JPWO2020162474A1 - 測定対象物質を測定するためのキットおよび測定対象物質を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、高いノイズ抑制効果を示すことができる、測定対象物質を測定するためのキットおよび測定対象物質を測定する方法を提供することである。本発明によれば、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板と、所定の構造単位を含む非発光性高分子粒子、とを含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットが提供される。
Description
本発明は、測定対象物質を測定するためのキットおよび測定対象物質を測定する方法に関する。
タンパク質、酵素または無機化合物などを定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合には、例えば、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した状態で試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。
上記のような蛍光検出法において、微量に存在する測定対象物質を検出するための感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させる。かかる励起光の照射により金属層に表面プラズモンが発生するが、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上し高感度な測定が可能となる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法とも称する）に対して、信号増強度が約１０倍得られ、高感度に測定することができる。
一方、特許文献１には、特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する検出方法が記載されている。特許文献１の方法においては、ノイズを抑制するための手段として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用している。
特許文献２には、所定の構造で表される単量体を重合してなるオキシアルキレン基含有アクリル系重合体を含むことを特徴とする蛋白質非特異的吸着防止剤が記載されている。特許文献２に記載された蛋白質非特異的吸着防止剤は、抗原抗体反応に関与しない蛋白質の非特異的吸着を防止して、高感度かつ高精度で免疫学的活性物質を測定するためのものである。特許文献２においては、ノイズを抑制するための手段として、オキシアルキレン基含有アクリル系重合体を使用している。
特許文献３には、少なくとも、基板表面に形成されたリガンドと、アナライトと、蛍光分子（Ａ）が連結した蛍光標識体とからなる複合体中の蛍光分子（Ａ）から発せられる蛍光を、カチオン性の水溶性高分子（Ｂ）の水溶液の存在下で測定することを含むことを特徴とする、蛍光測定方法が記載されている。
本発明は、高いノイズ抑制効果を示すことができる、測定対象物質を測定するためのキットおよび測定対象物質を測定する方法を提供することを解決すべき課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板を用いて生体試料中の測定対象物質を測定する際に、生体試料と、上記発光性標識粒子と、本明細書で定義する式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子との混合物を用いて測定を行うことによって、高いノイズ抑制効果を達成できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ 測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、
上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板と、
式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子、
とを含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
式中、Ｒ５１は水素原子またはメチル基を表す。Ｘ５１は酸素原子またはＮＲ５３を表す。Ｒ５２は、水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。Ｒ５３は水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。
式中、Ｒ５４およびＲ５５はそれぞれ独立に水素原子またはメチル基を表す。Ｘ５２およびＸ５３はそれぞれ独立に酸素原子またはＮＲ５６を表す。Ｌは、置換または無置換のポリアルキレンオキシ鎖、置換または無置換のアルキレン基、置換または無置換のアリーレン基、あるいは置換または無置換のヘテロアリーレン基を表す。Ｒ５６は水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。
＜２＞ 非発光性高分子粒子が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位以外の構造単位として、スチレン単位、ジビニルベンゼン単位、アクリル酸またはその塩の単位、あるいはメタクリル酸またはその塩の単位を含む、＜１＞に記載のキット。
＜３＞ 発光性標識粒子が、下記式（１）で表される蛍光色素または下記式（１０）で表される蛍光色素を内包した粒子である、＜１＞または＜２＞に記載のキット。
式中、ＸはＣＲ６７またはＮを示す。
Ｒ６１〜Ｒ６７は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、Ｒ−ＣＯ−基、カルボキシ基、Ｒ−Ｏ−ＣＯ−基、Ｒ−ＣＯ−Ｏ−基、（ＲＡ）２Ｎ−ＣＯ−基、アミノ基、ニトロ基またはシリル基を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。ＲＡは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。
Ｒ６８およびＲ６９は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基またはハロゲン原子を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
式中、ｍ１およびｍ２はそれぞれ独立に０〜４の整数を表し、ｍ１およびｍ２の何れかは少なくとも１以上である。Ｍは半金属原子または金属原子を表す。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1およびＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ａｒ11およびＡｒ12はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Ｚ1およびＺ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基またはアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＺ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＺ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
＜４＞ 発光性標識粒子の平均粒径が５０〜３００ｎｍである、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載のキット。
＜５＞ 非発光性高分子粒子の平均粒径が１０〜３００ｎｍである、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載のキット。
＜６＞ 非発光性高分子粒子の多分散指数が０．４０以下である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載のキット。
＜１＞ 測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、
上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板と、
式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子、
とを含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
＜２＞ 非発光性高分子粒子が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位以外の構造単位として、スチレン単位、ジビニルベンゼン単位、アクリル酸またはその塩の単位、あるいはメタクリル酸またはその塩の単位を含む、＜１＞に記載のキット。
＜３＞ 発光性標識粒子が、下記式（１）で表される蛍光色素または下記式（１０）で表される蛍光色素を内包した粒子である、＜１＞または＜２＞に記載のキット。
Ｒ６１〜Ｒ６７は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、Ｒ−ＣＯ−基、カルボキシ基、Ｒ−Ｏ−ＣＯ−基、Ｒ−ＣＯ−Ｏ−基、（ＲＡ）２Ｎ−ＣＯ−基、アミノ基、ニトロ基またはシリル基を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。ＲＡは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。
Ｒ６８およびＲ６９は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基またはハロゲン原子を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
＜４＞ 発光性標識粒子の平均粒径が５０〜３００ｎｍである、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載のキット。
＜５＞ 非発光性高分子粒子の平均粒径が１０〜３００ｎｍである、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載のキット。
＜６＞ 非発光性高分子粒子の多分散指数が０．４０以下である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載のキット。
＜７＞ 生体試料中の測定対象物質を測定する方法であって、
生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子との混合物を、上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板に接触させて、発光性標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含む方法。
式中、Ｒ５１は水素原子またはメチル基を表す。Ｘ５１は酸素原子またはＮＲ５３を表す。Ｒ５２は、水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。Ｒ５３は水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。
Ｒ５４およびＲ５５はそれぞれ独立に水素原子またはメチル基を表す。Ｘ５２およびＸ５３はそれぞれ独立に酸素原子またはＮＲ５６を表す。Ｌは、置換または無置換のポリアルキレンオキシ鎖、置換または無置換のアルキレン基、置換または無置換のアリーレン基、あるいは置換または無置換のヘテロアリーレン基を表す。Ｒ５６は水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。
＜８＞ 発光性標識粒子の使用量に対する、非発光性高分子粒子の使用量の質量比が１〜１０００倍である、＜７＞に記載の方法。
生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子との混合物を、上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板に接触させて、発光性標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含む方法。
＜８＞ 発光性標識粒子の使用量に対する、非発光性高分子粒子の使用量の質量比が１〜１０００倍である、＜７＞に記載の方法。
本発明による測定対象物質を測定するためのキットによれば、高いノイズ抑制効果を達成することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
[用語の説明]
アルキル基は、直鎖、分岐鎖、環状またはこれらの組み合わせの何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは１〜３６であり、より好ましくは１〜１８であり、さらに好ましくは１〜１２であり、特に好ましくは１〜６である。環状のアルキル基としては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキルなどが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基、およびシクロヘキシル基などが挙げられる。
アルキレン基としては、上記したアルキル基から水素原子を１個除いた基を挙げることができる。
ポリアルキレンオキシ鎖としては、アルキレン基とＯ原子とが連結した基の繰り返しからなる基を挙げることができる。ポリアルキレンオキシ鎖を形成するアルキレン基としては、炭素数２〜４のアルキレン基が好ましく、無置換のエチレン基、メチル基で置換されたエチレン基、無置換のプロピレン基が特に好ましい。
アルキル基は、直鎖、分岐鎖、環状またはこれらの組み合わせの何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは１〜３６であり、より好ましくは１〜１８であり、さらに好ましくは１〜１２であり、特に好ましくは１〜６である。環状のアルキル基としては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキルなどが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基、およびシクロヘキシル基などが挙げられる。
アルキレン基としては、上記したアルキル基から水素原子を１個除いた基を挙げることができる。
ポリアルキレンオキシ鎖としては、アルキレン基とＯ原子とが連結した基の繰り返しからなる基を挙げることができる。ポリアルキレンオキシ鎖を形成するアルキレン基としては、炭素数２〜４のアルキレン基が好ましく、無置換のエチレン基、メチル基で置換されたエチレン基、無置換のプロピレン基が特に好ましい。
脂肪族複素環基としては、特に限定されないが、２−オキソピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、テトラヒドロフラン環、テトラヒドロピラン環、テトラヒドロチオフェン環等から導出される基が挙げられる。
アルケニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは２〜３６であり、より好ましくは２〜１８であり、さらに好ましくは２〜１２であり、特に好ましくは２〜６である。アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、プレニル基、ゲラニル基、オレイル基等が挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば炭素数３〜８のシクロアルケニル基などが挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば、２−シクロペンテン−１−イル基、２−シクロヘキセン−１−イル基等が挙げられる。
アルケニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは２〜３６であり、より好ましくは２〜１８であり、さらに好ましくは２〜１２であり、特に好ましくは２〜６である。アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、プレニル基、ゲラニル基、オレイル基等が挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば炭素数３〜８のシクロアルケニル基などが挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば、２−シクロペンテン−１−イル基、２−シクロヘキセン−１−イル基等が挙げられる。
アルキニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは２〜３６であり、より好ましくは２〜１８であり、さらに好ましくは２〜１２であり、特に好ましくは２〜６である。アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロパルギル基等が挙げられる。
アリール基とは、炭素数が６〜４８のアリール基が好ましく、炭素数が６〜２４のアリール基がより好ましく、炭素数が６〜１４のアリール基がさらに好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピレニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、フルオレニル基などが挙げられる。
アリーレン基としては、上記したアリール基から水素原子を１個除いた基を挙げることができる。
アリーレン基としては、上記したアリール基から水素原子を１個除いた基を挙げることができる。
本明細書において、ヘテロ環基としては、好ましくは５〜７員の置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、芳香族もしくは非芳香族、単環もしくは縮環のヘテロ環基の何れでもよい。ヘテロ環基は、好ましくは、環構成原子が炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択され、かつ窒素原子、酸素原子および硫黄原子の何れかのヘテロ原子を少なくとも一個有するヘテロ環基であり、さらに好ましくは、炭素数３〜３０の５もしくは６員の芳香族のヘテロ環基である。ヘテロ環基としては、例えば、フリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、イソキノリル基、アクリジニル基、フェナントリジニル基、プテリジニル基、ピラジニル基、キノキサリニル基、ピリミジニル基、キナゾリル基、ピリダジニル基、シンノリニル基、フタラジニル基、トリアジニル基、オキサゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、チアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、インダゾリル基、イソオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、インドリル基、イミダゾピリジニル基、カルバゾリル基等が挙げられる。
本明細書において、ヘテロアリール基としては、好ましくは５〜７員の置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、単環もしくは縮環のヘテロ環基の何れでもよい。ヘテロアリール基は、好ましくは、環構成原子が炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択され、かつ窒素原子、酸素原子および硫黄原子の何れかのヘテロ原子を少なくとも一個有するヘテロアリール基であり、さらに好ましくは、炭素数３〜３０の５もしくは６員のヘテロアリール基である。ヘテロアリール基としては、例えば、イミダゾリル基、ピリジル基、キノリル基、フリル基、チエニル基、ベンズオキサゾリル基、インドリル基、ベンズイミダゾリル基、ベンズチアゾリル基、カルバゾリル基、アゼピニル基等が挙げられる。
ヘテロアリーレン基としては、上記したヘテロアリール基から水素原子を１個除いた基を挙げることができる。
ヘテロアリーレン基としては、上記したヘテロアリール基から水素原子を１個除いた基を挙げることができる。
本明細書において、アシル基としては、好ましくは炭素数２〜１５の直鎖、または分岐アルカノイル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、ベンゾイル基などが挙げられる。
アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数１〜２０のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基などが挙げられる。
アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数６〜１４のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数６〜１４のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルチオ基であり、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−ヘキサデシルチオ基等が挙げられる。
アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数６から３０のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、ｐ−クロロフェニルチオ基、ｍ−メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数６から３０のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、ｐ−クロロフェニルチオ基、ｍ−メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。
芳香環とは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナンスレン環、ピレン環、ペリレン環およびテリレン環等の芳香族炭化水素環；インデン環、アズレン環、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環、ピラゾール環、ピラゾリジン環、チアゾリジン環、オキサゾリジン環、ピラン環、クロメン環、ピロール環、ピロリジン環、ベンゾイミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、イミダゾール環、ピラゾール環、トリアゾール環、トリアジン環、ジアゾール環、インドリン環、チオフェン環、チエノチオフェン環、フラン環、オキサゾール環、オキサジアゾール環、チアジン環、チアゾール環、インドール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾチアジアゾール環、ナフトチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ナフトオキサゾール環、インドレニン環、ベンゾインドレニン環、ピラジン環、キノリン環およびキナゾリン環等の芳香族ヘテロ環；並びにフルオレン環およびカルバゾール環等の縮合型芳香環等が挙げられ、炭素数５〜１６の芳香環（芳香環および芳香環を含む縮合環）が好ましい。
なお、芳香環は置換基を有していてもよく、「芳香環」との用語は、置換基を有する芳香環、および置換基を有さない芳香環の両方を意味する。芳香環が有する置換基としては、後記する置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
なお、芳香環は置換基を有していてもよく、「芳香環」との用語は、置換基を有する芳香環、および置換基を有さない芳香環の両方を意味する。芳香環が有する置換基としては、後記する置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
アミノ基としては、アミノ基；モノまたはジメチルアミノ基、モノまたはジエチルアミノ基並びにモノまたはジ（ｎ−プロピル）アミノ基等のアルキル置換アミノ基；モノまたはジフェニルアミノ基並びにモノまたはジナフチルアミノ基等の芳香族残基で置換されたアミノ基；モノアルキルモノフェニルアミノ基等のアルキル基と芳香族残基が一つずつ置換したアミノ基；ベンジルアミノ基、アセチルアミノ基、フェニルアセチルアミノ基等が挙げられる。ここで芳香族残基とは、芳香環から水素原子１個を除いた基を意味し、芳香環は本明細書中上記した通りである。
本明細書において「置換または無置換の」と称する場合における置換とは、該当する基が置換基を有していることを意味する。本発明における各種の基について、置換基を有していてもよい場合については、置換基を有していてもよいことが記載されている。上記の置換基としては、下記の置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。置換基群Ａの置換基は、置換基群Ａの置換基によりさらに置換されていてもよい。
置換基群Ａ：
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
[生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット]
本発明による生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットは、
測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、
上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板と、
後記する式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子、
とを含む。
本発明による生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットは、
測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、
上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板と、
後記する式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子、
とを含む。
本発明によれば、高いノイズ抑制効果を達成することができると同時に、高い感度も両立することができる。本発明においては、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子を使用することにより、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を向上させることができる。式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位が、非発光性高分子粒子の表面に存在することにより、非発光性高分子粒子がノイズ原因物質を吸着し、目的の抗原抗体反応の選択性を向上させていることが推察される。非発光性高分子の粒子を使用することにより、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位が、粒子表面に局在化し、より効率的にノイズ原因物質を吸着していることが推察される。
（非発光性高分子粒子）
本発明で用いる非発光性高分子粒子は、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む。
式中、Ｒ５１は水素原子またはメチル基を表す。Ｘ５１は酸素原子またはＮＲ５３を表す。Ｒ５２は、水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。Ｒ５３は水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。
式中、Ｒ５４およびＲ５５はそれぞれ独立に水素原子またはメチル基を表す。Ｘ５２およびＸ５３はそれぞれ独立に酸素原子またはＮＲ５６を表す。Ｌは、置換または無置換のポリアルキレンオキシ鎖、置換または無置換のアルキレン基、置換または無置換のアリーレン基、あるいは置換または無置換のヘテロアリーレン基を表す。Ｒ５６は水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、あるいは置換または無置換のヘテロアリール基を表す。
本発明で用いる非発光性高分子粒子は、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む。
非発光性高分子粒子としては、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。上記の通り、非発光性高分子粒子は、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位以外の構造単位として、スチレン単位、ジビニルベンゼン単位、アクリル酸またはその塩の単位、あるいはメタクリル酸またはその塩の単位を含むものでもよい。
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−（メタ）アクリル酸エステル共重合体などが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。
非発光性高分子粒子は、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位が固相の表面に存在している。式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位の導入方法は特に限定されない。例えば、上記したような方法により核粒子をまず調製し、次いで、上記の核粒子に、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位に対応するモノマー化合物と、所望により他のモノマー化合物とを加え、これらのモノマー化合物を重合させることにより、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む共重合体が粒子の表面に存在している粒子を製造することができる。
