
リンカー配列が自己切断ペプチド配列をコードする、請求項２７に記載の方法。
〔項３１〕
リンカー配列がＴ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＰ２Ａ配列をコードする、請求項２７に記載の方法。
〔項３２〕
ヒトレトロトランスポゾンの配列が、追加のタンパク質配列と融合したＯＲＦ１ｐをコードする配列および／または追加のタンパク質配列と融合したＯＲＦ２ｐをコードする配列を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
〔項３３〕
ＯＲＦ１ｐおよび／またはＯＲＦ２ｐが核内保留配列と融合する、請求項３２に記載の方法。
〔項３４〕
核内保留配列がＡｌｕ配列である、請求項３３に記載の方法。
〔項３５〕
ＯＲＦ１ｐおよび／またはＯＲＦ２ｐがＭＳ２コートタンパク質と融合する、請求項３２に記載の方法。
〔項３６〕
５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列が少なくとも１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くのＭＳ２ヘアピン配列を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
〔項３７〕
５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列が、ｍＲＮＡのポリＡ尾部とエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素との相互作用を促進または増強する配列を含む、請求項１７から３６のいずれか一項に記載の方法。
〔項３８〕
５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列が、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）とエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素との相互作用を促進または増強する配列を含む、請求項１７から３７のいずれか一項に記載の方法。
〔項３９〕
５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列が、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素のｍＲＮＡに対する特異性を、細胞によって発現される別のｍＲＮＡと比べて向上させる配列を含む、請求項１７から３８のいずれか一項に記載の方法。
〔項４０〕
５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列がＡｌｕエレメント配列を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
〔項４１〕
ＯＲＦ１ｐをコードする第１の配列とエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする第２の配列とが同じプロモーターを有する、請求項２６から４０のいずれか一項に記載の方法。
〔項４２〕
挿入配列が、ＯＲＦ１ｐをコードする第１の配列のプロモーターと異なるプロモーターを有する、請求項２４から４１のいずれか一項に記載の方法。
〔項４３〕
挿入配列が、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする第２の配列のプロモーターと異なるプロモーターを有する、請求項１７から４２のいずれか一項に記載の方法。
〔項４４〕
ＯＲＦ１ｐをコードする第１の配列ならびに／またはエンドヌクレアーゼおよび／もしくは逆転写酵素をコードする第２の配列が、誘導性プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたは転写開始部位、Ｔ７プロモーターまたは転写開始部位、ＥＦ１ａプロモーターまたは転写開始部位、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロモーターまたは転写開始部位を有する、請求項２６から４３のいずれか一項に記載の方法。
〔項４５〕
挿入配列が、誘導性プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたは転写開始部位、Ｔ７プロモーターまたは転写開始部位、ＥＦ１ａプロモーターまたは転写開始部位、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロモーターまたは転写開始部位を有する、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
〔項４６〕
ＯＲＦ１ｐをコードする第１の配列とエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする第２の配列とが、ヒト細胞における発現に対してコドン最適化される、請求項２６から４５のいずれか一項に記載の方法。
〔項４７〕
ｍＲＮＡがＷＰＲＥエレメントを含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
〔項４８〕
ｍＲＮＡが選択マーカーを含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
〔項４９〕
ｍＲＮＡが親和性タグをコードする配列を含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
〔項５０〕
親和性タグがエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする配列と連結する、請求項４９に記載の方法。
〔項５１〕
３’ＵＴＲがポリＡ配列を含むか、またはポリＡ配列がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｍＲＮＡに付加される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
〔項５２〕
ポリＡ配列がエンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする配列の下流にある、請求項５１に記載の方法。
〔項５３〕
挿入配列がポリＡ配列の上流にある、請求項５１または５２に記載の方法。
〔項５４〕
３’ＵＴＲ配列が挿入配列を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
〔項５５〕
挿入配列が、外来ポリペプチドをコードする配列の逆相補鎖である配列を含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
〔項５６〕
挿入配列がポリアデニル化部位を含む、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
〔項５７〕
挿入配列がＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
〔項５８〕
挿入配列が、外来ポリペプチドをコードする配列の逆相補鎖である配列の上流にポリアデニル化部位を含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
〔項５９〕
挿入配列が、リボソーム座位ではない座位においてゲノムに組み込まれる、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
〔項６０〕
挿入配列が遺伝子または遺伝子の調節領域に組み込まれ、それによって遺伝子を破壊するかまたは遺伝子の発現を下方制御する、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
〔項６１〕
挿入配列が遺伝子または遺伝子の調節領域に組み込まれ、それによって遺伝子の発現を上方制御する、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
〔項６２〕
挿入配列がゲノムに組み込まれ、遺伝子を置き換える、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
〔項６３〕
挿入配列がゲノムに安定に組み込まれる、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
〔項６４〕
挿入配列がゲノムにレトロ転移する、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
〔項６５〕
挿入配列が、ｍＲＮＡによってコードされるエンドヌクレアーゼによる標的部位のＤＮＡ鎖の切断によってゲノムに組み込まれる、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法。
〔項６６〕
挿入配列が、標的をプライマーとする逆転写（ＴＰＲＴ）を介してゲノムに組み込まれる、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法。
〔項６７〕
挿入配列が、ｍＲＮＡのゲノムのＤＮＡ標的部位への逆スプライシングを介してゲノムに組み込まれる、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法。
〔項６８〕
細胞が免疫細胞である、請求項１または４から６７のいずれか一項に記載の方法。
〔項６９〕
免疫細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項３または６８に記載の方法。
〔項７０〕
免疫細胞が骨髄細胞である、請求項３または６８に記載の方法。
〔項７１〕
免疫細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、樹状前駆細胞、およびマクロファージ前駆細胞からなる群から選択される、請求項３または６８に記載の方法。
〔項７２〕
ｍＲＮＡが自己組込みｍＲＮＡである、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
〔項７３〕
細胞にｍＲＮＡを導入するステップを含む、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。
〔項７４〕
細胞にｍＲＮＡをコードするベクターを導入するステップを含む、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。
〔項７５〕
ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードするベクターを細胞にｅｘ ｖｉｖｏにおいて導入するステップを含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の方法。
〔項７６〕
前記細胞をヒト対象に投与するステップをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
〔項７７〕
ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードするベクターをヒト対象に投与するステップを含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の方法。
〔項７８〕
免疫応答がヒト対象において誘発されない、請求項７６または７７に記載の方法。
〔項７９〕
ｍＲＮＡまたはベクターが実質的に非免疫原性である、請求項７６または７７に記載の方法。
〔項８０〕
ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
〔項８１〕
ベクターが非ＬＴＲレトロトランスポゾンを含む、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
〔項８２〕
ベクターがヒトＬ１エレメントを含む、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
〔項８３〕
ベクターがＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子を含む、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
〔項８４〕
ベクターがＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子を含む、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
〔項８５〕
ベクターがＬ１レトロトランスポゾンを含む、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
〔項８６〕
ｍＲＮＡが少なくとも約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３キロベースである、請求項１から８５のいずれか一項に記載の方法。
〔項８７〕
ｍＲＮＡが最大で約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５キロベースである、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
〔項８８〕
ｍＲＮＡがｍＲＮＡの分解を阻害または防止する配列を含む、請求項１から８７のいずれか一項に記載の方法。
〔項８９〕
ｍＲＮＡの分解を阻害または防止する配列が、エキソヌクレアーゼまたはＲＮＡｓｅによるｍＲＮＡの分解を阻害または防止する、請求項８８に記載の方法。
〔項９０〕
ｍＲＮＡの分解を阻害または防止する配列が、Ｇ４構造、シュードノット、または三重鎖配列である、請求項８８に記載の方法。
〔項９１〕
ｍＲＮＡの分解を阻害または防止する配列が、フラビウイルスＲＮＡ由来のエキソリボヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ構造またはＫＳＶ由来のＥＮＥエレメントである、請求項８８に記載の方法。
〔項９２〕
ｍＲＮＡの分解を阻害または防止する配列が、デアデニラーゼによるｍＲＮＡの分解を阻害または防止する、請求項８８に記載の方法。
〔項９３〕
ｍＲＮＡの分解を阻害または防止する配列が、ｍＲＮＡのポリＡ尾部の内部または末端に非アデノシンヌクレオチドを含む、請求項８８に記載の方法。
〔項９４〕
ｍＲＮＡの分解を阻害または防止する配列がｍＲＮＡの安定性を向上させる、請求項８８に記載の方法。
〔項９５〕
外来配列が外来ポリペプチドをコードする配列を含む、請求項１から９４のいずれか一項に記載の方法。
〔項９６〕
外来ポリペプチドをコードする配列が、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする配列とインフレームではない、請求項９５に記載の方法。
〔項９７〕
外来ポリペプチドをコードする配列が、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする配列とインフレームではない、請求項９５または９６に記載の方法。
〔項９８〕
外来配列がイントロンを含まない、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の方法。
〔項９９〕
外来配列が、酵素、受容体、輸送タンパク質、構造タンパク質、ホルモン、抗体、収縮タンパク質、および貯蔵タンパク質からなる群から選択される外来ポリペプチドをコードする配列を含む、請求項９５から９８のいずれか一項に記載の方法。
〔項１００〕
外来配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、リガンド、抗体、受容体、および酵素からなる群から選択される外来ポリペプチドをコードする配列を含む、請求項９５から９８のいずれか一項に記載の方法。
〔項１０１〕
外来配列が調節配列を含む、請求項１から９４のいずれか一項に記載の方法。
〔項１０２〕
調節配列がシス作用性調節配列を含む、請求項１０１に記載の方法。
〔項１０３〕
調節配列が、エンハンサー、サイレンサー、プロモーター、または応答エレメントからなる群から選択されるシス作用性調節配列を含む、請求項１０１に記載の方法。
〔項１０４〕
調節配列がトランス作用性調節配列を含む、請求項１０１に記載の方法。
〔項１０５〕
調節配列が、転写因子をコードするトランス作用性調節配列を含む、請求項１０１に記載の方法。
〔項１０６〕
挿入配列の組込みが細胞の健康状態に悪影響を及ぼさない、請求項１から１０５のいずれか一項に記載の方法。
〔項１０７〕
エンドヌクレアーゼ、逆転写酵素、またはその両方が、挿入配列の部位特異的組込みが可能である、請求項１から１０６のいずれか一項に記載の方法。
〔項１０８〕
ｍＲＮＡが、追加のヌクレアーゼドメインまたはＯＲＦ２に由来しないヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む、請求項１から１０７のいずれか一項に記載の方法。
〔項１０９〕
ｍＲＮＡが、メガＴＡＬヌクレアーゼドメイン、ＴＡＬＥＮドメイン、Ｃａｓ９ドメイン、Ｒ２レトロエレメント由来のジンクフィンガー結合ドメイン、またはＡＡＶ由来のＲｅｐ７８等の反復配列に結合するＤＮＡ結合ドメインをコードする配列を含む、請求項１から１０７のいずれか一項に記載の方法。
〔項１１０〕
エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼの活性を、変異を有しないエンドヌクレアーゼと比較して低下させる変異を含む、請求項１７から１０９のいずれか一項に記載の方法。
〔項１１１〕
エンドヌクレアーゼがＯＲＦ２ｐエンドヌクレアーゼであり、変異がＳ２２８Ｐである、請求項１１０に記載の方法。
〔項１１２〕
ｍＲＮＡが、逆転写酵素の正確性および／またはプロセシング能を向上させるドメインをコードする配列を含む、請求項１７から１１１のいずれか一項に記載の方法。
〔項１１３〕
逆転写酵素が、ＯＲＦ２以外のレトロエレメント由来の逆転写酵素、またはＯＲＦ２ｐの逆転写酵素と比較してより高い正確性および／もしくはプロセシング能を有する逆転写酵素である、請求項１７から１１１のいずれか一項に記載の方法。
〔項１１４〕
逆転写酵素がグループＩＩイントロン逆転写酵素である、請求項１１３に記載の方法。
〔項１１５〕
グループＩＩイントロン逆転写酵素が、グループＩＩＡイントロン逆転写酵素、グループＩＩＢイントロン逆転写酵素、またはグループＩＩＣイントロン逆転写酵素である、請求項１１４に記載の方法。
〔項１１６〕
グループＩＩイントロン逆転写酵素がＴＧＩＲＴ－ＩＩまたはＴＧＩＲＴ－ＩＩＩである、請求項１１４に記載の方法。
〔項１１７〕
ｍＲＮＡが、Ａｌｕエレメントおよび／またはリボソーム結合アプタマーを含む配列を含む、請求項１から１１６のいずれか一項に記載の方法。
〔項１１８〕
ｍＲＮＡが、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む、請求項１から１１７のいずれか一項に記載の方法。
〔項１１９〕
３’ＵＴＲ配列がウイルス３’ＵＴＲまたはベータ－グロビン３’ＵＴＲに由来する、請求項１から１１８のいずれか一項に記載の方法。
〔項１２０〕
組換えｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードするベクターを含む組成物であって、ｍＲＮＡが、
（ｉ）ヒトＬＩＮＥ－１トランスポゾン５’ＵＴＲ配列、
（ｉｉ）該ヒトＬＩＮＥ－１トランスポゾン５’ＵＴＲ配列の下流にあるＯＲＦ１ｐをコードする配列、
（ｉｉｉ）該ＯＲＦ１ｐをコードする配列の下流にあるＯＲＦ間リンカー配列、
（ｉｖ）該ＯＲＦ間リンカー配列の下流にあるＯＲＦ２ｐをコードする配列、および
（ｖ）該ＯＲＦ２ｐをコードする配列の下流にあるヒトＬＩＮＥ－１トランスポゾンに由来する３’ＵＴＲ配列
を含むヒトＬＩＮＥ－１トランスポゾン配列を含み、
３’ＵＴＲ配列が挿入配列を含み、挿入配列が、外来ポリペプチドをコードする配列の逆相補鎖または外来調節エレメントをコードする配列の逆相補鎖である、組成物。
〔項１２１〕
挿入配列が、細胞に導入される場合、細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１２０に記載の組成物。
〔項１２２〕
挿入配列が状態または疾患と関連する遺伝子に組み込まれ、それによって遺伝子を破壊するかまたは遺伝子の発現を下方制御する、請求項１２１に記載の組成物。
〔項１２３〕
挿入配列が遺伝子に組み込まれ、それによって遺伝子の発現を上方制御する、請求項１２１に記載の組成物。
〔項１２４〕
ｍＲＮＡが、配列番号３５～５０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１２１に記載の組成物。
〔項１２５〕
組換えｍＲＮＡまたはｍＲＮＡをコードするベクターが単離または精製される、請求項１２１に記載の組成物。
〔項１２６〕
（ａ）長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチドであって、ヒトＯＲＦ１ｐおよびヒトＯＲＦ２ｐを含む、ＬＩＮＥポリペプチドと、（ｂ）挿入配列であって、外来ポリペプチドをコードする配列の逆相補鎖または外来調節エレメントをコードする配列の逆相補鎖である、挿入配列とをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、実質的に非免疫原性である、組成物。
〔項１２７〕
ヒトＯＲＦ１ｐおよびヒトＯＲＦ２ｐタンパク質を含む、請求項１２６に記載の組成物。
〔項１２８〕
前記核酸と複合体を形成したヒトＯＲＦ１ｐおよびヒトＯＲＦ２ｐを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む、請求項１２６または１２７に記載の組成物。
〔項１２９〕
核酸がｍＲＮＡである、請求項１２７または１２８に記載の組成物。
〔項１３０〕
請求項１２０から１２９のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞を含む組成物。
〔項１３１〕
細胞が免疫細胞である、請求項１３０に記載の組成物。
〔項１３２〕
免疫細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項１３１に記載の組成物。
〔項１３３〕
免疫細胞が骨髄細胞である、請求項１３１に記載の組成物。
〔項１３４〕
免疫細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、樹状前駆細胞、およびマクロファージ前駆細胞からなる群から選択される、請求項１３１に記載の組成物。
〔項１３５〕
挿入配列が外来ポリペプチドをコードする配列の逆相補鎖であり、外来ポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１２０から１３４のいずれか一項に記載の組成物。
〔項１３６〕
請求項１２０から１３５のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
〔項１３７〕
遺伝子療法における使用のための、請求項１３６に記載の医薬組成物。
〔項１３８〕
疾患または状態を処置するための医薬の製造における使用のための、請求項１３６に記載の医薬組成物。
〔項１３９〕
疾患または状態を処置することにおける使用のための、請求項１３６に記載の医薬組成物。
〔項１４０〕
対象における疾患を処置する方法であって、疾患または状態を有する対象に請求項１３６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
〔項１４１〕
対象におけるタンパク質または機能性ＲＮＡの量または活性を増加する、請求項１４０に記載の方法。
〔項１４２〕
対象が不十分な量または活性のタンパク質または機能性ＲＮＡを有する、請求項１４０または１４１に記載の方法。
〔項１４３〕
不十分な量または活性のタンパク質または機能性ＲＮＡが、疾患もしくは状態と関連するかまたは疾患もしくは状態を引き起こす、請求項１４２に記載の方法。
〔項１４４〕
