JPWO2021032060A5

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Publication number: JPWO2021032060A5
Application number: JP2021514525A
Authority: JP
Publication date: 2023-02-07
Anticipated expiration: 2040-08-17

Description

本発明者らは、一実施形態では、酵素的および／または化学的変換、あるいはタンパク質および／または抗体結合などの鋳型ＤＮＡの前処理なしで、核酸中の５ｍＣなどの塩基修飾の決定を可能にする新しい方法を開発した。そのような鋳型ＤＮＡの前処理は、塩基修飾の決定に必要ではないが、示される実施例において、特定の前処理（例えば、制限酵素による消化）は、本発明の態様を強化するのに役立つ可能性がある（例えば、分析のためのＣｐＧ部位の濃縮を可能にする）。本開示に存在する実施形態は、例えば、限定されないが、４ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、および５ｃａＣ、１ｍＡ、３ｍＡ、７ｍＡ、３ｍＣ、２ｍＧ、６ｍＧ、７ｍＧ、３ｍＴおよび４ｍＴなどを含む、異なるタイプの塩基修飾を検出するために使用され得る。そのような実施形態は、様々な塩基修飾によって影響を受ける動態特徴などの配列決定に由来する特徴、ならびにメチル化状態が決定される標的位置周囲のウィンドウにおけるヌクレオチドの識別（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を利用することができる。

本発明の実施形態は、限定されないが、単一分子配列決定に使用することができる。単一分子配列決定の１つのタイプは、単一ＤＮＡ分子の配列決定の進行状況をリアルタイムで監視する単一分子リアルタイム配列決定である。単一分子リアルタイム配列決定の１つのタイプは、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）システムを使用して商品化されたものである。方法は、塩基または近傍の塩基の修飾を検出するために、配列決定塩基からの信号のパルス幅、塩基のパルス間隔（ｉｎｔｅｒｐｕｌｓｅｄｕｒａｔｉｏｎ、ＩＰＤ）、および塩基の識別（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を使用することができる。別の単一分子システムは、ナノポア配列決定に基づくシステムである。ナノポア配列決定システムの一例は、ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって、商品化されたものである。

Ｃ．他の数学／統計モデル
別の実施形態では、例えば、限定されないが、ランダムフォレストおよびロジスティック回帰を含む他の数学的／統計モデルは、上記の開発された特徴を適応することによって訓練することができる。ＣＮＮモデルに関して、訓練データセットおよび試験データセットは、ランダムフォレストを訓練するのに使用されたＭ．ＳｓｓＩ処理（メチル化）およびＰＣＲ増幅（非メチル化）を用いて、ＤＮＡから構築された（Ｂｒｅｉｍａｎ，２００１）。このランダムフォレスト分析では、６つの特徴：ＩＰＤ、ＰＷ、および塩基識別（ｂａｓｅｉｄｅｎｔｉｔｙ）をコードする４成分のバイナリベクトルを用いて、各ヌクレオチドについて説明した。このようなバイナリベクトルでは、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、それぞれ、［１，０，０，０］、［０，１，０，０］、［０，０，１，０］、および［０，０，０，１］でコードされる。本発明者らは、分析される各ＣｐＧ部位について、両方の鎖のその１０ｎｔ上流と下流の情報を組み込んで、各特徴が１つの次元を表す２５２次元（２５２Ｄ）のベクトルを形成した。２５２Ｄベクトルを有する上に記載の訓練データセットを使用して、ランダムフォレストモデルならびにロジスティック回帰モデルを訓練した。訓練されたモデルは、独立した試験データセットのメチル化状態を予測するために使用された。ランダムフォレストは、１００本の決定木で構成された。ツリーの構築中に、ブートストラップ試料が使用された。各決定木のノードを分割する際、最適な分割を決定するためにジニ不純度を使用し、各分割で、最大１５の特徴が考慮される。また、決定木の各リーフには、少なくとも６０試料を含有する必要があった。

