JPWO2021154791A5 - - Google Patents
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Description
いくつかのそのような方法において、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。任意選択的に、非ヒト動物は、マウスである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物であって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、非ヒト動物。
（項目２）
前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号５の１４８位に対応する位置で野生型である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、Ｉ１４８Ｍ突然変異および／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含む、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、前記Ｉ１４８Ｍ突然変異および前記Ｋ４３４Ｅ突然変異を含む、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号１０に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号２０に記載のコード配列によってコードされる、項目５に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、前記Ｋ４３４Ｅ突然変異を含むが、前記Ｉ１４８Ｍ突然変異を含まない、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号６５に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号６６に記載のコード配列によってコードされる、項目７に記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインである、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号８に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号１８に記載のコード配列によってコードされる、項目９に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインが、配列番号７に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインが、配列番号１７に記載のコード配列によってコードされる、項目１１に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインが、配列番号６に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインが、配列番号１６に記載のコード配列によってコードされる、項目１３に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
コード配列および非コード配列の両方を含む前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエキソンが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
ヒトＰＮＰＬＡ３コード配列全体が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３開始コドンと前記ヒトＰＮＰＬＡ３終止コドンとの間に前記配列を含む前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の領域が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている、項目１８に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の５’ＵＴＲが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されており、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の３’ＵＴＲが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されているか、または前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の前記５’ＵＴＲおよびヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の前記３’ＵＴＲの両方が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２１）
最後のエキソンを除く前記内因性Ｐｎｐｌａ３エキソンのすべてが、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２２）
介在するすべてのイントロンを含む、第１のエキソンから最後から２番目のエキソンまでの前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されている、項目２１に記載の非ヒト動物。
（項目２３）
前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の最後のイントロンの全部または一部が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されていない、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２４）
前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されていない前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の前記最後のイントロンの前記一部が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の下流の遺伝子の発現に影響を与える調節エレメントを含む、項目２３に記載の非ヒト動物。
（項目２５）
介在するすべてのイントロンを含む、前記第１のエキソンから前記最後から２番目のエキソンまでの前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されており、前記ヒトＰＮＰＬＡ３開始コドンと前記ヒトＰＮＰＬＡ３終止コドンとの間に前記配列を含む前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の領域で置き換えられており、
前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２６）
前記ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされる前記ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、Ｉ１４８Ｍ突然変異および／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含む、項目２５に記載の非ヒト動物。
（項目２７）
ヒト化ＰＩＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされる前記ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質である、項目２５に記載の非ヒト動物。
（項目２８）
（ｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座における前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列が、配列番号６２もしくは６９に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含み、かつ／または
（ｉｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号５、９、もしくは６３に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むタンパク質をコードし、かつ／または
（ｉｉｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号１５、１９、もしくは６４に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含み、かつ／または
（ｉｖ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号２１、２２、６７、もしくは６８に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２９）
前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含まない、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目３０）
前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座に対してホモ接合である、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目３１）
前記非ヒト動物が、その生殖系列に前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目３２）
前記非ヒト動物が、哺乳動物である、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目３３）
前記非ヒト動物が、ラットまたはマウスである、項目３２に記載の非ヒト動物。
（項目３４）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目３３に記載の非ヒト動物。
（項目３５）
固形飼料を与えられた条件下での前記非ヒト動物の肝臓における前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現が、固形飼料を与えられた条件下での対照の非ヒト動物の肝臓における非ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座からのＲＮＡ発現よりも高く、
任意選択的に、固形飼料を与えられた条件下での前記非ヒト動物の前記肝臓における前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からの前記ＲＮＡ発現が、高ショ糖食（ＨＳＤ）または高フルクトース食（ＨＦＤ）条件下での前記非ヒト動物の前記肝臓における前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からの前記ＲＮＡ発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％である、先行項目のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目３６）
ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物細胞であって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、非ヒト動物細胞。
（項目３７）
ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、非ヒト動物ゲノム。
（項目３８）
ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられており、前記標的化ベクターが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームと前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームとが隣接する前記対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む挿入核酸を含む、標的化ベクター。
（項目３９）
ヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子であって、前記非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子。