ヒトサイレンシングハブ（ＨＵＳＨ）複合体を阻害する薬剤、ＦＡＭ２０８Ａを阻害する薬剤、またはＴＲＩＭ２８を阻害する薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項１４０から１４３のいずれか一項に記載の方法。
〔項１４５〕
ヒトサイレンシングハブ（ＨＵＳＨ）複合体を阻害する薬剤が、ペリフィリン、ＴＡＳＯＲ、および／またはＭＰＰ８を阻害する薬剤である、請求項１４４に記載の方法。
〔項１４６〕
ヒトサイレンシングハブ（ＨＵＳＨ）複合体を阻害する薬剤がＨＵＳＨ複合体の集合を阻害する、請求項１４４に記載の方法。
〔項１４７〕
ファンコニ貧血複合体を阻害する薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項１４０から１４６のいずれか一項に記載の方法。

配列
[0489]以下は、実施例において使用される構築物の例示的な配列である。これらの配列は参照例示を目的としており、当業者によって過度の実験を行わずに想到される配列の変形および最適化は本開示によって企図および包含される。配列の表題にｍＲＮＡ配列と記載される場合、構築物はＤＮＡ鋳型のヌクレオチドを記載しており、当業者は対応するｍＲＮＡ配列を容易に得ることができる。 The scope of claims at the time of international filing is as follows.
[Section 1]
A method of integrating a nucleic acid sequence into the genome of a cell, the method comprising the step of introducing into the cell a recombinant mRNA or a vector encoding the mRNA, the mRNA comprising:
(a) an insertion sequence,
(i) a foreign sequence, or
(ii) a sequence that is the reverse complement of a foreign sequence;
an insert array containing,
(b) a 5'UTR sequence and a 3'UTR sequence downstream of the 5'UTR sequence, the 5'UTR sequence or the 3'UTR sequence comprising a binding site for a human ORF protein; and 3'UTR sequence
including;
A method in which an inserted sequence is integrated into the genome of a cell.
[Section 2]
2. The method of claim 1, wherein the 5'UTR sequence or 3'UTR sequence contains a binding site for human ORF2p.
[Section 3]
A method for integrating a nucleic acid sequence into the genome of an immune cell, the method comprising the step of introducing a recombinant mRNA or a vector encoding the mRNA, the mRNA comprising:
(a) an insertion sequence comprising (i) a foreign sequence or (ii) a sequence that is the reverse complement of the foreign sequence;
(b) a 5'UTR sequence and a 3'UTR sequence downstream of the 5'UTR sequence, the 5'UTR sequence or 3'UTR sequence comprising an endonuclease binding site and/or a reverse transcriptase binding site; 5'UTR sequence and 3'UTR sequence
including;
A method in which a transgene sequence is integrated into the genome of an immune cell.
[Section 4]
A method for integrating a nucleic acid sequence into the genome of a cell, the method comprising the step of introducing a recombinant mRNA or a vector encoding the mRNA, the mRNA comprising:
(a) an insertion sequence comprising (i) a foreign sequence or (ii) a sequence that is the reverse complement of the foreign sequence;
(b) a 5'UTR sequence, a sequence of a human retrotransposon downstream of the 5'UTR sequence, and a 3'UTR sequence downstream of the human retrotransposon sequence, the 5'UTR sequence or the 3'UTR sequence; 5'UTR sequences, sequences of human retrotransposons, and 3'UTR sequences, the sequences of which include an endonuclease binding site and/or a reverse transcriptase binding site.
including;
the sequence of a human retrotransposon encodes two proteins that are translated from a single RNA containing two ORFs,
A method in which an inserted sequence is integrated into the genome of a cell.
[Section 5]
5. The method of claim 3 or 4, wherein the 5'UTR sequence or 3'UTR sequence comprises an ORF2p binding site.
[Section 6]
6. The method according to claim 2 or 5, wherein the ORF2p binding site is a poly A sequence in the 3'UTR sequence.
[Section 7]
4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the mRNA comprises a sequence of a human retrotransposon.
[Section 8]
8. The method of claim 7, wherein the human retrotransposon sequence is downstream of the 5'UTR sequence.
[Section 9]
9. The method of claim 7 or 8, wherein the human retrotransposon sequence is upstream of the 3'UTR sequence.
[Section 10]
10. The method of any one of claims 7 to 9, wherein the sequence of the human retrotransposon encodes two proteins that are translated from a single RNA containing two ORFs.
[Section 11]
11. The method of claim 4 or 10, wherein the two ORFs are non-overlapping ORFs.
[Section 12]
12. The method of claim 4, 10, or 11, wherein the two ORFs are ORF1 and ORF2.
[Section 13]
13. The method of claim 12, wherein ORF1 encodes ORF1p and ORF2 encodes ORF2p.
[Section 14]
14. The method of any one of claims 4 to 13, wherein the human retrotransposon sequence comprises a non-LTR retrotransposon sequence.
[Section 15]
14. The method of any one of claims 4 to 13, wherein the human retrotransposon sequence comprises a LINE-1 retrotransposon.
[Section 16]
16. The method of claim 15, wherein the LINE-1 retrotransposon is a human LINE-1 retrotransposon.
[Section 17]
17. The method according to any one of claims 4 to 16, wherein the sequence of the human retrotransposon comprises a sequence encoding an endonuclease and/or a reverse transcriptase.
[Section 18]
18. The method according to claim 17, wherein the endonuclease and/or reverse transcriptase is ORF2p.
[Section 19]
18. The method of claim 17, wherein the reverse transcriptase is a group II intron reverse transcriptase domain.
[Section 20]
18. The method of claim 17, wherein the endonuclease and/or reverse transcriptase is minke whale endonuclease and/or reverse transcriptase.
[Section 21]
21. The method according to any one of claims 4 to 16 or 20, wherein the sequence of the human retrotransposon comprises a sequence encoding ORF2p.
[Section 22]
22. The method of claim 21, wherein the insertion sequence is integrated into the genome at a poly-T site using the specificity of the endonuclease domain of ORF2p.