各第１のデータ構造には、ウィンドウ内の特性についての値が含まれる。特性は、ウィンドウ内の各ヌクレオチドについてのものであり得る。特性は、ヌクレオチドの識別（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を含み得る。識別（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）を含み得る。特性はまた、それぞれのウィンドウ内の標的位置に対するヌクレオチドの位置を含み得る。例えば、位置は、標的位置に対するヌクレオチドの距離であり得る。ヌクレオチドが標的位置からある方向へ１ヌクレオチド離れている場合、位置は＋１であり得、ヌクレオチドが標的位置から反対方向へ１ヌクレオチド離れている場合、位置は－１であり得る。

Claims

核酸分子におけるヌクレオチドの修飾を検出するための方法であって、
（ａ）試料核酸分子で配列決定されたヌクレオチドに対応する光信号のパルスを測定することによって得られるデータを受信し、前記データから、以下の特性：
各ヌクレオチドについての
前記ヌクレオチドの識別、
前記試料核酸分子内の前記ヌクレオチドの位置、
前記ヌクレオチドに対応する前記パルスの幅、および
前記ヌクレオチドに対応する前記パルスと近傍のヌクレオチドに対応するパルスとの間の時間を表すパルス間隔、
についての値を得ること；
（ｂ）入力データ構造を作成することであって、入力データ構造は前記試料核酸分子で配列決定された前記ヌクレオチドのウィンドウを含み、ここで前記入力データ構造が、前記ウィンドウ内の各ヌクレオチドについての、以下の特性：
前記ヌクレオチドの前記識別、
前記ウィンドウ内の標的位置に対する前記ヌクレオチドの位置、
前記ヌクレオチドに対応する前記パルスの幅、および
前記パルス間隔、
を含む、作成することと；
（ｃ）前記入力データ構造をモデルに入力することであって、前記モデルは、
第１の複数の第１のデータ構造を受信することであって、前記第１の複数の第１のデータ構造の各第１のデータ構造が、複数の第１の核酸分子のそれぞれの核酸分子において配列決定されたヌクレオチドのそれぞれのウィンドウに対応し、前記第１の核酸分子の各々は、前記ヌクレオチドに対応する前記光信号のパルスを測定することによって配列決定され、前記修飾は、各第１の核酸分子の各ウィンドウにおける標的位置のヌクレオチドの既知の第１の状態を有し、各第１のデータ構造が、前記入力データ構造と同じ特性についての値を含む、受信すること、
複数の第１の訓練試料を記憶することであって、各々が、前記第１の複数の第１のデータ構造のうちの１つと、前記標的位置の前記ヌクレオチドの前記第１の状態を示す第１のラベルとを含む、記憶すること、および、
前記第１の複数の第１のデータ構造が前記モデルに入力されたとき、前記複数の第１の訓練試料を使用して、前記第１のラベルの対応するラベルに一致するかまたは一致しない前記モデルの出力に基づいて前記モデルのパラメータを最適化することであって、前記モデルの出力は、前記それぞれのウィンドウにおける前記標的位置の前記ヌクレオチドが前記修飾を有するかどうかを指定する、最適化すること、によって訓練される、入力することと；並びに
（ｄ）前記モデルを使用して、前記入力データ構造の前記ウィンドウ内の前記標的位置のヌクレオチドに前記修飾が存在するかどうかを決定することと、を含む、方法。
前記入力データ構造は、複数の入力データ構造のうちの１つの入力データ構造であり、
前記試料核酸分子は、複数の試料核酸分子のうちの１つの試料核酸分子であり、
前記複数の試料核酸分子は、対象の生体試料から取得され、
各入力データ構造は、前記複数の試料核酸分子のそれぞれの試料核酸分子における配列決定されたヌクレオチドのそれぞれのウィンドウに対応し、
前記方法が、
前記複数の入力データ構造を受信することと、
前記複数の入力データ構造を前記モデルに入力することと、
前記モデルを使用して、各入力データ構造の前記それぞれのウィンドウにおける標的位置のヌクレオチドに修飾が存在するかどうかを決定することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記修飾が１つ以上のヌクレオチドに存在することを決定することと、
１つ以上のヌクレオチドの前記修飾の存在を使用して、障害の分類を割り当てることと、をさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記障害が、癌を含む、請求項３に記載の方法。
前記障害の前記分類は、前記対象が前記障害を有することであると割り当てること、
をさらに含む、請求項３又は４に記載の方法。
前記修飾の数または前記修飾の部位を使用して、前記障害の前記分類を割り当てる、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