（項目４０）
インビボでヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価する方法であって、
（ａ）項目１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を投与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を評価することと、を含む、方法。
（項目４１）
前記投与することが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、流体力学的送達（ＨＤＤ）、または注射を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の前記肝臓における前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を評価することを含む、項目４０または４１に記載の方法。
（項目４３）
ステップ（ｂ）が、肝脂肪含有量を測定すること、および／または前記非ヒト動物における肝脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルを測定することを含む、項目４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、項目４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現を測定することを含む、項目４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、ゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含む、項目４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤を含む、項目４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質および前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含み、前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するように設計されており、任意選択的に、前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶを介して送達される、項目４０～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、ＲＮＡｉ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、抗原結合タンパク質である、項目４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、小分子である、項目４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
インビボでヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を最適化する方法であって、
（Ｉ）ゲノムにヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において、項目４０～５４のいずれか一項に記載の方法を１回目に実施することと、
（ＩＩ）可変要素を変更し、ゲノムにヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、前記変更された可変要素を用いてステップ（Ｉ）の方法を２回目に実施することと、
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を、ステップ（ＩＩ）の前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含む、方法。
（項目５６）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の濃度または量である、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の形態である、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬である、項目５５に記載の方法。
（項目６１）
項目１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子
改変された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を導入することであって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、導入することと、
（ｂ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
（項目６２）
項目１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを改変して、そのゲノムに、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられたヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含み、それにより、非ヒト動物の遺伝子改変胚を生成することと、
（ｂ）前記非ヒト動物の遺伝子改変胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
（項目６３）
項目１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームと前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームとが隣接する前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、
前記標的化ベクターが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を組換えて、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、
（ｂ）前記遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
（ｃ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
（項目６４）
前記標的化ベクターが、少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または前記５’および３’相同性アームの合計が、少なくとも１０ｋｂの長さである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
項目１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームと前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームとが隣接する前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、
前記標的化ベクターが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を組換えて、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト１細胞期胚を産生する、導入することと、
（ｂ）前記遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させて、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生することと、を含む、方法。
（項目６６）
ステップ（ａ）が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤を導入することをさらに含む、項目６３～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
ステップ（ａ）が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７０）
ステップ（ａ）が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第３の標的配列を標的とする第３のガイドＲＮＡおよび前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第４の標的配列を標的とする第４のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記非ヒト動物が、マウスまたはラットである、項目６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目７１に記載の方法。
In some such methods, the non-human animal is a mouse or rat. Optionally, the non-human animal is a mouse.
In the embodiment of the present invention, the following items are provided, for example.
(Item 1)
A non-human animal comprising a humanized endogenous Pnpla3 locus in its genome, wherein a segment of said endogenous Pnpla3 locus has been deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence.
(Item 2)
2. The non-human animal of item 1, wherein the humanized endogenous Pnpla3 locus encodes a PNPLA3 protein comprising a human PNPLA3 luminal domain.
(Item 3)
The non-human animal according to item 2, wherein the human PNPLA3 luminal domain is wild type at a position corresponding to position 148 of SEQ ID NO: 5.
(Item 4)
The non-human animal according to item 2, wherein the human PNPLA3 luminal domain comprises an I148M mutation and/or a K434E mutation.
(Item 5)
5. The non-human animal of item 4, wherein said human PNPLA3 luminal domain comprises said I148M mutation and said K434E mutation.
(Item 6)
The non-human according to item 5, wherein said human PNPLA3 luminal domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 10, and optionally said human PNPLA3 luminal domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 20. animal.
(Item 7)
5. The non-human animal of item 4, wherein the human PNPLA3 luminal domain comprises the K434E mutation but not the I148M mutation.
(Item 8)
Non-human according to item 7, wherein said human PNPLA3 luminal domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 65, and optionally said human PNPLA3 luminal domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 66. animal.