[Section 23]
23. The method of claim 22, wherein the poly T site comprises the sequence TTTTTA.
[Section 24]
(i) the sequence of the human retrotransposon contains a sequence encoding ORF1p, (ii) the mRNA does not contain a sequence encoding ORF1p, or (iii) the mRNA has a 5'UTR sequence derived from a complementary gene. , comprising a replacement sequence of the sequence encoding ORF1p.
[Section 25]
25. The method according to any one of claims 1 to 24, wherein the mRNA comprises a first mRNA molecule encoding ORF1p and a second mRNA molecule encoding an endonuclease and/or reverse transcriptase.
[Section 26]
25. The method according to any one of claims 1 to 24, wherein the mRNA is an mRNA molecule comprising a first sequence encoding ORF1p and a second sequence encoding an endonuclease and/or reverse transcriptase.
[Section 27]
27. The method of claim 26, wherein the first sequence encoding ORF1p and the second sequence encoding an endonuclease and/or reverse transcriptase are separated by a linker sequence.
[Section 28]
28. The method of claim 27, wherein the linker sequence comprises an internal ribosome entry sequence (IRES).
[Section 29]
29. The method of claim 28, wherein the IRES is a CVB3 or EV71 derived IRES.
[Section 30]
28. The method of claim 27, wherein the linker sequence encodes a self-cleaving peptide sequence.
[Section 31]
28. The method of claim 27, wherein the linker sequence encodes a T2A, E2A, or P2A sequence.
[Section 32]
32. The human retrotransposon sequence according to any one of claims 1 to 31, wherein the sequence of the human retrotransposon comprises a sequence encoding ORF1p fused to an additional protein sequence and/or a sequence encoding ORF2p fused to an additional protein sequence. Method.
[Section 33]
33. The method according to claim 32, wherein ORF1p and/or ORF2p are fused with a nuclear retention sequence.
[Section 34]
34. The method according to claim 33, wherein the nuclear retention sequence is an Alu sequence.
[Section 35]
33. The method according to claim 32, wherein ORF1p and/or ORF2p are fused to MS2 coat protein.
[Section 36]
36. The method of any one of claims 1-35, wherein the 5'UTR or 3'UTR sequence comprises at least one, two, three or more MS2 hairpin sequences.
[Section 37]
37. According to any one of claims 17 to 36, the 5'UTR sequence or 3'UTR sequence comprises a sequence that promotes or enhances the interaction of the polyA tail of the mRNA with an endonuclease and/or a reverse transcriptase. the method of.
[Section 38]
38. Any one of claims 17 to 37, wherein the 5'UTR sequence or 3'UTR sequence comprises a sequence that promotes or enhances the interaction of poly A binding protein (PABP) with an endonuclease and/or reverse transcriptase. The method described in.
[Section 39]
39. Any of claims 17 to 38, wherein the 5'UTR sequence or 3'UTR sequence comprises a sequence that increases the specificity of an endonuclease and/or reverse transcriptase for an mRNA compared to another mRNA expressed by the cell. The method described in paragraph (1).
[Section 40]
33. A method according to any one of claims 1 to 32, wherein the 5'UTR sequence or 3'UTR sequence comprises an Alu element sequence.
[Section 41]
41. The method according to any one of claims 26 to 40, wherein the first sequence encoding ORF1p and the second sequence encoding an endonuclease and/or reverse transcriptase have the same promoter.
[Section 42]
42. The method of any one of claims 24 to 41, wherein the inserted sequence has a promoter different from the promoter of the first sequence encoding ORF1p.
[Section 43]
43. A method according to any one of claims 17 to 42, wherein the insertion sequence has a promoter different from the promoter of the second sequence encoding the endonuclease and/or reverse transcriptase.
[Section 44]
The first sequence encoding ORF1p and/or the second sequence encoding an endonuclease and/or reverse transcriptase is an inducible promoter, a CMV promoter or transcription start site, a T7 promoter or transcription start site, an EF1a promoter or transcription start site. 44. The method of any one of claims 26 to 43, having a promoter or transcription initiation site selected from the group consisting of an initiation site, and combinations thereof.
[Section 45]
12. The inserted sequence has a promoter or transcription initiation site selected from the group consisting of an inducible promoter, a CMV promoter or transcription initiation site, a T7 promoter or transcription initiation site, an EF1a promoter or transcription initiation site, and combinations thereof. 45. The method according to any one of 1 to 44.
[Section 46]
46. Any one of claims 26 to 45, wherein the first sequence encoding ORF1p and the second sequence encoding an endonuclease and/or reverse transcriptase are codon optimized for expression in human cells. The method described in.
[Section 47]
47. A method according to any one of claims 1 to 46, wherein the mRNA comprises a WPRE element.
[Section 48]
48. A method according to any one of claims 1 to 47, wherein the mRNA comprises a selectable marker.
[Section 49]
49. The method of any one of claims 1-48, wherein the mRNA comprises a sequence encoding an affinity tag.
[Section 50]
50. The method of claim 49, wherein the affinity tag is linked to a sequence encoding an endonuclease and/or reverse transcriptase.
[Section 51]
51. The method of any one of claims 1 to 50, wherein the 3'UTR comprises a poly A sequence or the poly A sequence is added to the mRNA in vitro.
[Section 52]
52. The method of claim 51, wherein the polyA sequence is downstream of an endonuclease and/or reverse transcriptase encoding sequence.
[Section 53]
53. The method of claim 51 or 52, wherein the insertion sequence is upstream of the polyA sequence.
[Section 54]
54. The method of any one of claims 1-53, wherein the 3'UTR sequence comprises an insertion sequence.
[Section 55]
55. The method of any one of claims 1-54, wherein the inserted sequence comprises a sequence that is the reverse complement of a sequence encoding a foreign polypeptide.
[Section 56]
56. A method according to any one of claims 1 to 55, wherein the insertion sequence comprises a polyadenylation site.
[Section 57]
57. The method of any one of claims 1-56, wherein the inserted sequence comprises an SV40 polyadenylation site.
[Section 58]
58. The method of any one of claims 1 to 57, wherein the inserted sequence comprises a polyadenylation site upstream of a sequence that is the reverse complement of the sequence encoding the foreign polypeptide.
[Section 59]
59. A method according to any one of claims 1 to 58, wherein the insertion sequence is integrated into the genome at a locus that is not a ribosomal locus.
[Section 60]
59. A method according to any one of claims 1 to 58, wherein the insertion sequence is integrated into the gene or the regulatory region of the gene, thereby disrupting the gene or down-regulating the expression of the gene.
[Section 61]
59. A method according to any one of claims 1 to 58, wherein the insertion sequence is integrated into the gene or the regulatory region of the gene, thereby upregulating the expression of the gene.
[Section 62]
59. A method according to any one of claims 1 to 58, wherein the insertion sequence is integrated into the genome and replaces a gene.
[Section 63]
63. A method according to any one of claims 1 to 62, wherein the inserted sequence is stably integrated into the genome.
[Section 64]
64. A method according to any one of claims 1 to 63, wherein the inserted sequence is retrotransposed into the genome.
[Section 65]
65. The method of any one of claims 1 to 64, wherein the insertion sequence is integrated into the genome by cleavage of the DNA strand at a target site by an endonuclease encoded by the mRNA.
[Section 66]
66. The method of any one of claims 1 to 65, wherein the inserted sequence is integrated into the genome via target-primed reverse transcription (TPRT).
[Section 67]
66. The method of any one of claims 1 to 65, wherein the insertion sequence is integrated into the genome via reverse splicing of the mRNA to a DNA target site of the genome.
[Section 68]
68. The method of any one of claims 1 or 4-67, wherein the cells are immune cells.
[Section 69]
69. The method of claim 3 or 68, wherein the immune cells are T cells or B cells.
[Section 70]
69. The method of claim 3 or 68, wherein the immune cells are bone marrow cells.
[Section 71]
69. The method of claim 3 or 68, wherein the immune cells are selected from the group consisting of monocytes, macrophages, dendritic cells, dendritic progenitor cells, and macrophage progenitor cells.