前記修飾が、メチル化である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記メチル化が、４ｍＣ（Ｎ４－メチルシトシン）、５ｍＣ（５－メチルシトシン）、、５ｈｍＣ（５－ヒドロキシメチルシトシン）、５ｆＣ（５－ホルミルシトシン）、５ｃａＣ（５－カルボキシルシトシン）、１ｍＡ（Ｎ１－メチルアデニン）、３ｍＡ（Ｎ３－メチルアデニン）、６ｍＡ（Ｎ６－メチルアデニン）、７ｍＡ（Ｎ７－メチルアデニン）、３ｍＣ（Ｎ３－メチルシトシン）、２ｍＧ（Ｎ２－メチルグアニン）、６ｍＧ（Ｏ６－メチルグアニン）、７ｍＧ（Ｎ７－メチルグアニン）、３ｍＴ（Ｎ３－メチルチミン）、又は４ｍＴ（Ｏ４－メチルチミン）を含む、請求項７に記載の方法。
前記メチル化が、５ｍＣである、請求項７に記載の方法。
前記メチル化が、６ｍＡである、請求項７に記載の方法。
前記修飾がメチル化であって、前記方法が：
前記修飾が１つ以上のヌクレオチドに存在するかどうかのメチル化状態を決定することと、
前記１つ以上のヌクレオチドの前記メチル化状態を使用して、臨床関連のＤＮＡ画分、胎児のメチル化プロファイル、母体のメチル化プロファイル、インプリント遺伝子領域の存在、または起源の組織を決定することと、をさらに含む、請求項２に記載の方法。
請求項１１に記載の方法であって、ここで：
前記方法は、起源の組織を決定することを含み、
起源の組織を決定することは、試料核酸分子が胎児または母体起源であるかどうかを決定することを含む、方法。
試料核酸分子が胎児または母体起源であるかどうかを決定することが：
前記１つ以上のヌクレオチドの前記メチル化状態を使用して前記試料核酸分子のメチル化レベルを決定すること、および
前記試料核酸分子のメチル化レベルを参照値と比較すること
を含む、請求項１２に記載の方法。
前記参照値が、１つ以上の母体核酸分子のメチル化レベルから決定される、請求項１３に記載の方法。
請求項１３に記載の方法であって、ここで：
前記試料核酸分子の前記メチル化レベルを前記参照値と比較することは、前記試料核酸分子の前記メチル化レベルが、前記参照値よりも低いことを決定することを含み、
前記試料核酸分子が胎児または母体起源であるかどうかを決定することは、比較を用いて前記試料核酸分子が胎児起源であるかを決定することを含む、
方法。
請求項２記載の方法であって、前記修飾がメチル化であり、前記方法がさらに：
複数の試料核酸分子の各試料核酸分子を、ゲノムの領域に整列するものとして同定すること；
前記モデルを使用して、前記修飾が前記複数の試料核酸分子の各試料核酸分子の１つ以上のヌクレオチドに存在するかどうかについてメチル化状態を決定すること；
前記複数の試料核酸分子の前記１つ以上のヌクレオチドの複数のメチル化状態を使用して、前記ゲノムの領域のメチル化レベルを決定すること；及び
前記メチル化レベルを使用して、コピー数異常が前記ゲノムの領域に存在するかどうかを決定すること、
を含む、方法。
前記領域のメチル化レベルを参照レベルと比較することをさらに含み、ここでコピー数異常が前記ゲノムの領域に存在するかどうかを決定することが、比較を使用することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記参照レベルが、同じタイプのコピー数異常のない領域を使用して決定される、請求項１７に記載の方法。
請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法であって、前記領域が染色体であり、前記対象が胎児を妊娠している女性対象であり、前記方法は、さらに：
コピー数異常が存在することを決定すること、及び
前記胎児が染色体異数性を有することを決定すること、
を含む、方法。
前記複数の試料核酸分子の各試料核酸分子が、カットオフサイズよりも大きいサイズを有する、請求項２～１９のいずれか１項に記載の方法。
前記ウィンドウ内の前記ヌクレオチドが、循環コンセンサス配列を使用して、前記配列決定されたヌクレオチドを参照ゲノムに整列させることなく決定される、１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記ウィンドウ内のヌクレオチドが、循環コンセンサス配列を使用することなく、かつ前記配列決定されたヌクレオチドを参照ゲノムに整列させることなく決定される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の試料核酸分子が、複数のゲノム領域に整列し、
前記複数のゲノム領域の各ゲノム領域について
いくつかの試料核酸分子が、前記ゲノム領域に整列され、
