JP2022519781A

JP2022519781A - 血小板放出物および多血小板フィブリンに関する方法および組成物

Info

Publication number: JP2022519781A
Application number: JP2021569256A
Authority: JP
Inventors: アナンドスリニヴァサン
Original assignee: バイオブリッジグローバル
Priority date: 2019-02-07
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2022-03-24
Also published as: WO2020163787A1; EP3920944A1; US20210361718A1; EP3920944A4

Abstract

本開示は、ヒト血小板放出物（hPR）、ゼノフリー培地補充物質を含む組成物および方法を提供する。本開示は、4時間未満で行われ得るhPRの迅速、効率的および大規模な製造のためのcGMP過程にも関する。本開示の血小板放出物は、成長培地のゲル化を防止し、ヘパリンまたはその他の抗凝固剤の必要性を軽減する。血小板放出物の存在下で増殖された間葉系幹細胞は、血小板溶解物を含む市販の補充物質と比較して、優れた拡大増殖速度および効力を示した。放出物は、治療的および医学的用途を有する。本開示は、多血小板フィブリンに関連する組成物および方法にも関する。

Description

相互参照
本出願は、2019年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/802,623号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本開示は、一般に、バイオテクノロジー、医療製品および細胞培養培地補充物質の商業的製造に関する。実施形態は、細胞培養培地補充物質を含む組成物、および動物血液由来の多血小板血漿からそのような補充物質を調製する方法に関する。

背景
間葉系幹細胞（MSC）は、外傷、創傷ケア（骨および軟骨の再生）、心筋梗塞および自己免疫疾患の処置において広範な用途が見出されている。さらに、例えば、負傷者の処置におけるMSCの使用には、軍事的意義が存在する。

このような様々な範囲の臨床症状において臨床的に妥当な投薬を支援するためには、MSCの独自性を損なうことなく、大規模に、優良医薬品製造基準（GMP）ガイドラインの下で細胞を拡大増殖することが重要である。幹細胞増殖の従来の手法は、長い拡大増殖時間および動物由来血清の使用などの付随する問題に依然として直面している。大規模な細胞拡大増殖という困難な過程は、バイオリアクターの使用および自動化によって改善することができる。

一般的な従来の手法は、成長培地への補充物質としてのウシ胎児血清（FBS）の使用に依存している。FBSは、細胞の成長および増殖を活発に促進することにおいて極めて重要な役割を果たす。人獣共通感染症への曝露のリスクは小さいが、異種の病原体を精査するための規制上の努力は依然として高い。さらに、動物由来タンパク質に対する免疫反応のリスクは、厳格な規制を必要とする。これらの問題を軽減するために、FDAおよびその他の規制当局は、FBSに対するゼノフリー代替物の使用を奨励してきた。しかしながら、化学組成が明らかな無血清培地の使用は、大規模拡大増殖には費用対効果がない。

臨床グレードの細胞拡大増殖に関するいくつかの報告は、成長培地へのゼノフリー補充物質としてのヒト血小板溶解物（hPL）の使用を示している。hPLは、MSCの免疫表現型に影響を及ぼすことなくMSCの成長を維持することができるが、最近の報告は、MSCの集団倍加および免疫抑制特性に対して与えるかなり一貫性のない効果を示している。このような不一致は、hPL産生方法の違いに起因する可能性がある。これに加えて、hPLを補充することにより、成長培地のゲル化が誘発され、それにより、従来の細胞培養に対してよりふさわしくない環境および拡大増殖速度がもたらされる。多くの場合、この問題は、ブタ由来の抗凝固剤であるヘパリンの添加によって軽減されるが、結局、ゼノフリー拡大増殖条件を保つというこれまでの努力を無にしてしまう。

現在、ヘパリンまたはその他の抗凝固剤の必要性が軽減される、hPL産生の商業的スケールアップのためのより効率的なプロトコル、方法およびシステムが必要とされている。さらに、商業的な量のhPLを提供するために、優良医薬品製造基準のガイドラインの下でスケールアップすることができるプロトコルが必要とされている。このようなプロトコルは、費用対効果が高いこと、汚染のリスクを最小限に抑えるために閉じられた系の中で実施されること、成長因子およびサイトカインが豊富な望ましい組成物を与えることが必要であり、過程全体が開始から終了までに最短の時間を要することが必要である。

開示の概要
本実施形態は、とりわけ、血小板放出物（hPR）、特に大規模でのhPRの製造に関する組成物および方法を含む。本開示による放出物は、本開示の方法に従って操作（例えば、脱顆粒）された細胞から得られた生成物または抽出物であり、放出物は、細胞を培養または拡大増殖させるための細胞培養培地中の補充物質として使用することができる。hPRは、成長培地のゲル化を防止し、それにより、ヘパリンまたはその他の抗凝固剤の必要性を軽減する。さらに、多血小板フィブリンに関する組成物および方法、特に大規模な多血小板フィブリンの製造を含む実施形態が存在する。

いくつかの実施形態において、hPRは、成長因子が濃縮されており、約0.05mg/dL未満のフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態において、hPRは、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、hPRは、約50pg/ml～約20pg/mlのレベルでSDF-1αを含む。いくつかの実施形態において、hPR製造過程は、最大10リットル、50リットル、100リットル、またはさらには数百リットルものhPRをもたらすことができる工業規模でおよび/または閉じられた系の中で行われる。hPRの存在下で拡大増殖された間葉系幹細胞などの幹細胞は、それらの市販の対応物と比較して優れた拡大増殖速度を示した。

ここで、実施形態には、血小板放出物の組成物、血小板放出物を含む培地補充物質、血小板放出物を含むゼノフリー血清補充物質、血小板放出物上で拡大増殖された細胞培養物、血小板放出物を含む細胞培養培地、滅菌された血小板放出物、放出物を滅菌する方法、凍結乾燥された放出物、治療用組成物、医薬製剤、血小板放出物を調製する方法、血小板放出物を製造する方法、血小板放出物を工業的に生産する方法、骨髄由来間葉系幹細胞を商業的にスケールアップする方法、細胞を拡大増殖する方法、工業規模で細胞を拡大増殖する方法、再生医療のために細胞を拡大増殖する方法、血小板放出物を産生するための閉じられた系、血小板放出物を産生するための開放系、血小板放出物の産生のための過程時間を短縮する方法、およびhPR上で増殖された間葉系幹細胞を使用して対象を処置する方法が含まれる。

本開示の方法の任意の1つまたは複数は、以下の工程の1つもしくは複数を含み得、または除外し得、以下の工程の1つもしくは複数からなり得、または以下の工程の1つもしくは複数から本質的になり得る：全血、血小板もしくは多血小板血漿（PRP）または血小板濃縮物の供給源または溶液を得る工程、秤量する工程、プールする工程、混合する工程、撹拌する工程、振盪する工程、活性化する工程、凝集する工程、遠心分離する工程、凍結する工程、解凍する工程、計量する工程、濾過する工程、二重濾過する工程、インキュベートする工程、引き起こす工程、濃縮する工程、産生する工程、凝固させる工程、ゲル化する工程、分離する工程、および包装する工程。

いくつかの態様において、本開示は、血小板放出物を調製するための方法であって、（i）ヒト血液から血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;（ii）25mMを超える最終濃度までPRPにCaCl₂を添加する工程;および（iii）CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それにより血餅および放出物を形成する工程を含む方法に関する。方法のいくつかの実施形態において、放出物は、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって濃縮する工程をさらに含む。

本開示の方法のいくつかの実施形態において、放出物は、少なくとも約300pg/mlのレベルのFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約300pg/ml～約550pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。他の実施形態において、放出物は、約350pg/ml～約520pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。さらなる実施形態において、放出物は、約400pg/ml～約500pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約450pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、509、510、515、520、525、530、535、540、545、もしくは、550pg/ml、少なくとも約300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、509、510、515、520、525、530、535、540、545、もしくは、550pg/ml、多くとも約300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、509、510、515、520、525、530、535、540、545、もしくは、550pg/ml、またはその中で導き出せる任意の範囲のレベルでFGF塩基性を含む。

本開示の方法のいくつかの実施形態において、放出物は、約5.0pg/ml～約20pg/mlのSDF-1αを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約7.0pg/ml～約15pg/mlのSDF-1αを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約8.0pg/ml～約14pg/mlのSDF-1αを含む。他の実施形態において、放出物は、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlのSDF-1αを含む。さらなる実施形態において、放出物は、約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0pg/ml、少なくとも約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0pg/ml、または多くとも約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0pg/ml、またはその中で導き出せる任意の範囲の濃度でSDF-1αを含む。

本開示の方法のいくつかの実施形態において、CaCl₂の最終濃度は約30mMを超える。いくつかの実施形態において、CaCl₂の最終濃度は約25mM～約80mMである。いくつかの実施形態において、CaCl₂の最終濃度は約30mM～約50mMである。さらなる実施形態において、CaCl₂の最終濃度は約40mM～約47mMである。さらに別の実施形態において、CaCl₂の最終濃度は約45mMである。本開示の方法のいくつかの実施形態において、CaCl₂の最終濃度は80mMである。いくつかの実施形態において、CaCl₂最終濃度は約80mM～約90mMである。いくつかの実施形態において、CaCl₂の最終濃度は、少なくとも約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100mM、多くとも約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100mM、または約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100mMであり、またはそれを超える（またはその中で導き出せる任意の値）。いくつかの実施形態において、当業者によって認識され得るように、濃度はカルシウム塩の選択に応じて変化する。いくつかの実施形態において、カルシウム塩は、グルコン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウムもしくはその他のカルシウム塩であり、またはカルシウム塩は、グルコン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウムもしくはその他のカルシウム塩を含む。

いくつかの実施形態において、血小板放出物を調製するための方法は、最初から最後まで、4時間以下または2.5時間～4時間を要する。いくつかの実施形態において、方法の期間は、少なくとも2、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、もしくは8.0時間、多くとも2、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、もしくは8.0時間、または約2、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、もしくは8.0時間、またはその中で導き出される任意の範囲である。いくつかの実施形態において、方法の期間は、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300分、または約120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300分であり、およびその中で導き出せる任意の範囲である。方法の開始は、いくつかの実施形態において、血液試料の血液型を試験すること、対象もしくは生物学的試料から血液を得ること、生物学的試料から血小板を得ること、生物学的試料から血小板を単離すること、凍結された血小板の試料を解凍すること、または生物学的試料から血漿を単離することから始まり、いくつかの実施形態において、血小板を含有する混合物を撹拌して放出物を生成すること、放出物を遠心分離すること、放出物を濾過すること、放出物を保存すること、放出物を凍結すること、放出物を細胞培養培地と混合すること、または細胞を放出物と培養することで終了する。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）および（iii）は、それぞれ、ヒト血液の血小板を得ること（例えば、単離すること）、PRPにCaCl₂を添加すること、およびCaCl₂/PRP混合物を撹拌して血餅を形成することであると理解される。いくつかの実施形態において、工程（i）は、過剰な血漿を除去することによって血小板を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）および（iii）の期間は、2時間～6時間（例えば、3時間～4時間）である。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）の期間は、2時間～6時間（例えば、3時間～4時間）である。

本開示の方法のいくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は約4時間未満撹拌される。いくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は約6時間未満撹拌される。他の実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は約180分未満撹拌される。さらなる実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は約30分間～約150分間または45～135分間撹拌される。さらに他の実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は60分～90分撹拌される。いくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240分間、または多くとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240分間、または20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240分間、またはその中で導き出される任意の範囲で撹拌される。

本開示の方法のいくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は、50rpm～500rpmである分当たり一定の回転で撹拌される。本開示の方法のいくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は、150rpm～350rpmである分当たり一定の回転で撹拌される。いくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500rpm、または多くとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500rpm、または約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500rpm、またはその中で導き出せる任意の値であるrpmで撹拌される。約50Lまたは約100Lのバッチサイズを含む本開示の方法のいくつかの実施形態において、rpmは、少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250rpm、多くとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250rpm、または約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250rpm、またはその中で導き出せる任意の値であり得る。

本開示は、血漿（例えば、多血小板血漿）に由来するヒト血小板放出物に関する。いくつかの実施形態において、血小板は、提供の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30日後、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30日後であり、またはその中で導き出せる任意の値である。「日」は24時間またはそれ未満を意味し、例えば、3日は72時間またはそれ未満の時間を意味する。いくつかの実施形態において、放出物は新鮮な血小板（すなわち、提供の24時間以内）に由来する。いくつかの実施形態において、血小板は有効期限切れである。いくつかの実施形態において、有効期限が切れた血小板は、提供後少なくとも7日、提供後少なくとも14日、提供後少なくとも21日、提供後少なくとも30日または提供後多くとも7日、提供後多くとも14日、提供後多くとも21日、提供後多くとも30日である。いくつかの実施形態において、血小板は室温（例えば、23℃～25℃）で保存される。いくつかの実施形態において、血小板は低温保存された血小板（例えば、4℃～20℃）である。いくつかの実施形態において、血小板は凍結される。いくつかの実施形態において、血小板は、約-55℃～約-80℃またはこの範囲の任意の温度で凍結される。いくつかの実施形態において、血小板濃縮物を得るために、血漿はさらに濃縮される。いくつかの実施形態において、血小板濃縮物は、約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75パーセント、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）高い、もしくは約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20倍、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）高い、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75パーセント、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）高い、もしくは少なくとも約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20倍、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）高い、または多くとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75パーセント、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）高い、もしくは多くとも約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20倍、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）高い濃縮レベルを有する。いくつかの実施形態において、血漿は濃縮されない。

いくつかの実施形態において、放出物は、哺乳動物の多血小板血漿に由来する。いくつかの実施形態において、血小板は、ヒト多血小板血漿に由来する。いくつかの実施形態において、血小板は、ウマ、イヌ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ブタ、ウサギ、イルカ、ヒツジ、マウス、ラットまたはサルの血液に由来する。いくつかの実施形態において、血小板は、スポーツ動物、家畜またはペットに由来する。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％、約1％またはそれ未満の血餅が分離された放出物中に検出可能に残存するように、血餅を放出物から分離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、血餅はフィブリン塊である。いくつかの実施形態において、血餅は血液からの細胞および細胞片を被包する。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、放出物を濾過する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、放出物は、0.45ミクロン～1.0ミクロンのフィルターであるフィルターを用いて濾過される。いくつかの実施形態において、フィルターは、0.45ミクロン、0.50ミクロン、0.55ミクロン、0.60ミクロン、0.65ミクロン、0.70ミクロン、0.75ミクロン、0.80ミクロン、0.85ミクロン、0.90ミクロン、0.95ミクロン、1.0ミクロン、またはその中で導き出せる任意のサイズである。いくつかの実施形態において、フィルターは3ミクロン～10ミクロンのフィルターである。いくつかの実施形態において、フィルターは、少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0ミクロン、または多くとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0ミクロンまたはその中で導き出せる任意のサイズである。いくつかの実施形態において、フィルターは170ミクロン～260ミクロンのフィルターである。いくつかの実施形態において、フィルターは170ミクロン～260ミクロンのフィルターである。いくつかの実施形態において、フィルターは、少なくとも170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260ミクロン、または多くとも170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260ミクロンまたはその中で導き出せる任意の範囲のフィルターである。

血小板放出物を調製するための方法のいくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）および（iii）は、閉じられた袋の中で行われる。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）および（iii）は、閉じられた系の中で行われる。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）および（iii）は、閉じられた系の中で、工業規模で行われる。本明細書に提示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、これらの方法は、放出物を濾過する工程（iv）をさらに含む。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）は、閉じられた袋の中で行われる。いくつかの実施形態において、濾過工程も閉じられた系の一部である。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）の一部または全部は、閉じられた系の中で行われる。いくつかの実施形態において、工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）の一部または全部は、開放された系において行われる。

血小板放出物を調製するための方法のいくつかの実施形態において、放出物は、約0.2リットル～約10リットルの収量で産生される。いくつかの実施形態において、放出物は、約4.5リットル～約10リットルの収量で産生される。いくつかの実施形態において、収量は、少なくとも2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、もしくは10リットル、多くとも2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、もしくは10リットル、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、もしくは10リットル、またはその中で導き出せる任意の値である。血小板放出物を調製するための方法のいくつかの実施形態において、放出物は、約0.2リットル～約100リットルの収量で産生される。いくつかの実施形態において、放出物は、約50リットル～約100リットルの収量で産生される。いくつかの実施形態において、収量は、少なくとも2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100リットル、多くとも2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100リットル、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100リットル、またはその中で導き出せる任意の値である。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって産生された放出物組成物に関する。放出物組成物の量は、約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100リットル、多くとも約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100リットル、または少なくとも約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100リットル、またはその中で導き出せる任意の値であり得る。

他の態様において、本開示は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって産生された放出物を含む細胞培養培地に関する。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、添加されたヘパリンまたはその他の抗凝固剤を含まない。

本開示のさらなる態様は、細胞（例えば、幹細胞）を培養する方法であって、ヒトまたは哺乳動物の多血小板血漿からの放出物を含む細胞培養培地上で細胞を拡大増殖させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施形態において、放出物は、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約300pg/ml未満のレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約5.0pg/ml～約20pg/mlのレベルでSDF-1αを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は添加されたヘパリンを含まない。いくつかの実施形態において、細胞は、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、造血幹細胞（HSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞またはケラチン生成細胞または線維芽細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、内皮細胞、免疫系の細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、改変された細胞（例えば、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞）または神経細胞である。いくつかの実施形態において、放出物は、細胞からの成分の放出を刺激する。いくつかの実施形態において、放出物は、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、核酸またはこれらの組み合わせの放出を刺激する。いくつかの実施形態において、放出物は、エキソソームの放出を刺激する。いくつかの実施形態において、方法は、放出物を含む細胞培養培地上で拡大増殖された細胞から放出された成分を回収することを含む。

本開示のさらなる態様は、幹細胞の集団を含む組成物を哺乳動物対象に投与することを含む、哺乳動物対象を処置する方法であって、幹細胞は、本明細書中に記載されている放出物組成物とともに培養されていた、方法に関する。いくつかの実施形態において、幹細胞は間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、多能性幹細胞（PSC）または人工多能性幹細胞（iPSC）または任意の関連する分化の系統である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は自家である。他の実施形態において、幹細胞は同種異系である。いくつかの実施形態において、幹細胞は異種性である。いくつかの実施形態において、幹細胞は改変された（engineered）細胞または操作された（manipulated）細胞である。

いくつかの実施形態において、幹細胞の集団は、2～100％の分化の特定の系統の細胞を含む。いくつかの実施形態において、本開示の放出物組成物とともに幹細胞を培養する方法は、ある系統のパーセンテージが、総集団の1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％またはその中で導き出せる任意の値である細胞の集団をもたらす。

本開示のさらなる態様は、対象を処置する方法であって、幹細胞を含む組成物を対象に投与する組成物を対象に投与する工程を含み、幹細胞は、ヒト血液由来血小板からの放出物とともに培養されており、細胞は、本明細書に記載されている放出物組成物とともに培養されていた、方法に関する。