あるいは、上記したような方法により核粒子を調整する際に、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位に対応するモノマー化合物を共存させた場合、適切な反応条件を選ぶことで、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む共重合体が粒子の表面に存在している粒子を製造することができる。
非発光性高分子粒子の平均粒径の好ましい範囲は、１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、より好ましい範囲は、１０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下であり、更に好ましい範囲は、２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。
非発光性高分子粒子の多分散指数の好ましい範囲は０．４０以下であり、より好ましい範囲は、０．２０以下であり、更に好ましい範囲は、０．１０以下である。
非発光性高分子粒子の多分散指数の好ましい範囲は０．４０以下であり、より好ましい範囲は、０．２０以下であり、更に好ましい範囲は、０．１０以下である。
非発光性高分子粒子の平均粒径および多分散指数は、非発光性高分子粒子の固形分５質量％水分散液４．０μＬをＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．４）７９６μLで希釈し、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社製）を用いて測定することができる。
式（Ａ）で表わされる構造単位の具体例を以下に示す。
式（Ｂ）で表わされる構造単位の具体例を以下に示す。
（生体試料）
生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
（測定対象物質）
測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、サイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、エストラジオール（Ｅ２）、アルドステロン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、胆汁酸、コルチゾール、コレステロール、コルチコステロン、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、ビタミン類、クレアチニン、アミノ酸、βカロチン、クレアチニン、ジゴキシン、テオフィリン、葉酸、炎症マーカーや敗血症マーカーなどのタンパク質などが挙げられる。
測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、サイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、エストラジオール（Ｅ２）、アルドステロン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、胆汁酸、コルチゾール、コレステロール、コルチコステロン、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、ビタミン類、クレアチニン、アミノ酸、βカロチン、クレアチニン、ジゴキシン、テオフィリン、葉酸、炎症マーカーや敗血症マーカーなどのタンパク質などが挙げられる。
（第一の結合物質）
本発明で用いる第一の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、測定対象物質と結合性を有する抗体として、例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは断片化抗体［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清または培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。
本発明で用いる第一の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、測定対象物質と結合性を有する抗体として、例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは断片化抗体［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清または培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。
本発明において、抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルまたはモノクローナルのどちらも使用可能である。
（発光性標識粒子）
本発明で使用される発光性標識粒子は、好ましくは発光性化合物と粒子とを含有する発光性標識粒子であり、蛍光標識粒子とも言う。
本発明で使用される発光性標識粒子は、好ましくは発光性化合物と粒子とを含有する発光性標識粒子であり、蛍光標識粒子とも言う。
発光性標識粒子は、好ましくは、発光性化合物として下記式（１）で表される蛍光色素または下記式（１０）で表される蛍光色素を内包した粒子である。
式中、ＸはＣＲ６７またはＮを示す。
Ｒ６１〜Ｒ６７は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、Ｒ−ＣＯ−基、カルボキシ基、Ｒ−Ｏ−ＣＯ−基、Ｒ−ＣＯ−Ｏ−基、（ＲＡ）２Ｎ−ＣＯ−基、アミノ基、ニトロ基またはシリル基を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。ＲＡは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。
Ｒ６８およびＲ６９は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基またはハロゲン原子を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
式中、ｍ１およびｍ２はそれぞれ独立に０〜４の整数を表し、ｍ１およびｍ２の何れかは少なくとも１以上である。Ｍは半金属原子または金属原子を表す。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1およびＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ａｒ11およびＡｒ12はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Ｚ1およびＺ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基またはアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＺ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＺ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
Ｒ６１〜Ｒ６７は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、Ｒ−ＣＯ−基、カルボキシ基、Ｒ−Ｏ−ＣＯ−基、Ｒ−ＣＯ−Ｏ−基、（ＲＡ）２Ｎ−ＣＯ−基、アミノ基、ニトロ基またはシリル基を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。ＲＡは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。
Ｒ６８およびＲ６９は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基またはハロゲン原子を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
＜式（１Ａ）で表される化合物について＞
式（１）で表される蛍光色素は、下記式（１Ａ）で表される化合物でもよい。
式（１）で表される蛍光色素は、下記式（１Ａ）で表される化合物でもよい。
Ｒ11およびＲ15は、同一のまたは異なる原子または基でもよいが、好ましくは同一の原子または基である。Ｒ12およびＲ14は、同一のまたは異なる原子または基でもよいが、好ましくは同一の原子または基である。
Ｒ11およびＲ15は、好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
Ｒ12およびＲ14は、好ましくは、アルキル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
Ｒ13は、好ましくは、アリール基を表し、これは置換基を有していてもよい。
Ｒ11およびＲ15は、好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
Ｒ12およびＲ14は、好ましくは、アルキル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
Ｒ13は、好ましくは、アリール基を表し、これは置換基を有していてもよい。
式（１Ａ）中、Ｘ1およびＸ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｘ1およびＸ2は互いに連結して環を形成してもよい。
Ｘ1およびＸ2は、好ましくは、ハロゲン原子、またはアルコキシ基を表す。Ｘ1およびＸ2は、フッ素原子、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基であることがより好ましく、これらはフッ素原子、アルコキシ基によって置換されていることも好ましい。
Ｘ1およびＸ2は、好ましくは、ハロゲン原子、またはアルコキシ基を表す。Ｘ1およびＸ2は、フッ素原子、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基であることがより好ましく、これらはフッ素原子、アルコキシ基によって置換されていることも好ましい。
式（１Ａ）中、Ａｒ1およびＡｒ2はそれぞれ独立に、アリール基またはヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
式（１Ａ）中、Ｌ1およびＬ2はそれぞれ独立に、式（Ｌ−１）〜式（Ｌ−４）の何れかを表す。
式中、Ｒ111〜Ｒ116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａは、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−を表す。
Ｌ1およびＬ2は、好ましくは、式（Ｌ−１）または式（Ｌ−２）の何れかを表す。
Ｒ111〜Ｒ116は、好ましくは水素原子である。
Ｌ1およびＬ2は、好ましくは、式（Ｌ−１）または式（Ｌ−２）の何れかを表す。
Ｒ111〜Ｒ116は、好ましくは水素原子である。
＜式（２）で表される化合物について＞
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（２）で表される化合物が挙げられる。
式中、Ｒ11〜Ｒ15、Ｘ1、Ｘ2、Ａｒ1およびＡｒ2は式（１Ａ）における定義と同義であり、好ましい範囲も、式（１Ａ）における好ましい範囲と同じである。Ｌ21およびＬ22はそれぞれ独立に、式（Ｌ−１）または式（Ｌ−２）で表される基を表わす。
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（２）で表される化合物が挙げられる。
＜式（３）で表される化合物について＞
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（３）で表される化合物が挙げられる。
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（３）で表される化合物が挙げられる。
式（３）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ14、Ｒ15、Ｘ1、Ｘ2、Ａｒ1、Ａｒ2、Ｌ1およびＬ2は、式（１Ａ）における定義と同義であり、好ましい範囲も、式（１Ａ）における好ましい範囲と同じである。但し、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ14およびＲ15の少なくとも２つは水素原子以外の原子または基であり、好ましくは、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ14およびＲ15の少なくとも３つは水素原子以外の原子または基であり、より好ましくは、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ14およびＲ15は、水素原子以外の原子または基である。
式（３）中、Ｒ31〜Ｒ35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、シアノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基（上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる）を有していてもよく、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ34およびＲ35のいずれか一つは２原子以上からなる基である。２原子以上からなる基としては、アルキル基、アリール基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、シアノ基、アルコキシ基が好ましく、アルキル基がより好ましい。アルキル基の中でも、炭素原子と水素原子のみで構成されるアルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基が好ましく、炭素数１〜６の炭素原子と水素原子のみで構成されるアルキル基、フッ素原子で置換されたアルキル基がより好ましく、メチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、トリフルオロメチル基がさらに好ましく、メチル基が特に好ましい。
＜式（４）で表される化合物について＞
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
