Claims (87)
1. Отличное от человека животное, имеющее в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12, в котором сегмент эндогенного локуса F12 удален и заменен соответствующей последовательностью F12 человека. 1. A non-human animal having in its genome a humanized endogenous F12 locus in which a segment of the endogenous F12 locus has been deleted and replaced with a corresponding human F12 sequence .
2. Отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус F12 кодирует белок, содержащий тяжелую цепь фактора свертывания крови XII человека.2. A non-human animal according to claim 1, wherein the humanized endogenous F12 locus encodes a protein containing the human coagulation factor XII heavy chain.
3. Отличное от человека животное по п. 1 или 2, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус F12 кодирует белок, содержащий легкую цепь фактора свертывания крови XII человека.3. A non-human animal according to claim 1 or 2, wherein the humanized endogenous F12 locus encodes a protein containing the human coagulation factor XII light chain.
4. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус F12 кодирует белок, содержащий сигнальный пептид фактора свертывания крови XII человека.4. A non-human animal according to any one of the preceding claims, characterized in that the humanized endogenous F12 locus encodes a protein containing the human coagulation factor XII signal peptide.
5. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что область эндогенного локуса F12, содержащая как кодирующую последовательность, так и некодирующую последовательность, была удалена и заменена соответствующей последовательностью F12 человека, содержащей как кодирующую последовательность, так и некодирующую последовательность.5. A non-human animal according to any one of the preceding claims, characterized in that a region of the endogenous F12 locus containing both a coding sequence and a non-coding sequence has been deleted and replaced with a corresponding human F12 sequence containing both a coding sequence and a non-coding sequence.
6. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус F12 содержит эндогенный промотор F12, при этом последовательность F12 человека функционально связана с эндогенным промотором F12. 6. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein the humanized endogenous F12 locus contains the endogenous F12 promoter, wherein the human F12 sequence is operably linked to the endogenous F12 promoter.
7. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что по меньшей мере один интрон и по меньшей мере один экзон эндогенного локуса F12 были удалены и заменены соответствующей последовательностью F12 человека. 7. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein at least one intron and at least one exon of the endogenous F12 locus has been deleted and replaced with a corresponding human F12 sequence .
8. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что вся кодирующей последовательность F12 эндогенного локуса F12 была удалена и заменена соответствующей последовательностью F12 человека. 8. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein the entire F12 coding sequence of the endogenous F12 locus has been deleted and replaced with the corresponding human F12 sequence .
9. Отличное от человека животное по п. 8, отличающееся тем, что область эндогенного локуса F12 от стартового кодона до стоп-кодона была удалена и заменена соответствующей последовательностью F12 человека. 9. A non-human animal according to claim 8, wherein the region of the endogenous F12 locus from the start codon to the stop codon has been deleted and replaced with the corresponding human F12 sequence .
10. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что эндогенная 3'-нетранслируемая область F12 не была удалена и заменена соответствующей последовательностью F12 человека. 10. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein the endogenous F12 3' untranslated region has not been deleted and replaced with the corresponding human F12 sequence .
11. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что эндогенная 5'-нетранслируемая область F12 не была удалена и заменена соответствующей последовательностью F12 человека. 11. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein the endogenous F12 5' untranslated region has not been deleted and replaced with the corresponding human F12 sequence .
12. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что область эндогенного локуса F12 от стартового кодона до стоп-кодона была удалена и заменена соответствующей последовательностью F12 человека, и12. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein the region of the endogenous F12 locus from a start codon to a stop codon has been deleted and replaced with a corresponding human F12 sequence, and
где эндогенный промотор F12 не был удален и заменен соответствующей последовательностью F12 человека. where the endogenous F12 promoter has not been removed and replaced with the corresponding human F12 sequence .
13. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что13. A non-human animal according to any one of the preceding claims, characterized in that
(i) последовательность человеческого F12 в гуманизированном эндогенном локусе F12 содержит последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31 или 32; и/или(i) the human F12 sequence at the humanized endogenous F12 locus contains a sequence that is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence specified in SEQ ID NO: 31 or 32; and/or
(ii) гуманизированный эндогенный локус F12 кодирует белок, содержащий последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5 или 46; и/или(ii) the humanized endogenous F12 locus encodes a protein containing a sequence that is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence specified in SEQ ID NO: 5 or 46 ; and/or
(iii) гуманизированный эндогенный локус F12 содержит кодирующую последовательность, содержащую последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13 или 48; и/или(iii) the humanized endogenous F12 locus contains a coding sequence containing a sequence that is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence specified in SEQ ID NO: 13 or 48; and/or
(iv) гуманизированный эндогенный локус F12 содержит последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17 или 18.(iv) the humanized endogenous F12 locus contains a sequence that is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence indicated in SEQ ID NO: 17 or 18.
14. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус F12 содержит селекционную кассету или репортерный ген в интроне соответствующей последовательности F12 человека, или при этом гуманизированный эндогенный локус F12 не содержит селекционную кассету или репортерный ген.14. A non-human animal according to any of the preceding claims, wherein the humanized endogenous F12 locus contains a selection cassette or reporter gene in the intron of the corresponding human F12 sequence, or wherein the humanized endogenous F12 locus does not contain a selection cassette or reporter gene.
15. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное является гомозиготным по гуманизированному эндогенному локусу F12. 15. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein said non-human animal is homozygous for the humanized endogenous F12 locus.
16. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное имеет гуманизированный эндогенный локус F12 в своей зародышевой линии.16. A non-human animal according to any one of the preceding claims, characterized in that said non-human animal has a humanized endogenous F12 locus in its germline.
17. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное является млекопитающим.17. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein said non-human animal is a mammal.
18. Отличное от человека животное по п. 17, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное представляет собой крысу или мышь.18. A non-human animal according to claim 17, wherein said non-human animal is a rat or a mouse.
19. Отличное от человека животное по п. 18, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное представляет собой мышь.19. A non-human animal according to claim 18, wherein said non-human animal is a mouse.
20. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что у указанного отличного от человека животного в головном мозге экспрессируется короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека.20. A non-human animal according to any one of the preceding claims, wherein said non-human animal expresses a short isoform of human coagulation factor XII in the brain.
21. Отличное от человека животное по п. 20, отличающееся тем, что 21. Non-human animal according to claim 20, characterized in that
(i) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека кодируется мРНК F12, обнаруживаемой зондами против экзонов 11-14 F12 человека, но не зондами против экзонов 1-6 F12 человека; и/или(i) the short isoform of human coagulation factor XII is encoded by F12 mRNA detectable by probes against human F12 exons 11-14 but not by probes against human F12 exons 1-6; and/or
(ii) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека представляет собой FXII297-596; и/или(ii) the short isoform of human coagulation factor XII is FXII 297-596 ; and/or
(iii) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека экспрессируется в нейронах головного мозга; и/или(iii) the short isoform of human coagulation factor XII is expressed in brain neurons; and/or
(iv) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека может быть активирована калликреином плазмы и превращать про-ФРГ в активный ФРГ.(iv) the short isoform of human coagulation factor XII can be activated by plasma kallikrein and convert pro-HGF to active HGF.
22. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное имеет активированное частичное тромбопластиновое время (аЧТВ), которое существенно не отличается от аЧТВ у соответствующего отличного от человека животного и/или при этом у отличного от человека животного протромбиновое время (ПВ) существенно не отличается от ПВ у соответствующего отличного от человека животного дикого типа.22. A non-human animal according to any one of the preceding claims, characterized in that said non-human animal has an activated partial thromboplastin time (aPTT) that is not significantly different from the aPTT of the corresponding non-human animal and/or that of the non-human animal. the human animal's prothrombin time (PT) is not significantly different from the PT in the corresponding non-human wild-type animal.
23. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что уровни фактора свертывания крови XII человека в плазме крови указанного отличного от человека животного составляют по меньшей мере около 5 мкг/мл.23. A non-human animal according to any one of the preceding claims, characterized in that the levels of human blood coagulation factor XII in the blood plasma of said non-human animal are at least about 5 μg/ml.
