JPWO2020247812A5 - - Google Patents
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Description
結論として、ｈＦＩＸは、１、３、および４週間でＡｌｂ＋／ｈｕ／Ｆ９－／－マウスの血漿において検出され、トロンビンがＴＧＡアッセイにおいて生成され、ａＰＴＴ凝固時間が改善されたため、発現されたｈＦＩＸ－Ｒ３３８Ｌは機能的であることがわかった。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
非ヒト動物であって、そのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含み、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、非ヒト動物。
（項目２）
前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒト血清アルブミンペプチドを含むタンパク質をコードする、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒトアルブミンプロペプチドを含むタンパク質をコードする、項目１または２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒトアルブミンシグナルペプチドを含むタンパク質をコードする、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目５）
コード配列および非コード配列の両方を含む前記内因性アルブミン遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、前記内因性アルブミンプロモーターを含み、前記ヒトアルブミン配列が、前記内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエキソンが削除され、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記内因性アルブミン遺伝子座の全アルブミンコード配列が削除され、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目９）
開始コドンから終止コドンまでの前記内因性アルブミン遺伝子座の前記領域が削除され、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、項目８に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒトアルブミン３’非翻訳領域を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
内因性アルブミン５’非翻訳領域が削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられていない、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記開始コドンから前記終止コドンまでの前記内因性アルブミン遺伝子座の前記領域が削除され、前記対応するヒトアルブミン配列およびヒトアルブミン３’非翻訳領域を含むヒトアルブミン配列で置き換えられており、かつ
前記内因性アルブミン５’非翻訳領域が削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられておらず、かつ
前記内因性アルブミンプロモーターが削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられていない、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
（ｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座におけるヒトアルブミン配列が、配列番号３５に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むか、または
（ｉｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号５に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％同一の配列を含むタンパク質をコードし、
（ｉｉｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号１３に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含むか、または
（ｉｖ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号１７もしくは１８に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含まない、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてホモ接合性である、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
前記非ヒト動物が、その生殖系列において前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
前記非ヒト動物が哺乳動物である、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
前記非ヒト動物がラットまたはマウスである、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記非ヒト動物がマウスである、項目１８に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてホモ接合性である、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２１）
前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてヘテロ接合性である、項目１～１９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２２）
前記非ヒト動物が、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンレベルを含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２３）
前記非ヒト動物における血清アルブミンレベルが、野生型アルブミン遺伝子座を含む対照非ヒト動物における血清アルブミンレベルと少なくとも同じくらい高い、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２４）
前記非ヒト動物が、前記非ヒト動物の１つ以上の細胞内の前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた外因性タンパク質のコード配列をさらに含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２５）
前記外因性タンパク質の前記コード配列が、前記非ヒト動物の前記１つ以上の細胞内の前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の前記少なくとも１つの対立遺伝子のイントロン１に組み込まれている、項目２４に記載の非ヒト動物。
（項目２６）
前記非ヒト動物が、前記内因性アルブミン遺伝子座ではない不活化された内因性遺伝子座をさらに含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２７）
前記非ヒト動物が、前記非ヒト動物の１つ以上の細胞内の前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた外因性タンパク質のコード配列をさらに含み、前記外因性タンパク質が、前記不活化された内因性遺伝子座の機能を置き換える、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２８）
前記不活化された内因性遺伝子座が、不活化されたＦ９遺伝子座である、項目２６または２７に記載の非ヒト動物。
（項目２９）
非ヒト動物細胞であって、そのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含み、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、非ヒト動物細胞。
（項目３０）
ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、非ヒト動物ゲノム。
（項目３１）
ヒト化非ヒト動物アルブミン遺伝子であって、前記非ヒトアルブミン遺伝子のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物アルブミン遺伝子。
（項目３２）
ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられており、前記標的化ベクターが、前記内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する対応するヒトアルブミン配列を含む挿入核酸を含む、標的化ベクター。
（項目３３）
インビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価する方法であって、
（ａ）項目１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトアルブミン標的化試薬を投与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することと、を含む、方法。
（項目３４）
前記投与が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、または流体力学的送達（ＨＤＤ）を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記投与が、ＬＮＰ媒介送達を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ＬＮＰ用量が、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記投与が、ＡＡＶ８媒介送達を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から肝臓を単離することと、前記肝臓における前記ヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することとを含む、項目３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記ヒトアルブミン標的化試薬が、ゲノム編集剤であり、前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の修飾を評価することを含む、項目３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、項目３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質の発現を測定することを含む、項目３３～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記アルブミンタンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物における前記アルブミンタンパク質の血清レベルを測定することを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記アルブミンタンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物の前記肝臓における前記アルブミンタンパク質の発現を測定することを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記ヒトアルブミン標的化試薬が、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含み、前記ヌクレアーゼ剤が、ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されている、項目３３～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質および前記ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１にある、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ヒトアルブミン標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含み、前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されており、任意選択で、前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶを介して送達される、項目３３～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記外因性ドナー核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記外因性ドナー核酸が、相同性アームを含まない、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５２）