式（４）中、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｘ1、Ｘ2、Ａｒ1、Ａｒ2、Ｌ1およびＬ2は、式（１）における定義と同義であり、好ましい範囲も、式（１）における好ましい範囲と同じである。但し、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14の少なくとも１つは水素原子以外の原子または基であり、好ましくは、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14の少なくとも２つは水素原子以外の原子または基であり、より好ましくは、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は水素原子以外の原子または基である。
式（４）中、Ｒ41およびＲ42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。Ｒ41およびＲ42はそれぞれ独立に、アリール基、エテニル基、またはエチニル基であることが好ましく、量子収率向上の観点からは、アリール基が好ましく、長波長化の観点からは、エテニル基、エチニル基であることが好ましい。アリール基である場合、アリール基のオルト位またはメタ位に少なくとも一つ置換基を有していることが好ましく、オルト位に少なくとも一つ置換基を有していることがより好ましい。アリール基に置換する置換基の数は、１〜３つが好ましく、２つまたは３つがより好ましい。アリール基に置換する置換基としては、アルキル基であることが好ましく、メチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基であることがより好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
式（４）中、Ｒ41およびＲ42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。Ｒ41およびＲ42はそれぞれ独立に、アリール基、エテニル基、またはエチニル基であることが好ましく、量子収率向上の観点からは、アリール基が好ましく、長波長化の観点からは、エテニル基、エチニル基であることが好ましい。アリール基である場合、アリール基のオルト位またはメタ位に少なくとも一つ置換基を有していることが好ましく、オルト位に少なくとも一つ置換基を有していることがより好ましい。アリール基に置換する置換基の数は、１〜３つが好ましく、２つまたは３つがより好ましい。アリール基に置換する置換基としては、アルキル基であることが好ましく、メチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基であることがより好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。
＜式（５）で表される化合物について＞
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（５）で表される化合物が挙げられる。
式（１）または式（１Ａ）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（５）で表される化合物が挙げられる。
式（５）中、Ｒ11〜Ｒ15、Ｘ1、Ｘ2、Ｌ1およびＬ2は、式（１Ａ）における定義と同義であり、好ましい範囲も、式（１Ａ）における好ましい範囲と同じである。
式（５）中、Ｒ51およびＲ52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。Ｒ51およびＲ52はそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基であることが好ましく、量子収率向上の観点では、アルキル基であることがより好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基であることがさらに好ましく、メチル基であることが特に好ましい。長波長化の観点では、アルコキシ基であることがより好ましく、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基であることがさらに好ましく、メトキシ基であることが特に好ましい。
Ｑ1およびＱ2はそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環または芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。Ｑ1およびＱ2は、芳香族炭化水素環であることが好ましく、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナンスレン環、ピレン環であることがより好ましく、ベンゼン環、ナフタレン環であることがさらに好ましく、ベンゼン環であることが特に好ましい。Ｒ51を含みＱ1を形成する基、および、Ｒ52を含みＱ1を形成する基としては、トリル基、キシリル基、メシチル基が好ましく、キシリル基、メシチル基であることがより好ましく、Ｌ1あるいはＬ2との結合位置に対してオルト位の両方にメチル基を有するキシリル基、Ｌ1あるいはＬ2との結合位置に対してオルト位の両方およびパラ位にメチル基を有するメシチル基であることがさらに好ましく、Ｌ1あるいはＬ2との結合位置に対してオルト位の両方およびパラ位にメチル基を有するメシチル基であることが特に好ましい。
＜式（６）で表される化合物について＞
式（５）で表わされる化合物は、下記式（６）で表わされる化合物であることがより好ましい。
式中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ14およびＲ15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ14およびＲ15の少なくとも２つは水素原子以外の原子または基である。Ｘ1およびＸ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｘ1およびＸ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ｒ31〜Ｒ35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、シアノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｒ31〜Ｒ35のいずれか一つは水素原子である。Ｒ51およびＲ52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｑ1およびＱ2はそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環または芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。
Ｌ1およびＬ2はそれぞれ独立に、式（Ｌ−１）〜式（Ｌ−４）の何れかを表す。
式中、Ｒ111〜Ｒ116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａは、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−を表す。
式（５）で表わされる化合物は、下記式（６）で表わされる化合物であることがより好ましい。
Ｌ1およびＬ2はそれぞれ独立に、式（Ｌ−１）〜式（Ｌ−４）の何れかを表す。
Ｒ11およびＲ15はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基であることが好ましく、上記Ｒ４1およびＲ４２と同義であること、すなわち、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、またはエチニル基であることがより好ましく、アリール基、エテニル基、エチニル基であることがさらに好ましい。量子収率向上の観点からは、アリール基がより好ましく、長波長化の観点からは、エテニル基、エチニル基であることがより好ましい。アリール基である場合、アリール基のオルト位またはメタ位に少なくとも一つ置換基を有していることが好ましく、オルト位に少なくとも一つ置換基を有していることがより好ましい。アリール基に置換する置換基の数は、１〜３つが好ましく、２つまたは３つがより好ましい。アリール基に置換する置換基としては、アルキル基であることが好ましく、メチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基であることがより好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。
＜式（１）〜式（６）で表される化合物の具体例＞
式（１）〜式（６）で表される化合物の具体例としては、国際公開ＷＯ２０１８／１８１７９６号公報の段落００６０〜００６５に記載されている化合物を挙げることができる。
式（１）〜式（６）で表される化合物の具体例としては、国際公開ＷＯ２０１８／１８１７９６号公報の段落００６０〜００６５に記載されている化合物を挙げることができる。
＜式（１０）で表される化合物＞
式（１０）中、ｍ１およびｍ２はそれぞれ独立に０〜４の整数を表し、ｍ１およびｍ２の何れかは少なくとも１以上である。Ｍは半金属原子または金属原子を表す。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1およびＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ａｒ11およびＡｒ12はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Ｚ1およびＺ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基またはアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＺ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＺ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
式（１０）中、ｍ１およびｍ２はそれぞれ独立に０〜４の整数を表し、好ましくは、ｍ１およびｍ２は共に１以上である。ｍ１およびｍ２は同一でも異なる整数でもよいが、好ましくは同一の整数である。好ましくは、ｍ１およびｍ２はそれぞれ独立に１または２であり、より好ましくは、ｍ１およびｍ２は共に１または共に２であり、特に好ましくはｍ１およびｍ２は共に１である。
式（１０）中、Ｍは半金属原子または金属原子を表し、好ましくは半金属原子を表し、特に好ましくは、ホウ素原子を示す。
式（１０）中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、またはアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、アリール基またはヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
Ｒ1およびＲ2は、連結して環を形成することはない。
好ましくは、Ｒ3は、水素原子、アルキル基、アリール基またはヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。より好ましくは、Ｒ3は、水素原子である。
好ましくは、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、アリール基またはヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
Ｒ1およびＲ2は、連結して環を形成することはない。
好ましくは、Ｒ3は、水素原子、アルキル基、アリール基またはヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。より好ましくは、Ｒ3は、水素原子である。
式（１０）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1およびＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。
好ましくは、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、またはアリールオキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1およびＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。
より好ましくは、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子である。
さらに好ましくは、Ｙ1およびＹ2はフッ素原子である。
Ｙ1およびＹ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
好ましくは、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、またはアリールオキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1およびＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。
より好ましくは、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子である。
さらに好ましくは、Ｙ1およびＹ2はフッ素原子である。
Ｙ1およびＹ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
式（１０）中、Ａｒ1およびＡｒ2はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。
好ましくは、Ａｒ1およびＡｒ2はベンゼン環を表す。
好ましくは、Ａｒ1およびＡｒ2はベンゼン環を表す。
式（１０）中、Ｚ1およびＺ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、またはアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＺ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＺ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
好ましくは、Ｚ1およびＺ2は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアリール基を表す。
より好ましくは、Ｚ1およびＺ2は、それぞれ独立に、フェニル基、ナフチル基、またはアントリル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、ｍ１が２以上である場合、複数のＺ1は同じ基である。
好ましくは、ｍ２が２以上である場合、複数のＺ2は同じ基である。
式（２）で表される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
好ましくは、Ｚ1およびＺ2は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアリール基を表す。