[Section 72]
72. A method according to any one of claims 1 to 71, wherein the mRNA is self-integrating mRNA.
[Section 73]
73. A method according to any one of claims 1 to 72, comprising the step of introducing mRNA into the cell.
[Section 74]
73. The method of any one of claims 1 to 72, comprising introducing a vector encoding the mRNA into the cell.
[Section 75]
75. A method according to any one of claims 1 to 74, comprising introducing the mRNA or a vector encoding the mRNA into the cell ex vivo.
[Section 76]
76. The method of claim 75, further comprising administering the cell to a human subject.
[Section 77]
75. The method of any one of claims 1-74, comprising administering the mRNA or a vector encoding the mRNA to a human subject.
[Section 78]
78. The method of claim 76 or 77, wherein no immune response is elicited in the human subject.
[Section 79]
78. The method of claim 76 or 77, wherein the mRNA or vector is substantially non-immunogenic.
[Section 80]
80. A method according to any one of claims 1 to 79, wherein the vector is a plasmid or a viral vector.
[Section 81]
80. The method of any one of claims 1-79, wherein the vector comprises a non-LTR retrotransposon.
[Section 82]
80. The method of any one of claims 1-79, wherein the vector comprises a human L1 element.
[Section 83]
80. The method according to any one of claims 1 to 79, wherein the vector comprises the L1 retrotransposon ORF1 gene.
[Section 84]
80. The method according to any one of claims 1 to 79, wherein the vector comprises the L1 retrotransposon ORF2 gene.
[Section 85]
80. The method of any one of claims 1-79, wherein the vector comprises an L1 retrotransposon.
[Section 86]
The mRNA is at least about 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2. 86. according to any one of claims 1 to 85, which is 2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, or 3 kilobases. Method.
[Section 87]
The maximum mRNA is approximately 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 , 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 , or 5 kilobases.
[Section 88]
88. The method of any one of claims 1 to 87, wherein the mRNA comprises a sequence that inhibits or prevents degradation of the mRNA.
[Section 89]
89. The method of claim 88, wherein the sequence that inhibits or prevents mRNA degradation inhibits or prevents mRNA degradation by an exonuclease or RNAse.
[Section 90]
89. The method of claim 88, wherein the sequence that inhibits or prevents mRNA degradation is a G4 structure, a pseudoknot, or a triplex sequence.
[Section 91]
89. The method of claim 88, wherein the sequence that inhibits or prevents mRNA degradation is an exoribonuclease resistant RNA structure derived from flavivirus RNA or an ENE element derived from KSV.
[Section 92]
89. The method of claim 88, wherein the sequence that inhibits or prevents mRNA degradation inhibits or prevents mRNA degradation by deadenylase.
[Section 93]
89. The method of claim 88, wherein the sequence that inhibits or prevents degradation of the mRNA comprises non-adenosine nucleotides within or at the end of the polyA tail of the mRNA.
[Section 94]
89. The method of claim 88, wherein the sequence that inhibits or prevents mRNA degradation improves mRNA stability.
[Section 95]
95. The method of any one of claims 1-94, wherein the foreign sequence comprises a sequence encoding a foreign polypeptide.
[Section 96]
96. The method of claim 95, wherein the foreign polypeptide encoding sequence is not in frame with the endonuclease and/or reverse transcriptase encoding sequence.
[Section 97]
97. The method of claim 95 or 96, wherein the sequence encoding the foreign polypeptide is not in frame with the sequence encoding the endonuclease and/or reverse transcriptase.
[Section 98]
98. The method of any one of claims 95-97, wherein the foreign sequence does not include introns.
[Section 99]
Any of claims 95-98, wherein the foreign sequence comprises a sequence encoding a foreign polypeptide selected from the group consisting of enzymes, receptors, transport proteins, structural proteins, hormones, antibodies, contractile proteins, and storage proteins. The method described in paragraph 1.
[Section 100]
99. According to any one of claims 95 to 98, the foreign sequence comprises a sequence encoding a foreign polypeptide selected from the group consisting of a chimeric antigen receptor (CAR), a ligand, an antibody, a receptor, and an enzyme. the method of.
[Section 101]
95. The method of any one of claims 1-94, wherein the foreign sequence comprises a regulatory sequence.
[Section 102]
102. The method of claim 101, wherein the regulatory sequence comprises a cis-acting regulatory sequence.
[Section 103]
102. The method of claim 101, wherein the regulatory sequence comprises a cis-acting regulatory sequence selected from the group consisting of an enhancer, silencer, promoter, or response element.
[Section 104]
102. The method of claim 101, wherein the regulatory sequence comprises a trans-acting regulatory sequence.
[Section 105]
102. The method of claim 101, wherein the regulatory sequence comprises a trans-acting regulatory sequence encoding a transcription factor.
[Section 106]
106. A method according to any one of claims 1 to 105, wherein the incorporation of the insertion sequence does not adversely affect the health of the cells.
[Section 107]
107. The method of any one of claims 1 to 106, wherein the endonuclease, reverse transcriptase, or both are capable of site-specific integration of the inserted sequence.
[Section 108]
108. The method of any one of claims 1-107, wherein the mRNA comprises a sequence encoding an additional nuclease domain or a nuclease domain not derived from ORF2.
[Section 109]
From claim 1, wherein the mRNA comprises a sequence encoding a DNA binding domain that binds to a repeat sequence such as a mega TAL nuclease domain, a TALEN domain, a Cas9 domain, a zinc finger binding domain from an R2 retroelement, or Rep78 from AAV. 108. The method according to any one of 107.
[Section 110]
110. The method of any one of claims 17 to 109, wherein the endonuclease comprises a mutation that reduces the activity of the endonuclease compared to an endonuclease without the mutation.
[Section 111]
111. The method of claim 110, wherein the endonuclease is an ORF2p endonuclease and the mutation is S228P.
[Section 112]
112. A method according to any one of claims 17 to 111, wherein the mRNA comprises a sequence encoding a domain that improves the accuracy and/or processing capacity of reverse transcriptase.
[Section 113]
Any of claims 17 to 111, wherein the reverse transcriptase is a reverse transcriptase derived from a retroelement other than ORF2, or a reverse transcriptase with higher accuracy and/or processing ability compared to a reverse transcriptase of ORF2p. The method described in paragraph (1).
[Section 114]
114. The method of claim 113, wherein the reverse transcriptase is a group II intron reverse transcriptase.
[Section 115]
115. The method of claim 114, wherein the Group II intron reverse transcriptase is a Group IIA intron reverse transcriptase, a Group IIB intron reverse transcriptase, or a Group IIC intron reverse transcriptase.
[Section 116]
115. The method of claim 114, wherein the Group II intron reverse transcriptase is TGIRT-II or TGIRT-III.
[Section 117]
117. The method of any one of claims 1 to 116, wherein the mRNA comprises a sequence comprising an Alu element and/or a ribosome binding aptamer.
[Section 118]
118. The method of any one of claims 1-117, wherein the mRNA comprises a sequence encoding a polypeptide comprising a DNA binding domain.
[Section 119]
119. The method of any one of claims 1-118, wherein the 3'UTR sequence is derived from a viral 3'UTR or a beta-globin 3'UTR.
[Section 120]
A composition comprising a recombinant mRNA or a vector encoding an mRNA, the mRNA comprising:
(i) human LINE-1 transposon 5'UTR sequence,
(ii) a sequence encoding ORF1p downstream of the human LINE-1 transposon 5'UTR sequence;
(iii) an inter-ORF linker sequence downstream of the ORF1p-encoding sequence;
(iv) a sequence encoding ORF2p downstream of the inter-ORF linker sequence, and
(v) 3'UTR sequence derived from the human LINE-1 transposon downstream of the sequence encoding said ORF2p
comprising a human LINE-1 transposon sequence comprising;
A composition wherein the 3'UTR sequence comprises an insertion sequence, the insertion sequence being the reverse complement of a sequence encoding a foreign polypeptide or a sequence encoding a foreign regulatory element.