(Item 9)
The non-human animal according to item 2, wherein the human PNPLA3 luminal domain is a wild type human PNPLA3 luminal domain.
(Item 10)
The non-human according to item 9, wherein said human PNPLA3 luminal domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and optionally said human PNPLA3 luminal domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 18. animal.
(Item 11)
A non-human animal according to any of the preceding items, wherein said humanized endogenous Pnpla3 locus encodes a PNPLA3 protein comprising a human PNPLA3 transmembrane domain.
(Item 12)
12. The non-human according to item 11, wherein said human PNPLA3 transmembrane domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and optionally said human PNPLA3 transmembrane domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 17. animal.
(Item 13)
The non-human animal according to any of the preceding items, wherein said humanized endogenous Pnpla3 locus encodes a PNPLA3 protein comprising a human PNPLA3 cytoplasmic domain.
(Item 14)
14. The non-human animal of item 13, wherein said human PNPLA3 cytoplasmic domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and optionally said human PNPLA3 cytoplasmic domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 16.
(Item 15)
Any one of the preceding items, wherein a region of said endogenous Pnpla3 locus containing both coding and non-coding sequences is deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence containing both coding and non-coding sequences. Non-human animals described in.
(Item 16)
The non-human animal of any of the preceding items, wherein the humanized endogenous Pnpla3 locus comprises an endogenous Pnpla3 promoter, and the human PNPLA3 sequence is operably linked to the endogenous Pnpla3 promoter. .
(Item 17)
Non-human animal according to any of the preceding items, wherein at least one intron and at least one exon of the endogenous Pnpla3 locus have been deleted and replaced with the corresponding human PNPLA3 sequence.
(Item 18)
A non-human animal according to any one of the preceding items, wherein the entire human PNPLA3 coding sequence is inserted into said endogenous Pnpla3 locus.
(Item 19)
19. The non-human animal according to item 18, wherein a region of the human PNPLA3 locus that includes the sequence between the human PNPLA3 start codon and the human PNPLA3 stop codon is inserted into the endogenous PNPLA3 locus.
(Item 20)
the 5'UTR of the human PNPLA3 locus is inserted into the endogenous Pnpla3 locus, and the 3'UTR of the human PNPLA3 locus is inserted into the endogenous Pnpla3 locus, or The non-human animal according to any one of the preceding items, wherein both the 5'UTR of the human PNPLA3 locus and the 3'UTR of the human PNPLA3 locus are inserted into the endogenous PNPLA3 locus.
(Item 21)
A non-human animal according to any of the preceding items, wherein all of said endogenous Pnpla3 exons except the last exon are deleted in said humanized endogenous Pnpla3 locus.
(Item 22)
22. The region of the endogenous Pnpla3 locus from the first exon to the penultimate exon, including all intervening introns, has been deleted in the humanized endogenous Pnpla3 locus. Non-human animals.
(Item 23)
Non-human animal according to any of the preceding items, wherein all or part of the last intron of the endogenous Pnpla3 locus has not been deleted in the humanized endogenous Pnpla3 locus.
(Item 24)
said portion of said last intron of said endogenous Pnpla3 locus that is not deleted in said humanized endogenous Pnpla3 locus comprises regulatory elements that influence the expression of genes downstream of said endogenous Pnpla3 locus. , the non-human animal according to item 23.
(Item 25)
The region of the endogenous Pnpla3 locus from the first exon to the penultimate exon, including all intervening introns, has been deleted in the humanized endogenous Pnpla3 locus, and the human PNPLA3 replaced with a region of the human PNPLA3 locus that includes the sequence between the start codon and the human PNPLA3 stop codon,
The non-human animal of any of the preceding items, wherein the humanized endogenous Pnpla3 locus comprises an endogenous Pnpla3 promoter, and the human PNPLA3 sequence is operably linked to the endogenous Pnpla3 promoter. .
(Item 26)
26. The non-human animal according to item 25, wherein the PNPLA3 protein encoded by the humanized PNPLA3 locus comprises an I148M mutation and/or a K434E mutation.