本開示のさらなる態様は、対象を処置する方法であって、幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含み、幹細胞は、ヒト血液由来血小板からの放出物とともに培養されており、放出物は、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、対象は、骨疾患、骨欠損（defect）、骨損傷、骨粗鬆症、変形性関節症または脊髄損傷に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、軟骨疾患または軟骨欠損または軟骨損傷に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、骨、腱、軟骨または筋肉の損傷を患っている。いくつかの実施形態において、対象は歯周病に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、自己免疫疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、心筋梗塞に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、移植片対宿主病（GvHD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸促迫症候群（ARDS）、多発性外傷（poly-trauma）、全身感染または癌に罹患しており、または罹患したことがある。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト動物対象である。

本開示のさらなる態様は、ヒトまたは哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、放出物は、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約300pg/ml未満のレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約5.0pg/ml～約20pg/mlのレベルでSDF-1αを含む。いくつかの実施形態において、放出物は血小板からの微小胞を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、血小板からのエキソソームを含む。

本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載されている放出物を含む製剤に関する。製剤は、骨、筋肉、皮膚、神経、腱、結合組織、眼組織、歯周組織または心血管組織を含むがこれらに限定されない患部組織または損傷組織の処置などの治療目的のために使用され得る。いくつかの実施形態において、製剤は、例えばドライアイを含む眼の症状を処置または緩和するための治療目的のために使用される。いくつかの実施形態において、本開示の製剤は、人工または合成の涙液製剤であり得る。

本開示の組成物、製剤および方法のいくつかの実施形態において、放出物は、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約300pg/ml～約550pg/ml、350pg/ml～520pg/mlまたは約400pg/ml～約500pg/mlでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約450pg/mlでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、FGF塩基性は、少なくとも300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550pg/mlであり、または多くとも300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550pg/mlであり、または約300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550pg/mlである。

本開示の方法または組成物のいくつかの実施形態において、放出物は、グロブリン、アルブミン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、ホルモンおよびフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの糖タンパク質またはその他の化合物を含む。いくつかの実施形態において、放出物は微小胞または細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態において、放出物はエキソソームを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、TGFβ1、EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、SDF-1α、VEGFまたはHGFを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、表1に列挙されているタンパク質の1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、表1に列挙されているタンパク質の1つまたは複数を含まない。いくつかの実施形態において、放出物は、表1に列挙されているタンパク質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、100、150、もしくは200、またはその中で導き出せる任意の値を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、表1に列挙されているタンパク質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、100、150、もしくは200、またはその中で導き出せる任意の値を含まない。いくつかの実施形態において、放出物は、.01pg/ml、0.02pg/ml、0.03pg/ml、0.04pg/ml、0.05pg/ml、0.06pg/ml、0.07pg/ml、0.08pg/ml、0.09pg/ml、0.1pg/ml、0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.4pg/mlまたは0.5pg/ml未満の、表1に列挙されているタンパク質の1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、0.1pg/ml未満の、表1に列挙されているタンパク質の1つまたは複数を含む。

本開示のいくつかの態様は、hPR上で拡大増殖された、間葉系幹細胞、内皮細胞、線維芽細胞、免疫系の細胞（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞またはその他の改変された細胞）、または神経細胞を使用して、負傷者を処置する方法に関する。本開示中で論述される工程および実施形態は、これらの方法のいずれかの一部として企図される。

本開示のさらなる態様は、組織培養における細胞接着、細胞分化または細胞拡大増殖を促進する方法であって、ヒト血液由来血小板からの放出物を含む組成物で組織培養容器をコーティングする工程を含み、放出物は、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、容器はペトリ皿、フラスコまたはバイオリアクターである。

本開示のさらなる態様は、骨生物学的材料を調製する方法であって、ヒト血液由来血小板からの放出物を含む組成物を前記骨生物学的材料に添加する工程を含み、放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、骨生物学的材料は、骨生物学的移植材料、骨スポンジまたは骨パテである。いくつかの実施形態において、骨生物学的材料は、哺乳動物組織、改変された細胞または操作された細胞をさらに含む。

いくつかの態様において、本開示は、凝固剤を調製する方法であって、前記凝固剤に、ヒト血液由来血小板からの放出物を含む組成物を添加する工程を含み、放出物が約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法に関する。

いくつかの態様において、本開示は、哺乳動物血液由来血小板から多血小板フィブリンを調製するための方法であって、（i）ヒト血液の血小板を得て（例えば、単離して）、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;（ii）25mMを超える最終濃度までCaCl₂をPRPに添加する工程;（iii）CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによりフィブリン塊および上清を形成する工程;（iv）繊維素溶解を防止するために抗繊維素溶解剤を添加する工程;および（v）多血小板フィブリンを得るために上清を除去する工程を含む方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、過剰な血漿を除去することによって濃縮する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物の血液は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ブタ、ウサギ、イルカ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物（sport animal）の血液、家畜（farm animal）の血液、またはペットの血液である。いくつかの実施形態において、放出物を産生するために使用される任意の工程または方法を使用して、多血小板フィブリンを産生し得る。このような工程および方法は、繊維素溶解を防止するために抗繊維素溶解剤を添加すること、および次いで上清を除去して多血小板フィブリンを得ることをさらに含み得る。他の態様において、本開示は、本明細書に記載されている方法によって産生される多血小板フィブリン組成物に関する。いくつかの実施形態において、多血小板フィブリンは、検出可能なレベルのトロンビンを含まない。

態様は、哺乳動物血液由来血小板からの血小板放出物を含むキットに関する。キットは、追加の成分、例えば細胞培養培地またはその他の細胞培養添加剤を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、細胞培養培地補充物質として放出物を使用するための説明書を含む。

本明細書に記載されている任意の方法または組成物または方法工程は、本明細書に記載されている任意の他の方法または組成物に関して実施することができること、および異なる実施形態が組み合わされ得ることが企図される。特定の実施形態において、多血小板フィブリンを生成する方法は、放出物を産生するために使用される1つまたは複数の工程を含み、その逆も同様である。

1つまたは複数の方法工程または組成物の使用は、本明細書中に記載されている方法のいずれかに基づいて使用され得る。その他の実施形態は、本出願を通じて論述されている。本開示の一態様に関して論述されている任意の実施形態は、本開示の他の態様にも適用され、その逆も同様である。実施例の部の中の実施形態は、本明細書に記載されている技術のすべての態様に適用可能な実施形態であると理解される。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、例示としてのみ与えられることを理解すべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。

図1A～1Oは、血漿、血小板溶解物、組成が明らかな化学培地、またはFBSを供給された培地と比較した、本開示の例示的な放出物中の様々な成長因子サイトカイン、インターロイキン、インターフェロンの量および同一性を示す。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、示されている各値は真の濃度値の半分である。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Aの説明を参照のこと。図1Pは、試料タイプを図2～図6で使用される試料IDと相関させる表を示す。「ACR」は、「Acrodose」プール血小板から得られた放出物を示す。「APH」は、単一個体のアフェレーシスから得られた放出物を示す。「前」は濾過前の試料を示す。「後」は濾過後の試料を示す。「RT」は、室温での血小板からの試料を示す。「RT」は、凍結された血小板からの試料を示す。図2は、本開示の放出物の例における様々な成長因子およびサイトカインの値を示す3次元棒グラフである。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、各値は真の濃度値の半分である。図3は、本開示の放出物の例における様々な成長因子およびサイトカインの値を示す3次元棒グラフである。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、示されている各値は真の濃度値の半分である。図4は、本開示の放出物の例における様々な成長因子およびサイトカインの値を示す3次元棒グラフである。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、示されている各値は真の濃度値の半分である。図5は、本開示の放出物の例における様々な成長因子およびサイトカインの値を示す3次元棒グラフである。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、示されている各値は真の濃度値の半分である。図6は、本開示の放出物の例における様々な成長因子およびサイトカインの値を示す3次元棒グラフである。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、示されている各値は真の濃度値の半分である。図7は、本開示の例示的な放出物を血漿、血小板溶解物、組成が明らかな化学培地、およびFBSが供給された培地と比較する主成分分析を示す。図8は、本開示の例示的な放出物からのバイオマーカーを対照と比較するヒートマップである。対照には、血漿、市販の血小板溶解物、化学的に組成が明らかな培地、およびウシ胎児血清を補充された培地が含まれる。図9は、様々な濃度のCaCl₂を使用して本開示による血小板放出物を調製する例示的な方法を試験して得られた結果を示す。25mM～80mMの範囲のCaCl₂の濃度は、細胞片を包む明確に定義されたフィブリン塊を与える。図9Aの説明を参照のこと。図10は、本開示の例示的な放出物中のフィブリノーゲンの量を示す。「ACR」は、「Acrodose」プール血小板から得られた放出物を示す。「APH」は、単一個体のアフェレーシスから得られた放出物を示す。「前」は濾過前の試料を示す。「後」は濾過後の試料を示す。「RT」は、室温での血小板からの試料を示す。「RT」は、凍結された血小板からの試料を示す。図11A～11Cは、MSC倍加に対するhPR中のCaCl₂濃度の影響を示す。CaCl₂濃度の増加は、左から右に示されている。図12A～12Cは、MSC倍加に対する血小板撹拌の期間の影響を示す。増大する撹拌期間が、Acrodose血小板とアフェレーシス血小板の間で交互に、左から右に示されている。図12Aの説明を参照のこと。図12Aの説明を参照のこと。図13は、MSC倍加に対するhPR遠心分離期間の影響を示す。ACRはAcrodose血小板であり、APHはアフェレーシスによって得られた血小板を示す。増大する遠心分離期間が、Acrodose血小板とアフェレーシス血小板の間で交互に、左から右に示されている。図14は、本開示の例示的な放出物において得られた様々な成長因子の値を示す。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、示されている各値は真の濃度値の半分である。放出物は、室温で期限切れの血小板または凍結された期限切れの血小板からのものである。図15は、本開示の例示的な放出物において得られた総タンパク質、アルブミンおよびグロブリンの値を示す。放出物は、室温で期限切れの血小板または凍結された期限切れの血小板からのものである。図16A～16Cは、本開示のhPRと対照との比較データを示す。図16Aは、総タンパク質および成長因子の値を示す。図16Bは、MSC拡大増殖に対するhPRの効果を示す。図16Cは、hPRおよび対照について得られた発光強度を示す。図17Aは、cGMP小規模製造のための本開示の一実施形態によるスキームを示す。図17Bは、30ml容量の小規模収量のための袋の一例を示す。図18は、cGMP小規模製造のための本開示の一実施形態によるスキームを示す。図19は、本開示による例示的なヒト放出物と市販の溶解物の間での総タンパク質、グロブリンおよびアルブミンに関する比較データを示す。図20A～20Bは、本開示による例示的なヒト放出物と市販の溶解物の間での成長因子に関する比較データを示す。各値は2.0の希釈係数を表す、すなわち、示されている各値は真の濃度値の半分である。図21は、本開示による例示的なヒト放出物と市販の溶解物の間での比較データを示す。図21Aは、補充物質と混合されたDMEM成長培地中で増殖させた細胞についての5日後のMSC倍加を示す。図21Bは、hPRおよび対照について得られた発光強度を示す。対照には、市販の血小板溶解物、化学的に組成が明らかな培地、およびウシ胎児血清を補充された培地が含まれる。結果は、本開示の放出物と同様の集団倍加レベル（PDL）をもたらすためには、市販の溶解物の少なくとも2倍の量を要することを示す。この結果は、MSCの拡大増殖に対する、培地補充物質としての開示された放出物の優位性も示す。図22A～22Fは、本開示の例示的な放出物（放出物F1および放出物F2）からのバイオマーカーを対照と比較するヒートマップを示す。対照には、ヒト血清（AB Serum）、市販の血小板溶解物（溶解物A、溶解物B、溶解物C）、およびウシ胎児血清（FBS）を補充した培地が含まれる。これらのデータは、放出物の組成が血小板溶解物とは異なることを示す。図22Aは、類似性に基づいて5つの群にグループ分けされた、試験されたすべてのバイオマーカーのヒートマップを示す。図22Bは、群1中のバイオマーカーのヒートマップの部分を示す。図22Cは、群2中のバイオマーカーのヒートマップの部分を示す。図22Dは、群3中のバイオマーカーのヒートマップの部分を示す。図22Eは、群4中のバイオマーカーのヒートマップの部分を示す。図22Fは、群5中のバイオマーカーのヒートマップの部分を示す。図23は、種々の添加物:ウシ胎児血清（FBS）、ヒトAB血漿（AB血清）、市販の溶解物（溶解物A、溶解物B、溶解物C）または本開示の例示的な放出物（放出物F1、放出物F2）とともに培養された3名の異なるドナー由来の間葉系幹細胞（MSC）の集団倍加レベルを示す。図24は、様々な補充物質:ウシ胎児血清（FBS）、ヒトAB血漿（AB血清）、市販の溶解物（溶解物A、溶解物B、溶解物C）、本開示の例示的な放出物（放出物F1、放出物F2）、またはプールされた血漿を用いて拡大増殖された細胞に対して行ったタンパク質濃度アッセイの結果を示す。図25Aおよび25Bは、休止血小板（図25A）および活性化された血小板（図25B）の走査型電子顕微鏡（SEM）画像を示す。図26Aは、活性化過程（CaCl₂添加、撹拌）による局所的変化を示す活性化された血小板のSEM画像である。図26Bは、脱顆粒を実証する活性化された血小板の断面を示す透過型電子顕微鏡（TEM）画像であり、小胞（例えば、α顆粒、密顆粒、ミトコンドリアなど）が細胞から出て、その内容物を周囲の培地中に放出するか、または完全な状態のままである。図27は、活性化された血小板の断面のTEM画像であり、顆粒（例えば、α顆粒、密顆粒、ミトコンドリアなど）が細胞の末梢方向に移動し、独立した小胞として剥離しまたは放出することが観察される（矢印、左上および右上）。細胞外の小胞は、その内容物を周囲の培地中に放出するか、完全な状態のままであることが示されている（矢印、左下）。図28は、脱顆粒を示す活性化された血小板の断面のTEM画像であり、顆粒が細胞の末梢の方向に移動し、独立した小胞として剥離しまたは放出することが観察される。小胞は、サイズ（矢印、左下）および内容物が異なることが示されている。細胞は、周囲の培地中に因子を放出することも示されている（矢印、左中央）。図29は、脱顆粒後の血小板の断面のTEM画像を示し、細胞が顆粒を欠いている（例えば、α顆粒、密顆粒、ミトコンドリアなど）が完全な状態のままである（すなわち、溶解されていない）ことを実証する。フィブリンとともに捕捉されている細胞外の小胞（暗い鎖）も示されている。図30Aは、フィブリンマトリックス中に埋め込まれたまたは被包された血小板のSEM画像を示す。図30Bは、メッシュ内に捕捉された血小板を有するフィブリンポリマーの鎖を示す。図31は、骨髄由来MSC（BM-MSC）の拡大増殖およびMSCマーカー分析の結果を示す。図32A～32Gは、BM-MSCの脂肪生成能を評価するために、図示されているように、様々な補充物質の1つが補充された基礎成長培地中で拡大増殖されたBM-MSCの顕微鏡画像を示す。図33A～33Gは、BM-MSCの軟骨形成能を評価するために、図示されているように、様々な補充物質の1つが補充された基礎成長培地中で拡大増殖されたBM-MSCの顕微鏡画像を示す。図34A～34Gは、BM-MSCの骨形成能を評価するために、図示されているように、様々な補充物質の1つが補充された基礎成長培地中で拡大増殖されたBM-MSCの顕微鏡画像を示す。図35は、図示されているように、様々な補充物質の1つが補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させ、サイトカイン刺激に応答したインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）の合成による免疫調節について評価した、免疫調節実験の結果を示す。試料は、各条件について左から右に、FBS、溶解物A、溶解物C、放出物F1および放出物F2である。図36は、図示されているように、様々な補充物質の1つが補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させ、BM-MSCの存在下で末梢血単核球（PBMC）を5日間共培養することによって免疫調節について評価した免疫調節実験の結果を示す。図37は、図示されているように、様々な補充物質の1つが補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させ、BM-MSCの存在下でPBMCを5日間共培養することによって免疫調節について評価した免疫調節実験の結果を示す。

例示的態様の説明
I. 定義
本明細書で使用される「現行優良医薬品製造基準（cGMP）」という用語は、製品が品質基準に従って一貫して製造および管理されることを保証する最小限のガイドラインの系を指す。cGMPは、最終製品の試験を通じて排除することができない医薬品製造に伴うリスクを最小限に抑えるように設計されている。これらのガイドラインは、製造業者の製品がその意図される用途のためにバッチごとに一貫して高品質であることを保証するために、製造業者が満たさなければならない最小要件を規定する。

「細胞培養」という用語は、インビトロでの細胞の維持および増殖を指す。細胞は、幹細胞および前駆細胞を含み得る。

「細胞培養培地」は、インビトロでの培養における細胞の維持のために使用される。いくつかの細胞型では、培地は、培養中の細胞の拡大および増殖を支えるのに十分でもあり得る。本発明による培地は、エネルギー源、アミノ酸および無機イオンならびに当業者に公知の他の化合物などの栄養素を提供する。

本開示の意味における「細胞培養培地補充物質」という用語は、細胞の増殖、分化および拡大を刺激するために培地に添加される培地添加剤を指す。通常、この補充物質は、増殖および/または分化の刺激に関与する1つまたは複数の成長因子を含有する。

「細胞の拡大増殖（expansion）」という用語は、細胞の分裂増殖（multiplication）を意味し、それによって細胞数の増加をもたらすことを意図している。

「成長因子」という用語は、特定の受容体に結合することによって細胞の増殖（proliferation）を刺激するタンパク質を含むことを意図している。通常、成長因子は、それぞれの受容体を発現する特定の細胞型にのみ作用する。

「対象」、「個体」または「患者」または「負傷者」は、本明細書では互換的に使用され、脊椎動物、例えば霊長類、哺乳動物、またはヒトを指す。哺乳動物には、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ブタ、ウサギ、イルカ、ヒツジ、マウス、ラット、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物およびペットが含まれるが、これらに限定されない。また、疾患の臨床徴候を示さない臨床研究試験に関与する任意の対象または対照として使用される対象を対象として本明細書に含めることも意図されている。

本明細書で使用される場合、「を含む（comprising）」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図している。「～から本質的になる（consisting essentially of）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載された目的のためにその組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。本開示の生物学的組成物の文脈における「～から本質的になる」は、列挙された全ての活性剤を含むことを意図し、列挙されていない任意のさらなる活性剤を除外するが、活性成分ではない組成物の他の成分を除外しない。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容され得る担体を除外しない。「からなる」は、微量を超える他の成分および本発明の組成物を投与するための実質的な方法工程または組成物を生成するためのもしくは意図した結果を達成するための過程工程を除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。

本明細書で使用される場合、「または」および「および/または」という用語は、互いに組み合わせてまたは除外して複数の成分を記載するために利用される。例えば、「x、y、および/またはz」は、「x」単独、「y」単独、「z」単独、「x、y、およびz、」「（xおよびy）またはz」、「xまたは（yおよびz）」または「xまたはyまたはz」を指すことができる。x、y、またはzが実施形態から特に除外され得ることが特に企図される。

本出願を通じて、「約」という用語は、ある値がその値を決定するために使用されている装置または方法に対する誤差の標準偏差を含むことを示すために、細胞生物学の分野におけるその平易な通常の意味に従って使用される。