[Section 121]
121. The composition of claim 120, wherein the insertion sequence is integrated into the genome of the cell when introduced into the cell.
[Section 122]
122. The composition of claim 121, wherein the inserted sequence is incorporated into a gene associated with a condition or disease, thereby disrupting the gene or downregulating expression of the gene.
[Section 123]
122. The composition of claim 121, wherein the insertion sequence is integrated into a gene, thereby upregulating expression of the gene.
[Section 124]
122. The composition of claim 121, wherein the mRNA comprises a sequence having at least 80% sequence identity with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 35-50.
[Section 125]
122. The composition of claim 121, wherein the recombinant mRNA or mRNA-encoding vector is isolated or purified.
[Section 126]
The reverse complement of (a) a long interspersed repeat (LINE) polypeptide, including human ORF1p and human ORF2p, and (b) an inserted sequence encoding a foreign polypeptide. or an inserted sequence that is the reverse complement of a sequence encoding a foreign regulatory element, the composition comprising a nucleic acid sequence that is substantially non-immunogenic.
[Section 127]
127. The composition of claim 126, comprising human ORF1p and human ORF2p proteins.
[Section 128]
128. The composition of claim 126 or 127, comprising a ribonucleoprotein (RNP) comprising human ORF1p and human ORF2p complexed with the nucleic acid.
[Section 129]
129. The composition according to claim 127 or 128, wherein the nucleic acid is mRNA.
[Section 130]
130. A composition comprising cells comprising a composition according to any one of claims 120 to 129.
[Section 131]
131. The composition of claim 130, wherein the cell is an immune cell.
[Section 132]
132. The composition of claim 131, wherein the immune cell is a T cell or a B cell.
[Section 133]
132. The composition of claim 131, wherein the immune cells are bone marrow cells.
[Section 134]
132. The composition of claim 131, wherein the immune cells are selected from the group consisting of monocytes, macrophages, dendritic cells, dendritic progenitor cells, and macrophage progenitor cells.
[Section 135]
135. The composition of any one of claims 120 to 134, wherein the inserted sequence is the reverse complement of a sequence encoding a foreign polypeptide, and the foreign polypeptide is a chimeric antigen receptor (CAR).
[Section 136]
136. A pharmaceutical composition comprising a composition according to any one of claims 120 to 135 and a pharmaceutically acceptable excipient.
[Section 137]
137. A pharmaceutical composition according to claim 136 for use in gene therapy.
[Section 138]
137. A pharmaceutical composition according to claim 136 for use in the manufacture of a medicament for treating a disease or condition.
[Section 139]
137. A pharmaceutical composition according to claim 136 for use in treating a disease or condition.
[Section 140]
137. A method of treating a disease in a subject, the method comprising administering a pharmaceutical composition according to claim 136 to a subject having the disease or condition.
[Section 141]
141. The method of claim 140, wherein the method increases the amount or activity of a protein or functional RNA in the subject.
[Section 142]
142. The method of claim 140 or 141, wherein the subject has an insufficient amount or activity of protein or functional RNA.
[Section 143]
143. The method of claim 142, wherein insufficient amount or activity of the protein or functional RNA is associated with or causes a disease or condition.
[Section 144]
144. The method of any one of claims 140-143, further comprising administering an agent that inhibits the human silencing hub (HUSH) complex, an agent that inhibits FAM208A, or an agent that inhibits TRIM28.
[Section 145]
145. The method of claim 144, wherein the agent that inhibits the human silencing hub (HUSH) complex is an agent that inhibits perophilin, TASOR, and/or MPP8.
[Section 146]
145. The method of claim 144, wherein the agent that inhibits human silencing hub (HUSH) complex inhibits HUSH complex assembly.
[Section 147]
147. The method of any one of claims 140-146, further comprising administering an agent that inhibits Fanconi anemia complex.

array
[0489] Below are exemplary sequences of constructs used in the Examples. These sequences are for exemplary reference purposes, and variations and optimizations of the sequences that occur to those skilled in the art without undue experimentation are contemplated and encompassed by this disclosure. When a sequence title states an mRNA sequence, the construct describes the nucleotides of a DNA template, and those skilled in the art can easily obtain the corresponding mRNA sequence.

Claims (36)

標的ヒト細胞集団のゲノムに組み込まれたＤＮＡ配列から外来ヒト治療用ポリペプチドを発現させる方法であって、
（ａ）１つもしくは複数のＲＮＡ分子を標的ヒト細胞集団に接触させるステップであって、該１つもしくは複数のＲＮＡ分子は：
（ｉ）挿入配列であって、外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の逆相補鎖であるＲＮＡ配列を含む、挿入配列、および
（ｉｉ）標的をプライマーとする逆転写（ＴＰＲＴ）活性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を含むヒト可動性遺伝因子
を含む、ステップ；
（ｂ）前記ヒト可動性遺伝因子を翻訳してＴＰＲＴ活性を有するポリペプチドを産生させるステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で翻訳されたポリペプチドのＴＰＲＴ活性を介して前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の逆相補鎖であるＲＮＡ配列を逆転写することにより、前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を産生させるステップ；
（ｄ）前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を前記標的ヒト細胞集団の標的ヒト細胞のゲノムＤＮＡ中に標的部位で組み込むステップ；および
（ｅ）ゲノムに組み込まれた外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から前記標的ヒト細胞中で前記外来ヒト治療用ポリペプチドを発現させるステップ
を含み、
ＴＰＲＴ活性を有するポリペプチドは、ヒト長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）１（Ｌ１）ＯＲＦ２ｐポリペプチドまたはその機能性断片を含み、
挿入配列は１００～１２０００塩基長である、方法。 A method for expressing a foreign human therapeutic polypeptide from a DNA sequence integrated into the genome of a target human cell population , the method comprising:
(a) contacting a target human cell population with one or more RNA molecules, wherein the one or more RNA molecules are:
(i) an insertion sequence comprising an RNA sequence that is the reverse complement of a DNA sequence encoding a foreign human therapeutic polypeptide, and
(ii) a human mobile genetic element comprising an RNA sequence encoding a polypeptide with target-primed reverse transcription (TPRT) activity;
a step including;
(b) translating the human mobile genetic element to produce a polypeptide having TPRT activity;
(c) producing said exogenous human therapeutic by reverse transcribing an RNA sequence that is the reverse complement of the DNA sequence encoding said exogenous human therapeutic polypeptide through the TPRT activity of the polypeptide translated in step (b); producing a DNA sequence encoding a polypeptide;
(d) integrating a DNA sequence encoding said exogenous human therapeutic polypeptide into the genomic DNA of a target human cell of said target human cell population at a targeted site; and
(e) expressing the foreign human therapeutic polypeptide in the target human cell from a DNA sequence encoding the foreign human therapeutic polypeptide integrated into the genome;
including ;