(Item 27)
26. The non-human animal of item 25, wherein the PNPLA3 protein encoded by the humanized PINPLA3 locus is a wild-type human PNPLA3 protein.
(Item 28)
(i) the human PNPLA3 sequence in the humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% the sequence set forth in SEQ ID NO: 62 or 69; % or 100% identical sequences, and/or
(ii) said humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% of the sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 9, or 63; or encodes a protein containing a 100% identical sequence, and/or
(iii) the humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% of the sequence set forth in SEQ ID NO: 15, 19, or 64; or contains coding sequences that contain 100% identical sequences, and/or
(iv) said humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% of the sequence set forth in SEQ ID NO: 21, 22, 67, or 68; % or 100% identical sequences.
(Item 29)
Non-human animal according to any of the preceding items, wherein said humanized endogenous PNPLA3 locus does not include a selection cassette or a reporter gene.
(Item 30)
The non-human animal according to any of the preceding items, wherein the non-human animal is homozygous for the humanized endogenous PNPLA3 locus.
(Item 31)
The non-human animal according to any one of the preceding items, wherein the non-human animal comprises in its germline the humanized endogenous PNPLA3 locus.
(Item 32)
Non-human animal according to any one of the preceding items, wherein said non-human animal is a mammal.
(Item 33)
33. The non-human animal according to item 32, wherein the non-human animal is a rat or a mouse.
(Item 34)
The non-human animal according to item 33, wherein the non-human animal is a mouse.
(Item 35)
RNA expression from the humanized endogenous PNPLA3 locus in the liver of the non-human animal under chow-fed conditions was significantly higher than that in the liver of the control non-human animal under chow-fed conditions. higher than RNA expression from the humanized endogenous Pnpla3 locus;
Optionally, said RNA expression from said humanized endogenous PNPLA3 locus in said liver of said non-human animal under chow-fed conditions is determined by a high sucrose diet (HSD) or a high fructose diet ( at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, or at least 25% of the RNA expression from the humanized endogenous PNPLA3 locus in the liver of the non-human animal under HFD) conditions. , a non-human animal according to any one of the preceding items.
(Item 36)
A non-human animal cell comprising a humanized endogenous PNPLA3 locus in its genome, wherein a segment of the endogenous PNPLA3 locus has been deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence.
(Item 37)
A non-human animal genome comprising a humanized endogenous PNPLA3 locus, wherein a segment of the endogenous PNPLA3 locus has been deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence.
(Item 38)
A targeting vector for generating a humanized endogenous PNPLA3 locus, wherein a segment of the endogenous PNPLA3 locus is deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence, the targeting vector the corresponding human PNPLA3 sequence flanked by a 5' homology arm targeting the 5' target sequence of the endogenous Pnpla3 locus and a 3' homology arm targeting the 3' target sequence of the endogenous Pnpla3 locus; A targeting vector comprising an insert nucleic acid containing.
(Item 39)
A humanized non-human animal PNPLA3 gene, wherein a segment of said non-human animal Pnpla3 gene is deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence.
(Item 40)
1. A method of evaluating the activity of a human PNPLA3 targeting reagent in vivo, the method comprising:
(a) administering the human PNPLA3 targeting reagent to the non-human animal according to any one of items 1 to 35;
(b) assessing the activity of the human PNPLA3 targeting reagent in the non-human animal.
(Item 41)
41. The method of item 40, wherein said administering comprises adeno-associated virus (AAV)-mediated delivery, lipid nanoparticle (LNP)-mediated delivery, hydrodynamic delivery (HDD), or injection.
(Item 42)
42. The method of item 40 or 41, wherein step (b) comprises assessing the activity of the human PNPLA3 targeting reagent in the liver of the non-human animal.
(Item 43)
The method according to any one of items 40 to 42, wherein step (b) comprises measuring liver fat content and/or measuring PNPLA3 levels in liver fat droplets in said non-human animal. .