「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含有する（containing）」または「特徴とする（characterized by）」と同義であり、包括的または非限定的であって、列挙されていない追加の要素または方法工程を排除しない。「からなる（consisting of）」という語句は、指定されていない要素、工程、または成分を除外する。「～から本質的になる（consisting essentially of）」という語句は、記載された主題の範囲を、指定された材料または工程、およびその基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。「含む（comprising）」という用語の文脈で記載される実施形態は、「からなる」または「から本質的になる」という用語の文脈でも実施され得ることが企図される。

本発明の一実施形態に関して論述された任意の限定は、本発明の任意の他の実施形態に適用され得ることが特に企図される。さらに、本発明の任意の組成物は本発明の任意の方法において使用し得、本発明の任意の方法は本発明の任意の組成物を製造するためにまたは利用するために使用し得る。実施例に記載されている実施形態の態様は、発明の概要、実施形態の詳細な説明、特許請求の範囲、および図の説明文の記載など、異なる実施例中の他の箇所または本出願の他の箇所において論述されている実施形態の文脈で実施され得る実施形態でもある。

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されていなければ、またはその選択肢が相互に排他的でなければ、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみおよび「および/または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第2のまたはそれを超えるものを意味し得る。

特許請求の範囲および/または明細書において「含む（comprising）」という用語と組み合わせて使用される場合の「a」または「an」という単語の使用は、「1つ」を意味し得るが、「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」、および「1または1を超える」の意味とも一致する。

「間葉系間質細胞」という用語は、プラスチック接着の特性を有し、中胚葉起源の細胞へのインビトロ分化が可能な線維芽細胞または線維芽細胞様非造血細胞の亜集団を指す。間葉系間質細胞は、骨髄、脂肪組織、臍帯（ワルトン膠様質）、臍帯血管周囲細胞、臍帯血、羊水、胎盤、皮膚、歯髄、母乳および滑膜に由来する。間葉系間質細胞はクローン形成能を有し、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞または内臓間質細胞などの中胚葉起源のいくつかの細胞に分化することができる。「間葉系幹細胞」という用語は、初代間葉系間質細胞集団の培養された（自己再生した）子孫を指す。間葉系間質/幹細胞（MSC）とは、間葉系間質細胞および/または間葉系幹細胞のことを指す。

「骨生物学的材料（osteobiologic material）」という用語は、既存のまたは新たな骨成長を誘導および/または支持することができる任意の材料を指す。いくつかの実施形態において、骨生物学的材料は耐荷重材料である。本用語は、骨折および骨欠損の治癒を促進する改変された材料（例えば、羊膜由来または胎盤由来材料、3D印刷された構築物など）も含む。

マイクロキャリアは、接着性細胞の成長を支持する支持マトリックスである。マイクロキャリア細胞培養は、フラスコまたはバイオリアクター（例えば、中空繊維バイオリアクター、ウエーブバイオリアクターなど）中で行われ得る。

本開示による「放出物」は、本開示のプロトコルまたは方法に従って操作された（例えば、脱顆粒された）ときに細胞から得られる生成物または抽出物である。放出物は、完全な細胞溶解の非存在下で細胞から得られる生成物を記載する。放出物は、血小板細胞から取得され得る（すなわち、血小板放出物であり得る）。放出物は、細胞を培養または拡大増殖させるための細胞培養培地中で補充物質として使用することができる。放出物は、骨生物学的製剤を含む治療用途においても使用することができる。放出物は、図1A～図1Oまたは表1中の成長因子または化合物の全てを含むことができる。放出物は、図1A～図1Oまたは表1中の成長因子または化合物の任意の1つまたは任意の組み合わせを除外することができる。いくつかの実施形態において、放出物は、細胞からの微小胞またはエキソソームを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、本明細書に開示される操作（例えば、脱顆粒）手順後に細胞から単離または精製されたエキソソームを含む。

用語「脱顆粒する（degranulate）」、「脱顆粒された（degranulated）」、「脱顆粒している（degranulating）」および「脱顆粒（degranulation）」は、本明細書中に開示される細胞操作のためのプロトコルまたは方法を記載し、それにより、細胞の1つまたは複数の小胞または細胞内区画が、1）それらの内容物を細胞の外側に放出し、および/または2）細胞から除去され、もしくは排除される。脱顆粒は、完全な細胞溶解を含まない過程を記載する。

本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」または「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るために使用されるアプローチまたは方法論である。これには、症候の軽減、炎症の軽減、患部または創傷組織または器官の改善が含まれる。

「幹細胞」という用語は、特殊化されておらず、細胞分裂を通して長期間にわたって再生することができ、特殊化された機能を有する細胞になるように誘導可能であるという特徴を有する任意の細胞を指す。

本明細書において使用される「含んでいる」または「含む」という用語は、組成物、方法および本発明にとって不可欠であるこれらの各成分に関して使用されるが、不可欠であるか否かを問わず、指定されていない要素の包含に対してなお開かれている。

本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に対して必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的および新規なまたは機能的特性に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。薬学的組成物に関して、「～から本質的になる」という用語は、列挙された活性成分を含み、他の活性成分を除外するが、治療的に活性ではない任意の薬学的賦形剤またはその他の成分を除外しない。

「～からなる」という用語は、実施形態のその記述中に記載されていない任意の要素を除外する、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分を指す。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上明確に別段の指示がなければ、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、1つもしくは複数の方法、および/または本明細書に記載された種類の工程を含み、および/または本開示などを読めば当業者には明らかになるであろう。

語句「および/または」は、「および」または「または」を意味する。例示すると、A、Bおよび/またはCは、A単独、B単独、C単独、AとBの組み合わせ、AとCの組み合わせ、BとCの組み合わせ、またはA、B、およびCの組み合わせを含む。言い換えれば、「および/または」は包括的な「または」として機能する。

本出願を通して、「約」という用語は、値が測定または定量方法に対する誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。

II. 概要
本発明者らは、FBSおよび血小板溶解物の両方に対するゼノフリーの代替物となる血小板放出物（hPR）を工業的に製造することができる過程を開発した。hPRは、成長培地のゲル化を防止し、ヘパリンまたはその他の抗凝固剤の必要性を軽減する。本開示の過程は、成長因子および細胞増殖にとって有益なその他の化合物が一貫して十分に存在するhPRのバッチをもたらす。いくつかの実施形態において、hPR製造プ過程は、最大10リットル、50リットル、100リットルまたは数百リットルのhPRをもたらすことができる閉じられた系の中で、工業規模で行われる。いくつかの実施形態において、収量は4.5～10Lである。いくつかの実施形態において、収量は、約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、もしくは、10リットル、少なくとも約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、もしくは、10リットル、または多くとも約2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、もしくは、10リットル、またはその中で導き出せる任意の値である。いくつかの実施形態において、収量は、約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300リットル、少なくとも約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300リットル、または多くとも約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300リットルまたはその中で導き出せる任意の値である。いくつかの実施形態において、例えば、10、20、30、40、50、または100リットルのhPRのバッチは、10L、20L、30L、40L、50L、または100Lの袋の中で調製される。いくつかの実施形態において、収量はプールすることができる。

本開示の放出物は、幹細胞およびそれらの関連する系統を含む様々な細胞を培養、拡大増殖または分化させるための細胞培養培地補充物質として使用され得る。いくつかの実施形態において、放出物は、冷温貯蔵または低温貯蔵などの細胞の長期貯蔵のための貯蔵媒体の成分として使用される。例示的な細胞としては、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、造血幹細胞（HSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞またはケラチン生成細胞が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本開示の放出物は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）を培養/拡大増殖させて、抗体、組換えタンパク質およびペプチドを製造するために使用され得る。他の細胞としては、線維芽細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞内皮細胞、免疫系の細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、改変された/操作された細胞および神経細胞が挙げられる。

塩による活性化
開示される方法の態様は、塩を使用した血小板の活性化を含む。塩は、血小板に添加されると凝固剤として作用し得、ゲル様であり、細胞片を含むフィブリン塊の形成を引き起こし得る。様々な塩が企図され、例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩を含む放出物を調製するための開示された方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、カルシウム塩、例えば硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウム（CaCl₂）、酢酸カルシウムおよび/または炭酸カルシウムが使用される。いくつかの実施形態において、塩化カルシウム（CaCl₂）が使用される。いくつかの実施形態において、マグネシウム塩、例えば、硫酸マグネシウム（MgSO4）、グルコン酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化マグネシウム（MgCl₂）、酢酸マグネシウムおよび/または炭酸マグネシウムが使用される。

いくつかの態様において、本発明者は、例えばCaCl₂について25mM～80mM程度のはるかに高い塩濃度が改善された生成物をもたらすという予想外の発見に基づく、多血小板血漿からhPRを調製するための方法を開発した。この発見は、従来の推奨および当技術分野で教示されているものと矛盾し、開始から終了まで3時間～4時間で完了することができるはるかに効率的な過程をもたらす。血餅を除去すると、得られた液体は、成長因子、微粒子（例えば、エキソソーム）、およびその他の生物活性物質が十分に存在する透明な上清である。添加されるCaCl₂の量は、約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95mM、もしくは、100mM、少なくとも約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95mM、もしくは、100mM、または多くとも約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95mM、もしくは、100mM、またはその中で導き出せる任意のその他の値のCaCl₂の最終濃度をもたらすことができる。

血小板の供給源は、有効期限が切れた多血漿血小板または任意の適切な血液供給源であり得る。いくつかの実施形態において、血液源はヒトである。血小板の供給源は、凍結されまたは室温で維持され得る。血小板は、-50℃または-80℃またはその間の任意の適切な温度で凍結され得る。血小板は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、もしくは24時間または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、もしくは24時間、またはその中で導き出せる任意の範囲もしくは値の間、凍結され得る。いくつかの実施形態において、血小板は24時間未満凍結される。血小板は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、100、200、もしくは300日間、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、100、200、もしくは300日間、またはその中で導き出せる任意の範囲もしくは値の間、凍結され得る。

多血小板血漿の有効期限が切れたユニットは、ABO血液型に関してプールされ得る。血球数および/または感染症マーカー検査結果が取得され得、それに応じてユニットは一緒にプールされ得る。いくつかの実施形態において、A型多血漿血小板が使用される。いくつかの実施形態において、B型多血漿血小板が使用される。いくつかの実施形態において、AB型多血漿血小板が使用される。いくつかの実施形態において、O型多血漿血小板のみが使用される。いくつかの態様において、血小板は、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000ミリリットル（ml）、デシリットル（dl）、またはリットル（lまたはL）の体積までプールされ得、その間のすべての値と範囲を含む。

本開示の方法のいくつかの実施形態において、血小板は、さらなる処理の前に濃縮される。いくつかの実施形態において、血小板は、さらなる処理の前に濃縮されない。塩（例えば、CaCl₂）を血小板に添加した後、例えば内容物を撹拌するためにオービタルシェーカーを使用するなどの任意の適切な方法によって混合物は撹拌される。撹拌は、任意の適切なrpmで行うことができる。いくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は50rpm～500rpmで撹拌される。撹拌は、任意の適切なrpmで行うことができる。いくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は150rpm～350rpmで撹拌される。いくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500rpm、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500rpm、または多くとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500rpm、またはその中で導き出される任意の値で撹拌される。50Lまたは100Lのバッチサイズを含む本開示の方法のいくつかの実施形態において、rpmは、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、または多くとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、またはその中で導き出される任意の値であり得る。撹拌は、1つまたは複数の機械的力を含み得る。いくつかの実施形態において、撹拌は重度の撹拌であり、重度の機械的力を含む。いくつかの実施形態において、撹拌は穏やかな撹拌であり、穏やかな機械的力を含む。撹拌のために使用され得る機械的力としては、例えば、粉砕（grinding）（例えば乳鉢/乳棒、クリオグラインダー、ガラスホモジナイザー、ビーズホモジナイザー）、ビーズおよび/またはへらを使用した撹拌（beating）、せん断（例えば、混合;ガラス、セラミックまたはスチールビーズを用いたボルテックス操作;ローター/固定子、ダウンスホモジナイザーによるホモジナイゼーション）、音響および超音波処理（例えば槽式およびプローブ式超音波処理機;超低周波、音波および超音波の波長）、フレンチプレス/フレンチプレッシャーセル、光学的方法（例えば、熱分解、キャビテーション）、電磁場（例えば、マイクロ波、電撃（shocking）、電気穿孔）、揺動、振盪（例えば、ボルテックス振盪機、プラットフォーム振盪機、オービタル振盪機、インキュベーター振盪機）、撹拌（例えば、磁気撹拌）、流動化、摩砕（milling）、凍結/熱処理、および高圧均質化が挙げられる。

塩（例えば、CaCl₂）の添加後、凝固時間は任意の適切な時間であり得、混合物は撹拌され得る。本開示の方法のいくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は20分～4時間血餅を形成させる。いくつかの実施形態において、凝固時間は60分～90分である。凝固時間は、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、60分、65分、70分、75分、80分、85分、90分、95分、100分、105分、110分、115分、120分、125分、130分、135分、140分、145分、150分、155分、160分、165分、170分、175分、180分、185分、190分、195分、200分、205分、210分、215分、220分、225分、230分、235分、240分、またはその間の任意の適切な量であり得る。いくつかの実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は180分未満撹拌される。さらなる実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は30分間～150分間または45分間～135分間撹拌される。さらに他の実施形態において、CaCl₂/PRP混合物は60分～90分撹拌される。いくつかの実施形態において、いくつかの因子（カオリンなど）は、2分～5分に凝固を促進することができる。このような因子を本方法とともに使用する場合、凝固時間は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240分、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240分、または多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240分、またはその中で導き出される任意の範囲であり得ることが企図される。

血餅が形成された後、血餅は、任意の適切な方法によって液体材料から分離することができる。一実施形態において、血餅は遠心分離によって分離される。いくつかの場合、混合物は適切な温度で遠心分離される。例えば、混合物は、4℃で4000gで遠心分離することができる。一実施形態において、エクスプレッサーまたは重力分離技術を使用して液体のデカンテーションを行うことによって、血餅は液体材料から分離される。約500、1000、2000、3000、4000、5000、約6000、7000、8000g、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）で、少なくとも約500、1000、2000、3000、4000、5000、約6000、7000、8000g、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）で、または多くとも約500、1000、2000、3000、4000、5000、約6000、7000、8000g、もしくはそれを超えて（またはその中で導き出せる任意の範囲）で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分、および/または1、2、3、4時間、もしくはそれを超える時間（またはその中で導き出せる任意の範囲）、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分、および/もしくは少なくとも1、2、3、4時間、もしくはそれを超える時間（またはその中で導き出せる任意の範囲）、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分、および/もしくは多くとも1、2、3、4時間、もしくはそれを超える時間（またはその中で導き出せる任意の範囲）、遠心分離することができる。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、放出物を濾過する工程をさらに含む。放出物を濾過することによって、最終生成物中のフィブリノーゲンおよびその他の汚染物質の量が減少する。濾過は、1回または2回の濾過で行うことができる。いくつかの実施形態において、放出物は、0.45ミクロン～1.0ミクロンであるフィルターを使用して濾過される。いくつかの実施形態において、放出物は、0.45ミクロン～0.65ミクロンであるフィルターを使用して濾過される。いくつかの実施形態において、フィルターは、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0ミクロン、またはその中で導き出せる任意のサイズである。いくつかの実施形態において、フィルターは3ミクロン～10ミクロンのフィルターである。いくつかの実施形態において、フィルターは、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0ミクロン、少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0ミクロン、または多くとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0ミクロン、またはその中で導き出せる任意のサイズである。いくつかの実施形態において、フィルターは170ミクロン～260ミクロンのフィルターである。いくつかの実施形態において、フィルターは、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260ミクロンのフィルター、またはその中で導き出せる任意の範囲である。

いくつかの実施形態において、放出物は、生成後にプールされる。いくつかの態様において、放出物は、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000ミリリットル（ml）、デシリットル（dl）、またはリットル（lまたはL）の体積までプールされ得、その間のすべての値と範囲を含む。

hPR中の成長因子およびその他の生物活性化合物
本開示によるhPR産物は、幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞が、hPRの存在下で拡大増殖されたときに、FBS、血小板溶解物および化学的に組成が明らかな培地と比較して優れた拡大増殖速度を有するような量および/または組み合わせで、成長因子、サイトカインおよびケモカインなどの複数の生物活性成分を保持する。成長因子、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロンまたはその他の成分は、アンフィレグリン（AR）（結腸直腸細胞由来成長因子）（CRDGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）（アブリニューリン）、線維芽細胞成長因子2（FGF-2）（塩基性線維芽細胞成長因子）（bFGF）（ヘパリン結合成長因子2）（HBGF-2）、骨形成タンパク質4（BMP-4）（骨形成タンパク質2B）（BMP-2B）、骨形成タンパク質5（BMP-5）、骨形成タンパク質7（BMP-7）（骨形成タンパク質1）（OP-1）（エプトテルミンアルファ）、ベータ神経成長因子（ベータ-NGF）、プロ表皮成長因子（EGF）［切断されて、表皮成長因子（ウロガストロン）になる］、表皮成長因子受容体（EC 2.7.10.1）（プロトオンコジーンc-ErbB-1）（受容体チロシンタンパク質キナーゼerbB-1）、プロキネチシン-1（内分泌腺由来血管内皮成長因子）（EG-VEGF）（マンバカイン）、線維芽細胞成長因子4（FGF-4）（ヘパリン分泌形質転換タンパク質1）（HST）（HST-1）（HSTF-1）（ヘパリン結合成長因子4）（HBGF-4）（形質転換タンパク質KS3）、線維芽細胞成長因子7（FGF-7）（ヘパリン結合成長因子7）（HBGF-7）（ケラチン生成細胞成長因子）、成長/分化因子15（GDF-15）（マクロファージ阻害性サイトカイン1）（MIC-1）（NSAID活性化遺伝子1タンパク質）（NAG-1）（NSAID調節遺伝子1タンパク質）（NRG-1）（胎盤TGF-ベータ）（胎盤骨形成タンパク質）（前立腺分化因子）、神経膠細胞株由来神経栄養因子（hGDNF）（星状細胞由来栄養因子）（ATF）、ソマトトロピン（成長ホルモン）（GH）（GH-N）（成長ホルモン1）（下垂体成長ホルモン）、プロヘパリン結合性EGF様成長因子［切断されて、ヘパリン結合EGF様成長因子（HB-EGF）（HBEGF）（ジフテリア毒素受容体）（DT-R）になる］、肝細胞成長因子（ヘパトポイエチン-A）（散乱因子）（SF）［切断されて、肝細胞成長因子アルファ鎖;肝細胞増殖因子ベータ鎖になる］、インスリン様成長因子結合タンパク質1（IBP-1）（IGF結合タンパク質1）（IGFBP-1）（胎盤タンパク質12）（PP12）、インスリン様成長因子結合タンパク質2（IBP-2）（IGF結合タンパク質2）（IGFBP-2）、インスリン様成長因子結合タンパク質3（IBP-3）（IGF結合タンパク質3）（IGFBP-3）、インスリン様成長因子結合タンパク質4（IBP-4）（IGF結合タンパク質4）（IGFBP-4）、インスリン様成長因子結合タンパク質6（IBP-6）（IGF結合タンパク質6）（IGFBP-6）、インスリン様成長因子I（IGF-I）（メカノ成長因子）（MGF）（ソマトメジン-C）、インスリン［切断されて、インスリンB鎖;インスリンA鎖になる］、マクロファージコロニー刺激因子1受容体（CSF-1受容体）（CSF-1-R）（CSF-1R）（M-CSF-R）（EC 2.7.10.1）（プロトオンコジーンc-Fms）（CD抗原CD115）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー16（Gp80-LNGFR）（低親和性ニューロトロフィン受容体p75NTR）（低親和性神経成長因子受容体）（NGF受容体）（p75 ICD）（CD抗原CD271）、ニューロトロフィン-3（NT-3）（HDNF）（神経成長因子2）（NGF-2）（神経栄養因子）、ニューロトロフィン-4（NT-4）（ニューロトロフィン-5）（NT-5）（神経栄養因子4）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー11B（破骨細胞形成阻害因子）（オステオプロテジェリン）、血小板由来成長因子サブユニットA（PDGFサブユニットA）（PDGF-1）（血小板由来成長因子A鎖）（血小板由来成長因子アルファポリペプチド）、胎盤成長因子（PlGF）、Kitリガンド（マスト細胞成長因子）（MGF）（幹細胞因子）（SCF）（c-Kitリガンド）［切断されて、可溶性KITリガンド（sKITLG）になる］、マスト/幹細胞成長因子受容体キット（SCFR）（EC 2.7.10.1）（限局性白皮症（Piebald）形質タンパク質）（PBT）（癌原遺伝子c-Kit）（チロシンタンパク質キナーゼKit）（p145 c-kit）（v-kit ハーディー・ザッカーマン（Zuckerman）4ネコ肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ）（CD抗原CD117）、プロ形質転換成長因子アルファ［切断されて、形質転換成長因子アルファ（TGF-アルファ）（EGF様TGF）（ETGF）（TGF1型）になる］、形質転換成長因子ベータ-1（TGF-ベータ-1）［切断されて、潜伏関連ペプチド（LAP）になる］、形質転換成長因子ベータ-3（TGF-ベータ-3）［切断されて、潜伏関連ペプチド（LAP）になる］、血管内皮成長因子A（VEGF-A）（血管透過性因子）（VPF）、血管内皮成長因子受容体2（VEGFR-2）（EC 2.7.10.1）（胎児肝キナーゼ1）（FLK-1）（キナーゼ挿入ドメイン受容体）（KDR）（タンパク質-チロシンキナーゼ受容体flk-1）（CD抗原CD309）、血管内皮成長因子受容体3（VEGFR-3）（EC 2.7.10.1）（Fms様チロシンキナーゼ4）（FLT-4）（チロシンタンパク質キナーゼ受容体FLT4）、血管内皮成長因子D（VEGF-D）（c-Fos誘導成長因子）（FIGF）の任意の組み合わせまたはこれらの全てであり得る。いくつかの実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ることが特に企図されるが、他の実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ないことが特に企図される。