The polypeptide having TPRT activity comprises a human long interspersed repeat (LINE) 1 (L1) ORF2p polypeptide or a functional fragment thereof,
A method in which the inserted sequence is 100 to 12,000 bases long . 前記１つもしくは複数のＲＮＡ分子がｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the one or more RNA molecules are mRNA . 前記１つもしくは複数のＲＮＡ分子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ分子、合成ＲＮＡ分子、精製されたＲＮＡ分子、または単離されたＲＮＡ分子である、請求項１または２に記載の方法。3. The method of claim 1 or 2, wherein the one or more RNA molecules are in vitro transcribed, synthetic, purified, or isolated RNA molecules. 前記ＴＰＲＴ活性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ配列が、ＬＩＮＥ１ ＯＲＦ２ｐ逆転写酵素（ＲＴ）を含む、ヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドまたはその機能性断片をコードする、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the RNA sequence encoding a polypeptide having TPRT activity encodes a human ORF2p polypeptide or a functional fragment thereof, including LINE1 ORF2p reverse transcriptase (RT). 前記ＴＰＲＴ活性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ配列が、さらにエンドヌクレアーゼをコードし、該エンドヌクレアーゼはＯＲＦ２ｐエンドヌクレアーゼまたはその断片である、請求項４に記載の方法。5. The method of claim 4, wherein the RNA sequence encoding the polypeptide having TPRT activity further encodes an endonuclease, and the endonuclease is ORF2p endonuclease or a fragment thereof. 前記ＴＰＲＴ活性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ配列が、さらにヒトＯＲＦ１ｐまたはその機能性断片を含むポリペプチドをコードする、請求項４に記載の方法。5. The method according to claim 4, wherein the RNA sequence encoding the polypeptide having TPRT activity further encodes a polypeptide comprising human ORF1p or a functional fragment thereof. 前記ヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドをコードするＲＮＡ配列およびヒトＯＲＦ１ｐポリペプチドをコードするＲＮＡ配列が、単一のＲＮＡ分子上にある、請求項５または６に記載の方法。7. The method of claim 5 or 6, wherein the RNA sequence encoding human ORF2p polypeptide and the RNA sequence encoding human ORF1p polypeptide are on a single RNA molecule. ヒトＯＲＦ１ｐポリペプチドをコードする配列とヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドをコードする配列のコピー数の間の比率が少なくとも２：１である、請求項７に記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the ratio between the copy number of the human ORF1p polypeptide-encoding sequence and the human ORF2p polypeptide-encoding sequence is at least 2:1. 前記１つもしくは複数のＲＮＡ分子が第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子を含み、第１のＲＮＡ分子はヒトＯＲＦ１ｐまたはその機能性断片をコードする配列を含み、第２のＲＮＡ分子はヒトＯＲＦ２ｐまたはその機能性断片をコードする、請求項１または２に記載の方法。The one or more RNA molecules include a first RNA molecule and a second RNA molecule, the first RNA molecule comprising a sequence encoding human ORF1p or a functional fragment thereof, and the second RNA molecule comprising a human 3. The method according to claim 1 or 2, which encodes ORF2p or a functional fragment thereof. 組成物中の第１のＲＮＡ分子の第２のＲＮＡ分子に対する比率が、（ａ）少なくとも２：１である、（ｂ）最大で５：１である、または（ｃ）約３：１である、請求項９に記載の方法。the ratio of first RNA molecules to second RNA molecules in the composition is (a) at least 2:1, (b) at most 5:1, or (c) about 3:1. 10. The method according to claim 9. 前記ヒト可動性遺伝因子が、配列番号５５に少なくとも９０％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする配列を含む、請求項１または２に記載の方法。3. The method of claim 1 or 2, wherein the human mobile genetic element comprises a sequence encoding a polypeptide having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 55. 前記ヒトＯＲＦ１ｐポリペプチドをコードする配列とヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドをコードする配列が、前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の逆相補鎖であるＲＮＡ配列とインフレームではない、請求項６に記載の方法。7. The human ORF1p polypeptide-encoding sequence and the human ORF2p polypeptide-encoding sequence are not in frame with an RNA sequence that is the reverse complement of the DNA sequence encoding the foreign human therapeutic polypeptide. Method described. 前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、さらにプロモーターを含む、請求項１または２に記載の方法。3. The method of claim 1 or 2, wherein the DNA sequence encoding the exogenous human therapeutic polypeptide further comprises a promoter. 前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードする配列が、リガンド、抗体、受容体、酵素、輸送タンパク質、構造タンパク質、ホルモン、収縮タンパク質、貯蔵タンパク質、転写因子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１または２に記載の方法。The sequence encoding the foreign human therapeutic polypeptide may be a ligand, an antibody, a receptor, an enzyme, a transport protein, a structural protein, a hormone, a contractile protein, a storage protein, a transcription factor, a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the method is TCR. 前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードする配列がイントロンを含まない、請求項１または２に記載の方法。3. The method of claim 1 or 2, wherein the sequence encoding the exogenous human therapeutic polypeptide is intron-free. 前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードする配列が、標的部位で前記標的ヒト細胞集団の標的ヒト細胞のゲノムＤＮＡ中にレトロ転移し、標的部位はリボソームＲＮＡ座位ではなく；標的部位は、（ｉ）ゲノムの遺伝子または遺伝子の調節領域であり、それによって遺伝子を破壊するかまたは遺伝子の発現を下方制御する；（ｉｉ）ゲノムの遺伝子または遺伝子の調節領域であり、それによって遺伝子の発現を上方制御する；（ｉｉｉ）ゲノムの遺伝子であり、ゲノムの遺伝子を置き換える；または（ｉｖ）セーフハーバー座位である、請求項１または２に記載の方法。the sequence encoding said foreign human therapeutic polypeptide is retrotransposed into the genomic DNA of a target human cell of said target human cell population at a target site, the target site is not a ribosomal RNA locus; the target site is (i) (ii) a gene of the genome or a regulatory region of a gene, thereby disrupting the gene or downregulating the expression of the gene; (ii) a gene or regulatory region of the gene, thereby upregulating the expression of the gene; (iii) is a genomic gene and replaces a genomic gene; or (iv) is a safe harbor locus. 前記ＲＮＡ配列を含むヒト可動性遺伝因子が、メガＴＡＬヌクレアーゼドメイン、ＴＡＬＥＮドメイン、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質ドメイン、ジンクフィンガー結合ドメイン、またはＡＡＶ由来のＲｅｐ７８等の反復配列に結合するＤＮＡ結合ドメインから選択される、ＯＲＦ２に由来しない異種タンパク質またはその断片に由来するドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１５に記載の方法。The human mobile genetic element comprising said RNA sequence is selected from a mega TAL nuclease domain, a TALEN domain, a CRISPR-Cas protein domain, a zinc finger binding domain, or a DNA binding domain that binds to a repetitive sequence such as Rep78 from AAV. 16. The method of claim 15, further comprising a sequence encoding a domain derived from a heterologous protein not derived from ORF2, or a fragment thereof. 前記異種タンパク質またはその断片に由来するドメインをコードする配列が、特定の標的部位に対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を伴うＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質ドメインをコードする、請求項１７に記載の方法。18. The method of claim 17, wherein the domain-encoding sequence derived from the heterologous protein or fragment thereof encodes a CRISPR-Cas protein domain with a guide RNA (gRNA) directed to a specific target site. 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質ドメインが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、またはＣａｓＹタンパク質由来のエンドヌクレアーゼドメインである、請求項１８に記載の方法。19. The method of claim 18, wherein the CRISPR-Cas protein domain is an endonuclease domain from a Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13, CasX, or CasY protein. 前記ＲＮＡ配列を含むヒト可動性遺伝因子が、異種タンパク質由来のドメインをコードする配列をさらに含み、該異種タンパク質由来のドメインはヒトＯＲＦ２ｐエンドヌクレアーゼドメインに融合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼドメインを含む、請求項１に記載の方法。