前記外因性ドナー核酸が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５３）
前記５’標的配列および前記３’標的配列の各々が、前記ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１のセグメントを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記外因性ドナー核酸が、外因性タンパク質をコードする、項目４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされる前記タンパク質が、前記外因性タンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記外因性タンパク質が、第ＩＸ因子タンパク質である、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５７）
前記評価が、前記非ヒト動物における第ＩＸ因子タンパク質の血清レベルを測定することを含み、かつ／または活性化部分トロンボプラスチン時間を評価すること、もしくはトロンビン生成アッセイを行うことを含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ヒトアルブミン標的化試薬が、（１）ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤、および（２）外因性ドナー核酸を含み、
前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されており、
前記外因性ドナー核酸が、外因性タンパク質をコードし、
前記外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされる前記タンパク質が、前記外因性タンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である、項目３３～５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記評価が、前記外因性ドナー核酸によってコードされるメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、項目５４～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記評価が、単一細胞分解能で前記外因性ドナー核酸によってコードされる前記メッセンジャーＲＮＡの発現を定量化するためのインサイチュハイブリダイゼーションアッセイを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記評価が、前記非ヒト動物の前記肝臓由来の複数の葉における前記外因性ドナー核酸によってコードされる前記メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、項目５９または６０に記載の方法。
（項目６２）
前記評価が、前記外因性タンパク質の発現を測定することを含む、項目５４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記異種タンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物における前記異種タンパク質の血清レベルを測定することを含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記異種タンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物の前記肝臓における発現を測定することを含む、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
インビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価する方法であって、
（Ｉ）項目３３～６４のいずれか一項に記載の方法を、そのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において、１回目に実行することと、
（ＩＩ）可変要素を変更し、ステップ（Ｉ）の前記方法を、ゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、変更された可変要素を用いて２回目に実行することと、
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトアルブミン標的化試薬の前記活性を、ステップ（ＩＩ）の前記ヒトアルブミン標的化試薬の前記活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含む、方法。
（項目６６）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトアルブミン標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記投与が、ＬＮＰ媒介送達を含み、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素が、ＬＮＰ製剤である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトアルブミン標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目６５に記載の方法。
（項目６９）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬の濃度または量である、項目６５に記載の方法。
（項目７０）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬の形態である、項目６５に記載の方法。
（項目７１）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬である、項目６５に記載の方法。
（項目７２）
前記ヒトアルブミン標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを含み、前記ガイドＲＮＡが、ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されている、項目６５に記載の方法。
（項目７３）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ガイドＲＮＡ配列または前記ガイドＲＮＡ標的配列である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記ヒトアルブミン標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの比である、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、ガイドＲＮＡ修飾である、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記ヒトアルブミン標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含む、項目６５に記載の方法。
（項目７７）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記外因性ドナー核酸の形態である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記外因性ドナー核酸が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記５’相同性アームの配列もしくは長さおよび／または前記３’相同性アームの配列もしくは長さである、項目７６に記載の方法。
（項目７９）
項目１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物の胚性幹（ＥＳ）細胞に、
（ｉ）ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が、前記内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とする、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸、ならびに
（ｉｉ）前記内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび前記内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む、標的化ベクターであって、
前記標的化ベクターが、前記内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を産生する、標的化ベクターを導入することと、
（ｂ）前記遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
（ｃ）代理母において前記非ヒト動物宿主胚を懐胎させることであって、前記代理母が、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、懐胎させることと、を含む、方法。
（項目８０）
前記標的化ベクターが少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または前記５’および３’相同性アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
項目１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物の１細胞期胚に、
（ｉ）ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が、前記内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とする、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸、ならびに
（ｉｉ）前記内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび前記内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む、標的化ベクターであって、
前記標的化ベクターが、前記内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒト１細胞期胚を産生する、標的化ベクターを導入することと、
（ｂ）代理母において前記遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させて、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾されたＦ０世代の非ヒト動物を産生することと、を含む、方法。
（項目８２）
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、項目７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
ステップ（ａ）が、前記内因性アルブミン遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
前記非ヒト動物が、マウスまたはラットである、項目７９～８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
項目１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（Ｉ）（ａ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように、多能性非ヒト動物細胞のゲノムを修飾することと、
（ｂ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む前記遺伝子修飾された多能性非ヒト動物細胞を同定または選択することと、
（ｃ）前記遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
（ｄ）代理母に前記非ヒト動物宿主胚を懐胎させることと、を含むか、または
（ＩＩ）（ａ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように、非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを修飾することと、
（ｂ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む前記遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を選択することと、
（ｃ）代理母に前記遺伝子改変された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させることを含む、方法。
In conclusion, hFIX was detected in the plasma of Alb +/hu /F9 −/− mice at 1, 3, and 4 weeks, thrombin was generated in the TGA assay, and the aPTT clotting time was improved, thus the expressed hFIX -R338L was found to be functional.