より好ましくは、Ｚ1およびＺ2は、それぞれ独立に、フェニル基、ナフチル基、またはアントリル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、ｍ１が２以上である場合、複数のＺ1は同じ基である。
好ましくは、ｍ２が２以上である場合、複数のＺ2は同じ基である。
式（２）で表される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
＜式（１０Ａ）で表される化合物について＞
式（１０）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（１０Ａ）で表される化合物が挙げられる。
式（１０）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（１０Ａ）で表される化合物が挙げられる。
式（１０Ａ）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、またはエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
好ましくは、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子を表す。
特に好ましくは、Ｙ1およびＹ2はフッ素原子である。
好ましくは、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子を表す。
特に好ましくは、Ｙ1およびＹ2はフッ素原子である。
式（１０Ａ）中、Ｒ3は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、またはアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、Ｒ3は、水素原子、アルキル基、アリール基またはヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
より好ましくは、Ｒ3は、水素原子である。
好ましくは、Ｒ3は、水素原子、アルキル基、アリール基またはヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
より好ましくは、Ｒ3は、水素原子である。
式（１０Ａ）中、Ａｒ3およびＡｒ4はそれぞれ独立にアリール基またはヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
式（１０Ａ）中、Ｒ34〜Ｒ41はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、またはアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
式（１０Ａ）中、好ましくは、Ｒ34〜Ｒ41の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
さらに好ましくは、Ｒ34〜Ｒ37の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基であり、Ｒ38〜Ｒ41の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
さらに好ましくは、Ｒ34〜Ｒ37の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基であり、Ｒ38〜Ｒ41の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
より好ましくは、Ｒ34〜Ｒ41の少なくとも１つ以上が、式（１１）で表される基である。さらに好ましくは、Ｒ34〜Ｒ37の少なくとも１つ以上が、式（１１）で表される基であり、Ｒ38〜Ｒ41の少なくとも１つ以上が、式（１１）で表される基である。
式（１１）中、Ｒ201〜Ｒ205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、またはアミノ基であり、Ｒ201およびＲ205の少なくとも一方は水素原子以外の原子または基である。Ｒ201とＲ202は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ202とＲ203は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ203とＲ204は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ204とＲ205は互いに連結して環を形成してもよい。
別の好ましい態様によれば、Ｒ34〜Ｒ41の少なくとも１つ以上が、式（１２）で表される基である。さらに好ましくは、Ｒ34〜Ｒ37の少なくとも１つ以上が、式（１２）で表される基であり、Ｒ38〜Ｒ41の少なくとも１つ以上が、式（１２）で表される基である。
式（１２）中、Ｒ101は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、またはアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。Ａｒ101はアリール基、またはヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。Ａｒ101とＲ101は互いに連結して環を形成してもよい。
式（１０）で表される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
式（１０）で表される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
＜式（１０）または式（１０Ａ）で表される化合物の具体例＞
式（１０）または式（１０Ａ）で表される化合物の具体例としては、国際公開ＷＯ２０１８／１８１７９６号公報の段落００８５〜００９２に記載されている化合物を挙げることができる。
式（１０）または式（１０Ａ）で表される化合物の具体例としては、国際公開ＷＯ２０１８／１８１７９６号公報の段落００８５〜００９２に記載されている化合物を挙げることができる。
＜発光性化合物の使用量＞
発光性化合物を添加する前の粒子に対する発光性化合物（例えば、式（１）または式（１０）で表される蛍光色素）の含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．５μｍｏｌ／ｇ〜４００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは１μｍｏｌ／ｇ〜３００μｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは２μｍｏｌ／ｇ〜２００μｍｏｌ／ｇであり、特に好ましくは３μｍｏｌ／ｇ〜１００μｍｏｌ／ｇである。
発光性化合物を添加する前の粒子に対する発光性化合物（例えば、式（１）または式（１０）で表される蛍光色素）の含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．５μｍｏｌ／ｇ〜４００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは１μｍｏｌ／ｇ〜３００μｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは２μｍｏｌ／ｇ〜２００μｍｏｌ／ｇであり、特に好ましくは３μｍｏｌ／ｇ〜１００μｍｏｌ／ｇである。
発光性化合物を添加する前の粒子に対する発光性化合物の含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．１質量％〜３０質量％であり、より好ましくは０．２質量％〜２０質量％であり、さらに好ましくは０．３質量％〜１０質量％であり、特に好ましくは０．４質量％〜８質量％である。
＜粒子＞
発光性標識粒子は、粒子を含む。粒子の材質および形態は特に限定されず、例えば、ポリスチレンビーズなどの有機高分子粒子、またはガラスビーズ等の無機粒子を用いることができる。粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、またはブチルメタクリレートなどのモノマーを重合させたホモポリマー、並びに２種以上のモノマーを重合させたコポリマーなどが挙げられ、上記のホモポリマーまたはコポリマーを均一に懸濁させたラテックスでもよい。また、粒子としては、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。粒子としては、ラテックス粒子が好ましい。
発光性標識粒子は、粒子を含む。粒子の材質および形態は特に限定されず、例えば、ポリスチレンビーズなどの有機高分子粒子、またはガラスビーズ等の無機粒子を用いることができる。粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、またはブチルメタクリレートなどのモノマーを重合させたホモポリマー、並びに２種以上のモノマーを重合させたコポリマーなどが挙げられ、上記のホモポリマーまたはコポリマーを均一に懸濁させたラテックスでもよい。また、粒子としては、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。粒子としては、ラテックス粒子が好ましい。
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体などが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、発光性の標識粒子に抗体を標識して使用する場合には、界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
＜発光性標識粒子の平均粒径（平均粒子径）の測定方法＞
発光性標識粒子の平均粒径は、粒子の材質や被検物質を測定する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１〜１０μｍ（より好ましくは０．０１〜１μｍ）の範囲が好ましく、３０〜５００ｎｍの範囲がより好ましく、５０〜３００ｎｍの範囲がさらに好ましく、８０〜２００ｎｍの範囲が特に好ましく、１００〜１５０ｎｍの範囲が最も好ましい。発光性標識粒子の多分散指数の好ましい範囲は０．４０以下であり、より好ましい範囲は、０．２０以下であり、更に好ましい範囲は、０．１０以下である。発光性標識粒子の平均粒径および多分散指数は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定方法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。これらの測定方法のうち、粒子径範囲および測定の容易さから、動的光散乱法を用いて発光性の標識粒子の平均粒径および多分散指数を測定することが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社製）等が挙げられる。本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めるものとする。
発光性標識粒子の平均粒径は、粒子の材質や被検物質を測定する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１〜１０μｍ（より好ましくは０．０１〜１μｍ）の範囲が好ましく、３０〜５００ｎｍの範囲がより好ましく、５０〜３００ｎｍの範囲がさらに好ましく、８０〜２００ｎｍの範囲が特に好ましく、１００〜１５０ｎｍの範囲が最も好ましい。発光性標識粒子の多分散指数の好ましい範囲は０．４０以下であり、より好ましい範囲は、０．２０以下であり、更に好ましい範囲は、０．１０以下である。発光性標識粒子の平均粒径および多分散指数は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定方法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。これらの測定方法のうち、粒子径範囲および測定の容易さから、動的光散乱法を用いて発光性の標識粒子の平均粒径および多分散指数を測定することが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社製）等が挙げられる。本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めるものとする。
＜発光性標識粒子の製造方法＞
発光性標識粒子の製造方法は特に限定されないが、発光性化合物と粒子とを混合することによって製造することができる。例えば、ラテックス粒子などの粒子に、発光性化合物を添加することによって、発光性標識粒子を作製することができる。より具体的には、水および水溶性有機溶剤（テトラヒドロフラン、メタノール等）の何れか一種以上を含む粒子の分散液に、式（１）で表される化合物を含む溶液を添加して攪拌することにより、発光性の標識粒子を製造することができる。
発光性標識粒子の製造方法は特に限定されないが、発光性化合物と粒子とを混合することによって製造することができる。例えば、ラテックス粒子などの粒子に、発光性化合物を添加することによって、発光性標識粒子を作製することができる。より具体的には、水および水溶性有機溶剤（テトラヒドロフラン、メタノール等）の何れか一種以上を含む粒子の分散液に、式（１）で表される化合物を含む溶液を添加して攪拌することにより、発光性の標識粒子を製造することができる。
本発明においては、発光性標識粒子を含む分散液を調製してもよい。
分散液は、発光性標識粒子を分散媒に分散することにより製造することができる。分散媒としては、水、有機溶媒、または水と有機溶媒との混合物等が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒などを使用することができる。
分散液における発光性標識粒子の固形分濃度は特に限定されないが、一般的には０．１〜２０質量％であり、好ましくは０．５〜１０質量％であり、より好ましくは１〜５質量％である。
分散液は、発光性標識粒子を分散媒に分散することにより製造することができる。分散媒としては、水、有機溶媒、または水と有機溶媒との混合物等が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒などを使用することができる。
分散液における発光性標識粒子の固形分濃度は特に限定されないが、一般的には０．１〜２０質量％であり、好ましくは０．５〜１０質量％であり、より好ましくは１〜５質量％である。
（第一の結合物質による発光性標識粒子の修飾）
第一の結合物質を発光性の標識粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やThermo Fisher 社FluoSpheres（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着および共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤（即ち、第一のブロッキング剤）としては、例えば、アルブミン（ＢＳＡなど）、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、またはポリエチレングリコールなど、並びに上記物質または上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。さらに、第一のブロッキング剤としては、測定対象物質と結合性を有しない抗体（グロブリン）、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することもできる。
