JPWO2020163787A5 - - Google Patents

Description

[本発明1001]
（i）ヒト血液から血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;
（ii）25mMを超える最終濃度まで該PRPにCaCl ₂ を添加し、それによりCaCl ₂ /PRP混合物を生成させる工程;および
（iii）該CaCl ₂ /PRP混合物を6時間未満撹拌し、それにより血餅および放出物を形成する工程
を含む、血小板放出物を調製するための方法。
[本発明1002]
前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
CaCl ₂ の前記最終濃度が約30mMを超える、本発明1001の方法。
[本発明1004]
CaCl ₂ の前記最終濃度が約25mM～約80mMである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
CaCl ₂ の前記最終濃度が約30mM～約50mMである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
CaCl ₂ の前記最終濃度が約35mM～約50mMである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
CaCl ₂ の前記最終濃度が約40mM～約47mMである、本発明1001の方法。
[本発明1008]
CaCl ₂ の前記最終濃度が約45mMである、本発明1001の方法。
[本発明1009]
CaCl ₂ の前記最終濃度が約80mMである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記CaCl ₂ /PRP混合物が4時間未満撹拌される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記CaCl ₂ /PRP混合物が180分未満撹拌される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記CaCl ₂ /PRP混合物が30分間～150分間撹拌される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記CaCl ₂ /PRP混合物が45分間～135分間撹拌される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記CaCl ₂ /PRP混合物が60分～90分撹拌される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記CaCl ₂ /PRP混合物が50rpm～500rpmで撹拌される、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記CaCl ₂ /PRP混合物が250rpmで撹拌される、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記放出物が、グロブリン、アルブミン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、糖タンパク質、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはラミニンを含む、本発明1001～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記放出物が、TGFβ1、TGFβ3、EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、SDF-1α、VEGFまたはHGFを含む、本発明1001～1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記放出物が、少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記放出物が、約400pg/ml～約500pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1αを含む、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1αを含む、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1αを含む、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1αを含む、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記血小板が、新鮮な血小板由来、室温に保たれた血小板由来、または以前に凍結された血小板由来であった、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記血餅を前記放出物から分離する工程をさらに含む、本発明1001～1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記放出物を濾過する工程（iv）をさらに含む、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
工程（iv）が、0.45ミクロン～1.0ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
工程（iv）が、3.0ミクロン～10ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
工程（iv）が、170ミクロン～260ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、本発明1030の方法。
[本発明1034]
工程（i）、（ii）および（iii）が閉じられた袋の中で行われる、本発明1001～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）が閉じられた袋の中で行われる、本発明1031～1033のいずれかの方法。
[本発明1036]
工程（i）、（ii）および（iii）が閉じられた系の中で行われる、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1037]
工程（i）、（ii）および（iii）が、閉じられた系の中で、工業規模で行われる、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1038]
工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）が、閉じられた系の中で、工業規模で行われる、本発明1031～1033のいずれかの方法。
[本発明1039]
方法全体が4時間またはそれ未満で行われる、本発明1001～1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
工程（i）、（ii）および（iii）の期間が3～4時間である、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1041]
工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）の期間が3時間～4時間である、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記放出物が約0.2リットル～約100リットルの収量で産生される、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記放出物が約4.5リットル～約10リットルの収量で産生される、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記放出物が約50リットル～約100リットルの収量で産生される、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1045]
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって血小板を濃縮する工程をさらに含む、本発明1001～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
本発明1001～1045のいずれかの方法によって産生された、放出物組成物。