他の生物活性化合物には、CCモチーフケモカイン21（6Ckine）（βケモカインエクソダス-2）（二次リンパ組織ケモカイン）（SLC）（小誘導性サイトカインA21）、チロシンタンパク質キナーゼ受容体UFO（EC 2.7.10.1）（AXL腫瘍遺伝子）、プロベタセルリン［切断されて、βセルリン（BTC）になる］、C-Cモチーフケモカイン28（粘膜関連上皮ケモカイン）（MEC）（タンパク質CCK1）（小誘導性サイトカインA28）、C-Cモチーフケモカイン27（CCケモカインILC）（皮膚T細胞誘引ケモカイン）（CTACK）（ESkine）（IL-11 R-α-ローカスケモカイン）（スキンカイン）（小誘導性サイトカインA27）、C-X-Cモチーフケモカイン16（ホスファチジルセリンおよび酸化された低密度リポタンパク質に対するスカベンジャー受容体）（SR-PSOX）（小誘導性サイトカインB16）（膜貫通ケモカインCXCL16）、C-X-Cモチーフケモカイン5（ENA-78（1-78））（上皮由来好中球活性化タンパク質78）（好中球活性化ペプチドENA-78）（小誘導性サイトカインB5）［切断されて、ENA-78（8-78）;ENA-78（9-78）になる］、C-Cモチーフケモカイン26（CCケモカインIMAC）（エオタキシン-3）（マクロファージ炎症性タンパク質4-α）（MIP-4-α）（小誘導性サイトカインA26）（胸腺間質ケモカイン-1）（TSC-1）、C-X-Cモチーフケモカイン6（ケモカインα3）（CKA-3）（顆粒球走化性タンパク質2）（GCP-2）（小誘導性サイトカインB6）［切断されて、小誘導性サイトカインB6、Nプロセシングされたバリアント1;小誘導性サイトカインB6、N-プロセシングされたバリアント2;小誘導性サイトカインB6、N-プロセシングされたバリアント3になる］、成長調節αタンパク質（C-X-Cモチーフケモカイン1）（GRO-α（1-73））（黒色腫成長刺激活性）（MGSA）（好中球活性化タンパク質3）（NAP-3）［切断されて、GRO-α（4-73）;GRO-α（5-73）;GRO-α（6-73）になる］;C-X-Cモチーフケモカイン2（成長調節タンパク質β）（Gro-β）（マクロファージ炎症性タンパク質2-α）（MIP2-α）［切断されて、GRO-β（5-73）（GRO-β-T）（造血相乗的因子）（HSF）（SB-251353）になる］;C-X-Cモチーフケモカイン3（GRO-γ（1-73））（成長調節タンパク質γ）（GRO-γ）（マクロファージ炎症性タンパク質2-β）（MIP2-β）［切断されて、GRO-γ（5-73）になる］、C-Cモチーフケモカイン14（ケモカインCC-1/CC-3）（HCC-1/HCC-3）（HCC-1（1-74））（NCC-2）（小誘導性サイトカインA14）［切断されて、HCC-1（3-74）;HCC-1（4-74）;HCC-1（9-74）になる］、C-Cモチーフケモカイン16（ケモカインCC-4）（HCC-4）（ケモカインLEC）（IL-10誘導性ケモカイン）（LCC-1）（肝臓発現ケモカイン）（リンパ球および単球化学誘引物質）（LMC）（モノタクチン-1）（MTN-1）（NCC-4）（小誘導性サイトカインA16）、インターフェロン-9（IL-9）（サイトカインP40）（T細胞増殖因子P40）、インターロイキン-17F（IL-17F）（サイトカインML-1）、インターロイキン-18-結合タンパク質（IL-18BP）（Tadekinig-アルファ）、インターフェロンλ-2（IFN-λ-2）（Cytokine Zcyto20）（インターロイキン-28A）（IL-28A）、インターフェロンλ-1（IFN-λ-1）（Cytokine Zcyto21）（インターロイキン-29）（IL-29）、インターフェロン-31（IL-31）、C-X-Cモチーフケモカイン10（10 kDaインターフェロンγ誘導タンパク質）（γ-IP10）（IP-10）（小誘導性サイトカインB10）［切断されて、CXCL10（1-73）になる］、C-X-Cモチーフケモカイン11（β-R1）（H174）（インターフェロンγ誘導性タンパク質9）（IP-9）（インターフェロン誘導性T細胞α化学誘引物質）（I-TAC）（小誘導性サイトカインB11）、白血病抑制因子（LIF）（分化刺激因子）（D因子）（黒色腫由来LPL阻害剤）（MLPLI）（Emfilermin）、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー14（ヘルペスウイルス侵入メディエーターリガンド）（HVEM-L）（ヘルペスウイルス侵入メディエーターリガンド）（CD抗原CD258）［切断されて、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー14、膜形態;腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー14、可溶型になる］、リンホタクチン（ATAC）（Cモチーフケモカイン1）（サイトカインSCM-1）（リンホタキシン）（SCM-1-α）（小誘導性サイトカインC1）（XCケモカインリガンド1）、C-Cモチーフケモカイン8（HC14）（単球化学誘引物質タンパク質2）（単球走化性タンパク質2）（MCP-2）（小誘導性サイトカインA8）［切断されて、MCP-2（6-76）になる］、C-Cモチーフケモカイン7（単球走化性タンパク質3）（単球走化性タンパク質3）（MCP-3）（NC28）（小誘導性サイトカインA7）、C-Cモチーフケモカイン13（CK-β-10）（単球走化性タンパク質4）（単球走化性タンパク質4）（MCP-4）（NCC-1）（小誘導性サイトカインA13）［切断されて、C-Cモチーフケモカイン13、長鎖;C-Cモチーフケモカイン13、中鎖;C-Cモチーフケモカイン13、短鎖になる］、C-Cモチーフケモカイン22（CCケモカインSTCP-1）（MDC（1-69））（マクロファージ由来ケモカイン）（小誘導性サイトカインA22）（刺激されたT細胞走化性タンパク質1）［切断されて、MDC（3-69）;MDC（5-69）;MDC（7-69）になる］マクロファージ遊走阻止因子（MIF）（EC 5.3.2.1）（グリコシル化阻害因子）（GIF）（L-ドパクロムイソメラーゼ）（L-ドパクロムトートメラーゼ）（EC 5.3.3.12）（フェニルピルビン酸トートメラーゼ）、C-Cモチーフケモカイン20（βケモカインエクソダス-1）（CCケモカインLARC）（肝臓および活性化調節ケモカイン）（マクロファージ炎症性タンパク質3α）（MIP-3-α）（小誘導性サイトカインA20）［切断されて、CCL20（1-67）;CCL20（1-64）;CCL20（2-70）になる］、C-Cモチーフケモカイン19（βケモカインエクソダス-3）（CKβ-11）（エプスタインバーウイルス誘発分子1リガンドケモカイン）（EBI1リガンドケモカイン）（ELC）（マクロファージ炎症性タンパク質3β）（MIP-3-β）（小誘導性サイトカインA19）、CKβ8およびMIP-3としても知られている骨髄前駆細胞阻害因子（MPIF-1）が含まれる。MPIF-1遺伝子の選択的スプライシングは、ケモカインの短い（CKβ8）および長い（CKβ8-1）アイソフォームをコードする2つのmRNAをもたらす。C-Cモチーフケモカイン23（CK-β-8）（CKB-8）（マクロファージ炎症性タンパク質3）（MIP-3）（骨髄前駆細胞阻害因子1）（MPIF-1）（小誘導性サイトカインA23）［切断されて、CCL23（19-99）;CCL23（22-99）;CCL23（27-99）;CCL23（30-99）になる］、肝細胞成長因子様タンパク質（マクロファージ刺激タンパク質）（マクロファージ刺激タンパク質）（MSP）［切断されて、肝細胞成長因子様タンパク質α鎖;肝細胞成長因子様タンパク質β鎖になる］、血小板塩基性タンパク質（PBP）（C-X-Cモチーフケモカイン7）（白血球由来成長因子）（LDGF）（マクロファージ由来成長因子）（MDGF）（小誘導性サイトカインB7）［切断されて、結合組織活性化ペプチドIII（CTAP-III）（LA-PF4）（低親和性血小板因子IV）;TC-2;結合組織活性化ペプチドIII（1-81）（CTAP-III（1-81））;βトロンボグロブリン（β-TG）;好中球活性化ペプチド2（74）（NAP-2（74））;好中球活性化ペプチド2（73）（NAP-2（73））;好中球活性化ペプチド2（NAP-2）;TC-1;好中球活性化ペプチド2（1-66）（NAP-2（1-66））;好中球活性化ペプチド2（1-63）（NAP-2（1-63））になる］、オステオポンチン（骨シアロタンパク質1）（ネフロポンチン）（分泌型リン酸化タンパク質1）（SPP-1）（尿路結石タンパク質）（ウロポンチン）、C-Cモチーフケモカイン18（選択的マクロファージ活性化関連CCケモカイン1）（AMAC-1）（CCケモカインPARC）（樹状細胞ケモカイン1）（DC-CK1）（マクロファージ炎症性タンパク質4）（MIP-4）（肺および活性化調節ケモカイン）（小誘導性サイトカインA18）［切断されて、CCL18（1-68）;CCL18（3-69）;CCL18（4-69）になる］、血小板第4因子（PF-4）（C-X-Cモチーフケモカイン4）（Iroplact）（オンコスタチン-A）［切断されて、血小板第4因子、短縮形になる］、間質細胞由来因子1（SDF-1）（hSDF-1）（C-X-Cモチーフケモカイン12）（肝細胞腫中低下するインタークリン）（IRH）（hIRH）（プレB細胞増殖刺激因子）（PBSF）［切断されて、SDF-1-β（3-72）;SDF-1α（3-67）になる］、C-Cモチーフケモカイン17（CCケモカインTARC）（小誘導性サイトカインA17）（胸腺および活性化調節ケモカイン）、およびC-Cモチーフケモカイン25（ケモカインTECK）（小誘導性サイトカインA25）（胸腺発現ケモカイン）、胸腺間質性リンホポイエチン。いくつかの実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ることが特に企図されるが、他の実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ないことが特に企図される。

放出物に存在するさらなる生物活性物質には、以下のものが含まれ得る:インヒビンβA鎖（アクチビンβA鎖）（赤血球分化タンパク質）（EDF）、アグーチ関連タンパク質、アンギオゲニン（EC 3.1.27.-）（リボヌクレアーゼ5）（RNase 5）、アンジオポエチン-1（ANG-1）、プラスミノーゲン（EC 3.4.21.7）［切断されて、プラスミン重鎖A;活性化ペプチド;アンジオスタチン;プラスミン重鎖A、短い形態;プラスミン軽鎖Bになる］、カテプシンS（EC 3.4.22.27）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー5（B細胞表面抗原CD40）（Bp50）（CD40L受容体）（CDw40）（CD抗原CD40）、奇形癌腫由来の成長因子1（Cripto-1成長因子）（CRGF）（上皮成長因子様クリプトタンパク質CR1）、ポリ（A）特異的リボヌクレアーゼPARN（EC 3.1.13.4）（脱アデニル化ヌクレアーゼ）（脱アデニル化ヌクレアーゼ）（ポリアデニル酸特異的リボヌクレアーゼ）、Dickkopf関連タンパク質1（Dickkopf-1）（Dkk-1）（hDkk-1）（SK）、カドヘリン-1（CAM 120/80）（上皮カドヘリン）（E-カドヘリン）（ウボモルリン）（CD抗原CD324）［切断されて、E-Cad/CTF1;E-Cad/CTF2;E-Cad/CTF3になる］、上皮細胞接着分子（Ep-CAM）（腺癌関連抗原）（細胞表面糖タンパク質Trop-1）（上皮細胞表面抗原）（上皮糖タンパク質）（EGP）（上皮糖タンパク質314）（EGP314）（hEGP314）（KS 1/4抗原）（KSA）（主要胃腸腫瘍関連タンパク質GA733-2）（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1）（CD抗原CD326）、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー6（アポトーシス抗原リガンド）（APTL）（CD95リガンド）（CD95-L）（Fas抗原リガンド）（Fasリガンド）（FasL）（CD抗原CD178）［切断されて、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー6、膜形態;腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー6、可溶型（受容体結合FasL外部ドメイン）（可溶性Fasリガンド）（sFasL）;ADAM10によってプロセッシングされたFasLフォーム（APL）;FasL細胞内ドメイン（FasL ICD）（SPPL2AによってプロセッシングされたFasLフォーム）（SPA）］、低親和性免疫グロブリンγFc領域受容体II-b（IgG Fc受容体II-b）（CDw32）（Fc-γRII-b）（Fc-γ-RIIb）（FcRII-b）（CD抗原CD32）;低親和性免疫グロブリンγFc領域受容体II-c（IgG Fc受容体II-c）（CDw32）（Fc-γRII-c）（Fc-γ-RIIc）（FcRII-c）（CD抗原CD32）、フォリスタチン（FS）（アクチビン結合タンパク質）、ガレクチン-7（Gal-7）（HKL-14）（PI7）（p53誘導遺伝子1タンパク質）、細胞間接着分子2（ICAM-2）（CD抗原CD102）、インターロイキン-13受容体サブユニットα-1（IL-13受容体サブユニットα-1）（IL-13Rサブユニットα-1）（IL-13R-α-1）（IL-13RA1）（癌/精巣抗原19）（CT19）（CD抗原CD213a1）、インターロイキン-13受容体サブユニットα-2（IL-13受容体サブユニットα-2）（IL-13Rサブユニットα-2）（IL-13R-α-2）（IL-13RA2）（インターロイキン-13-結合タンパク質）（CD抗原CD213a2）、インターロイキン-17B（IL-17B）（サイトカインZcyto7）（インターロイキン-20）（IL-20）（神経細胞インターロイキン-17関連因子）、インターロイキン-2受容体サブユニットα（IL-2受容体サブユニットα）（IL-2-RA）（IL-2Rサブユニットα）（IL2-RA）（TAC抗原）（p55）（CD抗原CD25）、インターロイキン-2受容体サブユニットβ（IL-2受容体サブユニットβ）（IL-2Rサブユニットβ）（IL-2RB）（高親和性IL-2受容体サブユニットβ）（p70-75）（p75）（CD抗原CD122）、インターロイキン-23サブユニットα（IL-23サブユニットα）（IL-23-A）（インターロイキン-23サブユニットp19）（IL-23p19）、ヒトTGF-β1 cDNAは、29アミノ酸シグナルペプチドと361アミノ酸プロタンパク質を含む390アミノ酸（aa）前駆体をコードし、プロタンパク質は、N末端249アミノ酸潜伏関連ペプチド（LAP）およびC末端112アミノ酸成熟TGF-β-1へとさらに切断され、神経細胞接着分子（Nr-CAM）（神経細胞表面タンパク質Bravo）（hBravo）（NgCAM関連細胞接着分子）（Ng-CAM関連）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤1（PAI）（PAI-1）（内皮プラスミノーゲン活性化因子阻害剤）（Serpin E1）、血小板由来成長因子サブユニットA（PDGFサブユニットA）（PDGF-1）（血小板由来成長因子A鎖）（血小板由来成長因子αポリペプチド）;血小板由来成長因子サブユニットB（PDGFサブユニットB）（PDGF-2）（血小板由来成長因子B鎖）（血小板由来成長因子βポリペプチド）（プロトオンコジーンc-Sis）（ベカプレルミン）、レジスチン（脂肪組織特異的分泌因子）（ADSF）（C/EBP-ε調節骨髄特異的分泌システインリッチタンパク質）（システインリッチ分泌タンパク質A12-α様2）（システインリッチ分泌タンパク質FIZZ3）、間質細胞由来因子1（SDF-1）（hSDF-1）（C-X-Cモチーフケモカイン12）（肝細胞腫中で低下するインタークリン）（IRH）（hIRH）（プレB細胞増殖刺激因子）（PBSF）［切断されて、SDF-1-β（3-72）;SDF-1-α（3-67）］;SDF-1αおよびSDF-1βは単一の遺伝子によってコードされ、選択的スプライシングによって生じる。2つのタンパク質は、SDF-1βのカルボキシ末端中に存在し、SDF-1αには存在しない4つのアミノ酸残基を除いて同一である、インターロイキン-6受容体サブユニットβ（IL-6受容体サブユニットβ）（IL-6Rサブユニットβ）（IL-6R-β）（IL-6RB）（CDw130）（インターロイキン-6シグナルトランスデューサー）（膜糖タンパク質130）（gp130）（オンコスタチン-M受容体サブユニットα）（CD抗原CD130）、ソニックヘッジホッグタンパク質（SHH）（HHG-1）［切断されて、ソニックヘッジホッグタンパク質N生成物;ソニックヘッジホッグタンパク質C生成物になる］、シアル酸結合Ig様レクチン5（Siglec-5）（CD33抗原様2）（肥満結合タンパク質2）（OB-BP2）（OB結合タンパク質2）（CD抗原CD170）、インターロイキン-1受容体様1（タンパク質ST2）、形質転換増殖因子β-2（TGF-β-2）（BSC-1細胞増殖阻害剤）（セテルミン）（神経膠芽細胞腫由来T細胞抑制因子）（G-TSF）（ポリエルギン）［切断されて、潜伏関連ペプチド（LAP）になる］、アンギオポエチン-1受容体（EC 2.7.10.1）（内皮チロシンキナーゼ）（内膜（Tunica interna）内皮細胞キナーゼ）（IgおよびEGF相同性ドメイン-2を有するチロシンキナーゼ）（チロシンタンパク質キナーゼ受容体TEK）（チロシンタンパク質キナーゼ受容体TIE-2）（hTIE2）（p140 TEK）（CD抗原CD202b）、トロンボポエチン（C-mplリガンド）（ML）（巨核球コロニー-刺激因子）（巨核球増殖分化因子）（MGDF）（骨髄増殖性白血病ウイルス腫瘍遺伝子リガンド）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10D（デコイ受容体2）（DcR2）（TNF関連アポトーシス誘導性リガンド受容体4）（TRAIL受容体4）（TRAIL-R4）（切断されたデスドメインを有するTRAIL受容体）（CD抗原CD264）、骨髄系細胞に発現するトリガー受容体1（TREM-1）（単球で発現するトリガー受容体1）（CD抗原CD354）、血管内皮増殖因子C（VEGF-C）（Flt4リガンド）（Flt4-L）（血管内皮増殖因子関連タンパク質）（VRP）、および血管内皮成長因子受容体1（VEGFR-1）（EC 2.7.10.1）（Fms様チロシンキナーゼ1）（FLT-1）（チロシンタンパク質キナーゼFRT）（チロシンタンパク質キナーゼ受容体FLT）（FLT）（血管透過性因子受容体）。いくつかの実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ることが特に企図されるが、他の実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ないことが特に企図される。