第一の結合物質を発光性の標識粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やThermo Fisher 社FluoSpheres（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着および共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤（即ち、第一のブロッキング剤）としては、例えば、アルブミン（ＢＳＡなど）、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、またはポリエチレングリコールなど、並びに上記物質または上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。さらに、第一のブロッキング剤としては、測定対象物質と結合性を有しない抗体（グロブリン）、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することもできる。
抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が０．１〜１０質量％になるよう分散させた液に、０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度４〜５０℃の条件下で５分間〜４８時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液に含まれている、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、粒子を緩衝液にて洗浄する操作を０〜１０回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはグロブリン、アルブミン、ブロックエース（登録商標）、スキムミルクおよびカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。
抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤とは、ショ糖や多糖類などの合成高分子あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer（Advanced Biotechnologies Inc （ABI社））などの市販の安定化剤も使用可能である。
第一の結合物質を有する標識粒子は本発明のキットに含まれており、キットの一部である容器、たとえばカップに含まれている態様が好ましい。この場合、生体試料を、標識粒子を含む容器に注入して混合、攪拌することにより、生体試料中の測定対象物質と第一の結合物質とを結合させることができる。
（基板）
本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、または白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独または組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であることが好ましい。
本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、または白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独または組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であることが好ましい。
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、または無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、１０ｎｍ以下が好ましい。
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、またはシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
ＳＰＦ検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)に金膜を蒸着した基板などを挙げることができる。
基板は、測定対象物質または第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えている。
（第二の結合物質）
第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、または第一の結合物質と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することができる。
第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、または第一の結合物質と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することができる。
第二の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられるが、好ましくは、抗原であり、第二の結合物質として、測定対象物質（これは、第一の結合物質と結合性を有する物質である）を使用することが特に好ましい。
第二の結合物質として、測定対象物質を使用する場合には、第二の結合物質は、測定対象物質とキャリアとの結合体であることが好ましい。キャリアとは、測定対象物質の複数の分子が結合可能な物質を意味する。好ましいキャリアの一例としては、タンパク質などが挙げられ、その中でも具体的には、ウシ血清アルブミン等を挙げることができる。
測定対象物質がＴＳＨである場合、第二の結合物質は、抗ＴＳＨ抗体であることが好ましい。
（第二の結合物質を基板に固定化する方法）
第二の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ Ｖｏｌ．２−１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）などを配することによる表面修飾を施しても良く、第二の結合物質を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。第二の結合物質を基板に固定させた後に、第二の結合物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤（第二のブロッキング剤）としては、公知の物質、例えば、ＢＳＡ、グロブリン、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分またはポリエチレングリコールなど、並びに上記物質または上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
第二の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ Ｖｏｌ．２−１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）などを配することによる表面修飾を施しても良く、第二の結合物質を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。第二の結合物質を基板に固定させた後に、第二の結合物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤（第二のブロッキング剤）としては、公知の物質、例えば、ＢＳＡ、グロブリン、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分またはポリエチレングリコールなど、並びに上記物質または上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（検出領域＜テストエリア＞）
本発明においては、基板上に生体試料中の測定対象物質の有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
本発明においては、基板上に生体試料中の測定対象物質の有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
基板のテストエリアには、標識粒子上に存在する結合物質（例えば抗体）と反応するサイトを有することが好ましい。本発明の好ましい一態様としては、生体試料中に存在する抗原を、基板のテストエリア上に有する態様が好ましい。この場合、抗原とＢＳＡを縮合剤の存在下で反応させて、抗原・ＢＳＡ結合体を作製し、この結合体をテストエリア上に吸着させることでテストエリアを作製することが可能となる。測定対象物質である抗原−ＢＳＡ結合体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板上のテストエリアに結合させることが可能である。
（参照領域＜コントロールエリア＞）
本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在する測定対象物質の量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識粒子上に存在する抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在する測定対象物質の量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識粒子上に存在する抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
コントロールエリアに存在させる好ましい抗体としては、標識粒子上に存在する結合物質（例えば、抗体）を認識する機能をもち、その抗体がマウス由来であれば、抗マウス抗体であることが好ましく、標識粒子上の抗体が、ヤギ由来であれば、抗ヤギ抗体であることが好ましい。これらコントロールエリア上の抗体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板に結合させることが可能である。
（ブロッキング剤）
例えば、競合法において、測定対象物質を含まない陰性となる生体試料だけでなく、測定対象物質を含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない標識粒子表面と、検出領域（テストエリア）との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない標識粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が標識粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、標識粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、測定対象物質を含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。
一般的に、固相表面（例えば標識粒子表面、基板の金膜表面）、への非特異吸着抑制のためにＢＳＡでのブロッキングが用いられている。
例えば、競合法において、測定対象物質を含まない陰性となる生体試料だけでなく、測定対象物質を含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない標識粒子表面と、検出領域（テストエリア）との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない標識粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が標識粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、標識粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、測定対象物質を含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。
一般的に、固相表面（例えば標識粒子表面、基板の金膜表面）、への非特異吸着抑制のためにＢＳＡでのブロッキングが用いられている。
測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンとして具体的には、測定対象物質とは異なる抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。
（キットの他の要素）
本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質がＴＳＨである場合には、ＴＳＨ測定診断用のキットである。本発明において、測定対象物質の測定を実施するに当たり、第二の結合物質を固定した基板と、蛍光粒子などの標識粒子を保持した部材を含むセンサチップを含むものであるが、表面プラズモン励起装置、および蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材または装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質がＴＳＨである場合には、ＴＳＨ測定診断用のキットである。本発明において、測定対象物質の測定を実施するに当たり、第二の結合物質を固定した基板と、蛍光粒子などの標識粒子を保持した部材を含むセンサチップを含むものであるが、表面プラズモン励起装置、および蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材または装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
［生体試料中の測定対象物質を測定する方法］
本発明による生体試料中の測定対象物質を測定する方法は、
生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子との混合物を、上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板に接触させて、発光性標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含む方法である。
本発明による生体試料中の測定対象物質を測定する方法は、