[本発明1047]
本発明1001～1045のいずれかの方法によって産生された放出物を含む、細胞培養培地。
[本発明1048]
添加されたヘパリンを含まない、本発明1047の細胞培養培地。
[本発明1049]
細胞を培養する方法であって、哺乳動物の多血小板血漿に由来する放出物を含む細胞培養培地上で該細胞を拡大増殖させる工程を含む、方法。
[本発明1050]
前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記放出物が、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、本発明1049または1050の方法。
[本発明1052]
前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1049または1050の方法。
[本発明1053]
前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1049または1050の方法。
[本発明1054]
前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1049～1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1を含む、本発明1049～1053のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1を含む、本発明1049～1053のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1を含む、本発明1049～1053のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1を含む、本発明1049～1053のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記細胞培養培地が、添加されたヘパリンを含まない、本発明1049～1053のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記細胞が、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞またはケラチン生成細胞または線維芽細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、内皮細胞、免疫系の細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、改変された細胞、または神経細胞である、本発明1049～1053のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記細胞が間葉系幹細胞である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記放出物が、前記細胞の骨細胞への分化を刺激する、本発明1061の方法。
[本発明1063]
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって血小板を濃縮する工程をさらに含む、本発明1049～1061のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記放出物が、前記細胞の軟骨細胞または脂肪細胞への分化を刺激する、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記放出物が、前記細胞からの成分の放出を刺激する、本発明1049～1061のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記成分が、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、核酸、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1065の方法。
[本発明1065]
前記成分を収集する工程をさらに含む、本発明1065または1066の方法。
[本発明1066]
哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物であって、該放出物が約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、組成物。
[本発明1067]
前記放出物がヒト血液由来である、本発明1066の組成物。
[本発明1068]
溶液である、本発明1066または1067の組成物。
[本発明1069]
乾燥されたまたは凍結乾燥された粉末である、本発明1066または1067の組成物。
[本発明1070]
前記放出物が、少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む、本発明1066～1069のいずれかの組成物。
[本発明1071]
前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1066～1069のいずれかの組成物。
[本発明1002]
前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1066～1069のいずれかの組成物。
[本発明1073]
前記放出物が、約400pg/ml～約500pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1066～1069のいずれかの組成物。
[本発明1074]
前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、本発明1066～1069のいずれかの組成物。
[本発明1075]
前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1を含む、本発明1066～1074のいずれかの組成物。
[本発明1076]
前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1を含む、本発明1066～1074のいずれかの組成物。
[本発明1077]
前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1を含む、本発明1066～1074のいずれかの組成物。
[本発明1078]
前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1を含む、本発明1066～1074のいずれかの組成物。
[本発明1079]
添加されたヘパリンを含まない、本発明1066～1074のいずれかの組成物。
[本発明1080]
前記放出物が1つまたは複数のエキソソームを含む、本発明1066～1079のいずれかの組成物。
[本発明1081]
本発明1066～1080のいずれかの組成物を含む、治療用製剤。
[本発明1082]
哺乳動物対象を処置する方法であって、幹細胞の集団を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該幹細胞が、本発明1066～1080のいずれかの放出物組成物とともに培養されていた、方法。
[本発明1083]
前記放出物が、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記放出物が、5.0pg/ml～20pg/mlでSDF-1を含む、本発明1082または1083の方法。
[本発明1085]
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、本発明1082～1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
前記幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、本発明1082～1084のいずれかの方法。
[本発明1087]
前記幹細胞が、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、またはケラチン生成細胞である、本発明1082～1084のいずれかの方法。
[本発明1088]
幹細胞の集団が、2％～100％の一種類の分化した系統を含む、本発明1082～1084のいずれかの方法。
[本発明1089]
前記幹細胞が自家由来または同種異系である、本発明1082～1084のいずれかの方法。
[本発明1090]