試料核酸分子の数がカットオフ数よりも大きい、請求項２～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記モデルには、機械学習モデル、主成分分析、畳み込みニューラルネットワーク、またはロジスティック回帰が含まれる、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
前記入力データ構造に対応するヌクレオチドの前記ウィンドウは、前記試料核酸分子の第１の鎖上のヌクレオチドおよび前記試料核酸分子の第２の鎖上のヌクレオチドを含み、
前記入力データ構造は、前記ウィンドウ内の各ヌクレオチドについて、鎖特性の値をさらに含み、前記鎖特性は、前記ヌクレオチドが前記第１の鎖または前記第２の鎖のいずれかに存在することを示す、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
前記試料核酸分子が、環状ＤＮＡ分子であり、
Ｃａｓ９複合体を使用して二本鎖ＤＮＡ分子を切断して、切断された二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
前記切断された二本鎖ＤＮＡ分子の末端にヘアピンアダプターを連結すること、によって形成される、請求項２５に記載の方法。
前記ウィンドウ内の各ヌクレオチドが、濃縮またはフィルタリングされる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
前記ウィンドウ内の各ヌクレオチドが、
Ｃａｓ９複合体を使用して二本鎖ＤＮＡ分子を切断して、切断された二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、前記切断された二本鎖ＤＮＡ分子の末端にヘアピンアダプターを連結することによって濃縮されるか、または
サイズ範囲のサイズを有する二本鎖ＤＮＡ分子を選択することによってフィルタリングされる、請求項２７に記載の方法。
前記光信号は、色素標識ヌクレオチドからの蛍光信号である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の複数の第１のデータ構造に関連する各ウィンドウは、各第１の核酸分子の第１の鎖上の少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、メチル化の存在を使用して、前記試料核酸分子の組織起源を検出するか、またはキメラおよびハイブリッドＤＮＡを特定することをさらに含み、前記試料核酸分子が前記対象から得られる、方法。
前記複数の第１の核酸分子のうちの少なくともいくつかは、各々、第１の参照配列に対応する第１の箇所と、前記第１の参照配列とは異なる第２の参照配列に対応する第２の箇所とを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
複数のキメラ核酸分子を使用して前記モデルを検証することをさらに含み、各々が、第１の参照配列に対応する第１の箇所と、第２の参照配列に対応する第２の箇所とを含み、前記第１の箇所が第１のメチル化パターンを有し、前記第２の箇所が第２のメチル化パターンを有する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の箇所は、メチラーゼで処理される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
前記第２の箇所は、前記第２の参照配列の非メチル化箇所に対応する、請求項３４に記載の方法。
前記第１の参照配列は、ヒトであり、前記第２の参照配列は、異なる動物に由来する、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
前記ウィンドウが、前記ウィンドウ内の標的位置の少なくとも３ヌクレオチド上流を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
前記試料核酸分子の配列決定をさらに含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
試料核酸分子の配列決定が、前記試料核酸分子中のヌクレオチドに対応する光信号のパルスを測定することを含む、請求項３８に記載の方法。
コンピュータシステムによって実行されると、前記コンピュータシステムに請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法を実行させる複数の命令を格納するコンピュータ可読媒体。
少なくとも１つの記憶装置；
少なくとも１つの記憶装置に記憶された複数の命令；及び
請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法を実行するために、複数の命令の少なくともいくつかによってプログラムされた少なくとも１つのプロセッサ
を含む、コンピュータシステム。