24. Клетка отличного от человека животного, содержащая в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12, в котором сегмент эндогенного локуса F12 удален и заменен соответствующей последовательностью F12 человека. 24. A non-human animal cell containing in its genome a humanized endogenous F12 locus in which a segment of the endogenous F12 locus has been deleted and replaced with the corresponding human F12 sequence .
25. Геном отличного от человека животного, содержащий гуманизированный эндогенный локус F12, в котором сегмент эндогенного локуса F12 удален и заменен соответствующей последовательностью F12 человека. 25. A non-human animal genome containing a humanized endogenous F12 locus in which a segment of the endogenous F12 locus has been deleted and replaced with the corresponding human F12 sequence .
26. Нацеленный вектор для создания гуманизированного эндогенного локуса F12, в котором сегмент эндогенного локуса F12 удален и заменен соответствующей последовательностью F12 человека, причем нацеленный вектор содержит вставку нуклеиновой кислоты, содержащую соответствующую последовательность F12 человека, фланкированную 5'-плечом гомологии, нацеленным на 5'-последовательность-мишень в эндогенном локусе F12, и 3'-плечом гомологии, нацеленным на 3'-последовательность-мишень в эндогенном локусе F12. 26. A targeted vector for generating a humanized endogenous F12 locus in which a segment of the endogenous F12 locus is deleted and replaced with a corresponding human F12 sequence, wherein the targeted vector contains a nucleic acid insert containing the corresponding human F12 sequence flanked by a 5' homology arm targeted at 5' a target sequence at the endogenous F12 locus, and a 3' arm of homology targeting a 3' target sequence at the endogenous F12 locus.
27. Гуманизированный ген F12 отличного от человека животного, в котором сегмент эндогенного локуса F12 удален и заменен соответствующей последовательностью F12 человека. 27. A humanized non-human F12 gene in which a segment of the endogenous F12 locus has been deleted and replaced with the corresponding human F12 sequence .
28. Способ оценки активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, in vivo, включающий28. A method for evaluating the activity of a reagent targeting human coagulation factor XII in vivo , comprising
а) введение реагента, нацеленного фактор свертывания крови XII человека, отличному от человека животному по любому из пп. 1-23; иa) administering a reagent that targets human coagulation factor XII to a non-human animal according to any one of claims. 1-23; And
(б) оценку активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, у отличного от человека животного.(b) evaluating the activity of a reagent targeting human coagulation factor XII in a non-human animal.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что введение включает опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) доставку, опосредованную липидными наночастицами (ЛНЧ) доставку, гидродинамическую доставку (HDD - англ.: hydrodynamic delivery) или инъекцию.29. The method of claim 28, wherein the administration comprises adeno-associated virus (AAV) mediated delivery, lipid nanoparticle (LNP) mediated delivery, hydrodynamic delivery (HDD) or injection.
30. Способ по п. 28 или п. 29, отличающийся тем, что стадия (b) включает выделение плазмы отличного от человека животного и оценку активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, в плазме.30. The method of claim 28 or claim 29, wherein step (b) comprises isolating plasma from a non-human animal and assessing the activity of a reagent targeting human coagulation factor XII in the plasma.
31. Способ по любому из пп. 28-30, отличающийся тем, что стадия (b) включает оценку активности реагента, нацеленного на фактор свертывания XII человека, в печени или головном мозге отличного от человека животного.31. The method according to any one of paragraphs. 28-30, characterized in that step (b) includes assessing the activity of a reagent targeting human coagulation factor XII in the liver or brain of a non-human animal.
32. Способ по любому из пп. 28-31, отличающийся тем, что стадия (b) включает оценку свертывания крови или образования тромбина.32. The method according to any one of paragraphs. 28-31, characterized in that stage (b) includes an assessment of blood coagulation or thrombin formation.
33. Способ по любому из пп. 28-32, отличающийся тем, что стадия (b) включает оценку сигналинга ФРГ-Met.33. The method according to any one of paragraphs. 28-32, wherein step (b) includes evaluation of HGF-Met signaling.