前記幹細胞が、改変されたまたは操作された細胞である、本発明1082～1084のいずれかの方法。
[本発明1091]
対象を処置する方法であって、幹細胞を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該幹細胞が、ヒト血液由来血小板からの放出物とともに培養されていた、方法。
[本発明1092]
前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、本発明1091または1092の方法。
[本発明1094]
前記放出物が5.0pg/ml～20pg/mlでSDF-1を含む、本発明1091～1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
前記対象が、骨疾患、骨欠損、骨損傷、骨粗鬆症、変形性関節症、または脊髄損傷に罹患している、本発明1091の方法。
[本発明1096]
前記対象が、軟骨疾患または軟骨欠損または軟骨損傷に罹患している、本発明1091の方法。
[本発明1097]
前記対象が歯周病に罹患している、本発明1091の方法。
[本発明1098]
前記対象が自己免疫疾患に罹患している、本発明1091の方法。
[本発明1099]
前記対象が心筋梗塞に罹患している、本発明1091の方法。
[本発明1100]
前記対象が、移植片対宿主病（GvHD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸促迫症候群（ARDS）、多発性外傷、全身感染、または癌に罹患している、本発明1091の方法。
[本発明1101]
（i）哺乳動物の血液から血小板を得る工程;
（ii）25mMを超える最終濃度までPRPにCaCl ₂ を添加する工程;および
（iii）該CaCl ₂ /PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによって血餅および放出物を形成する工程であって、該放出物が約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、工程
を含む、血小板放出物を調製するための方法。
[本発明1102]
前記哺乳動物の血液が、ウマ、ネコ、ブタ、イヌ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ブタ、ウサギ、イルカ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物由来、家畜由来、またはペット由来である、本発明1101の方法。
[本発明1103]
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって前記血小板を濃縮する工程をさらに含む、本発明1101または1102の方法。
[本発明1104]
組織培養における細胞接着、細胞分化、または細胞拡大増殖を促進する方法であって、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物で組織培養容器をコーティングする工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
[本発明1105]
前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記容器が、ペトリ皿、フラスコ、またはバイオリアクターである、本発明1104または1105の方法。
[本発明1107]
骨生物学的材料を調製する方法であって、該骨生物学的材料に、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物を添加する工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
[本発明1108]
前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、本発明1107の方法。
[本発明1109]
前記骨生物学的材料が、骨生物学的移植材料、骨スポンジ、または骨パテである、本発明1107または1108の方法。
[本発明1110]
前記骨生物学的材料が、哺乳動物組織、改変された細胞、または操作された細胞をさらに含む、本発明1107または1108の方法。
[本発明1111]
凝固剤を調製する方法であって、該凝固剤に、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物を添加する工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
[本発明1112]
前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、本発明1111の方法。
[本発明1113]
（i）哺乳動物の血液から血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;
（ii）25mMを超える最終濃度までCaCl ₂ を該PRPに添加し、それによってCaCl ₂ /PRP混合物を得る工程;
（iii）該CaCl ₂ /PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによりフィブリン塊および上清を形成する工程;
（iv）繊維素溶解を防止するために抗繊維素溶解剤を添加する工程;および
（v）該多血小板フィブリンを得るために該上清を除去する工程
を含む、多血小板フィブリンを調製するための方法。
[本発明1114]
前記哺乳動物の血液が、ヒト、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物由来、家畜由来、またはペット由来である、本発明1113の方法。
[本発明1115]
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって前記血小板を濃縮する工程をさらに含む、本発明1113または1114の方法。
[本発明1116]
本発明1113～1115のいずれかの方法によって産生された、多血小板フィブリン組成物。
[本発明1117]
前記フィブリンが、検出可能なレベルのトロンビンを含まない、本発明1116の多血小板フィブリン。
[本発明1118]
（a）哺乳動物血液由来血小板からの血小板放出物と、（b）細胞培養培地補充物質として前記放出物を使用するための説明書とを含む、キット。
[本発明1119]
細胞培養培地をさらに含む、本発明1118のキット。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、例示としてのみ与えられることを理解すべきである。

Claims (58)

1. 哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物であって、該放出物が約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、組成物。
2. 前記放出物がヒト血液由来である、請求項1記載の組成物。
3. 溶液である、または
   乾燥されたまたは凍結乾燥された粉末である、
   請求項1または2記載の組成物。
4. 前記放出物が、少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む、
   前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、
   前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、
   前記放出物が、約400pg/ml～約500pg/mlでFGF塩基性を含む、
   前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、
   前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1を含む、
   前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1を含む、
   前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1を含む、かつ／または
   前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1を含む、
   請求項1～3のいずれか一項記載の組成物。
5. 添加されたヘパリンを含まない、請求項1～4のいずれか一項記載の組成物。