(Item 44)
44. The method of any one of items 40-43, wherein step (b) comprises measuring the expression of PNPLA3 messenger RNA encoded by the humanized endogenous PNPLA3 locus.
(Item 45)
45. The method of any one of items 40-44, wherein step (b) comprises measuring the expression of PNPLA3 protein encoded by the humanized endogenous PNPLA3 locus.
(Item 46)
46. The method of any one of items 40-45, wherein the human PNPLA3 targeting reagent is a genome editing agent and step (b) comprises assessing modification of the humanized endogenous PNPLA3 locus. .
(Item 47)
47. The method of item 46, wherein step (b) comprises determining the frequency of insertions or deletions within the humanized endogenous PNPLA3 locus.
(Item 48)
48. The method of any one of items 40-47, wherein the human PNPLA3 targeting reagent comprises a nuclease agent designed to target a region of the human PNPLA3 gene.
(Item 49)
49. The method of item 48, wherein the nuclease agent comprises a guide RNA designed to target a Cas protein and a guide RNA target sequence of the human PNPLA3 gene.
(Item 50)
50. The method according to item 49, wherein the Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 51)
The human PNPLA3 targeting reagent comprises an exogenous donor nucleic acid, the exogenous donor nucleic acid is designed to target the human PNPLA3 gene, and optionally the exogenous donor nucleic acid is an AAV. 51. The method according to any one of items 40 to 50, wherein the method is delivered via.
(Item 52)
46. The method of any one of items 40-45, wherein the human PNPLA3 targeting reagent is an RNAi agent or an antisense oligonucleotide.
(Item 53)
46. The method of any one of items 40-45, wherein the human PNPLA3 targeting reagent is an antigen binding protein.
(Item 54)
46. The method of any one of items 40-45, wherein the human PNPLA3 targeting reagent is a small molecule.
(Item 55)
1. A method of optimizing the activity of a human PNPLA3 targeting reagent in vivo, the method comprising:
(I) performing the method described in any one of items 40 to 54 for the first time in a first non-human animal containing a humanized endogenous PNPLA3 locus in its genome;
(II) modifying the variable element and performing the method of step (I) a second time using the modified variable element in a second non-human animal whose genome includes a humanized endogenous PNPLA3 locus; and,
(III) comparing the activity of the human PNPLA3 targeting reagent of step (I) with the activity of the human PNPLA3 targeting reagent of step (II) and selecting a method that results in a higher activity. ,Method.
(Item 56)
56. The method of item 55, wherein the altered variable in step (II) is a delivery method for introducing the human PNPLA3 targeting reagent into the non-human animal.
(Item 57)
56. The method of item 55, wherein the altered variable in step (II) is a route of administration for introducing the human PNPLA3 targeting reagent into the non-human animal.
(Item 58)
56. The method of item 55, wherein the altered variable in step (II) is the concentration or amount of the human PNPLA3 targeting reagent introduced into the non-human animal.
(Item 59)
56. The method of item 55, wherein the altered variable element in step (II) is in the form of the human PNPLA3 targeting reagent introduced into the non-human animal.
(Item 60)
56. The method of item 55, wherein the altered variable element in step (II) is the human PNPLA3 targeting reagent introduced into the non-human animal.
(Item 61)
A method for producing a non-human animal according to any one of items 1 to 35, comprising:
(a) A gene containing a humanized endogenous Pnpla3 locus in its genome in a non-human animal host embryo
introducing a modified non-human animal embryonic stem (ES) cell, in which a segment of the endogenous Pnpla3 locus has been deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence;
(b) impregnating said non-human animal host embryo in a surrogate mother, said surrogate mother producing an F0 progeny genetically modified non-human animal comprising said humanized endogenous Pnpla3 locus; , including a method.
(Item 62)
A method for producing a non-human animal according to any one of items 1 to 35, comprising:
(a) The genome of a non-human animal one-cell stage embryo is modified to contain a humanized endogenous Pnpla3 locus in which a segment of the endogenous Pnpla3 locus is deleted and replaced with the corresponding human PNPLA3 sequence. comprising, thereby producing a genetically modified embryo of a non-human animal;
(b) impregnating the genetically modified embryo of said non-human animal in a surrogate mother, said surrogate mother producing an F0 progeny genetically modified non-human animal comprising said humanized endogenous Pnpla3 locus; and methods including.