本開示による放出物のさらなる実施形態は、以下の生物活性化合物の1つまたは複数を含む。C-X-Cモチーフケモカイン13（Angie）（B細胞誘引ケモカイン1）（BCA-1）（Bリンパ球化学誘引物質）（CXCケモカインBLC）（小誘導性サイトカインB13）、エオタキシン（C-Cモチーフケモカイン11）（好酸球走化性タンパク質）（小誘導性サイトカインA11）、C-Cモチーフケモカイン24（CK-β-6）（好酸球走化性タンパク質2）（エオタキシン-2）（骨髄前駆細胞阻害因子2）（MPIF-2）（小誘導性サイトカインA24）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）（プルリポエチン）（フィルグラスチム）（レノグラスチム）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）（コロニー刺激因子）（CSF）（モルグラモスチン）（サルグラモスティム）、C-Cモチーフケモカイン1（小誘導性サイトカインA1）（Tリンパ球分泌タンパク質I-309）、細胞間接着分子1（ICAM-1）（主要グループライノウイルス受容体）（CD抗原CD54）、インターフェロンγ（IFN-γ）（免疫インターフェロン）、インターロイキン-1α（IL-1α）（ヘマトポエチン-1）、インターロイキン-1β（IL-1β）（カタボリン）、インターロイキン-1受容体アンタゴニストタンパク質（IL-1RN）（IL-1ra）（IRAP）（ICIL-1RA）（IL1阻害剤）（アナキンラ）、インターロイキン-2（IL-2）（T細胞増殖因子）（TCGF）（アルデスロイキン）、インターロイキン-4（IL-4）（B細胞刺激因子1）（BSF-1）（ビネトラキン）（リンパ球刺激因子1）（ピトラキンラ）、インターロイキン-5（IL-5）（B細胞分化因子I）（好酸球分化因子）（T細胞交換因子）（TRF）インターロイキン-6（IL-6）（B細胞刺激因子2）（BSF-2）（CTL分化因子）（CDF）（ハイブリドーマ増殖因子）（インターフェロンβ-2）（IFN-β-2）、インターロイキン-6受容体サブユニットα（IL-6受容体サブユニットα）（IL-6Rサブユニットα）（IL-6R-α）（IL-6RA）（IL-6R 1）（膜糖タンパク質80）（gp80）（CD抗原CD126）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）（C-X-Cモチーフケモカイン8）（ケモカイン（C-X-Cモチーフ）リガンド8）（エモクタキン）（顆粒球走化性タンパク質1）（GCP-1）（単球由来好中球走化性因子）（MDNCF）（単球由来好中球活性化ペプチド）（MONAP）（好中球活性化タンパク質1）（NAP-1）（タンパク質3-10C）（T細胞走化性因子）［切断されて、MDNCF-a（GCP/IL-8タンパク質IV）（IL8/NAP1I型）;インターロイキン-8（（Ala-IL-8）77）（GCP/IL-8タンパク質II）（IL-8（1-77））（IL8/NAP1II型）（MDNCF-b）;IL-8（5-77）;IL-8（6-77）（（Ser-IL-8）72）（GCP/IL-8タンパク質I）（IL8/NAP1III型）（リンパ球由来好中球活性化因子）（LYNAP）（MDNCF-c）（好中球活性化因子）（NAF）;IL-8（7-77）（GCP/IL-8タンパク質V）（IL8/NAP1IV型）;IL-8（8-77）（GCP/IL-8タンパク質VI）（IL8/NAP1V型）;IL-8（9-77）（GCP/IL-8タンパク質III）（IL8/NAP1VI型）］、インターロイキン-10（IL-10）（サイトカイン合成阻害因子）（CSIF）、インターロイキン-11（IL-11）（脂肪生成阻害因子）（AGIF）（オプレルベキン）、インターロイキン-12サブユニットβ（IL-12B）（細胞傷害性リンパ球成熟因子40kDaサブユニット）（CLMF p40）（IL-12サブユニットp40）（NK細胞刺激因子鎖2）（NKSF2）、インターロイキン-12サブユニットα（IL-12A）（細胞傷害性リンパ球成熟因子35kDaサブユニット）（CLMF p35）（IL-12サブユニットp35）（NK細胞刺激因子鎖1）（NKSF1）;インターロイキン-12サブユニットβ（IL-12B）（細胞傷害性リンパ球成熟因子40kDaサブユニット）（CLMF p40）（IL-12サブユニットp40）（NK細胞刺激因子鎖2）（NKSF2）、インターロイキン-13（IL-13）、インターロイキン-15（IL-15）、プロインターロイキン-16［切断されて、インターロイキン-16（IL-16）（リンパ球走化性因子）（LCF）になる］、インターロイキン-17A（IL-17）（IL-17A）（細胞傷害性Tリンパ球関連抗原8）（CTLA-8）、C-Cモチーフケモカイン2（HC11）（単球走化性タンパク質1）（単球走化性活性化因子）（MCAF）（単球走化性タンパク質1）（MCP-1）（単球分泌タンパク質JE）（小誘導性サイトカインA2）、マクロファージコロニー刺激因子1（CSF-1）（M-CSF）（MCSF）（ラニモスティム）［切断されて、プロセッシングされたマクロファージコロニー刺激因子1になる］、C-X-Cモチーフケモカイン9（γインターフェロン誘導モノカイン）（インターフェロンγによって誘導されるモノカイン）（HuMIG）（MIG）（小誘導性サイトカインB9）、C-Cモチーフケモカイン3（G0/G1スイッチ調節タンパク質19-1）（マクロファージ炎症性タンパク質1-α）（MIP-1-α）（PAT 464.1）（SIS-β）（小誘導性サイトカインA3）（扁桃腺リンパ球LD78αタンパク質）［切断されて、MIP-1-α（4-69）（LD78-α（4-69））になる］、C-Cモチーフケモカイン4（G-26 Tリンパ球分泌タンパク質）（HC21）（リンパ球活性化遺伝子1タンパク質）（LAG-1）（MIP-1-β（1-69））（マクロファージ炎症性タンパク質1-β）（MIP-1-β）（PAT 744）（タンパク質H400）（SIS-γ）（小誘導性サイトカインA4）（T細胞活性化タンパク質2）（ACT-2）［切断されて、MIP-1-β（3-69）になる］、C-Cモチーフケモカイン15（ケモカインCC-2）（HCC-2）（ロイコタクチン-1）（LKN-1）（MIP-1δ）（マクロファージ炎症性タンパク質5）（MIP-5）（Mrp-2b）（NCC-3）（小誘導性サイトカインA15）［切断されて、CCL15（22-92）;CCL15（25-92）;CCL15（29-92）になる］、血小板由来成長因子サブユニットB（PDGFサブユニットB）（PDGF-2）（血小板由来成長因子B鎖）（血小板由来成長因子βポリペプチド）（癌原遺伝子c-Sis）（ベカプレルミン）、C-Cモチーフケモカイン5（EoCP）（好酸球走化性サイトカイン）（SIS-δ）（小誘導性サイトカインA5）（T細胞特異的タンパク質P228）（TCP228）（T細胞特異的タンパク質RANTES）［切断されて、RANTES（3-68）;RANTES（4-68）になる］、メタロプロテイナーゼ阻害剤1（赤血球増強活性）（EPA）（線維芽細胞コラゲナーゼ阻害剤）（コラゲナーゼ阻害剤）（メタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤）（TIMP-1）、メタロプロテイナーゼ阻害剤2（CSC-21K）（メタロプロテイナーゼ2の組織阻害剤）（TIMP-2）、腫瘍壊死因子（カケクチン）（TNF-α）（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー2）（TNF-a）［切断されて、腫瘍壊死因子、膜形態（N-末端フラグメント）（NTF）;細胞内ドメイン1（ICD1）;細胞内ドメイン2（ICD2）;C-ドメイン1;C-ドメイン2;腫瘍壊死因子、可溶型になる］、リンホトキシン-α（LT-α）（TNF-β）（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー1）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1A（腫瘍壊死因子受容体1）（TNF-R1）（腫瘍壊死因子受容体I型）（TNF-RI）（TNFR-I）（p55）（p60）（CD抗原CD120a）［切断されて、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1A、膜形態;腫瘍壊死因子結合タンパク質1（TBPI）になる］、および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1B（腫瘍壊死因子受容体2）（TNF-R2）（腫瘍壊死因子受容体II型）（TNF-RII）（TNFR-II）（p75）（p80TNF-α受容体）（CD抗原CD120b）（エタネルセプト）［切断されて、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1b、膜形態;腫瘍壊死因子結合タンパク質2（TBP-2）（TBPII）になる］。いくつかの実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ることが特に企図されるが、他の実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ないことが特に企図される。

本開示の放出物または組成物中に存在し得る追加の生物活性物質には、以下のうちの1つまたは複数が含まれる:腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BBリガンド受容体）（CDw137）（T細胞抗原4-1BBホモログ）（T細胞抗原ILA）（CD抗原CD137）、CD166抗原（活性化白血球接着分子）（CD抗原CD166）、Tリンパ球活性化抗原CD80（活性化B7-1抗原）（BB1）（CTLA-4カウンター-受容体B7.1）（B7）（CD抗原CD80）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17（B細胞成熟タンパク質）（CD抗原CD269）、単球分化抗原CD14（骨髄細胞特異的ロイシンリッチ糖タンパク質）（CD抗原CD14）［切断されて、単球分化抗原CD14、尿型;単球分化抗原CD14、膜結合型になる］、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー8（CD30L受容体）（Ki-1抗原）（リンパ球活性化抗原CD30）（CD抗原CD30）、CD40リガンド（CD40-L）（T-細胞抗原Gp39）（TNF関連活性化タンパク質）（TRAP）（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー5）（CD抗原CD154）［切断されて、CD40リガンド、膜形態;CD40リガンド、可溶型になる］、癌胎児抗原関連細胞接着分子1（胆汁糖タンパク質1）（BGP-1）（CD抗原CD66a）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー21（細胞死受容体6）（CD抗原CD358）、チロシン-タンパク質キナーゼ受容体TYRO3（EC 2.7.10.1）（チロシンタンパク質キナーゼBYK）（チロシンタンパク質キナーゼDTK）（チロシンタンパク質キナーゼRSE）（チロシンタンパク質キナーゼSKY）（チロシンタンパク質キナーゼTIF）、エンドグリン（CD抗原CD105）、受容体チロシンタンパク質キナーゼerbB-3（EC 2.7.10.1）（癌原遺伝子様タンパク質c-ErbB-3）（チロシンキナーゼ型細胞表面受容体HER3）、E-セレクチン（CD62抗原様ファミリーメンバーE）（内皮白血球接着分子1）（ELAM-1）（白血球-内皮細胞接着分子2）（LECAM2）（CD抗原CD62E）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー6（Apo-1抗原）（アポトーシス-媒介表面抗原FAS）（FASLG受容体）（CD抗原CD95）、Fms関連チロシンキナーゼ3リガンド（Flt3リガンド）（Flt3L）（SLサイトカイン）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー18（活性化誘導性TNFRファミリー受容体）（グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質）（CD抗原CD357）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー14（ヘルペスウイルス侵入メディエーターA）（ヘルペスウイルス侵入メディエーターA）（HveA）（腫瘍壊死因子受容体様2）（TR2）（CD抗原CD270）、細胞間接着分子3（ICAM-3）（CDw50）（ICAM-R）（CD抗原CD50）、コンタクチン-2（軸索糖タンパク質TAG-1）（アキソニン-1）（一過性軸索糖タンパク質1）（TAX-1）、インターロイキン-1受容体1型（IL-1R-1）（IL-1RT-1）（IL-1RT1）（CD121抗原様ファミリーメンバーA）（インターロイキン-1受容体α）（IL-1R-α）（インターロイキン-1受容体I型）（p80）（CD抗原CD121a）［切断されて、インターロイキン-1受容体1型、膜型（mIL-1R1）（mIL-1RI）;インターロイキン-1受容体1型、可溶型（sIL-1R1）（sIL-1RI）になる］、サイトカイン受容体共通サブユニットγ（インターロイキン-2受容体サブユニットγ）（IL-2受容体サブユニットγ）（IL-2Rサブユニットγ）（IL-2RG）（γC）（p64）（CD抗原CD132）、インターロイキン-10受容体サブユニットβ（IL-10受容体サブユニットβ）（IL-10Rサブユニットβ）（IL-10RB）（サイトカイン受容体クラスIIメンバー4）（サイトカイン受容体ファミリー2メンバー4）（CRF2-4）（インターロイキン-10受容体サブユニット2）（IL-10Rサブユニット2）（IL-10R2）（CD抗原CDw210b）、インターロイキン-17受容体A（IL-17受容体A）（IL-17RA）（CDw217）（CD抗原CD217）、インターロイキン-21受容体（IL-21受容体）（IL-21R）（新規インターロイキン受容体）（CD抗原CD360）、リソソーム膜タンパク質2（85kDaリソソーム膜シアロ糖タンパク質）（LGP85）（CD36抗原様2）（リソソーム膜タンパク質II）（LIMP II）（スカベンジャー受容体クラスBメンバー2）（CD抗原CD36）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）（MMP-9の25kDaα-2-ミクログロブリン関連サブユニット）（リポカリン-2）（癌遺伝子24p3）（シデロカリンLCN2）（p25）、L-セレクチン（CD62抗原様ファミリーメンバーL）（白血球接着分子1）（LAM-1）（白血球表面抗原Leu-8）（白血球-内皮細胞接着分子1）（LECAM1）（リンパ節ホーミング受容体）（TQ1）（gp90-MEL）（CD抗原CD62L）、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1（LYVE-1）（細胞表面保持配列結合タンパク質1）（CRSBP-1）（細胞外リンクドメイン含有タンパク質1）（ヒアルロン酸受容体）、MHCクラスIポリペプチド関連配列A（MIC-A）、MHCクラスIポリペプチド関連配列B（MIC-B）、プロニューレグリン-1、膜結合アイソフォーム（プロ-NRG1）［切断されて、ニューレグリン-1（アセチルコリン受容体-誘導活性）（ARIA）（乳癌細胞分化因子p45）（グリア細胞成長因子）（ヘレグリン）（HRG）（Neu分化因子）（感覚および運動神経細胞由来因子）］、血小板由来成長因子受容体β（PDGF-R-β）（PDGFR-β）（EC 2.7.10.1）（β血小板由来成長因子受容体）（β型血小板由来成長因子受容体）（CD140抗原様ファミリーメンバーB）（血小板由来成長因子受容体1）（PDGFR-1）（CD抗原CD140b）、血小板内皮細胞接着分子（PECAM-1）（EndoCAM）（GPIIA’）（PECA1）（CD抗原CD31）、MAPK/MAK/MRKオーバーラップキナーゼ（EC 2.7.11.22）（MOKタンパク質キナーゼ）（腎腫瘍抗原1）（RAGE-1）、A型肝炎ウイルス細胞受容体1（HAVcr-1）（腎障害分子1）（KIM-1）（T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質1）（TIMD-1）（T細胞免疫グロブリンムチン受容体1）（TIM）（TIM-1）（T細胞膜タンパク質1）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10C（TRAIL/Apo-2Lのアンタゴニストデコイ受容体）（デスドメインのないデコイTRAIL受容体）（デコイ受容体1）（DcR1）（TRAILのリンパ球阻害剤）（TNF関連アポトーシス誘導リガンド受容体3）（TRAIL受容体3）（TRAIL-R3）（細胞内ドメインのないTRAIL受容体）（CD抗原CD263）、エラフィン（エラスターゼ特異的阻害剤）（ESI）（ペプチダーゼ阻害剤3）（PI-3）（プロテアーゼ阻害剤WAP3）（皮膚由来抗コイコプロテイナーゼ）（SKALP）（WAP 4ジスルフィドコアドメインタンパク質14）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子表面受容体（U-PAR）（uPAR）（単球活性化抗原Mo3）（CD抗原CD87）、血管細胞接着タンパク質1（V-CAM 1）（VCAM-1）（INCAM-100）（CD抗原CD106）、および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー27（X結合型エクトディスプラシン-A2受容体）（EDA-A2受容体）。いくつかの実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ることが特に企図されるが、他の実施形態においては、これらのいずれもが収量中に含まれ得ないことが特に企図される。