34. Способ по любому из пп. 28-33, отличающийся тем, что стадия (b) включает измерение экспрессии матричной РНК F12, кодируемой гуманизированным эндогенным локусом F12. 34. The method according to any one of paragraphs. 28-33, characterized in that step (b) includes measuring the expression of F12 messenger RNA encoded by the humanized endogenous F12 locus.
35. Способ по любому из пп. 28-34, отличающийся тем, что стадия (b) включает измерение экспрессии белка-фактора свертывания крови XII, кодируемого гуманизированным эндогенным локусом фактора свертывания крови XII.35. The method according to any one of paragraphs. 28-34, characterized in that step (b) comprises measuring the expression of the coagulation factor XII protein encoded by the humanized endogenous coagulation factor XII locus.
36. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой агент для редактирования генома, и стадия (b) включает оценку модификации гуманизированного эндогенного локуса F12. 36. The method according to any one of paragraphs. 28-35, characterized in that the reagent targeting human coagulation factor XII is a genome editing agent, and step (b) includes assessing the modification of the humanized endogenous F12 locus.
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что стадия (b) включает измерение частоты вставок или делеций в гуманизированном эндогенном локусе F12. 37. The method of claim 36, wherein step (b) comprises measuring the frequency of insertions or deletions at the humanized endogenous F12 locus.
38. Способ по любому из пп. 28-37, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, содержит нуклеазный агент, предназначенный для нацеливания на область гена F12 человека.38. The method according to any one of paragraphs. 28-37, characterized in that the reagent targeting human coagulation factor XII contains a nuclease agent designed to target the human F12 gene region.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что нуклеазный агент содержит белок Cas и направляющую РНК, предназначенную для нацеливания на последовательность-мишень направляющей РНК в гене F12 человека.39. The method of claim 38, wherein the nuclease agent comprises a Cas protein and a guide RNA designed to target a guide RNA target sequence in the human F12 gene.
40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.40. The method of claim 39, wherein said Cas protein is a Cas9 protein.
41. Способ по любому из пп. 28-40, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, содержит экзогенную донорную нуклеиновую кислоту, где экзогенная донорная нуклеиновая кислота предназначена для нацеливания на ген F12 человека, и, необязательно, при этом экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют через AAV.41. The method according to any one of paragraphs. 28-40, characterized in that the reagent targeting human coagulation factor XII contains an exogenous donor nucleic acid, where the exogenous donor nucleic acid is intended to target the human F12 gene, and, optionally, the exogenous donor nucleic acid is delivered via AAV .
42. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой агент РНКи или антисмысловой олигонуклеотид.42. The method according to any one of paragraphs. 28-35, characterized in that the reagent targeting human coagulation factor XII is an RNAi agent or an antisense oligonucleotide.
43. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой антигенсвязывающий белок.43. The method according to any one of paragraphs. 28-35, characterized in that the reagent targeting human coagulation factor XII is an antigen-binding protein.
44. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой небольшую молекулу.44. The method according to any one of paragraphs. 28-35, characterized in that the reagent targeting human coagulation factor XII is a small molecule.
45. Способ оптимизации активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, in vivo, включающий 45. A method for optimizing the activity of a reagent targeting human coagulation factor XII in vivo , comprising
(I) выполнение способа по любому из пп. 28-44 в первый раз на первом отличном от человека животном, имеющем в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12;(I) performing the method according to any one of paragraphs. 28-44 for the first time in the first non-human animal having a humanized endogenous F12α locus in its genome;
(II) изменение переменной и выполнение способа стадии (I) второй раз с измененной переменной на втором отличном от человека животном, имеющем в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12; и(II) changing the variable and performing the method of step (I) a second time with the changed variable in a second non-human animal having a humanized endogenous F12α locus in its genome; And
(III) сравнение активности реагента, нацеленного на фактор XII человека, на стадии (I) с активностью реагента, нацеленного на фактор XII человека, на стадии (II), и выбор способа, обеспечивающего более высокую активность.(III) comparing the activity of the human factor XII-targeting reagent in step (I) with that of the human factor XII-targeting reagent in step (II) and selecting a method that provides higher activity.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки, в котором реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, вводят отличному от человека животному.46. The method of claim 45, wherein the altered variable in step (II) is a delivery method in which a reagent targeting human coagulation factor XII is administered to a non-human animal.
47. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ введения реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, отличному от человека животному.47. The method of claim 45, wherein the altered variable in step (II) is a method of administering a reagent targeting human coagulation factor XII to a non-human animal.
48. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, введенного отличному от человека животному.48. The method of claim 45, wherein the variable in step (II) is the concentration or amount of a reagent targeting human coagulation factor XII administered to a non-human animal.
49. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой форму реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, введенного отличному от человека животному.49. The method of claim 45 wherein the altered variable in step (II) is the form of the human coagulation factor XII targeting reagent administered to a non-human animal.
50. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, введенный отличному от человека животному.50. The method of claim 45 wherein the altered variable in step (II) is a reagent targeting human coagulation factor XII administered to a non-human animal.
51. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-23, включающий51. The method of obtaining a non-human animal according to any one of paragraphs. 1-23 including
(а) введение в эмбрион отличного от человека животного-хозяина, генетически модифицированной эмбриональной стволовой (ЭС) клетки отличного от человека животного, содержащей в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12, в котором сегмент эндогенного локуса F12 был удален и заменен соответствующей последовательностью F12 человека; и(a) introducing into a non-human animal host embryo a genetically modified non-human embryonic stem (ES) cell containing in its genome a humanized endogenous F12 locus in which a segment of the endogenous F12 locus has been deleted and replaced with a corresponding human F12 sequence; And
(b) вынашивание эмбриона отличного от человека животного-хозяина суррогатной матерью, причем суррогатная мать производит генетически модифицированное отличное от человека животное потомства F0, имеющее гуманизированный эндогенный локус F12. (b) carrying a non-human animal host embryo into the surrogate mother, wherein the surrogate mother produces a genetically modified F0 non-human animal progeny having a humanized endogenous F12 locus.
52. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-23, включающий: 52. The method of obtaining a non-human animal according to any one of paragraphs. 1-23, including:
(а) введение в эмбриональную стволовую (ЭС) клетку отличного от человека животного нацеленного вектора, содержащего вставку нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность F12 человека, фланкированную 5’-плечом гомологии, соответствующим 5'-последовательности-мишени в эндогенном локусе F12, и 3’-плечом гомологии, соответствующим 3’-последовательности-мишени в эндогенном локусе F12, (a) introducing into an embryonic stem (ES) cell a non-human animal targeting vector containing a nucleic acid insert containing a human F12 sequence flanked by a 5' homology arm corresponding to the 5' target sequence at the endogenous F12 locus, and 3' - a homology arm corresponding to the 3' target sequence at the endogenous F12 locus,
где нацеленный вектор рекомбинирует с эндогенным локусом F12 с образованием генетически модифицированной ЭС клетки отличного от человека животного, содержащей в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12, содержащий последовательность F12 человека;where the targeted vector recombines with the endogenous F12 locus to form a genetically modified ES cell of a non-human animal containing in its genome a humanized endogenous F12 locus containing the human F12 sequence;
(b) введение генетически модифицированной ЭС клетки отличного от человека животного в эмбрион отличного от человека животного-хозяина;(b) introducing a genetically modified non-human ES cell into a non-human animal host embryo;
(c) вынашивание эмбриона отличного от человека животного-хозяина суррогатной матерью, при этом суррогатная мать производит модифицированное отличное от человека животное потомства F0, имеющее в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12, содержащий последовательность F12 человека. (c) carrying a non-human animal host embryo into the surrogate mother, wherein the surrogate mother produces a modified F0 non-human animal progeny having in its genome a humanized endogenous F12 locus containing the human F12 sequence .