Claim: the human mobile genetic element comprising the RNA sequence further comprises a sequence encoding a domain derived from a heterologous protein, the domain derived from the heterologous protein comprising a CRISPR-Cas9 endonuclease domain fused to a human ORF2p endonuclease domain. The method described in Section 1. 前記ＯＲＦ２ｐエンドヌクレアーゼドメインが変異を含み、変異はＯＲＦ２ｐエンドヌクレアーゼの活性を低下または抑制する欠失または点変異である、請求項２０に記載の方法。21. The method of claim 20, wherein the ORF2p endonuclease domain comprises a mutation, the mutation being a deletion or point mutation that reduces or suppresses ORF2p endonuclease activity. 変異がＳ２２８Ｐ変異である、請求項２１に記載の方法。22. The method of claim 21, wherein the mutation is the S228P mutation. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼドメインがＣａｓ９ニッカーゼである、請求項２０に記載の方法。21. The method of claim 20, wherein the CRISPR-Cas9 endonuclease domain is Cas9 nickase. 前記ヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドが核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端に、Ｃ末端に、または両方に含む、請求項４に記載の方法。5. The method of claim 4, wherein the human ORF2p polypeptide comprises a nuclear localization sequence (NLS) at the N-terminus, the C-terminus, or both. 前記外来ヒト治療用ポリペプチドが、前記標的ヒト細胞集団の標的ヒト細胞のゲノムＤＮＡから２日よりも長い間にわたり安定的に発現する、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the exogenous human therapeutic polypeptide is stably expressed from genomic DNA of target human cells of the target human cell population for more than two days. 外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のヒト細胞のゲノムへの安定した組み込みのための組成物であって、該組成物は非ＬＴＲレトロトランスポゾン系を含み、該非ＬＴＲレトロトランスポゾン系は、A composition for stable integration of a DNA sequence encoding a foreign human therapeutic polypeptide into the genome of a human cell, the composition comprising a non-LTR retrotransposon system, the non-LTR retrotransposon system comprising:
（ｉ）挿入配列であって、外来ヒト治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の逆相補鎖であるＲＮＡ配列を含む、挿入配列、および(i) an insertion sequence comprising an RNA sequence that is the reverse complement of a DNA sequence encoding a foreign human therapeutic polypeptide, and
（ｉｉ）標的をプライマーとする逆転写（ＴＰＲＴ）活性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を含むヒト可動性遺伝因子(ii) a human mobile genetic element comprising an RNA sequence encoding a polypeptide with target-primed reverse transcription (TPRT) activity;
を含む、１つもしくは複数の組換えｍＲＮＡ分子を含み、one or more recombinant mRNA molecules comprising;
前記ＴＰＲＴ活性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ配列が、ヒトＯＲＦ２ｐ逆転写酵素（ＲＴ）およびエンドヌクレアーゼを含む、ヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドまたはその機能性断片を含むポリペプチドをコードし、the RNA sequence encoding a polypeptide having TPRT activity encodes a polypeptide comprising a human ORF2p polypeptide or a functional fragment thereof, including a human ORF2p reverse transcriptase (RT) and an endonuclease;
挿入配列は１００～１２０００塩基長である、組成物。A composition in which the inserted sequence is 100 to 12,000 bases in length. 前記エンドヌクレアーゼがヒトＬＩＮＥ１ ＯＲＦ２ｐエンドヌクレアーゼである、請求項２６に記載の組成物。27. The composition of claim 26, wherein the endonuclease is human LINE1 ORF2p endonuclease. 前記ＴＰＲＴ活性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡ配列が、さらにヒトＬＩＮＥ１ ＯＲＦ１ｐポリペプチドまたはその機能性断片をコードする、請求項２６に記載の組成物。27. The composition of claim 26, wherein the RNA sequence encoding the polypeptide having TPRT activity further encodes a human LINE1 ORF1p polypeptide or a functional fragment thereof. ５’ＵＴＲ配列および該５’ＵＴＲ配列の下流にある３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項２６に記載の組成物であって；該５’ＵＴＲ配列または該３’ＵＴＲ配列はヒトＬＩＮＥ１ ＯＲＦ２ｐポリペプチドまたはヒトＬＩＮＥ１ ＯＲＦ１ｐポリペプチドまたはその機能性断片のための結合部位を含む、組成物。27. The composition of claim 26, further comprising a 5'UTR sequence and a 3'UTR sequence downstream of the 5'UTR sequence; wherein the 5'UTR sequence or the 3'UTR sequence A composition comprising a binding site for a peptide or human LINE1 ORF1p polypeptide or functional fragment thereof. ヒトＬＩＮＥ１ ＯＲＦ２ｐポリペプチドまたはその機能性断片を含むポリペプチドをコードするＲＮＡ配列と、ヒトＯＲＦ１ｐポリペプチドまたはその機能性断片を含むポリペプチドをコードするＲＮＡ配列とが単一のＲＮＡ分子上にあり、ヒトＯＲＦ１ｐポリペプチドをコードする配列とヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドをコードする配列のコピー数の間の比率が少なくとも２：１である、請求項２９に記載の組成物。An RNA sequence encoding a polypeptide comprising the human LINE1 ORF2p polypeptide or a functional fragment thereof and an RNA sequence encoding a polypeptide comprising the human ORF1p polypeptide or a functional fragment thereof are on a single RNA molecule, 30. The composition of claim 29, wherein the ratio between the copy number of the human ORF1p polypeptide-encoding sequence and the human ORF2p polypeptide-encoding sequence is at least 2:1. ヒトＬＩＮＥ１ ＯＲＦ２ｐポリペプチドまたはその機能性断片を含むポリペプチドをコードする配列と、ヒトＯＲＦ１ｐポリペプチドまたはその機能性断片を含むポリペプチドをコードするＲＮＡ配列とがリンカー配列によって分離され、該リンカー配列はＴ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＰ２Ａ配列をコードする、請求項３０に記載の組成物。A sequence encoding a polypeptide comprising the human LINE1 ORF2p polypeptide or a functional fragment thereof and an RNA sequence encoding a polypeptide comprising the human ORF1p polypeptide or a functional fragment thereof are separated by a linker sequence, and the linker sequence 31. The composition of claim 30, encoding a T2A, E2A, or P2A sequence. 前記１つもしくは複数の組換えｍＲＮＡ分子が第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子を含み、第１のＲＮＡ分子はヒトＯＲＦ１ｐポリペプチドまたはその機能性断片をコードする配列を含み、第２のＲＮＡ分子はヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドまたはその機能性断片をコードし、組成物中の第１のＲＮＡ分子の第２のＲＮＡ分子に対する比率が、（ａ）少なくとも２：１である、（ｂ）最大で５：１である、または（ｃ）約３：１である、請求項２６に記載の組成物。The one or more recombinant mRNA molecules comprise a first RNA molecule and a second RNA molecule, the first RNA molecule comprising a sequence encoding a human ORF1p polypeptide or a functional fragment thereof; The RNA molecule encodes a human ORF2p polypeptide or a functional fragment thereof, and the ratio of the first RNA molecule to the second RNA molecule in the composition is (a) at least 2:1, (b) at most 27. The composition of claim 26, wherein the ratio is 5:1, or (c) about 3:1. 前記ヒト可動性遺伝因子が、配列番号５５に少なくとも９０％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする配列を含む、請求項２６に記載の組成物。27. The composition of claim 26, wherein the human mobile genetic element comprises a sequence encoding a polypeptide having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 55. 前記ヒト可動性遺伝因子が、配列番号５３に少なくとも９０％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする配列を含む、請求項２６に記載の組成物。27. The composition of claim 26, wherein the human mobile genetic element comprises a sequence encoding a polypeptide having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 53. 前記ヒトＯＲＦ２ｐポリペプチドが核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端に、Ｃ末端に、または両方に含む、請求項２６に記載の組成物。27. The composition of claim 26, wherein the human ORF2p polypeptide comprises a nuclear localization sequence (NLS) at the N-terminus, the C-terminus, or both. 前記外来ヒト治療用ポリペプチドをコードする配列が、リガンド、抗体、受容体、酵素、輸送タンパク質、構造タンパク質、ホルモン、収縮タンパク質、貯蔵タンパク質、転写因子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項２６に記載の組成物。The sequence encoding the foreign human therapeutic polypeptide may be a ligand, an antibody, a receptor, an enzyme, a transport protein, a structural protein, a hormone, a contractile protein, a storage protein, a transcription factor, a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor. 27. The composition according to claim 26, wherein the composition is TCR.
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