本明細書に開示されている組成物において、生物活性化合物もしくは成長因子のいずれもが、約0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、2000、3000、4000、5000pg/ml、もしくはそれを超える（またはその中で導き出せる任意の範囲）、少なくとも約0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、2000、3000、4000、5000pg/ml、もしくはそれを超える（またはその中で導き出せる任意の範囲）、もしくは多くとも約0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、2000、3000、4000、5000pg/ml、もしくはそれを超える（またはその中で導き出せる任意の範囲）濃度を有してもよく、または生物活性化合物もしくは成長因子のいずれもが、本明細書中に論述されている任意の組成物中にもしくは本明細書中に論述されている方法の任意の工程の前もしくは後に検出可能である濃度を有さなくてもよい。特定の実施形態において、生物活性化合物または成長因子のいずれか1つまたは複数は、本明細書中に論述されている組成物中では特に除外される。

一実施例において、図1A～図1Oは、血漿、血小板溶解物、組成が明らかな化学培地またはFBSを供給された培地と比較した、本開示の例示的な放出物中の様々な成長因子サイトカイン、インターロイキン、インターフェロンの量および同一性を示す。さらなる例において、表1は、本開示の例示的な放出物（放出物F1および放出物F2）における様々な成長因子サイトカイン、インターロイキン、インターフェロンの量および同一性を示す。

FGF-βまたはFGF塩基性とも称される塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）は、FGF2遺伝子によってコードされる成長因子およびシグナル伝達タンパク質である。いくつかの実施形態において、血小板放出物は、少なくとも約100pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、血小板放出物は、少なくとも約200pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、血小板放出物は、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態において、放出物は、少なくとも約300pg/mlのレベルのFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約100pg/ml～約800pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約300pg/ml～約550pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。他の実施形態において、放出物は、約350pg/ml～約520pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。さらなる実施形態において、放出物は、約400pg/ml～約500pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約450pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む。放出物は、約110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、700、もしくは800pg/mlもしくはその中で導き出せる任意の値もしくは範囲、少なくとも約110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、700、もしくは800pg/ml、もしくはその中で導き出せる任意の値もしくは範囲、または多くとも約110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、700、もしくは800pg/ml、もしくはその中で導き出せる任意の値もしくは範囲のレベルでFGF塩基性を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物（例えば、放出物）はFGF塩基性を含むことが特に企図される。他の実施形態において、組成物はFGF塩基性を含まないか、または検出可能な量もしくは生物学的に関連する量のFGF塩基性を含まない（例えば、0.1pg/ml未満）ことが特に企図される。

本開示の方法のいくつかの実施形態において、放出物は、約2.0pg/ml～約50pg/mlでSDF-1αを含む。本開示の方法のいくつかの実施形態において、放出物は、約4.0pg/ml～約30pg/mlでSDF-1αを含む。本開示の方法のいくつかの実施形態において、放出物は、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1αを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1αを含む。いくつかの実施形態において、放出物は、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1αを含む。他の実施形態において、放出物は、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1αを含む。さらなる実施形態において、放出物は、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50pg/mlのSDF-1α、もしくはその中で導き出せる任意の値もしくは範囲を含有し、少なくとも2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50pg/mlのSDF-1α、もしくはその中で導き出せる任意の値もしくは範囲を含有し、または多くとも2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50pg/mlのSDF-1α、もしくはその中で導き出せる任意の値もしくは範囲を含有する。いくつかの実施形態において、組成物（例えば、放出物）はSDF1-αを含むことが特に企図される。他の実施形態において、組成物は、SDF-1αを含まないか、または検出可能な量もしくは生物学的に関連する量のSDF-1αを含まない（例えば、0.1pg/ml未満）ことが特に企図される。

本開示の方法および組成物のいくつかの実施形態において、放出物は、細胞からの微小胞またはエキソソームを含む。微小胞またはエキソソームは、細胞からの成長因子または他のタンパク質を含み得る。微小胞またはエキソソームは、サイズおよび組成が異なり得る。いくつかの実施形態において、微小胞またはエキソソームは、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、DNA、RNA、マイクロRNA（miRNA）、および他の核酸の1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、放出物が微小胞を含むことが特に企図される。他の実施形態において、組成物が微小胞を含まないか、または検出可能な量もしくは生物学的に関連する量の微小胞を含まないことが特に企図される。いくつかの実施形態において、放出物がエキソソームを含むことが特に企図される。他の実施形態において、組成物がエキソソームを含まないか、または検出可能な量もしくは生物学的に関連する量のエキソソームを含まないことが特に企図される。

本明細書では、提示される任意のデータは、約2％～約10％の標準偏差を含み得ることが企図される。この標準偏差は、高処理量の成長因子からサイトカインおよびケモカイン分析までのすべてのデータにわたって適用されると考えられる。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の標準偏差の値が、組成物中のサイトカインまたはバイオマーカーの許容され得る量または予想される量を評価する際に適用される。いくつかの実施形態において、1、2、3、4、5、6またはそれを超える標準偏差の値が適用される。

一般に、本開示は、cGMPを用いた、血小板の有効期限が切れたユニットからの血小板放出物（hPR）の大規模製造のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、無視できる量のフィブリノーゲンを含むhPRを産生する。いくつかの実施形態において、hPRは、約0.05mg/dL未満のフィブリノーゲンを含む。いくつかの実施形態において、hPRは、約0.00～0.05mg/dLの任意の量のフィブリノーゲンを含む。フィブリノーゲンは、他の細胞片も捕捉するフィブリン塊への変換によって除去され、hPRである透明な上清をもたらす。

本開示によるhPRは、図15に示されているように、グロブリンおよびアルブミンなどの他の血漿由来成分を保持し得る。

特定の実施形態において、細胞培養物または細胞保存培地を形成するために、本開示の放出物組成物はその他の成分、栄養素または培地に添加される。放出物は、既存の細胞培養培地、例えば最小必須培地（MEM）またはダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に添加され、細胞培養のために使用され得る。本開示による細胞培養培地は、例えば間葉系幹細胞などの幹細胞および/または前駆細胞を含む細胞の成長または維持に必要な栄養素（例えば、成長因子など）を与えるように調合される。このような細胞培養培地は、いくつかの実施形態において、添加されたヘパリンおよび凝固した材料も含まない。

閉じられた系
本開示によるhPRを調製する方法は、汚染物質を含まない最終生成物が確実に得られる閉じられた系の中で実施され得る。閉じられた系は、例えば、全血または多血小板血漿の前濾過モジュール、血小板保持モジュール、マイコプラズマおよびウイルス保持モジュールなどを含み得る。モジュールは、副生成物の添加および除去のためのモジュール接続を介して接続され得る。いくつかの実施形態において、血液貯蔵またはバイオリアクターにおいて使用されるような袋が使用される。このような袋は、チューブによって他の袋および濾過システムに接続され得る。接続は、例えば、無菌溶接機およびチューブシーラを使用して行われる。閉じられた系は、クリーンルームの必要性を軽減し得る。輸血のために収集された細胞が周囲の雰囲気に曝されることがなければ、袋の内容物（すなわち、細胞）は無菌のまま保たれる。拡張すると、この様式で（すなわち、1つの袋を別の袋またはフィルターに滅菌溶接することによって）行われる全てのユニット操作および下流過程は、内容物の無菌性を維持するであろう。

いくつかの実施形態は閉じられた系の使用を含むが、いくつかの実施形態においては、放出物は、バイオセーフティキャビネット、アイソレータまたはクリーンルーム内にあってもよい、フラスコ、チューブ、細胞培養リザーバ、バイオリアクターなどを使用する開放系中で調製される。

治療用途/製剤/組み合わせ
いくつかの実施形態において、本開示のhPR組成物は、治療用物質として使用され得る。本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載されている放出物を含む製剤に関する。製剤は、骨、筋肉、皮膚、神経、腱、結合組織、眼、歯周組織または心血管組織を含むがこれらに限定されない損傷組織、創傷組織または患部組織の処置などの治療目的のために使用され得る。hPRは、臨床用途における溶解物の改善された代替物として使用することができる。

本開示の組成物は、液体、ゲル、粉末、軟膏、エアロゾル、スプレーなどを含むがこれらに限定されない医学的処置のための任意の適切な様式で製剤化され得る。本明細書に記載されている組成物は、外科的移植、注射、局所適用、創傷被覆材などを含むがこれらに限定されない任意の適切な手段によって組織に送達され得る。

いくつかの実施形態において、hPRは、任意の公知の骨生物剤（osteobiologics）および凝固剤と組み合わせられる。前者は、成長因子、サイトカインおよびケモカインの存在によって治癒機構を促進するが、後者は、外傷、フィールドケアなどに用途を有し得る。いくつかの実施形態において、hPR（そのまままたは他の薬剤と組み合わせて）を使用して、組織培養プラスチック、マイクロキャリアなどをコーティングして、細胞の接着、分化および拡大を促進することができる）］。いくつかの実施形態において、本開示のhPRは、生体材料、哺乳動物組織、改変されたまたは操作された細胞および組織と組み合わされる。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象を処置する方法であって、幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含み、幹細胞は、ヒト血液由来血小板からの放出物とともに培養されており、放出物は、約0.05mg/dL未満、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、骨疾患、骨欠損（defect）、骨損傷、骨粗鬆症、変形性関節症または脊髄損傷に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、軟骨疾患または軟骨欠損または軟骨損傷に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、骨、腱、軟骨または筋肉の損傷を患っている。いくつかの実施形態において、対象は歯周病に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、自己免疫疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、心筋梗塞に罹患している。特定の実施形態において、放出物は標的患者に対して同種異系であり、他の実施形態において、放出物は標的患者に対して自家（autogenic）または異種（xenogenic）である。

特定の態様において、対象または患者に投与される組成物の実際の投与量は、損傷組織または創傷組織の大きさ、症状の重症度、処置されている症状の種類、以前のまたは同時に行われる治療的介入、患者の特発性疾患および投与経路などの物理的および生理学的要因によって決定することができる。

多血小板フィブリン
新鮮なまたは期限切れの多血小板血漿または血小板濃縮物に由来し得る本開示の放出物に加えて、別の有用な生成物であるフィブリン塊を治療目的に使用し得る。固体またはゲル状の血餅材料は、成長因子に富み、医療用途のために、凝固性構造となるのに十分な量および凝固因子を含む。

いくつかの態様において、本開示は、フィブリノーゲン哺乳動物血液由来血小板濃縮物から多血小板フィブリンを調製するための方法であって、（i）ヒト血液の血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;（ii）25mMを超える最終濃度までCaCl₂をPRPに添加する工程;（iii）CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによりフィブリン塊および上清を形成する工程;（iv）繊維素溶解を防止するために抗繊維素溶解剤を添加する工程;および（v）多血小板フィブリンを得るために上清を除去する工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、過剰な血漿を除去することによって濃縮する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物の血液は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ブタ、ウサギ、イルカ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物由来、家畜由来、またはペット由来である。hPRの文脈において本明細書中で論じられる1つまたは複数の任意の工程は、多血小板フィブリンを生成するための方法において実施され得る。特定の実施形態において、放出物生成方法は、得られた血餅を単離または分離する工程をさらに含む。特定の実施形態において、方法は、以下の工程:分離された血餅に抗繊維素溶解剤を添加して繊維素溶解を防止する工程;および多血小板フィブリンを得るために上清を除去する工程の一方または両方を含む。抗繊維素溶解剤としては、アプロチニン、トラネキサム酸、アミノメチル安息香酸またはアミノカプロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。セルピンも抗繊維素溶解性であり、例としては、アプロチニン、アルファ1アンチトリプシン、C1インヒビターおよびカモスタットが挙げられる。いくつかの実施形態において、添加される抗線溶剤の濃度または分離された血餅を加えたその最終濃度は、約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100μMもしくはmM（またはその中で導き出せる任意の範囲）、少なくとも約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100μMもしくはmM（またはその中で導き出せる任意の範囲）、または多くとも約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100μMもしくはmM（またはその中で導き出せる任意の範囲）である。いくつかの実施形態において、アプロチニンの濃度は、約1.0μM～約10mMの範囲である。トラネキサム酸は、約1μM～約100mMの範囲である;アミノカプロン酸は、約0.01mM～約50mMの範囲である。

フィブリン塊の治療的または医学的用途は当業者に公知である。フィブリン塊の治療的または医学的用途は、整形外科、スポーツ医学、再生歯科、美容、形成および顎顔面手術を含む多くの異なる分野に及ぶ。このような用途としては、生物学的接着剤、生物学的ヒドロゲル、スキンケアのための局所製剤および/または血管損傷部位での失血を防止する止血剤としての使用、またはこれらとの使用が挙げられるが、これらに限定されない。フィブリン塊中の成長因子およびサイトカインは、例えば、創傷治癒、治癒組織の新しいまたは迅速な血管新生、骨再生または軟組織成熟において役割を果たすことができる。

以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技術は、本開示の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成すると考えることができることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。実施例は、決して限定するものとして解釈されるべきではない。引用された全ての参考文献（本出願を通して引用される文献、発行された特許、公開された特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる文書中の用語の定義が、本明細書で使用されるものと矛盾する場合、本明細書で使用される定義が適用される。

III. 実施例
実施例1-ヒト血小板放出物を調製する方法
hPRは、成人血液由来血小板の期限切れユニットを使用して閉じられた系の中で製造される。期限切れ後すぐの血小板のユニットを分画して、多血小板血漿（PRP）を単離する。白血球除去後、血小板を4000gで10分間の遠心分離によってペレット化した。ABO型決定および感染性疾患試験の結果に基づいて、血小板をバッチにプールした。PRPのプールを撹拌して成長因子を放出させた。この工程の後に、細胞片と凝固因子を分離するために、4000gで15分間の別の回の遠心分離を行った。hPRである上清を一定分量に収集し、-80℃で保存した。hPRのバッチは、図19、図20Aおよび20B、ならびに図21Aおよび21Bに示されるように、（i）総タンパク質、（ii）成長因子濃度、および（iii）MSCの成長速度論を測定することによって特徴付けられた。

以下は、本開示によるヒト血小板放出物を調製するためのプロトコルの一例である。
1. （多血小板血漿）PRPのユニットを秤量した。
2. 以下のパラメータまたは試験結果を、使用した各ユニットについて記録した：ABO型、血球数、および感染性疾患マーカー（IDM）。
3. O型（Rh＋およびRh-）PRPのみを例として使用したが、任意のABO血液型を使用することができる。
4. 期限切れのユニットを、袋あたり250mlの最終容量までプールした。
5. 2つのさらなる空の移送袋に各PRPユニットを接続した。
6. 4℃で4000gに設定した遠心分離に入れて、PRPユニットのバランスを取った。
7. 15分間の遠心分離後、G4/G5エクスプレッサー系にユニットを穏やかに移した。
8. 上清を絞り出した（expressed）、すなわち空の袋中に血漿を入れた。
9. さらに使用するまで、-80℃で血漿袋を保存した。
10. 第2の袋を使用して、さらなる処理のために、濃縮されたPRP（50mlまたはそれを超える）を保存した。
11. 急冷冷凍庫を使用して、袋を-55℃に凍結した。
12. -80℃冷凍庫中で一晩、袋をインキュベートした。
13. 不可欠な製造体積を達成するために、この工程までユニットをインキュベートした。
14. 37℃に設定した水浴を使用して、袋を30分間解凍した。
15. 滅菌された溶接接続を使用して40mMの最終濃度で塩化カルシウムを注入することによって、血小板を活性化した。
16. 38～40℃、250rpmで90分間、オービタルシェーカー装置にユニットを配置することによって、袋の内容物を撹拌した。
17. 撹拌工程後、4℃で4000gに設定された遠心分離機中に、濃縮されたPRPユニットを入れてバランスを取った。
18. ユニットを15分間遠心分離した。
19. G4/G5を使用して、全ての袋（50ml）の中の上清を1リットルの袋に移した。
20. 500mlの最大体積まで、1リットルの袋の中にPRPのユニットをプールした。
21. 次いで、500mlの未濾過ヒト血小板放出物（UN-hPR）を含有する1Lの袋中で、さらなる使用まで4℃でユニットをインキュベートした。
22. この工程以降、すべての操作はバイオセーフティキャビネット（BSC）内で行った。
23. 3段階濾過のための真空式濾過システム（Stericup）を有するバイオセーフティキャビネット（BSC）に袋を移した。
24. 500mlのUN-hPRを0.45ミクロンStericupに移した。
25. 濾過後、Stericupシステムのボトルを回収し、その内容物を2回目の濾過のために0.22ミクロンStericupに移した。
26. 濾過後、0.22ミクロンのStericupシステムの転送ボトル中の内容物を集め、3回目の濾過のために0.10ミクロンのStericupに移した。
27. 濾過後、0.10ミクロンStericupシステムの転送ボトルを回収し、25mlの一定分割量の濾過されたヒト血小板放出物（Fil-hPR）を30mlの貯蔵ボトル中に移した。
28. 貯蔵ボトル（500mlごとに20本のボトル）を-20℃にまたは-80℃未満に設定した冷凍庫に移した。

図2～図6および図10～図20は、上記のプロトコルを用いて得られたhPRバッチ中の様々な成長因子、サイトカイン、インターフェロン、総タンパク質、グロブリン、アルブミンおよびその他の成分の定量的比較分析を示す。データは、予想外にも、成長因子およびサイトカインの量が、市販のヒト血小板溶解物（hPL）、化学的に組成が明らかな培地（CDM）およびウシ胎児血清（FBS）を含む対照と比較して、本方法によって産生されたhPRにおいてより高かったことを示す。これらの結果は、MSCの増殖速度が、FBS、CDMおよびhPLと比較して、hPRが補充された基礎培地においてより大きいことも示す。

本開示によるプロトコルの変形は、0.45ミクロン～0.65ミクロンのフィルターを用いて放出物を濾過することを含む。最近のデータは、閉じられた系の一部として放出物を濾過することが可能であることを示唆している。

実施例2-ヒト血小板放出物を調製するためのスケールアップされた方法
本発明者らは、抗凝固剤の成長培地への添加を必要としない一貫したロットのhPRを製造する過程を開発した。実施例1に概説したプロトコルまたはその改変を用いたヒト血小板放出物の収量は、スケールアップした場合、4時間未満で最大10LのhPRをもたらすことができる。大規模な細胞拡大系におけるhPRの影響も試験した。hPRの大規模製造では、4時間毎に24Lもの数値を得ることができる。

実施例3-フィブリン塊形成に対するCaCl ₂ 濃度の効果
本発明者は、実施例1のプロトコルを使用する場合の、血餅形成に対する様々な濃度のCaCl₂を試験した。試験した濃度には、10mM、20mM、40mM、80mM、100mMおよび200mMが含まれる。予想外にも、10mM未満の低濃度（従来技術の推奨に近い）では、細胞を被包するはっきりとしたフィブリン塊は得られなかった。同様に、より高濃度のCaCl₂、すなわち80mMを超えるCaCl₂は、はっきりとしたフィブリン塊および透明な上清（放出物）をもたらさなかった。最適なCaCl₂濃度は25mM～80mMの範囲であった。このような濃度では、フィブリン塊は、透明な液体として上清を残す、全ての細胞片を含むはっきりとしたゲルである。データを図9に示す。