(Item 63)
A method for producing a non-human animal according to any one of items 1 to 35, comprising:
(a) Inject non-human animal embryonic stem (ES) cells with a 5' homology arm corresponding to the 5' target sequence of the endogenous Pnpla3 locus and a 3' homology arm corresponding to the 3' target sequence of the endogenous Pnpla3 locus. 'Introducing a targeting vector comprising a nucleic acid insert comprising said human PNPLA3 sequence flanked by homology arms,
introducing the targeting vector to recombine the endogenous PNPLA3 locus to produce genetically modified non-human ES cells containing in their genome the humanized endogenous PNPLA3 locus containing the human PNPLA3 sequence; and,
(b) introducing the genetically modified non-human ES cells into a non-human animal host embryo;
(c) impregnating said non-human animal host embryo in a surrogate mother, wherein said surrogate mother is an F0 progeny genetically modified non-human animal whose genome contains said humanized endogenous PNPLA3 locus comprising said human PNPLA3 sequence; A method comprising: producing, impregnating;
(Item 64)
64. The method of item 63, wherein the targeting vector is a large targeting vector of at least 10 kb in length, or the sum of the 5' and 3' homology arms is at least 10 kb in length.
(Item 65)
A method for producing a non-human animal according to any one of items 1 to 35, comprising:
(a) A 5' homology arm corresponding to the 5' target sequence of the endogenous Pnpla3 locus and a 3' homology arm corresponding to the 3' target sequence of the endogenous Pnpla3 locus in a non-human animal one-cell stage embryo. introducing a targeting vector comprising a nucleic acid insert comprising the human PNPLA3 sequence flanked by arms,
Introduction, wherein the targeting vector recombines the endogenous PNPLA3 locus to produce a genetically modified non-human one-cell stage embryo containing in its genome the humanized endogenous PNPLA3 locus containing the human PNPLA3 sequence. to do and
(b) A genetically modified F0 generation non-human animal whose genome contains the humanized endogenous PNPLA3 locus containing the human PNPLA3 sequence by impregnating the genetically modified non-human animal one-cell stage embryo in a surrogate mother. A method comprising: producing.
(Item 66)
66. The method of any one of items 63-65, wherein step (a) further comprises introducing a nuclease agent that targets a target sequence within the endogenous Pnpla3 locus.
(Item 67)
67. The method of item 66, wherein the nuclease agent comprises a Cas protein and a guide RNA.
(Item 68)
68. The method according to item 67, wherein the Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 69)
69. The method of item 67 or 68, wherein step (a) further comprises introducing a second guide RNA targeting a second target sequence within said endogenous Pnpla3 locus.
(Item 70)
step (a) comprises a third guide RNA targeting a third target sequence within said endogenous Pnpla3 locus and a fourth guide targeting a fourth target sequence within said endogenous Pnpla3 locus. 70. The method of item 69, further comprising introducing RNA.
(Item 71)
The method according to any one of items 61 to 70, wherein the non-human animal is a mouse or a rat.
(Item 72)
72. The method according to item 71, wherein the non-human animal is a mouse.
Claims (33)
（Ｉ）野生型ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインである、
（ＩＩ）配列番号５の１４８位に対応する位置で野生型である、
（ＩＩＩ）Ｉ１４８Ｍ突然変異および／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含む、
（ＩＶ）前記Ｉ１４８Ｍ突然変異および前記Ｋ４３４Ｅ突然変異を含む、または
（Ｖ）前記Ｋ４３４Ｅ突然変異を含むが、前記Ｉ１４８Ｍ突然変異を含まない、
請求項２に記載の非ヒト動物。 The human PNPLA3 luminal domain is
(I) wild type human PNPLA3 luminal domain;
(II) is wild type at the position corresponding to position 148 of SEQ ID NO: 5;
(III) containing the I148M mutation and/or the K434E mutation;
(IV) comprising said I148M mutation and said K434E mutation, or
(V) comprising the K434E mutation but not the I148M mutation;
The non-human animal according to claim 2.