生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子との混合物を、上記測定対象物質または上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板に接触させて、発光性標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含む方法である。
本発明においては、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程により、測定対象物質を測定することができる。
本発明において、発光性標識粒子の使用量に対する、非発光性高分子粒子の使用量の質量比は、好ましくは１〜１０００倍であり、より好ましくは１〜１００倍であり、さらに好ましくは１〜５０倍であり、特に好ましくは１〜３０倍である。
本発明における測定は、測定対象物質の量の測定である限り、最も広い概念として解釈される。測定方法の具体的な実施態様としては、競合法およびサンドイッチ法が挙げられる。
競合法の一例として、プロゲステロンを定量する場合を以下に説明する。プロゲステロン以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
競合法では、先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子、および式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
競合法では、先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子、および式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、プロゲステロン濃度が異なるプロゲステロン量既知の試料を複数用意し、この試料および抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を予め混合する。この混合液を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各プロゲステロン濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、プロゲステロン濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対するプロゲステロン濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれるプロゲステロン量を定量することができる。
このプロゲステロン量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、１０分以内に行われることが好ましく、８分以内がより好ましく、更には６分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化とプロゲステロン濃度との関係式を利用して、試料および抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれるプロゲステロン量を換算する時間が含まれていることが好ましい。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により測定対象物質を測定することができる。測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子とを、基板上で接触させる。生体試料に測定対象物質が存在する場合には、測定対象物質と蛍光粒子と基板との間で結合反応（抗原抗体反応など）が生じる。その結果、生体試料中に測定対象物質が存在する場合には、基板に結合した第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子とからなる免疫複合体が形成される。サンドイッチ法では、第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子との反応が終了した後、上記免疫複合体を形成しなかった、第一の結合物質を有する蛍光粒子を除去し、洗浄する。次いで免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、測定対象物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度と測定対象物質の濃度は、正の相関関係がある。
（流路）
本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子を混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、非発光性高分子粒子とを、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、第一の結合物質を有する発光性標識粒子と非発光性高分子粒子とを含む生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、および金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子を混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、非発光性高分子粒子とを、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、第一の結合物質を有する発光性標識粒子と非発光性高分子粒子とを含む生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、および金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
（表面プラズモン蛍光測定）
本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８−２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されることによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
本発明の蛍光粒子を用いた表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化された測定対象物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、例えば、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法は、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な測定対象物質の検出方法を提供できる。
（規格化）
さらに本発明の方法は、標識粒子の量に関連した標識情報を取得する、標識粒子関連標識情報取得工程；および測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程で取得した標識情報を、標識粒子関連標識情報取得工程で取得した標識情報により規格化する、規格化工程を含む方法でもよい。
さらに本発明の方法は、標識粒子の量に関連した標識情報を取得する、標識粒子関連標識情報取得工程；および測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程で取得した標識情報を、標識粒子関連標識情報取得工程で取得した標識情報により規格化する、規格化工程を含む方法でもよい。
ここで、生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と非発光性高分子粒子とを含む混合液を、検出領域（テストエリア）と参照領域（コントロールエリア）とを有する基板に接触させて検出領域と参照領域上に表面プラズモンを発生させ、放出された蛍光の強度を測定する工程のうち、検出領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程であり、参照領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、標識粒子関連標識情報取得工程である。この２つの工程で取得した蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値の変化率として求め、検出領域のシグナル値の変化率を参照領域のシグナル値の変化率で除する工程が規格化工程である。
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
略号の説明
Ｍｅ：メチル基
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＫＰＳ：過硫酸カリウム
ＴＳＨ：甲状腺刺激ホルモン
Ｍｅ：メチル基
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＫＰＳ：過硫酸カリウム
ＴＳＨ：甲状腺刺激ホルモン
＜非発光性高分子粒子の粒径の測定の方法＞
非発光性高分子粒子の固形分５質量％水分散液４．０μＬをＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．４）７９６μLで希釈し、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社製）を用いて粒径（以下、Ｚ平均粒径と称する）および多分散指数を測定した。
非発光性高分子粒子の固形分５質量％水分散液４．０μＬをＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．４）７９６μLで希釈し、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社製）を用いて粒径（以下、Ｚ平均粒径と称する）および多分散指数を測定した。
＜非発光性高分子粒子の作製＞
（非発光性高分子粒子１の作製）
（非発光性高分子粒子１の作製）
１Ｌフラスコに、スチレン３０ｇ、水４００ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム２ｇを加え、２５０ｒｐｍで攪拌しながら、８６℃に昇温した。過硫酸カリウム１ｇを溶解させた水溶液３０ｇを添加し、８６℃で６時間攪拌した。ここに、アクリル酸１．５ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．３７５ｇを添加した後、過硫酸カリウム１ｇを溶解させた水溶液３０ｇを添加し、８６℃で４時間攪拌した。室温に冷却後、ナイロンフィルター（Ｎ−Ｎｏ．２３０Ｔ）でろ過し、得られた微粒子の水分散液を遠心分離によって精製した。上記の粒径測定方法に従って測定したところ、得られた粒子のＺ平均粒径は４７ｎｍであった。また、多分散指数は０．１未満であり単分散であることを確認した。
（非発光性高分子粒子２の作製）
１Ｌフラスコに、スチレン３０ｇ、水４００ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム ２ｇを加え、２５０ｒｐｍで攪拌しながら、８６℃に昇温した。過硫酸カリウム１ｇを溶解させた水溶液３０ｇを添加し、８６℃で６時間攪拌した。ここに、アクリル酸１．５ｇ、メトキシエチルアクリレート０．３７５ｇを添加した後、過硫酸カリウム１ｇを溶解させた水溶液３０ｇを添加し、８６℃で４時間攪拌した。室温に冷却後、ナイロンフィルター（Ｎ−Ｎｏ．２３０Ｔ）でろ過し、得られた微粒子の水分散液を遠心分離によって精製した。上記の粒径測定方法に従って測定したところ、得られた粒子のＺ平均粒径は４５ｎｍであった。また、多分散指数は０．１未満であり単分散であることを確認した。
（非発光性高分子粒子３の作製）
１Ｌフラスコに、スチレン３０ｇ、水４００ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム ２ｇを加え、２５０ｒｐｍで攪拌しながら、８６℃に昇温した。過硫酸カリウム１ｇを溶解させた水溶液３０ｇを添加し、８６℃で６時間攪拌した。ここに、アクリル酸１．５ｇ、モノマー３を０．３７５ｇ添加した後、過硫酸カリウム１ｇを溶解させた水溶液３０ｇを添加し、８６℃で４時間攪拌した。室温に冷却後、ナイロンフィルター（Ｎ−Ｎｏ．２３０Ｔ）でろ過し、得られた微粒子の水分散液を遠心分離によって精製した。上記の粒径測定方法に従って測定したところ、得られた粒子のＺ平均粒径は７３ｎｍであった。また、多分散指数は０．３６３であった。
（蛍光粒子用粒子の作製）
１Ｌ三口フラスコ中に超純水４２０ｇに導入した。窒素下で９５℃まで昇温した後、スチレン３０ｇを加え５分間撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム１ｇを超純水３０ｇに溶解させ、これを上記三口フラスコに入れ、９５℃で６時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンフィルター（Ｎ−Ｎｏ．２３０Ｔ）でろ過を行い、遠心分離により粒子を超純水で洗浄し、精製した。
１Ｌ三口フラスコ中に超純水４２０ｇに導入した。窒素下で９５℃まで昇温した後、スチレン３０ｇを加え５分間撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム１ｇを超純水３０ｇに溶解させ、これを上記三口フラスコに入れ、９５℃で６時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンフィルター（Ｎ−Ｎｏ．２３０Ｔ）でろ過を行い、遠心分離により粒子を超純水で洗浄し、精製した。
(蛍光粒子の作製)
１００ｍＬナスフラスコに上記粒子固形分２質量％水分散液７．５ｇとテトラヒドロフラン１．５ｍＬを加え、３０℃で２０分間撹拌した。別容器で３，３’，５，５’−テトラフェニル−メソ−アザ−２，２'−ジピロメテンジフルオロボレート０．９ｍｇをテトラヒドロフラン０．７５ｍＬに溶解させ、これを上記ナスフラスコに入れ、３０℃で３０分間撹拌した。テトラヒドロフランを減圧留去した後、桐山ろ過を行い遠心分離により粒子をＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．６）で洗浄し、蛍光粒子を得た。
１００ｍＬナスフラスコに上記粒子固形分２質量％水分散液７．５ｇとテトラヒドロフラン１．５ｍＬを加え、３０℃で２０分間撹拌した。別容器で３，３’，５，５’−テトラフェニル−メソ−アザ−２，２'−ジピロメテンジフルオロボレート０．９ｍｇをテトラヒドロフラン０．７５ｍＬに溶解させ、これを上記ナスフラスコに入れ、３０℃で３０分間撹拌した。テトラヒドロフランを減圧留去した後、桐山ろ過を行い遠心分離により粒子をＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．６）で洗浄し、蛍光粒子を得た。
（蛍光粒子の粒径および多分散指数測定）
上記蛍光粒子固形分２質量％水分散液４．０μＬをＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．４）７９６μLで希釈し、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社製）で蛍光粒子の粒径および多分散指数を測定した。得られた粒子のＺ平均粒径は１５８ｎｍであった。また、多分散指数は０．１未満であり、単分散であることを確認した。