The present invention provides, for example, the following items.
(Item 1)
A non-human animal comprising a humanized endogenous albumin locus in its genome, wherein a segment of said endogenous albumin locus has been deleted and replaced with the corresponding human albumin sequence.
(Item 2)
2. The non-human animal of item 1, wherein said humanized endogenous albumin locus encodes a protein comprising a human serum albumin peptide.
(Item 3)
3. The non-human animal of item 1 or 2, wherein said humanized endogenous albumin locus encodes a protein comprising a human albumin propeptide.
(Item 4)
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein said humanized endogenous albumin locus encodes a protein comprising a human albumin signal peptide.
(Item 5)
Any one of the preceding items, wherein a region of said endogenous albumin locus comprising both coding and non-coding sequences has been deleted and replaced with a corresponding human albumin sequence comprising both coding and non-coding sequences. Non-human animals as described in .
(Item 6)
4. The non-human of any one of the preceding items, wherein said humanized endogenous albumin locus comprises said endogenous albumin promoter, and wherein said human albumin sequence is operably linked to said endogenous albumin promoter. animal.
(Item 7)
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein at least one intron and at least one exon of said endogenous albumin locus have been deleted and replaced with said corresponding human albumin sequence.
(Item 8)
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein the entire albumin coding sequence of said endogenous albumin locus has been deleted and replaced with said corresponding human albumin sequence.
(Item 9)
9. The non-human animal of item 8, wherein said region of said endogenous albumin locus from start codon to stop codon is deleted and replaced with said corresponding human albumin sequence.
(Item 10)
The non-human animal of any one of the preceding items, wherein said humanized endogenous albumin locus comprises a human albumin 3' untranslated region.
(Item 11)
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein the endogenous albumin 5' untranslated region has not been deleted and replaced with said corresponding human albumin sequence.
(Item 12)
said region of said endogenous albumin locus from said start codon to said stop codon has been deleted and replaced with a human albumin sequence comprising said corresponding human albumin sequence and a human albumin 3' untranslated region; and
the endogenous albumin 5' untranslated region has not been deleted and replaced with the corresponding human albumin sequence, and
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein said endogenous albumin promoter has not been deleted and replaced with said corresponding human albumin sequence.
(Item 13)
(i) the human albumin sequence at said humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% the sequence set forth in SEQ ID NO: 35; contain 100% identical sequences, or
(ii) said humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 100% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO:5 encodes a protein containing the sequence of
(iii) said humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 13; contains a code sequence containing an array, or
(iv) the humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% the sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 18; A non-human animal according to any one of the preceding items, comprising identical sequences.
(Item 14)
A non-human animal according to any one of the preceding items, wherein said humanized endogenous albumin locus does not comprise a selection cassette or reporter gene.
(Item 15)
3. A non-human animal according to any one of the preceding items, wherein said non-human animal is homozygous for said humanized endogenous albumin locus.
(Item 16)
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein said non-human animal comprises said humanized endogenous albumin locus in its germline.
(Item 17)
A non-human animal according to any one of the preceding items, wherein said non-human animal is a mammal.
(Item 18)
18. The non-human animal of item 17, wherein said non-human animal is a rat or mouse.
(Item 19)
19. The non-human animal of item 18, wherein said non-human animal is a mouse.
(Item 20)
3. A non-human animal according to any one of the preceding items, wherein said non-human animal is homozygous for said humanized endogenous albumin locus.
(Item 21)
20. The non-human animal of any one of items 1-19, wherein said non-human animal is heterozygous for said humanized endogenous albumin locus.
(Item 22)
The non-human animal of any one of the preceding items, wherein said non-human animal comprises a serum albumin level of at least about 10 mg/mL.
(Item 23)
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein serum albumin levels in said non-human animal are at least as high as serum albumin levels in control non-human animals comprising a wild-type albumin locus.
(Item 24)
Any of the preceding items, wherein said non-human animal further comprises an exogenous protein coding sequence integrated into at least one allele of said humanized endogenous albumin locus in one or more cells of said non-human animal. or the non-human animal according to item 1.