（ＩＩ）前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号６５に記載の配列を含む、または前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号６６に記載のコード配列によってコードされる、または
（ＩＩＩ）前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号８に記載の配列を含む、または前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号１８に記載のコード配列によってコードされる、
請求項３に記載の非ヒト動物。 (I) the human PNPLA3 luminal domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 10, or the human PNPLA3 luminal domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 20;
(II) said human PNPLA3 luminal domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 65, or said human PNPLA3 luminal domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 66, or
(III) the human PNPLA3 luminal domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or the human PNPLA3 luminal domain is encoded by the coding sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
The non-human animal according to claim 3 .
前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。 The region of the endogenous Pnpla3 locus from the first exon to the penultimate exon, including all intervening introns, has been deleted in the humanized endogenous Pnpla3 locus, and the human PNPLA3 replaced with a region of the human PNPLA3 locus that includes the sequence between the start codon and the human PNPLA3 stop codon,
The non-human according to any one of the preceding claims, wherein the humanized endogenous Pnpla3 locus comprises an endogenous Pnpla3 promoter, and the human PNPLA3 sequence is operably linked to the endogenous Pnpla3 promoter. animal.
（ＩＩ）ヒト化ＰＩＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされる前記ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質である、
請求項１５に記載の非ヒト動物。 (I) said PNPLA3 protein encoded by said humanized PNPLA3 locus comprises an I148M mutation and/or a K434E mutation, or
(II) the PNPLA3 protein encoded by the humanized PINPLA3 locus is a wild-type human PNPLA3 protein;
The non-human animal according to claim 15 .
（ｉｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号５、９、もしくは６３に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むタンパク質をコードする、
（ｉｉｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号１５、１９、もしくは６４に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含む、または
（ｉｖ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号２１、２２、６７、もしくは６８に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。 (i) the human PNPLA3 sequence in the humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% the sequence set forth in SEQ ID NO: 62 or 69; % or 100% identical sequences ,
(ii) said humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% of the sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 9, or 63; or encode a protein that contains 100% identical sequences;
(iii) the humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% of the sequence set forth in SEQ ID NO: 15, 19, or 64; or (iv) said humanized endogenous PNPLA3 locus is at least 90%, at least 95% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 21, 22, 67, or 68. , at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical sequences.
A non-human animal cell comprising a humanized endogenous PNPLA3 locus in its genome, wherein a segment of the endogenous PNPLA3 locus has been deleted and replaced with a corresponding human PNPLA3 sequence.
（ａ）請求項１～２４のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を投与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を評価することと、を含む、方法。 1. A method of evaluating the activity of a human PNPLA3 targeting reagent in vivo, the method comprising:
(a) administering the human PNPLA3 targeting reagent to the non-human animal according to any one of claims 1 to 24 ;
(b) assessing the activity of the human PNPLA3 targeting reagent in the non-human animal.
（ＩＩ）ステップ（ｂ）が、肝脂肪含有量を測定すること、および／または前記非ヒト動物における肝脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルを測定することを含む、
（ＩＩＩ）ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、
（ＩＶ）ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現を測定することを含む、
（Ｖ）前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、ゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含む、または
（ＶＩ）ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、
請求項２６または２７に記載の方法。 (I) step (b) comprises assessing the activity of the human PNPLA3 targeting reagent in the liver of the non-human animal;
(II) step (b) comprises measuring liver fat content and/or measuring PNPLA3 levels in liver fat droplets in said non-human animal;
(III) step (b) comprises measuring the expression of PNPLA3 messenger RNA encoded by the humanized endogenous PNPLA3 locus;
(IV) step (b) comprises measuring the expression of PNPLA3 protein encoded by the humanized endogenous PNPLA3 locus;
(V) the human PNPLA3 targeting reagent is a genome editing agent, and step (b) comprises assessing modification of the humanized endogenous PNPLA3 locus, or
(VI) step (b) comprises determining the frequency of insertions or deletions within the humanized endogenous PNPLA3 locus;