6. 前記放出物が1つまたは複数のエキソソームを含む、請求項1～5のいずれか一項記載の組成物。
7. 請求項1～6のいずれか一項記載の組成物を含む、治療用製剤。
8. 幹細胞の集団を含む組成物を含む、哺乳動物対象を処置するための薬学的組成物であって、該幹細胞が、請求項1～6のいずれか一項記載の放出物組成物とともに培養されていた、薬学的組成物。
9. 前記対象が、骨疾患、骨欠損、骨損傷、骨粗鬆症、変形性関節症、または脊髄損傷に罹患している、
   前記対象が、軟骨疾患または軟骨欠損または軟骨損傷に罹患している、
   前記対象が歯周病に罹患している、
   前記対象が自己免疫疾患に罹患している、
   前記対象が心筋梗塞に罹患している、または
   前記対象が、移植片対宿主病（GvHD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸促迫症候群（ARDS）、多発性外傷、全身感染、または癌に罹患している、
   請求項8記載の薬学的組成物。
10. 前記放出物が、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、かつ／または
    前記放出物が、5.0pg/ml～20pg/mlでSDF-1を含む、
    請求項8または9記載の薬学的組成物。
11. 前記幹細胞が間葉系幹細胞である、
    前記幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、
    前記幹細胞が、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、またはケラチン生成細胞である、
    前記幹細胞が自家由来または同種異系である、かつ／または
    前記幹細胞が、改変されたまたは操作された細胞である、
    請求項8～10のいずれか一項記載の薬学的組成物。
12. 幹細胞の集団が、2％～100％の一種類の分化した系統を含む、請求項8～11のいずれか一項記載の薬学的組成物。
13. （a）哺乳動物血液由来血小板からの血小板放出物と、（b）細胞培養培地補充物質として前記放出物を使用するための説明書とを含む、キット。
14. 細胞培養培地をさらに含む、請求項13記載のキット。
15. （i）ヒト血液から血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;
    （ii）25mMを超える最終濃度まで該PRPにCaCl₂を添加し、それによりCaCl₂/PRP混合物を生成させる工程;および
    （iii）該CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それにより血餅および放出物を形成する工程
    を含む、血小板放出物を調製するための方法。
16. 前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、請求項15記載の方法。
17. CaCl₂の前記最終濃度が約30mMを超える、
    CaCl ₂ の前記最終濃度が約25mM～約80mMである、
    CaCl ₂ の前記最終濃度が約30mM～約50mMである、
    CaCl ₂ の前記最終濃度が約35mM～約50mMである、
    CaCl ₂ の前記最終濃度が約40mM～約47mMである、
    CaCl ₂ の前記最終濃度が約45mMである、または
    CaCl ₂ の前記最終濃度が約80mMである、
    請求項15記載の方法。
18. 前記CaCl₂/PRP混合物が4時間未満撹拌される、
    前記CaCl ₂ /PRP混合物が180分未満撹拌される、
    前記CaCl ₂ /PRP混合物が30分間～150分間撹拌される、
    前記CaCl ₂ /PRP混合物が45分間～135分間撹拌される、
    前記CaCl ₂ /PRP混合物が60分～90分撹拌される、
    前記CaCl ₂ /PRP混合物が50rpm～500rpmで撹拌される、かつ／または
    前記CaCl ₂ /PRP混合物が250rpmで撹拌される、
    請求項15～17のいずれか一項記載の方法。
19. 前記放出物が、グロブリン、アルブミン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、糖タンパク質、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはラミニンを含む、
    前記放出物が、TGFβ1、TGFβ3、EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、SDF-1α、VEGFまたはHGFを含む、
    前記放出物が、少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約400pg/ml～約500pg/mlでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1αを含む、
    前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1αを含む、
    前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1αを含む、かつ／または
    前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1αを含む、
    請求項15～18のいずれか一項記載の方法。
20. 前記血小板が、新鮮な血小板由来、室温に保たれた血小板由来、または以前に凍結された血小板由来であった、請求項15～19のいずれか一項記載の方法。
21. 前記血餅を前記放出物から分離する工程をさらに含む、請求項15～20のいずれか一項記載の方法。
22. 前記放出物を濾過する工程（iv）をさらに含む、請求項15～21のいずれか一項記載の方法。
23. 工程（iv）が、0.45ミクロン～1.0ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、
    工程（iv）が、3.0ミクロン～10ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、または
    工程（iv）が、170ミクロン～260ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、
    請求項22記載の方法。
24. 工程（i）、（ii）および（iii）が閉じられた袋の中で行われる、
    工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）が閉じられた袋の中で行われる、
    工程（i）、（ii）および（iii）が閉じられた系の中で行われる、
    工程（i）、（ii）および（iii）が、閉じられた系の中で、工業規模で行われる、または
    工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）が、閉じられた系の中で、工業規模で行われる、
    請求項15～23のいずれか一項記載の方法。
25. 方法全体が4時間またはそれ未満で行われる、
    工程（i）、（ii）および（iii）の期間が3～4時間である、かつ／または
    工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）の期間が3時間～4時間である、
    請求項15～24のいずれか一項記載の方法。
26. 前記放出物が約0.2リットル～約100リットルの収量で産生される、
    前記放出物が約4.5リットル～約10リットルの収量で産生される、または
    前記放出物が約50リットル～約100リットルの収量で産生される、
    請求項15～25のいずれか一項記載の方法。
27. （ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項15～26のいずれか一項記載の方法。
28. 請求項15～27のいずれか一項記載の方法によって産生された、放出物組成物。
29. 請求項15～27のいずれか一項記載の方法によって産生された放出物を含む、細胞培養培地。
30. 添加されたヘパリンを含まない、請求項29記載の細胞培養培地。
31. 細胞を培養する方法であって、哺乳動物の多血小板血漿に由来する放出物を含む細胞培養培地上で該細胞を拡大増殖させる工程を含む、方法。