(Item 25)
25, wherein said coding sequence for said exogenous protein is integrated into intron 1 of said at least one allele of said humanized endogenous albumin locus in said one or more cells of said non-human animal; Non-human animals as described.
(Item 26)
3. The non-human animal of any one of the preceding items, wherein said non-human animal further comprises an inactivated endogenous locus that is not said endogenous albumin locus.
(Item 27)
said non-human animal further comprising a coding sequence for an exogenous protein integrated into at least one allele of said humanized endogenous albumin locus in one or more cells of said non-human animal, said exogenous protein replaces the function of said inactivated endogenous locus.
(Item 28)
28. The non-human animal of items 26 or 27, wherein said inactivated endogenous locus is an inactivated F9 locus.
(Item 29)
A non-human animal cell comprising a humanized endogenous albumin locus in its genome, wherein a segment of said endogenous albumin locus has been deleted and replaced with the corresponding human albumin sequence.
(Item 30)
A non-human animal genome comprising a humanized endogenous albumin locus, wherein a segment of said endogenous albumin locus has been deleted and replaced with the corresponding human albumin sequence.
(Item 31)
A humanized non-human animal albumin gene, wherein a segment of said non-human albumin gene has been deleted and replaced with the corresponding human albumin sequence.
(Item 32)
A targeting vector for generating a humanized endogenous albumin locus, wherein a segment of said endogenous albumin locus has been deleted and replaced with a corresponding human albumin sequence, said targeting vector generating said endogenous an insert comprising the corresponding human albumin sequence flanked by a 5' homology arm targeting the 5' target sequence of the sex albumin locus and a 3' homology arm targeting the 3' target sequence of said endogenous albumin locus. A targeting vector comprising a nucleic acid.
(Item 33)
A method for evaluating the activity of a human albumin targeting reagent in vivo, comprising:
(a) administering the human albumin targeting reagent to the non-human animal of any one of items 1-28;
(b) evaluating the activity of said human albumin-targeted reagent in said non-human animal.
(Item 34)
34. The method of item 33, wherein said administration comprises adeno-associated virus (AAV)-mediated delivery, lipid nanoparticle (LNP)-mediated delivery, or hydrodynamic delivery (HDD).
(Item 35)
35. The method of item 34, wherein said administering comprises LNP-mediated delivery.
(Item 36)
36. The method of item 35, wherein the LNP dose is from about 0.1 mg/kg to about 2 mg/kg.
(Item 37)
35. The method of item 34, wherein said administering comprises AAV8-mediated delivery.
(Item 38)
38. The method of any one of items 33-37, wherein step (b) comprises isolating liver from said non-human animal and assessing activity of said human albumin targeting reagent in said liver. Method.
(Item 39)
39. The method of any one of items 33-38, wherein said human albumin targeting reagent is a genome editing agent and said evaluating comprises evaluating modifications of said humanized endogenous albumin locus.
(Item 40)
40. The method of item 39, wherein said evaluating comprises measuring the frequency of insertions or deletions within said humanized endogenous albumin locus.
(Item 41)
41. The method of any one of items 33-40, wherein said evaluating comprises measuring expression of albumin messenger RNA encoded by said humanized endogenous albumin locus.
(Item 42)
42. The method of any one of items 33-41, wherein said evaluating comprises measuring expression of albumin protein encoded by said humanized endogenous albumin locus.
(Item 43)
43. The method of item 42, wherein assessing expression of said albumin protein comprises measuring serum levels of said albumin protein in said non-human animal.
(Item 44)
43. The method of item 42, wherein assessing expression of albumin protein comprises measuring expression of albumin protein in the liver of the non-human animal.
(Item 45)
44. Any one of items 33-43, wherein said human albumin targeting reagent comprises a nuclease agent or a nucleic acid encoding said nuclease agent, said nuclease agent being designed to target a region of the human albumin gene. The method described in section.
(Item 46)
46. The method of item 45, wherein said nuclease agent comprises a Cas protein and a guide RNA designed to target a guide RNA target sequence of said human albumin gene.
(Item 47)
47. The method of item 46, wherein said guide RNA target sequence is in intron 1 of said human albumin gene.
(Item 48)
48. The method of item 46 or 47, wherein said Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 49)
said human albumin targeting reagent comprises an exogenous donor nucleic acid, said exogenous donor nucleic acid is designed to target said human albumin gene; 49. The method of any one of items 33-48, delivered via.