28. A method according to claim 26 or 27 .
（Ｉ）ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤、
（ＩＩ）外因性ドナー核酸であって、前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するように設計されている、外因性ドナー核酸、
（ＩＩＩ）ＲＮＡｉ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ＩＶ）抗原結合タンパク質、または
（Ｖ）小分子
を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。 The human PNPLA3 targeting reagent comprises:
(I) a nuclease agent designed to target a region of the human PNPLA3 gene ;
(II) an exogenous donor nucleic acid, the exogenous donor nucleic acid being designed to target said human PNPLA3 gene;
(III) RNAi agent or antisense oligonucleotide,
(IV) an antigen binding protein, or
(V) Small molecules
29. A method according to any one of claims 26 to 28 , comprising:
（Ｉ）ゲノムにヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法を１回目に実施することと、
（ＩＩ）可変要素を変更し、ゲノムにヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、前記変更された可変要素を用いてステップ（Ｉ）の方法を２回目に実施することと、
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を、ステップ（ＩＩ）の前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含む、方法。 1. A method of optimizing the activity of a human PNPLA3 targeting reagent in vivo, the method comprising:
(I) performing the method of any one of claims 26 to 30 for the first time in a first non-human animal containing a humanized endogenous PNPLA3 locus in its genome;
(II) modifying the variable element and performing the method of step (I) a second time using the modified variable element in a second non-human animal whose genome includes a humanized endogenous PNPLA3 locus; and,
(III) comparing the activity of the human PNPLA3 targeting reagent of step (I) with the activity of the human PNPLA3 targeting reagent of step (II) and selecting a method that results in a higher activity. ,Method.
（Ｉ）前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法、
（ＩＩ）前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路、
（ＩＩＩ）前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の濃度または量、
（ＩＶ）前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の形態、あるいは
（Ｖ）前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬
である、請求項３１に記載の方法。 The modified variable element in step (II) is
(I) a delivery method of introducing the human PNPLA3 targeting reagent into the non-human animal;
(II) an administration route for introducing the human PNPLA3 targeting reagent into the non-human animal;
(III) the concentration or amount of the human PNPLA3 targeting reagent introduced into the non-human animal;
(IV) the form of the human PNPLA3 targeting reagent introduced into the non-human animal, or
(V) the human PNPLA3 targeting reagent introduced into the non-human animal
32. The method of claim 31 .
（Ｉ）（ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を導入することであって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、導入することと、
（ｂ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、あるいは
（ＩＩ）（ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを改変して、そのゲノムに、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられたヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含み、それにより、非ヒト動物の遺伝子改変胚を生成することと、
（ｂ）前記非ヒト動物の遺伝子改変胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと
を含む、方法。
A method for producing a non-human animal according to any one of claims 1 to 24 , comprising:
(I) (a) introducing into a non-human animal host embryo a genetically modified non-human animal embryonic stem (ES) cell containing a humanized endogenous Pnpla3 locus in its genome, the endogenous Pnpla3 introducing a segment of the locus is deleted and replaced with the corresponding human PNPLA3 sequence;
(b) impregnating said non-human animal host embryo in a surrogate mother, said surrogate mother producing an F0 progeny genetically modified non-human animal comprising said humanized endogenous Pnpla3 locus; , or
(II) (a) Humanized endogenous Pnpla3 in which a segment of the endogenous Pnpla3 locus is deleted and replaced with the corresponding human PNPLA3 sequence by modifying the genome of a one-cell stage embryo of a non-human animal; comprising a genetic locus, thereby producing a genetically modified embryo of a non-human animal;
(b) impregnating the genetically modified embryo of said non-human animal in a surrogate mother, said surrogate mother producing an F0 progeny genetically modified non-human animal comprising said humanized endogenous Pnpla3 locus; Kototo
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