実施例4-MSC倍加に対するhPR中のCaCl ₂ 濃度の影響
本発明者は、骨髄由来間葉系幹細胞の集団倍加レベルに対するhPR中の10mM、20mM、40mM、80mM、100mMおよび200mM CaCl₂の効果を研究した。この実験のために、室温で保存された期限切れのAcrodoseまたはアフェレーシス血小板を使用した。対照は、FBSに代えて10％の市販ゼノフリー代替物を含む培地中で培養された細胞であった。5日目および7日目の細胞培養物に対して、細胞力価Glo発光アッセイを行った。データを図11に示す。最も高いPDLレベルをもたらした濃度は、20mMおよび40mM CaCl₂であった。

実施例5-フィブリン塊形成に対する攪拌期間の効果
本発明者は、骨髄由来間葉系幹細胞の集団倍加レベルに対する血小板撹拌期間の影響を研究した。この実験のために、室温で保存された期限切れのAcrodoseまたはアフェレーシス血小板を使用した。対照は、FBSに代えて10％の市販ゼノフリー代替物を含む培地中で培養された細胞であった。PDL3およびPDL7の時点で、細胞力価Glo発光アッセイを行った。データを図12に示す。60～90分間の撹拌が十分であることが示され、最大180分間の期間が同様の結果を与えた。

実施例6-MSC倍加に対するhPR遠心分離期間の影響
本発明者は、骨髄由来間葉系幹細胞の集団倍加レベルに対するhPR遠心分離期間の影響も試験した。この実験のために、室温で保存された期限切れのAcrodoseまたはアフェレーシス血小板を使用した。対照は、FBSに代わる10％の市販を含む培地中で培養された細胞であった。PDL3の時点で、細胞力価Glo発光アッセイを行った。データを図13に示す。結果は、15分間の遠心分離が、十分な集団倍加レベルを与えるhPRを生成するのに十分な期間であったことを示す。

実施例7-MSC倍加に対する、放出物補充期間を使用することの効果
0.5％、1％および2.5％、5％および10％の濃度で市販のヒト血小板溶解物および様々なヒト血小板放出物調製物を補充したα-MEM中で、ヒト骨髄由来MSCを培養した。細胞培養補充物質は、通常、細胞培養培地中に懸濁された1％～20％の範囲で使用した。5,000細胞/ウェルの播種密度で、24ウェル組織培養プレートに細胞を播種した。5日間にわたって細胞倍加をモニターし、CellTiter Glo発光アッセイを用いて評価した。図21Aおよび図21Bに示される結果は、MSCの増殖速度が、FBS、CDMおよびhPLと比較して、hPRが補充された培地において優れていることを示す。いくつかの例において、hPRによって得られた同じPDLレベルに達するために使用された市販の溶解物の量は、2倍以上であった。

実施例8-ヒト多血小板フィブリン（hPRF）の製造または調製
以下は、本開示によるヒト多血小板フィブリンを調製するためのプロトコルの一例である。
1. （多血小板血漿）PRPのユニットを秤量した。
2. 以下のパラメータまたは試験結果を、使用した各ユニットについて記録した:ABO型、血球数および感染性疾患マーカー（IDM）。
3. O型（Rh＋およびRh-）PRPのみを例として使用したが、任意の他のABO型を使用することができる。
4. 期限切れのユニットを、袋あたり250mlの最終容量までプールした。
5. 2つのさらなる空の移送袋に各PRPユニットを接続した。
6. 4℃で4000gに設定した遠心分離に入れて、PRPユニットのバランスを取った。
7. 15分間の遠心分離後、G4/G5エクスプレッサー系にユニットを穏やかに移した。
8. 上清を絞り出す、すなわち空の袋中に血漿を入れる。
9. さらに使用するまで、-80℃で血漿袋を保存した。
10. 第2の袋を使用して、さらなる処理のために、濃縮されたPRP（50mlまたはそれを超える）を保存した。
11. 急冷冷凍庫を使用して、袋を-55℃に凍結した。
12. -80℃冷凍庫中で一晩、袋をインキュベートした。
13. 不可欠な製造体積を達成するために、この工程までユニットをインキュベートした。
14. 37℃に設定した水浴を使用して、袋を30分間解凍した。
15. 滅菌された溶接接続を使用して40mMの最終濃度で塩化カルシウムを注入することによって、血小板を活性化した。
16. 38℃～40℃、250rpmで90分間、オービタルシェーカー装置にユニットを固定することによって、袋の内容物を撹拌した。
17. 撹拌工程後、4℃で4000gに設定された遠心分離機中に、濃縮されたPRPユニットを入れてバランスを取った。
18. ユニットを15分間遠心分離した。
19. G4/G5を使用して、上清を廃棄する。
20. 沈殿物をホモジナイザーに移す。
21. 線維素溶解を防ぐために、適切な濃度の抗繊維素溶解剤を添加する（例えば、アプロチニンまたはトラネキサム酸またはアミノカプロン酸など）。
22. 多血小板フィブリンを滅菌容器（5cc容量など）に移し、4℃で保存する。

実施例9-血小板放出物製剤の調製
例示的な放出物（放出物F1）の調製
以下は、本開示によるヒト血小板放出物（放出物F1）を調製するためのプロトコルの一例である。
1. （多血小板血漿）PRPのユニットを秤量した。
2. 以下のパラメータまたは試験結果を、各ユニットについて記録した:ABO型、血球数および感染性疾患マーカー（IDM）。
3. O型（Rh＋およびRh-）PRPのみを本実施例において使用したが、任意のABO血液型を使用することができる。
4. 袋あたり250mlの最終容量になるようにPRPユニットを調整した。
5. 無菌チューブ溶接機を使用して、300ml容量の空の移送袋に250mLの各重量調整されたPRPユニットを接続した。
6. 4℃で4000gに設定した遠心分離に入れて、PRPユニットのバランスを取った。
7. 15分間の遠心分離後、抽出器システム、例えばFresenius KabiによるCompomat G5にユニットを穏やかに移した。
8. 50mLの血漿を血小板とともに残存させて、上清、すなわち血漿を空の移送袋に移した。
9. 200mLの移された血漿を含む移送袋を、その他の使用または廃棄のために-80℃で保存した。
10. 50mlの血漿、すなわち濃縮されたPRPを有する血小板を含有する袋をさらなる処理のために使用した。
11. 急速冷却冷凍庫を使用して、まず、濃縮されたPRPを含有する袋を-55℃～-80℃に凍結した。
12. 次いで、濃縮されたPRPを含有する袋を貯蔵のために-80℃の冷凍庫に移した。
注:濃縮されたPRPユニットを収集し、処理し、必要不可欠な製造体積に達するまで-80℃で保存した。この保管により、大規模製造のための濃縮されたPRPユニットの蓄積が容易になる。
13. 濃縮されたPRPを含有する袋を-80℃の冷凍庫から取り出し、37℃に設定された水浴を使用して30分間解凍した。
注:大規模製造のために工程1でPRPユニットが豊富に利用可能であれば、工程11、12および13は省略し得る。
14. 無菌の溶接された接続を使用して40mMの最終濃度の無菌塩化カルシウム溶液の注射によって、血小板を活性化した。
15. 38℃～40℃、250rpmで90分間、オービタルシェーカー装置にユニットを配置することによって、袋の内容物を撹拌した。
16. 撹拌工程後、4℃で4000gに設定された遠心分離機中に、塩化カルシウム処理された濃縮されたPRPユニットを入れてバランスを取った。
17. ユニットを15分間遠心分離した。
18. 170ミクロン～260ミクロンのフィルターシステム。例えば、170ミクロン～260ミクロンのフィルターを含有するFenwal y型血液成分レシピエントセットに1L移送袋を滅菌溶接/接続することによって、新しい移送袋システムを組み立てた。この移送袋アセンブリは、ヒト血小板放出物を収集してプールするために次の工程で使用される。
19. 抽出器システムを使用して、すべての袋の中の上清（ヒト血小板放出物と呼ばれる）を収集袋システム中に移した。
20. ユニット当たり50mLのヒト血小板放出物で、収集袋システムの1リットルの移送袋中に500mlの最大体積まで10ユニットをプールした。
21. 次いで、500mlのヒト血小板放出物を含有する1Lの袋中に、プールされたユニットを-80℃で一晩保存した。
22. -80℃で一晩処理した後、ヒト血小板放出物を37℃の水浴中で30分間解凍した。
23. 解凍されたヒト血小板放出物を、無菌チューブ溶接機を使用して白血球除去システムに接続した。濾過されたヒト血小板放出物を、取り付けられた1Lの移送袋中に集めた。
24. さらに、生成物を含有する1Lの移送袋に取り付けられた0.65umインラインフィルター（例えば、Macopharmaインラインフィルター）を使用して、ヒト血小板放出物の無菌濾過を行った。
25. 濾過後、25mlの一定分割量の濾過されたヒト血小板放出物を30mlの貯蔵ボトル中に移した。
26. 貯蔵ボトル（500mlごとに20本のボトル）を-80℃にまたは-80℃未満に設定した冷凍庫に移した。

例示的な放出物（放出物F2）の調製
以下は、本開示によるヒト血小板放出物（放出物F2）を調製するためのプロトコルの一例である。この例示的なプロトコルは、多血小板血漿を遠心分離する工程を含まない。
1. （多血小板血漿）PRPのユニットを秤量した。
2. 以下のパラメータまたは試験結果を、各ユニットについて記録した:ABO型、血球数および感染性疾患マーカー（IDM）。
3. O型（Rh＋およびRh-）PRPのみを本実施例において使用したが、任意のABO血液型を使用することができる。
4. 袋あたり250mlの最終容量になるようにPRPユニットを調整した。
5. 急速冷却冷凍庫を使用して、まず、PRPを含有する袋を-55℃～-80℃に凍結した。
6. 次いで、PRPを含有する袋を貯蔵のために-80℃の冷凍庫に移した。
注:PRPユニットを収集し、処理し、必要不可欠な製造体積に達するまで-80℃で保存した。この保管により、大規模製造のためのPRPユニットの蓄積が容易になる。
7. PRPを含有する袋を-80℃の冷凍庫から取り出し、37℃に設定された水浴を使用して30分間解凍した。
注:大規模製造のために工程1でPRPユニットが豊富に利用可能であれば、工程5、6および7は省略し得る。
8. 無菌の溶接された接続を使用して40mMの最終濃度の無菌塩化カルシウム溶液の注射によって、血小板を活性化した。
9. 38℃～40℃、250rpmで90分間、オービタルシェーカー装置にユニットを配置することによって、袋の内容物を撹拌した。
10. 撹拌工程後、4℃で4000gに設定された遠心分離機中に、塩化カルシウム処理されたPRPユニットを入れてバランスを取った。
11. ユニットを15分間遠心分離した。
12. 170ミクロン～260ミクロンのフィルターシステム。例えば、170ミクロン～260ミクロンのフィルターを含有するFenwal y型血液成分レシピエントセットに1L移送袋を滅菌溶接/接続することによって、新しい移送袋システムを組み立てた。この移送袋アセンブリは、ヒト血小板放出物を収集してプールするために次の工程で使用される。
13. 抽出器システムを使用して、すべての袋の中の上清（ヒト血小板放出物と呼ばれる）を収集袋システム中に移した。
14. ユニット当たり250mLのヒト血小板放出物で、収集袋システムの2リットルの移送袋中に1000mlの最大体積まで4ユニットをプールした。
15. 次いで、1000mlのヒト血小板放出物を含有する2Lの袋中に、プールされたユニットを-80℃で一晩保存した。
16. -80℃で一晩処理した後、ヒト血小板放出物を37℃の水浴中で30分間解凍した。
17. 解凍されたヒト血小板放出物を、無菌チューブ溶接機を使用して白血球除去システムに接続した。濾過されたヒト血小板放出物を、取り付けられた2Lの移送袋中に集めた。
18. さらに、生成物を含有する2Lの移送袋に取り付けられた0.65umインラインフィルター（例えば、Macopharmaインラインフィルター）を使用して、ヒト血小板放出物の無菌濾過を行った。
19. 濾過後、50mlの一定分割量の濾過されたヒト血小板放出物を60mlの貯蔵ボトル中に移した。
20. 貯蔵ボトル（1000mlごとに20本のボトル）を-80℃にまたはー80℃未満に設定した冷凍庫に移した。

実施例10-血小板放出物における示差的バイオマーカー発現
様々な組成物:放出物F1および放出物F2、ヒトAB血清、FBS、および3つの市販の血小板溶解物（溶解物A、BおよびC）に対して、抗体アレイ分析を行った。抗体アレイ分析のために、Quantibody Human Cytokine Antibody Array 4000を使用してRaybiotech（ノークロス、GA）によるサービスとしてすべてのサンプルを処理した。この定量的アレイは、200個のヒト成長因子、サイトカイン、ケモカインおよびその他の因子の濃度を同時に与える（表1を参照）。すべての実験は、抗体アレイ添付文書に提供されている推奨される製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、ブロッキング緩衝液との30分間のインキュベーションの後、100μLの二倍希釈された試料をスライドガラスの各ウェルに添加した。規定のインキュベーション期間および広範な洗浄後、ビオチン標識された検出抗体および検出抗体カクテルを1～2時間（室温）添加し、次いで洗浄した。次いで、Cy3等価色素が結合されたストレプトアビジンを添加し、室温で1時間インキュベートした。スライドを十分に洗浄した後、マイクロアレイスキャナを用いて走査した。各タンパク質は、精製された標準タンパク質の既知の希釈物からの測定値が含まれる標準曲線を有していた。各スライドアレイは、正規化の目的で使用された陽性対照試料を含有していた。測定は、各スポットに結合した標識抗体の蛍光強度に基づき、抗体当たり4つのスポットの平均から計算した。Raybiotechソフトウェアを使用してスライドを測定し、分析し、陽性対照に対して正規化した。最終結果は、ピコグラムのタンパク質/ml抽出物として表した。

抗体アレイ分析の結果を表1および図22A～図22Fに示し、他の試料と比較して放出物におけるバイオマーカー発現が異なることを実証する。図22Aは、示されているように5つの群（1～5）に分離された、すべての試料中のすべてのタンパク質のレベルを示す。図22B～22Fは、図22Aに示される5つの群のそれぞれについてのタンパク質レベルを示す。表1中の0.0と表示された値は、検出限界（LOD）未満であった。表1中のイタリック体の値は、アッセイの最高基準（MAX）を上回った。

実施例11-血小板放出物によるMSC倍加時間
骨髄由来MSC（BM-MSC）を24ウェルプレートのウェル中に、5,000細胞/ウェルの密度で播種した。5％溶解物、10％FBS、10％AB血清、または5％放出物製剤のいずれかを補充された1倍濃度のGlutamax（Gibco）を含むDMEM（Gibco）からなる成長培地をウェルに添加した。市販の溶解物（5％の補充物質濃度）ならびにFBSおよびAB血清（10％の補充物質濃度）を対照とした。対照を含む各条件は3連で実行した。標準的な細胞培養条件下で、すなわち加湿した37℃、5％ CO₂/95％空気環境を用いて、細胞を5日間拡大増殖させた。5日目に、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（Promega、マディソン、WI）を用いて細胞増殖を評価した。簡潔には、培地を除去し、細胞を滅菌PBS中で3回洗浄した。調製した200ulのCellTiter-Glo試薬を各ウェルに添加し、次いで、撹拌しながら37℃で2分間インキュベートした。インキュベーターから取り出したら、ウェルプレートを室温で10分間静置して発光シグナルを平衡化させた。次いで、各ウェルの全内容物を、ルミノメーターと適合する96ウェルプレートのウェルに移した。Tecan Sparkプレートリーダー（モリスビル、NC）を使用して、各ウェルの発光を測定した。実験試料と並行して行われた既知濃度の細胞に対する相対光単位（RLU）の標準曲線を使用して、ウェルあたりの細胞数を決定した。以下の式を使用して、細胞数から、集団倍加レベル（PDL）を計算した：PDL＝3.322（LogA-LogB）、式中、Aは増殖期間終了時の細胞数（ウェルあたり）であり、Bは各ウェル中に播種された当初の細胞数（本実験では、5000）を表す。

MSC倍加実験の結果を図23に示す。

実施例12-放出物製剤中のタンパク質の定量
全タンパク質アッセイを様々な添加剤について行った：FBS、ヒトAB血漿（AB血清）、3つの市販の溶解物のうちの1つ（溶解液A、溶解液B、または溶解液C）、2つの血小板放出物製剤のうちの1つ（放出物F1、放出物F2）、またはプールされた血漿。全タンパク質アッセイは、添付文書に提供された指示に従って、Architect C8000システムを使用して、全タンパク質試薬キット（リスト番号7D73号）により、試料（すなわち、FBS、溶解物、放出物など）を試験することによって行った。試料中のフィブリノーゲンの濃度を定量するために、添付文書に規定されたアッセイ手順に従って、Diazymeのフィブリノーゲンアッセイキット（参照番号DZ768A-K）を使用した。CAPILLARYSシステムを用いたキャピラリー電気泳動によって、Sebiaのキャピラリータンパク質（E）6キットを使用して、試験試料中のアルブミンおよびグロブリンの濃度を定量した。結果を図24に示す。

実施例13-血小板の電子顕微鏡法
休止血小板および活性化血小板に対して、走査型電子顕微鏡法（SEM）および透過型電子顕微鏡法（TEM）を実施した。SEMでは、4％ホルムアルデヒドおよび1％グルタルアルデヒドを含有するPBS緩衝液を使用して、放出物製剤の製造の異なる段階から得た血小板を固定した。固定後、血小板を四酸化オスミウムで処理し、カコジル酸ナトリウム緩衝液を用いて洗浄し、続いて20％、40％、60％、80％、および100％エタノールで一連の洗浄を行い、血小板を脱水した。次いで、金-パラジウム合金で細胞をスパッタコーティングし、真空下で24時間保存し、JEOL JSM-6610LVを使用して画像化した。透過型電子顕微鏡法（TEM）は、4％ホルムアルデヒドおよび1％グルタルアルデヒドを含有するPBS緩衝液で血小板を固定することによって実施した。固定後、血小板を四酸化オスミウムで処理し、カコジル酸ナトリウム緩衝液を用いて洗浄し、続いて20％、40％、60％、80％、および100％エタノールで一連の洗浄を行い、血小板を脱水した。次いで、プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の1：1の比の混合物で細胞を処理した。真空下で24時間インキュベートした後、細胞を100％エポキシ樹脂中に包埋し、硬化のためにオーブンで焼成した。ダイヤモンドカッターを備えたウルトラミクロトームを使用して、細胞を含有する硬化されたブロックを厚さ90nmの切片とし、JOEL 1230を使用して画像化した。小胞および細胞内物質が血小板から外部環境に放出されることを含む脱顆粒過程が観察された。図25～図30は、これらの電子顕微鏡実験の結果を示す。特に、図29は、脱顆粒後の血小板を示し、血小板が顆粒を欠いているが無傷のままである（すなわち、溶解されない）ことを示す。

実施例14-放出物を用いて拡大増殖されたBM-MSC上でのCDマーカー発現
10％ FBS、10％ AB-血清、5％市販溶解物（溶解物A、溶解物B、または溶解物C）、5％放出物F1または5％放出物F2を補充された基礎成長培地中で、骨髄由来MSC（BM-MSC）を拡大増殖させた。MSCの分化能（potency）に対する放出物製剤の効果を明確に実証するために、異なる条件にわたって使用されるMSCを同じドナーから得、すべての条件について同じPDLで維持した。拡大増殖後、MSC関連CDマーカー発現について細胞を特徴づけた。結果を図31に示す。放出物製剤（F1およびF2）において拡大増殖されたBM-MSCのCDマーカー発現は、国際細胞療法学会（ISCT）によって提案されたMSCの特徴付けのための標準化された基準を満たした。