(Item 50)
50. The method of item 49, wherein said exogenous donor nucleic acid is a single stranded oligodeoxynucleotide (ssODN).
(Item 51)
51. The method of items 49 or 50, wherein said exogenous donor nucleic acid does not contain homology arms.
(Item 52)
said exogenous donor nucleic acid has a 5' homology arm targeting a 5' target sequence of said humanized endogenous albumin locus and a 3' homology targeting a 3' target sequence of said humanized endogenous albumin locus 51. A method according to items 49 or 50, comprising an insert nucleic acid flanked by sex arms.
(Item 53)
53. The method of item 52, wherein each of said 5' target sequence and said 3' target sequence comprises a segment of intron 1 of said human albumin gene.
(Item 54)
54. The method of any one of items 49-53, wherein said exogenous donor nucleic acid encodes an exogenous protein.
(Item 55)
55. The method of item 54, wherein said protein encoded by a humanized endogenous albumin locus targeted with said exogenous donor nucleic acid is a heterologous protein comprising a human albumin signal peptide fused to said exogenous protein. .
(Item 56)
56. The method of items 54 or 55, wherein said exogenous protein is Factor IX protein.
(Item 57)
57. The method of item 56, wherein said assessing comprises measuring serum levels of Factor IX protein in said non-human animal and/or comprises assessing activated partial thromboplastin time or performing a thrombin generation assay. the method of.
(Item 58)
said human albumin targeting reagent comprises (1) a nuclease agent designed to target a region of the human albumin gene and (2) an exogenous donor nucleic acid;
said exogenous donor nucleic acid is designed to target said human albumin gene;
said exogenous donor nucleic acid encodes an exogenous protein;
58. Any of items 33-57, wherein said protein encoded by said humanized endogenous albumin locus targeted by said exogenous donor nucleic acid is a heterologous protein comprising a human albumin signal peptide fused to said exogenous protein. or the method described in paragraph 1.
(Item 59)
59. The method of any one of items 54-58, wherein said evaluating comprises measuring expression of messenger RNA encoded by said exogenous donor nucleic acid.
(Item 60)
60. The method of item 59, wherein said evaluating comprises an in situ hybridization assay to quantify expression of said messenger RNA encoded by said exogenous donor nucleic acid at single cell resolution.
(Item 61)
61. The method of items 59 or 60, wherein said evaluating comprises measuring expression of said messenger RNA encoded by said exogenous donor nucleic acid in a plurality of lobes from said liver of said non-human animal.
(Item 62)
62. The method of any one of items 54-61, wherein said evaluating comprises measuring expression of said exogenous protein.
(Item 63)
63. The method of item 62, wherein assessing expression of said heterologous protein comprises measuring serum levels of said heterologous protein in said non-human animal.
(Item 64)
63. The method of item 62, wherein assessing expression of said heterologous protein comprises measuring expression in said liver of said non-human animal.
(Item 65)
A method for evaluating the activity of a human albumin targeting reagent in vivo, comprising:
(I) performing the method of any one of items 33-64 for a first time in a first non-human animal comprising a humanized endogenous albumin locus in its genome;
(II) altering the variable element and performing the method of step (I) for a second time with the altered variable element in a second non-human animal that contains a humanized endogenous albumin locus in its genome; and
(III) comparing said activity of said human albumin-targeted reagent of step (I) with said activity of said human albumin-targeted reagent of step (II), and selecting methods that result in higher activity. ,Method.
(Item 66)
66. The method of item 65, wherein the altered variable in step (II) is a delivery method that introduces the human albumin-targeted reagent to the non-human animal.
(Item 67)
67. The method of item 66, wherein said administering comprises LNP-mediated delivery and the modified variable in step (II) is a LNP formulation.
(Item 68)
66. The method of item 65, wherein the altered variable in step (II) is a route of administration for introducing the human albumin-targeted reagent to the non-human animal.
(Item 69)
66. The method of item 65, wherein the altered variable in step (II) is the concentration or amount of the human albumin targeting reagent introduced into the non-human animal.
(Item 70)
66. The method of item 65, wherein said altered variable in step (II) is in the form of said human albumin targeting reagent introduced into said non-human animal.
(Item 71)
66. The method of item 65, wherein the altered variable in step (II) is the human albumin targeting reagent introduced into the non-human animal.
(Item 72)
The human albumin targeting reagent comprises a Cas protein or a nucleic acid encoding said Cas protein and a guide RNA or DNA encoding said guide RNA, said guide RNA targeting a guide RNA target sequence of the human albumin gene. 66. The method of item 65, wherein the method is designed to
(Item 73)
73. The method of item 72, wherein the modified variable element in step (II) is the guide RNA sequence or the guide RNA target sequence.