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что нацеленный вектор представляет собой большой нацеленный вектор длиной по меньшей мере 10 т.п.н. или в котором сумма длин 5'- и 3'-плеч гомологии составляет по меньшей мере 10 т.п.н.53. The method of claim 52, wherein the targeting vector is a large targeting vector at least 10 kb in length. or wherein the sum of the lengths of the 5' and 3' homology arms is at least 10 kb.
54. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-23, включающий54. The method of obtaining a non-human animal according to any one of paragraphs. 1-23 including
а) введение в эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии нацеленного вектора, содержащего вставку нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность F12 человека, фланкированную 5’-плечом гомологии, соответствующим 5'-последовательности-мишени в эндогенном локусе F12, и 3’-плечом гомологии, соответствующим 3’-последовательности-мишени в эндогенном локусе F12, a) introducing into an embryo of a non-human animal at a single cell stage a targeting vector containing a nucleic acid insert containing a human F12 sequence flanked by a 5' homology arm corresponding to the 5' target sequence at the endogenous F12 locus and a 3' homology arm corresponding to the 3' target sequence at the endogenous F12 locus,
при этом нацеленный вектор рекомбинирует с эндогенным локусом F12 с образованием генетически модифицированного нечеловеческого эмбриона на одноклеточной стадии, имеющего в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12, содержащий последовательность F12 человека;wherein the targeted vector recombines with the endogenous F12 locus to form a genetically modified non-human embryo at the single cell stage having in its genome a humanized endogenous F12 locus containing the human F12 sequence;
(b) вынашивание генетически модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии суррогатной матерью для получения генетически модифицированного отличного от человека животного поколения F0, имеющего в своем геноме гуманизированный эндогенный локус F12, содержащий последовательность F12 человека. (b) carrying a genetically modified non-human animal embryo at the single cell stage by a surrogate mother to produce a genetically modified F0 generation non-human animal having a humanized endogenous locus in its genome F12, containing the sequenceF12human.
55. Способ по любому из пп. 52-54, отличающийся тем, что стадия (а) дополнительно включает введение нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, при этом нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень в эндогенном локусе F12. 55. The method according to any one of paragraphs. 52-54, characterized in that step (a) further comprises introducing a nuclease agent or a nucleic acid encoding a nuclease agent, wherein the nuclease agent targets a target sequence at the endogenous F12 locus.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что нуклеазный агент содержит белок Cas и направляющую РНК.56. The method according to p. 55, characterized in that the nuclease agent contains a Cas protein and a guide RNA.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.57. The method of claim 56 wherein said Cas protein is a Cas9 protein.
58. Способ по п. 56 или 57, отличающийся тем, что стадия (а) дополнительно включает введение второй направляющей РНК, которая нацелена на вторую последовательность-мишень в эндогенном локусе F12. 58. The method of claim 56 or 57, wherein step (a) further comprises introducing a second guide RNA that targets a second target sequence at the endogenous F12 locus.
59. Способ по любому из пп. 51-58, отличающийся тем, что отличное от человека животное представляет собой мышь или крысу.59. The method according to any one of paragraphs. 51-58, characterized in that the non-human animal is a mouse or a rat.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что указанное отличное от человека животное представляет собой мышь.60. The method of claim 59, wherein said non-human animal is a mouse.
61. Способ оценки экспрессии короткой изоформы мРНК F12 в биологическом образце, включающий 61. A method for assessing the expression of a short F12 mRNA isoform in a biological sample, comprising
(a) обнаружение и количественную оценку РНК-транскриптов с использованием праймеров и/или зондов против одного или более экзонов 9-14 гена F12; (a) detecting and quantifying RNA transcripts using primers and/or probes against one or more exons 9-14 of the F12 gene;
(b) обнаружение и количественную оценку РНК-транскриптов с использованием праймеров и/или зондов против одного или более экзонов 1-6 гена F12, (b) detecting and quantifying RNA transcripts using primers and/or probes against one or more exons 1-6 of the F12 gene,
при этом короткая изоформа выявляется праймерами и/или зондами против экзонов 9-14, но не праймерами и/или зондами против экзонов 1-6. while the short isoform is detected by primers and/or probes against exons 9-14, but not by primers and/or probes against exons 1-6.