実施例15-脂肪生成能の評価
10％ FBS、10％ AB血清、5％市販溶解物（溶解物A、溶解物B、または溶解物C）、5％放出物F1または5％放出物F2が補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させた。拡大増殖後、分化培地を用いて細胞の多能性を評価した。BM-MSCは、組織培養処理されたプラスチックに結合した放出物製剤（F1およびF2）中で拡大増殖し、多能性を示し、国際細胞療法学会（ISCT）によって提案されたMSCの特徴付けのための標準化された基準を満たした。MSCの分化能（potency）に対する放出物製剤の効果を明確に実証するために、異なる条件にわたって使用されるMSCを同じドナーから得、すべての条件について同じPDLで維持した。この実験の結果が図32A～図32Gに示されており、放出物F2と比較して、脂肪生成を刺激することにおいて放出物F1が好ましいことを示唆する。放出物製剤（F1およびF2）は、拡大増殖前（すなわち、ドナー選択）または細胞拡大増殖後（すなわち、ロットまたはバッチの評価、別名、放出基準）のドナーの細胞の分化能および/または適合性を評価するために使用することもできる。これに関連して、適合性試験は、ドナーのMSCが脂肪細胞に分化する能力を指す。

実施例16-軟骨形成能の評価
10％ FBS、10％ AB血清、5％市販溶解物（溶解物A、溶解物B、または溶解物C）、5％放出物F1または5％放出物F2が補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させた。拡大増殖後、分化培地を用いて細胞の多能性を評価した。BM-MSCは、組織培養処理されたプラスチックに結合した放出物製剤（F1およびF2）中で拡大増殖し、多能性を示し、国際細胞療法学会（ISCT）によって提案されたMSCの特徴付けのための標準化された基準を満たした。MSCの分化能（potency）に対する放出物製剤の効果を明確に実証するために、異なる条件にわたって使用されるMSCを同じドナーから得、すべての条件について同じPDLで維持した。この実験の結果が図33A～図33Gに示されており、放出物F2と比較して、軟骨形成を刺激することにおいて放出物F1が好ましいことを示唆する。放出物製剤（F1およびF2）は、拡大増殖前（すなわち、ドナー選択）または細胞拡大増殖後（すなわち、ロットまたはバッチの評価、別名、放出基準）のドナーの細胞の分化能および/または適合性を評価するために使用することもできる。これに関連して、適合性試験は、ドナーのMSCが軟骨細胞に分化する能力を指す。

実施例17-骨形成能の評価
10％ FBS、10％ AB血清、5％市販溶解物（溶解物A、溶解物B、または溶解物C）、5％放出物F1または5％放出物F2が補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させた。拡大増殖後、分化培地を用いて細胞の多能性を評価した。BM-MSCは、組織培養処理されたプラスチックに結合した放出物製剤（F1およびF2）中で拡大増殖し、多能性を示し、国際細胞療法学会（ISCT）によって提案されたMSCの特徴付けのための標準化された基準を満たした。MSCの分化能（potency）に対する放出物製剤の効果を明確に実証するために、異なる条件にわたって使用されるMSCを同じドナーから得、すべての条件について同じPDLで維持した。この実験の結果が図34A～図34Gに示されており、放出物F1と比較して、骨形成を刺激することにおいて放出物F2が好ましいことを示唆する。放出物製剤（F1およびF2）は、拡大増殖前（すなわち、ドナー選択）または細胞拡大増殖後（すなわち、ロットまたはバッチの評価、別名、放出基準）のドナーの細胞の分化能および/または適合性を評価するために使用することもできる。これに関連して、適合性試験は、ドナーのMSCが骨細胞に分化する能力を指す。

実施例18-放出物の免疫調節能力の評価
IDO合成アッセイ
10％ FBS、10％ AB血清、5％市販溶解物（溶解物A、溶解物B、または溶解物C）、5％放出物F1または5％放出物F2が補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させた。MSCの分化能（potency）に対する放出物製剤の効果を明確に実証するために、異なる条件にわたって使用されるMSCを同じドナーから得、すべての条件について同じPDLで維持した。拡大増殖後、サイトカインであるインターフェロンガンマ（IFNγ）および/または腫瘍壊死因子α（TNFα）からの刺激に応答したインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）の合成による免疫調節能について細胞を評価した。IDO特異的阻害剤を対照として使用した。放出物製剤中で拡大増殖された細胞は、図35に示されているようにIDOの増加した産生を示し、増加したIDO応答は増加したキヌレニン産生をもたらし、このアッセイではキヌレニン産生の増加を定量した。IDOは、基礎成長培地中に存在するトリプトファンに作用してキヌレニン（KYN）を形成し、したがって、キヌレニンレベルの増加は、細胞におけるIDO合成の増加に比例する。放出物製剤（F1およびF2）は、拡大増殖前（すなわち、ドナー選択）または細胞拡大増殖後（すなわち、ロットまたはバッチの評価、別名、放出基準）のドナーの細胞の分化能および/または適合性を評価/試験するために使用することもできる。これに関連して、適合性/分化能試験は、ドナーのMSCが免疫応答を調節する能力を指す。

PBMC培養アッセイ
5％放出物F1または5％放出物F2が補充された基礎成長培地中で、BM-MSCを拡大増殖させた。MSCの分化能（potency）に対する放出物製剤の効果を明確に実証するために、異なる条件にわたって使用されるMSCを同じドナーから得、すべての条件について同じPDLで維持した。拡大増殖後、BM-MSCの存在下で末梢血単核球（PBMC）を5日間共培養することによって、細胞を免疫調節能について評価した。フィトヘマグルチニン（PHA）を使用して、PBMCの拡大増殖を誘発した。放出物製剤（F1およびF2）中で拡大増殖させたMSCは、免疫調節特性を示した。図36に示すように、BM-MSCはPBMCの増殖を緩和した。放出物製剤（F1およびF2）は、拡大増殖前（すなわち、ドナー選択）または細胞拡大増殖後（すなわち、ロットまたはバッチの評価、別名、放出基準）のドナーの細胞の分化能および/または適合性を評価/試験するために使用することもできる。これに関連して、適合性/分化能試験は、PBMCの増殖を緩和することによって免疫応答を調節するドナーのMSCの能力を指す。

Treg刺激アッセイ
10％ FBS、10％ AB血清、5％市販溶解物（溶解物Aまたは溶解物C）、5％放出物F1または5％放出物F2が補充された基礎成長培地中でBM-MSCを拡大増殖させた。MSCの分化能（potency）に対する放出物製剤の効果を明確に実証するために、異なる条件にわたって使用されるMSCを同じドナーから得、すべての条件について同じPDLで維持した。拡大増殖後、PBMCのBM-MSCとの共培養によって免疫調節能について細胞を評価した。制御性T細胞（T-reg）を測定した。フィトヘマグルチニン（PHA）を使用してPBMCの拡大増殖を誘発した。インターロイキン-1（IL2）は、制御性T細胞の選択的上方制御を好む。図37に示すように、放出物製剤（F1およびF2）中で拡大増殖されたBM-MSCは、優れた免疫調節特性を示した。図37に示されるように、放出物製剤において拡大増殖されたMSCは、T-regの増殖を軽減しない。これは、免疫調節において望ましい特性である。放出物製剤（F1およびF2）は、拡大増殖前（すなわち、ドナー選択）または細胞拡大増殖後（すなわち、ロットまたはバッチの評価、別名、放出基準）のドナーの細胞の分化能および/または適合性を評価/試験するために使用することもできる。これに関連して、適合性/分化能試験は、T-regの増殖を阻害せずにPBMCの増殖を緩和することによって免疫応答を調節するドナーのMSCの能力を指す。

本明細書に開示され、特許請求されている方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている方法および方法の工程または工程の順序に変形を適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載の因子は化学的かつ生理学的に関連する特定の因子と置き換えられ得るが、同一のまたは同様の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に自明なすべてのこのような類似の置換および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。

参考文献
本出願に列挙された参考文献は、本明細書に記載された詳細を補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する限度まで、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

Claims

（i）ヒト血液から血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;
（ii）25mMを超える最終濃度まで該PRPにCaCl₂を添加し、それによりCaCl₂/PRP混合物を生成させる工程;および
（iii）該CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それにより血餅および放出物を形成する工程
を含む、血小板放出物を調製するための方法。
前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、請求項1記載の方法。
CaCl₂の前記最終濃度が約30mMを超える、請求項1記載の方法。
CaCl₂の前記最終濃度が約25mM～約80mMである、請求項1記載の方法。
CaCl₂の前記最終濃度が約30mM～約50mMである、請求項1記載の方法。
CaCl₂の前記最終濃度が約35mM～約50mMである、請求項1記載の方法。
CaCl₂の前記最終濃度が約40mM～約47mMである、請求項1記載の方法。
CaCl₂の前記最終濃度が約45mMである、請求項1記載の方法。
CaCl₂の前記最終濃度が約80mMである、請求項1記載の方法。
前記CaCl₂/PRP混合物が4時間未満撹拌される、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
前記CaCl₂/PRP混合物が180分未満撹拌される、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
前記CaCl₂/PRP混合物が30分間～150分間撹拌される、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
前記CaCl₂/PRP混合物が45分間～135分間撹拌される、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
前記CaCl₂/PRP混合物が60分～90分撹拌される、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
前記CaCl₂/PRP混合物が50rpm～500rpmで撹拌される、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
前記CaCl₂/PRP混合物が250rpmで撹拌される、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、グロブリン、アルブミン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、糖タンパク質、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはラミニンを含む、請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、TGFβ1、TGFβ3、EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、SDF-1α、VEGFまたはHGFを含む、請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約400pg/ml～約500pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項1～19のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1αを含む、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1αを含む、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1αを含む、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1αを含む、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
前記血小板が、新鮮な血小板由来、室温に保たれた血小板由来、または以前に凍結された血小板由来であった、請求項1～27のいずれか一項記載の方法。
前記血餅を前記放出物から分離する工程をさらに含む、請求項1～28のいずれか一項記載の方法。
前記放出物を濾過する工程（iv）をさらに含む、請求項1～29のいずれか一項記載の方法。
工程（iv）が、0.45ミクロン～1.0ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、請求項30記載の方法。
工程（iv）が、3.0ミクロン～10ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、請求項30記載の方法。
工程（iv）が、170ミクロン～260ミクロンであるフィルターを用いて前記放出物を濾過することを含む、請求項30記載の方法。
工程（i）、（ii）および（iii）が閉じられた袋の中で行われる、請求項1～33のいずれか一項記載の方法。
工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）が閉じられた袋の中で行われる、請求項31～33のいずれか一項記載の方法。
工程（i）、（ii）および（iii）が閉じられた系の中で行われる、請求項1～24のいずれか一項記載の方法。
工程（i）、（ii）および（iii）が、閉じられた系の中で、工業規模で行われる、請求項1～24のいずれか一項記載の方法。
工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）が、閉じられた系の中で、工業規模で行われる、請求項31～33のいずれか一項記載の方法。
方法全体が4時間またはそれ未満で行われる、請求項1～38のいずれか一項記載の方法。
工程（i）、（ii）および（iii）の期間が3～4時間である、請求項1～27のいずれか一項記載の方法。
工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）の期間が3時間～4時間である、請求項1～27のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が約0.2リットル～約100リットルの収量で産生される、請求項1～29のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が約4.5リットル～約10リットルの収量で産生される、請求項1～29のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が約50リットル～約100リットルの収量で産生される、請求項1～29のいずれか一項記載の方法。
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項1～44のいずれか一項記載の方法。
請求項1～45のいずれか一項記載の方法によって産生された、放出物組成物。
請求項1～45のいずれか一項記載の方法によって産生された放出物を含む、細胞培養培地。
添加されたヘパリンを含まない、請求項47記載の細胞培養培地。
細胞を培養する方法であって、哺乳動物の多血小板血漿に由来する放出物を含む細胞培養培地上で該細胞を拡大増殖させる工程を含む、方法。
前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、請求項49記載の方法。
前記放出物が、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、請求項49または50記載の方法。
前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項49または50記載の方法。
前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項49または50記載の方法。
前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1を含む、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1を含む、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1を含む、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1を含む、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
前記細胞培養培地が、添加されたヘパリンを含まない、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞またはケラチン生成細胞または線維芽細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、内皮細胞、免疫系の細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、改変された細胞、または神経細胞である、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が間葉系幹細胞である、請求項60記載の方法。
前記放出物が、前記細胞の骨細胞への分化を刺激する、請求項61記載の方法。
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項49～61のいずれか一項記載の方法。
前記放出物が、前記細胞の軟骨細胞または脂肪細胞への分化を刺激する、請求項63記載の方法。
前記放出物が、前記細胞からの成分の放出を刺激する、請求項49～61のいずれか一項記載の方法。
前記成分が、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、核酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項65記載の方法。
前記成分を収集する工程をさらに含む、請求項65または66記載の方法。
哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物であって、該放出物が約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、組成物。
前記放出物がヒト血液由来である、請求項66記載の組成物。
溶液である、請求項66または67記載の組成物。
乾燥されたまたは凍結乾燥された粉末である、請求項66または67記載の組成物。
前記放出物が、少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性を含む、請求項66～69のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約300pg/ml～約550pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項66～69のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約350pg/ml～約520pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項66～69のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約400pg/ml～約500pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項66～69のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約450pg/mlでFGF塩基性を含む、請求項66～69のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約5.0pg/ml～約20pg/mlでSDF-1を含む、請求項66～74のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約7.0pg/ml～約15pg/mlでSDF-1を含む、請求項66～74のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約8.0pg/ml～約14pg/mlでSDF-1を含む、請求項66～74のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が、約9.0pg/ml～約12.0pg/mlでSDF-1を含む、請求項66～74のいずれか一項記載の組成物。
添加されたヘパリンを含まない、請求項66～74のいずれか一項記載の組成物。
前記放出物が1つまたは複数のエキソソームを含む、請求項66～79のいずれか一項記載の組成物。
請求項66～80のいずれか一項記載の組成物を含む、治療用製剤。
哺乳動物対象を処置する方法であって、幹細胞の集団を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該幹細胞が、請求項66～80のいずれか一項記載の放出物組成物とともに培養されていた、方法。
前記放出物が、少なくとも約300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、請求項82記載の方法。
前記放出物が、5.0pg/ml～20pg/mlでSDF-1を含む、請求項82または83記載の方法。
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項82～84のいずれか一項記載の方法。
前記幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項82～84のいずれか一項記載の方法。
前記幹細胞が、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄由来間葉系間質/幹細胞（BM-MSC）、脂肪由来間葉系間質/幹細胞（ADP-MSC）、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、末梢血由来単核細胞、癌細胞癌幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、臍帯血由来細胞、臍帯血組織由来細胞、胎盤由来細胞、網膜細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、またはケラチン生成細胞である、請求項82～84のいずれか一項記載の方法。
幹細胞の集団が、2％～100％の一種類の分化した系統を含む、請求項82～84のいずれか一項記載の方法。
前記幹細胞が自家由来または同種異系である、請求項82～84のいずれか一項記載の方法。
前記幹細胞が、改変されたまたは操作された細胞である、請求項82～84のいずれか一項記載の方法。
対象を処置する方法であって、幹細胞を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該幹細胞が、ヒト血液由来血小板からの放出物とともに培養されていた、方法。
前記放出物が、約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、請求項91記載の方法。
少なくとも300pg/mlのレベルでFGF塩基性をさらに含む、請求項91または92記載の方法。
前記放出物が5.0pg/ml～20pg/mlでSDF-1を含む、請求項91～93のいずれか一項記載の方法。
前記対象が、骨疾患、骨欠損、骨損傷、骨粗鬆症、変形性関節症、または脊髄損傷に罹患している、請求項91記載の方法。
前記対象が、軟骨疾患または軟骨欠損または軟骨損傷に罹患している、請求項91記載の方法。
前記対象が歯周病に罹患している、請求項91記載の方法。
前記対象が自己免疫疾患に罹患している、請求項91記載の方法。
前記対象が心筋梗塞に罹患している、請求項91記載の方法。
前記対象が、移植片対宿主病（GvHD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸促迫症候群（ARDS）、多発性外傷、全身感染、または癌に罹患している、請求項91記載の方法。
（i）哺乳動物の血液から血小板を得る工程;
（ii）25mMを超える最終濃度までPRPにCaCl₂を添加する工程;および
（iii）該CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによって血餅および放出物を形成する工程であって、該放出物が約0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、工程
を含む、血小板放出物を調製するための方法。
前記哺乳動物の血液が、ウマ、ネコ、ブタ、イヌ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ブタ、ウサギ、イルカ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物由来、家畜由来、またはペット由来である、請求項101記載の方法。
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって前記血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項101または102記載の方法。
組織培養における細胞接着、細胞分化、または細胞拡大増殖を促進する方法であって、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物で組織培養容器をコーティングする工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、請求項104記載の方法。
前記容器が、ペトリ皿、フラスコ、またはバイオリアクターである、請求項104または105記載の方法。
骨生物学的材料を調製する方法であって、該骨生物学的材料に、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物を添加する工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、請求項107記載の方法。
前記骨生物学的材料が、骨生物学的移植材料、骨スポンジ、または骨パテである、請求項107または108記載の方法。
前記骨生物学的材料が、哺乳動物組織、改変された細胞、または操作された細胞をさらに含む、請求項107または108記載の方法。
凝固剤を調製する方法であって、該凝固剤に、哺乳動物血液由来血小板からの放出物を含む組成物を添加する工程を含み、該放出物が0.05mg/dL未満のレベルでフィブリノーゲンを含む、方法。
前記放出物が、ヒト血液由来血小板に由来する、請求項111記載の方法。
（i）哺乳動物の血液から血小板を得て、それにより多血小板血漿（PRP）を得る工程;
（ii）25mMを超える最終濃度までCaCl₂を該PRPに添加し、それによってCaCl₂/PRP混合物を得る工程;
（iii）該CaCl₂/PRP混合物を6時間未満撹拌し、それによりフィブリン塊および上清を形成する工程;
（iv）繊維素溶解を防止するために抗繊維素溶解剤を添加する工程;および
（v）該多血小板フィブリンを得るために該上清を除去する工程
を含む、多血小板フィブリンを調製するための方法。
前記哺乳動物の血液が、ヒト、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、サルの血液、スポーツ動物由来、家畜由来、またはペット由来である、請求項113記載の方法。
（ii）の前に、過剰な血漿を除去することによって前記血小板を濃縮する工程をさらに含む、請求項113または114記載の方法。
請求項113～115のいずれか一項記載の方法によって産生された、多血小板フィブリン組成物。
前記フィブリンが、検出可能なレベルのトロンビンを含まない、請求項116記載の多血小板フィブリン。
（a）哺乳動物血液由来血小板からの血小板放出物と、（b）細胞培養培地補充物質として前記放出物を使用するための説明書とを含む、キット。
細胞培養培地をさらに含む、請求項118記載のキット。