(Item 74)
Item 72, wherein said human albumin targeting reagent comprises a messenger RNA (mRNA) encoding a Cas protein and a guide RNA, and said altered variable in step (II) is the ratio of Cas mRNA to guide RNA The method described in .
(Item 75)
73. The method of item 72, wherein the altered variable in step (II) is a guide RNA modification.
(Item 76)
66. The method of item 65, wherein said human albumin targeting reagent comprises an exogenous donor nucleic acid.
(Item 77)
77. The method of item 76, wherein said modified variable in step (II) is in the form of said exogenous donor nucleic acid.
(Item 78)
said exogenous donor nucleic acid has a 5' homology arm targeting a 5' target sequence of said humanized endogenous albumin locus and a 3' homology targeting a 3' target sequence of said humanized endogenous albumin locus said modified variable element in step (II) is the sequence or length of said 5' homology arm and/or the sequence or length of said 3' homology arm. , item 76.
(Item 79)
A method for producing a non-human animal according to any one of items 1 to 28,
(a) in non-human animal embryonic stem (ES) cells,
(i) a nuclease agent or nucleic acid encoding said nuclease agent, wherein said nuclease agent targets a target sequence of said endogenous albumin locus; and
(ii) a human albumin sequence flanked by a 5' homology arm corresponding to a 5' target sequence of said endogenous albumin locus and a 3' homology arm corresponding to a 3' target sequence of said endogenous albumin locus; A targeting vector comprising a nucleic acid insert,
said targeting vector recombines with said endogenous albumin locus to produce a genetically modified non-human ES cell comprising said humanized endogenous albumin locus comprising said human albumin sequence in its genome; introducing a targeting vector;
(b) introducing the genetically modified non-human ES cell into a non-human animal host embryo;
(c) gestating said non-human animal host embryo in a surrogate mother, wherein said surrogate mother is an F0 offspring genetically modified which comprises said humanized endogenous albumin locus comprising said human albumin sequence in her genome; and gestating the non-human animal.
(Item 80)
80. The method of item 79, wherein said targeting vector is a large targeting vector at least 10 kb in length, or the sum of said 5' and 3' homology arms is at least 10 kb in length.
(Item 81)
A method for producing a non-human animal according to any one of items 1 to 28,
(a) in a non-human animal one-cell stage embryo,
(i) a nuclease agent or nucleic acid encoding said nuclease agent, wherein said nuclease agent targets a target sequence of said endogenous albumin locus; and
(ii) a human albumin sequence flanked by a 5' homology arm corresponding to a 5' target sequence of said endogenous albumin locus and a 3' homology arm corresponding to a 3' target sequence of said endogenous albumin locus; A targeting vector comprising a nucleic acid insert,
said targeting vector recombines with said endogenous albumin locus to produce a genetically modified non-human 1-cell stage embryo comprising said humanized endogenous albumin locus comprising said human albumin sequence in its genome introducing a targeting vector,
(b) gestating a one-cell stage embryo of said genetically modified non-human animal in a surrogate mother to produce a genetically modified F0 generation comprising said humanized endogenous albumin locus comprising said human albumin sequence in its genome; and producing a non-human animal of
(Item 82)
82. The method of any one of items 79-81, wherein said nuclease agent comprises Cas protein and guide RNA.
(Item 83)
83. The method of item 82, wherein the Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 84)
83. The method of item 82, wherein step (a) further comprises introducing a second guide RNA targeting a second target sequence within said endogenous albumin locus.
(Item 85)
85. The method of any one of items 79-84, wherein said non-human animal is a mouse or rat.
(Item 86)
86. The method of item 85, wherein said non-human animal is a mouse.
(Item 87)
A method for producing a non-human animal according to any one of items 1 to 28,
(I)(a) modifying the genome of a pluripotent non-human animal cell to contain said humanized endogenous albumin locus;
(b) identifying or selecting said genetically modified pluripotent non-human animal cell comprising said humanized endogenous albumin locus;
(c) introducing the genetically modified pluripotent non-human animal cell into a non-human animal host embryo;
(d) gestating said non-human animal host embryo in a surrogate mother, or
(II) (a) modifying the genome of a one-cell stage embryo of a non-human animal to include said humanized endogenous albumin locus;
(b) selecting a one-cell stage embryo of said genetically modified non-human animal comprising said humanized endogenous albumin locus;
(c) gestating a one-cell stage embryo of said genetically modified non-human animal in a surrogate mother.
Claims (49)
前記内因性アルブミン５’非翻訳領域が削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられておらず、かつ
前記内因性アルブミンプロモーターが削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられていない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。 said region of said endogenous albumin locus from said start codon to said stop codon has been deleted and replaced with a human albumin sequence comprising said corresponding human albumin sequence and a human albumin 3' untranslated region; and the albumin 5' untranslated region has not been deleted and replaced with the corresponding human albumin sequence, and the endogenous albumin promoter has not been deleted and replaced with the corresponding human albumin sequence. A non-human animal according to any one of the preceding claims, which is not.
（ｉｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号５に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％同一の配列を含むタンパク質をコードし、
（ｉｉｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号１３に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含むか、または
（ｉｖ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号１７もしくは１８に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。 (i) the human albumin sequence at said humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% the sequence set forth in SEQ ID NO: 35; or (ii) said humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% the sequence set forth in SEQ ID NO:5 , encodes a protein comprising a sequence that is at least 99%, or at least 100% identical,
(iii) said humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 13; or (iv) said humanized endogenous albumin locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 12. A non-human animal according to any one of the preceding claims, comprising 98%, at least 99% or 100% identical sequences.
（ｉｉ）前記非ヒト動物における血清アルブミンレベルが、野生型アルブミン遺伝子座を含む対照非ヒト動物における血清アルブミンレベルと少なくとも同じくらい高い、
先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。 (i) said non-human animal comprises a serum albumin level of at least about 10 mg/mL ; or
(ii) serum albumin levels in said non-human animal are at least as high as serum albumin levels in a control non-human animal comprising a wild-type albumin locus;
A non-human animal according to any one of the preceding claims.
（ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトアルブミン標的化試薬を投与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することと、を含む、方法。 A method for evaluating the activity of a human albumin targeting reagent in vivo, comprising:
(a) administering the human albumin targeting reagent to the non-human animal of any one of claims 1-25 ;
(b) evaluating the activity of said human albumin-targeted reagent in said non-human animal.
（ｉｉ）前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質の発現を測定することを含み、任意選択で、前記アルブミンタンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物における前記アルブミンタンパク質の血清レベルを測定すること、または前記非ヒト動物の前記肝臓における前記アルブミンタンパク質の発現を測定することを含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。 (i) said evaluating comprises measuring expression of albumin messenger RNA encoded by said humanized endogenous albumin locus ; or
(ii) said assessing comprises measuring expression of an albumin protein encoded by said humanized endogenous albumin locus, and optionally assessing expression of said albumin protein comprises in said non-human animal 33. The method of any one of claims 27-32 , comprising measuring serum levels of said albumin protein or measuring expression of said albumin protein in said liver of said non-human animal.
前記外因性ドナー核酸が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む、請求項３７に記載の方法。 said exogenous donor nucleic acid does not contain homology arms, or
said exogenous donor nucleic acid has a 5' homology arm targeting a 5' target sequence of said humanized endogenous albumin locus and a 3' homology targeting a 3' target sequence of said humanized endogenous albumin locus 38. The method of claim 37 , comprising an insert nucleic acid flanked by sex arms .
前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されており、
前記外因性ドナー核酸が、外因性タンパク質をコードし、
前記外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされる前記タンパク質が、前記外因性タンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である、請求項２７～４３のいずれか一項に記載の方法。 said human albumin targeting reagent comprises (1) a nuclease agent designed to target a region of the human albumin gene and (2) an exogenous donor nucleic acid;
said exogenous donor nucleic acid is designed to target said human albumin gene;
said exogenous donor nucleic acid encodes an exogenous protein;
of claims 27-43 , wherein said protein encoded by a humanized endogenous albumin locus targeted with said exogenous donor nucleic acid is a heterologous protein comprising a human albumin signal peptide fused to said exogenous protein. A method according to any one of paragraphs.
任意選択で、前記評価が、単一細胞分解能で前記外因性ドナー核酸によってコードされる前記メッセンジャーＲＮＡの発現を定量化するためのインサイチュハイブリダイゼーションアッセイを含む、または
任意選択で、前記評価が、前記非ヒト動物の前記肝臓由来の複数の葉における前記外因性ドナー核酸によってコードされる前記メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、
請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。 said evaluating comprises measuring expression of messenger RNA encoded by said exogenous donor nucleic acid;
optionally, said evaluation comprises an in situ hybridization assay to quantify expression of said messenger RNA encoded by said exogenous donor nucleic acid at single cell resolution, or
optionally, said evaluating comprises measuring expression of said messenger RNA encoded by said exogenous donor nucleic acid in a plurality of lobes from said liver of said non-human animal;
A method according to any one of claims 40-44 .