32. 前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、
    前記放出物が、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、
    前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、
    前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1を含む、
    前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1を含む、
    前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1を含む、かつ／または
    前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1を含む、
    請求項31記載の方法。
33. 前記細胞培養培地が、添加されたヘパリンを含まない、請求項31または32記載の方法。
34. 前記細胞が、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞またはケラチン生成細胞または線維芽細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、内皮細胞、免疫系の細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、改変された細胞、または神経細胞である、または
    前記細胞が間葉系幹細胞である、
    請求項31～33のいずれか一項記載の方法。
35. （ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項31～34のいずれか一項記載の方法。
36. 前記放出物が、前記細胞の骨細胞への分化を刺激する、
    前記放出物が、前記細胞の軟骨細胞または脂肪細胞への分化を刺激する、または
    前記放出物が、前記細胞からの成分の放出を刺激する、
    請求項35記載の方法。
37. 前記成分が、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、核酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項36記載の方法。
38. 前記成分を収集する工程をさらに含む、請求項36または37記載の方法。
39. 幹細胞を含む組成物を含む、対象を処置するための薬学的組成物であって、該幹細胞が、ヒト血液由来血小板からの放出物とともに培養されていた、薬学的組成物。
40. 前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、かつ／または
    前記放出物が5.0pg/ml～20pg/mlでSDF-1を含む、
    請求項39記載の薬学的組成物。
41. 少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、請求項39または40記載の薬学的組成物。
42. 前記対象が、骨疾患、骨欠損、骨損傷、骨粗鬆症、変形性関節症、または脊髄損傷に罹患している、
    前記対象が、軟骨疾患または軟骨欠損または軟骨損傷に罹患している、
    前記対象が歯周病に罹患している、
    前記対象が自己免疫疾患に罹患している、
    前記対象が心筋梗塞に罹患している、または
    前記対象が、移植片対宿主病（GvHD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸促迫症候群（ARDS）、多発性外傷、全身感染、または癌に罹患している、
    請求項39記載の薬学的組成物。
43. （i）哺乳動物の血液から血小板を得る工程;
    （ii）25mMを超える最終濃度までPRPにCaCl₂を添加する工程;および
    （iii）該CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによって血餅および放出物を形成する工程であって、該放出物が約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、工程
    を含む、血小板放出物を調製するための方法。
44. 前記哺乳動物の血液が、ウマ、ネコ、ブタ、イヌ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ブタ、ウサギ、イルカ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物由来、家畜由来、またはペット由来である、請求項43記載の方法。
45. （ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって前記血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項43または44記載の方法。
46. 組織培養における細胞接着、細胞分化、または細胞拡大増殖を促進する方法であって、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物で組織培養容器をコーティングする工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
47. 前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、請求項46記載の方法。
48. 前記容器が、ペトリ皿、フラスコ、またはバイオリアクターである、請求項46または47記載の方法。
49. 骨生物学的材料を調製する方法であって、該骨生物学的材料に、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物を添加する工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
50. 前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、請求項49記載の方法。
51. 前記骨生物学的材料が、骨生物学的移植材料、骨スポンジ、または骨パテである、かつ／または
    前記骨生物学的材料が、哺乳動物組織、改変された細胞、または操作された細胞をさらに含む、
    請求項49または50記載の方法。
52. 凝固剤を調製する方法であって、該凝固剤に、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物を添加する工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
53. 前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、請求項52記載の方法。
54. （i）哺乳動物の血液から血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;
    （ii）25mMを超える最終濃度までCaCl₂を該PRPに添加し、それによってCaCl₂/PRP混合物を得る工程;
    （iii）該CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによりフィブリン塊および上清を形成する工程;
    （iv）繊維素溶解を防止するために抗繊維素溶解剤を添加する工程;および
    （v）該多血小板フィブリンを得るために該上清を除去する工程
    を含む、多血小板フィブリンを調製するための方法。
55. 前記哺乳動物の血液が、ヒト、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物由来、家畜由来、またはペット由来である、請求項54記載の方法。
56. （ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって前記血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項54または55記載の方法。
57. 請求項54～56のいずれか一項記載の方法によって産生された、多血小板フィブリン組成物。
58. 前記フィブリンが、検出可能なレベルのトロンビンを含まない、請求項57記載の多血小板フィブリン。