（Ｉ）請求項２７～４６のいずれか一項に記載の方法を、そのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において、１回目に実行することと、
（ＩＩ）可変要素を変更し、ステップ（Ｉ）の前記方法を、ゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、変更された可変要素を用いて２回目に実行することと、
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトアルブミン標的化試薬の前記活性を、ステップ（ＩＩ）の前記ヒトアルブミン標的化試薬の前記活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含む、方法。 A method for evaluating the activity of a human albumin targeting reagent in vivo, comprising:
(I) performing the method of any one of claims 27-46 for a first time in a first non-human animal comprising a humanized endogenous albumin locus in its genome;
(II) altering the variable element and performing the method of step (I) for a second time with the altered variable element in a second non-human animal that contains a humanized endogenous albumin locus in its genome; and
(III) comparing said activity of said human albumin-targeted reagent of step (I) with said activity of said human albumin-targeted reagent of step (II), and selecting methods that result in higher activity. ,Method.
（ｉｉ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトアルブミン標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である；
（ｉｉｉ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬の濃度または量である；
（ｉｖ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬の形態である；
（ｖ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬である；
（ｖｉ）前記ヒトアルブミン標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを含み、前記ガイドＲＮＡが、ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されている、そして：
（Ａ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ガイドＲＮＡ配列または前記ガイドＲＮＡ標的配列である；
（Ｂ）前記ヒトアルブミン標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの比である；
（Ｃ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、ガイドＲＮＡ修飾である；または
（ｖｉｉ）前記ヒトアルブミン標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含む、そして：
（Ａ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記外因性ドナー核酸の形態である；
（Ｂ）前記外因性ドナー核酸が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記５’相同性アームの配列もしくは長さおよび／または前記３’相同性アームの配列もしくは長さである、請求項４７に記載の方法。 (i) said altered variable in step (II) is a delivery method wherein said human albumin-targeted reagent is introduced into said non-human animal, and optionally said administering comprises LNP-mediated delivery; the altered variable in step (II) is the LNP formulation;
(ii) said altered variable in step (II) is a route of administration for introducing said human albumin-targeted reagent to said non-human animal;
(iii) said altered variable in step (II) is the concentration or amount of said human albumin targeting reagent introduced into said non-human animal;
(iv) said altered variable in step (II) is in the form of said human albumin targeting reagent introduced into said non-human animal;
(v) said altered variable in step (II) is said human albumin targeting reagent introduced into said non-human animal;
(vi) said human albumin targeting reagent comprises a Cas protein or a nucleic acid encoding said Cas protein and a guide RNA or a DNA encoding said guide RNA, wherein said guide RNA is a guide RNA target sequence of the human albumin gene; is designed to target and:
(A) the altered variable element in step (II) is the guide RNA sequence or the guide RNA target sequence;
(B) said human albumin targeting reagent comprises a messenger RNA (mRNA) encoding a Cas protein and a guide RNA, and said altered variable in step (II) is the ratio of Cas mRNA to guide RNA; ;
(C) the altered variable in step (II) is a guide RNA modification; or
(vii) said human albumin targeting reagent comprises an exogenous donor nucleic acid, and:
(A) said modified variable element in step (II) is in the form of said exogenous donor nucleic acid;
(B) said exogenous donor nucleic acid targets a 5' homology arm targeting a 5' target sequence of said humanized endogenous albumin locus and a 3' target sequence of said humanized endogenous albumin locus; comprising an insert nucleic acid flanking a 3' homology arm, wherein said altered variable element in step (II) comprises a sequence or length of said 5' homology arm and/or a sequence or length of said 3' homology arm 48. The method of claim 47 , wherein the method is
（Ｉ）（ａ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように、多能性非ヒト動物細胞のゲノムを修飾することと、
（ｂ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む前記遺伝子修飾された多能性非ヒト動物細胞を同定または選択することと、
（ｃ）前記遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
（ｄ）非ヒト動物代理母に前記非ヒト動物宿主胚を懐胎させることと、を含むか、または
（ＩＩ）（ａ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように、非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを修飾することと、
（ｂ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む前記遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を選択することと、
（ｃ）非ヒト動物代理母に前記遺伝子改変された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させることを含む、方法。 A method for producing a non-human animal according to any one of claims 1 to 25 ,
(I)(a) modifying the genome of a pluripotent non-human animal cell to contain said humanized endogenous albumin locus;
(b) identifying or selecting said genetically modified pluripotent non-human animal cell comprising said humanized endogenous albumin locus;
(c) introducing the genetically modified pluripotent non-human animal cell into a non-human animal host embryo;
(d) gestating said non-human animal host embryo in a non-human animal surrogate mother; or modifying the genome of a cell stage embryo;
(b) selecting a one-cell stage embryo of said genetically modified non-human animal comprising said humanized endogenous albumin locus;
(c) gestating a non-human animal surrogate mother with a one-cell stage embryo of said genetically modified non-human animal.
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