上記蛍光粒子固形分２質量％水分散液４．０μＬをＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．４）７９６μLで希釈し、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社製）で蛍光粒子の粒径および多分散指数を測定した。得られた粒子のＺ平均粒径は１５８ｎｍであった。また、多分散指数は０．１未満であり、単分散であることを確認した。
（抗体の固定化）
上記蛍光粒子固形分２質量％水分散液２７５μＬを、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２−モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製）緩衝液(ｐＨ５．６)を８８μＬで希釈し、１０質量％の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）超純水溶液８．８μＬを加え、室温で１５分間撹拌した。その後、０．５ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製：Ａｎｔｉ−ＴＳＨ Ｍａｂ ＭＡＴ０４−４１０）を１８７μＬ添加し、室温で１時間撹拌し抗体を蛍光粒子に固定化した。固定化後、２ｍｏｌ／Ｌグリシン水溶液を２７．５μＬ加え、１５分間静置し、ブロッキングを行った。反応終了後、遠心分離による精製を行い、抗体結合蛍光粒子を得た。
上記蛍光粒子固形分２質量％水分散液２７５μＬを、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２−モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製）緩衝液(ｐＨ５．６)を８８μＬで希釈し、１０質量％の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）超純水溶液８．８μＬを加え、室温で１５分間撹拌した。その後、０．５ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製：Ａｎｔｉ−ＴＳＨ Ｍａｂ ＭＡＴ０４−４１０）を１８７μＬ添加し、室温で１時間撹拌し抗体を蛍光粒子に固定化した。固定化後、２ｍｏｌ／Ｌグリシン水溶液を２７．５μＬ加え、１５分間静置し、ブロッキングを行った。反応終了後、遠心分離による精製を行い、抗体結合蛍光粒子を得た。
＜サンドイッチ法によるＴＳＨ評価＞
上記蛍光標識抗体を用いて、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により生体試料中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）測定を実施した。
上記蛍光標識抗体を用いて、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により生体試料中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）測定を実施した。
ＴＳＨを定量する場合を以下に説明する。ＴＳＨ以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。先ず、抗ＴＳＨモノクローナル抗体１が固定化されているＴＳＨ免疫測定用基板に、ＴＳＨを含む生体試料および蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２を接触させる。その生体試料中にＴＳＨが存在する場合には、あらかじめ蛍光標識した抗ＴＳＨ抗体２と抗原抗体反応したＴＳＨと、基板上の抗ＴＳＨ抗体１とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にＴＳＨが存在しない場合には、生体試料と混合した蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２と基板上の抗ＴＳＨ抗体１との間で抗原抗体反応が起こらない。上記の反応が終了した後、基板上の抗ＴＳＨ抗体１に結合しなかった蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２とＴＳＨ、基板上の抗ＴＳＨ抗体１との複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出する。
（基板作製）
ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)の基体（三菱レイヨン株式会社製、アクリペット（登録商標）ＶＨ）を準備し、スパッタ法により、厚さ４５ｎｍの金膜を片面に作製し７ｍｍの幅に裁断して、同じ基板を７枚作製した。この基板の金膜表面上に、調製した抗ＴＳＨモノクローナル抗体１（Ｍｅｄｉｘ社製、５４０９）を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ ｉｎ １５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を点着して乾燥させ、抗ＴＳＨ抗体を固定化した基板を作製した。調製した基板を、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、富士フイルム和光純薬社製）を０．０５質量％の濃度で含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を予め調製し、この溶液３００μＬを用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜表面上の抗ＴＳＨ抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Thermo Scientific社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除き、評価用基板を作製した。
ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)の基体（三菱レイヨン株式会社製、アクリペット（登録商標）ＶＨ）を準備し、スパッタ法により、厚さ４５ｎｍの金膜を片面に作製し７ｍｍの幅に裁断して、同じ基板を７枚作製した。この基板の金膜表面上に、調製した抗ＴＳＨモノクローナル抗体１（Ｍｅｄｉｘ社製、５４０９）を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ ｉｎ １５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を点着して乾燥させ、抗ＴＳＨ抗体を固定化した基板を作製した。調製した基板を、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、富士フイルム和光純薬社製）を０．０５質量％の濃度で含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を予め調製し、この溶液３００μＬを用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜表面上の抗ＴＳＨ抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Thermo Scientific社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除き、評価用基板を作製した。
（センサチップの作製）
特開２０１０−１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１および図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２はセンサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３および基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５および第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５および第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８および参照領域９が形成されている。
特開２０１０−１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１および図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２はセンサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３および基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５および第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５および第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８および参照領域９が形成されている。
（被検試料の準備）
被検試料として、ＴＳＨ濃度が約０ｎｇ／ｍＬと約０．４ｎｇ／ｍＬのイヌ血清を使用した。イヌ血清は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を用意した。
被検試料として、ＴＳＨ濃度が約０ｎｇ／ｍＬと約０．４ｎｇ／ｍＬのイヌ血清を使用した。イヌ血清は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を用意した。
（ＴＳＨ評価）
上記で調製した蛍光標識抗体を用い、ＩＭＭＵＮＯ ＡＵ１０Ｖ（富士フイルム社製）にてＴＳＨの測定を実施した。上記で準備した被検試料（イヌ血清）１００μＬと、蛍光標識した抗ＴＳＨ抗体（蛍光粒子の重量として０．０４ｍｇ）との混合液を調製し、ここに下記表に記載の非発光性高分子微粒子の水分散液を添加し（実施例１では非発光性高分子粒子１の固形分１２質量％の水分散液を１０μＬ添加した。すなわち、固形分として１．２ｍｇ添加）、この混合液を１０分間攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップに蛍光標識抗体と被検試料との混合液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流下させ、抗ＴＳＨ抗体を固定した金膜面上に接触させてから、蛍光強度を１．５分間継続して測定した。基板において得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を求めた。得られた２被検試料の増加速度から、Ｓ／Ｎを求め、相対Ｓ／Ｎを比較した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
Ｓ／Ｎ ＝（ＴＳＨ濃度約０．４ｎｇ／ｍＬ被検試料から得られた増加速度）／（ＴＳＨ濃度約０ｎｇ／ｍＬ被検試料から得られた増加速度）
相対Ｓ／Ｎ ＝（各実施例および比較例のＳ／Ｎ）／（比較例１のＳ／Ｎ）
上記で調製した蛍光標識抗体を用い、ＩＭＭＵＮＯ ＡＵ１０Ｖ（富士フイルム社製）にてＴＳＨの測定を実施した。上記で準備した被検試料（イヌ血清）１００μＬと、蛍光標識した抗ＴＳＨ抗体（蛍光粒子の重量として０．０４ｍｇ）との混合液を調製し、ここに下記表に記載の非発光性高分子微粒子の水分散液を添加し（実施例１では非発光性高分子粒子１の固形分１２質量％の水分散液を１０μＬ添加した。すなわち、固形分として１．２ｍｇ添加）、この混合液を１０分間攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップに蛍光標識抗体と被検試料との混合液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流下させ、抗ＴＳＨ抗体を固定した金膜面上に接触させてから、蛍光強度を１．５分間継続して測定した。基板において得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を求めた。得られた２被検試料の増加速度から、Ｓ／Ｎを求め、相対Ｓ／Ｎを比較した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
Ｓ／Ｎ ＝（ＴＳＨ濃度約０．４ｎｇ／ｍＬ被検試料から得られた増加速度）／（ＴＳＨ濃度約０ｎｇ／ｍＬ被検試料から得られた増加速度）
相対Ｓ／Ｎ ＝（各実施例および比較例のＳ／Ｎ）／（比較例１のＳ／Ｎ）
（相対Ｓ／Ｎ）
Ｓ：２．０以上
Ａ：１．７以上２．０未満
Ｂ：１．４以上１．７未満
Ｃ：１．１以上１．４未満
Ｄ：１．１未満
Ｓ：２．０以上
Ａ：１．７以上２．０未満
Ｂ：１．４以上１．７未満
Ｃ：１．１以上１．４未満
Ｄ：１．１未満
評価不能＊１：血清のゲル化が起こり、流動性悪化によりサンドイッチ法による評価に至らなかった。
評価不能＊２：蛍光粒子が金基板上に非特異的に吸着し、ＴＳＨ濃度が約０ｎｇ／ｍＬの血清検体においても、定量限界を超える蛍光強度となり、ＴＳＨ量を評価することができなかった。
＊３：相対Ｓ／Ｎは比較例１のＳ／Ｎに対する相対比で定義しているので、比較例１の相対Ｓ／Ｎ＝１
評価不能＊２：蛍光粒子が金基板上に非特異的に吸着し、ＴＳＨ濃度が約０ｎｇ／ｍＬの血清検体においても、定量限界を超える蛍光強度となり、ＴＳＨ量を評価することができなかった。
＊３：相対Ｓ／Ｎは比較例１のＳ／Ｎに対する相対比で定義しているので、比較例１の相対Ｓ／Ｎ＝１
相対Ｓ／Ｎの評価がＳ、Ａ、およびＢの場合を合格とし、相対Ｓ／Ｎの評価がＣおよびＤの場合を不合格とすると、本発明の非発光性高分子粒子はいずれも合格であった。本発明における実施例では、抗体結合量と非特異吸着抑制効果が両立でき、高感度で被検試料の検出が可能であることが分かる。比較例２、４および６に示したように、本発明以外の添加剤（水溶性高分子、無機微粒子）では、流動性悪化または非特異的な吸着により評価不能であった。添加量を低減した比較例３および５では、相対Ｓ／Ｎが不合格であった。
比較例では、以下の添加剤を添加した。
（水溶性）ポリアクリル酸：富士フイルム和光純薬社製、平均分子量 約２５０００
（水溶性）ポリアクリルアミド：Ａｌｄｒｉｃｈ社製、平均分子量 約４００００親水性シリカ粒子：日本アエロジル 親水性フュームドシリカ比表面積１３０ｍ２／ｇ
比較例では、以下の添加剤を添加した。
（水溶性）ポリアクリル酸：富士フイルム和光純薬社製、平均分子量 約２５０００
（水溶性）ポリアクリルアミド：Ａｌｄｒｉｃｈ社製、平均分子量 約４００００親水性シリカ粒子：日本アエロジル 親水性フュームドシリカ比表面積１３０ｍ２／ｇ
１ センサチップ
２ 上部部材
３ 中間部材
４ 基板
５ 第一の容器
６ 第二の容器
７ 容器群
８ 検出領域
９ 参照領域
１０ 流路
２ 上部部材
３ 中間部材
４ 基板
５ 第一の容器
６ 第二の容器
７ 容器群
８ 検出領域
９ 参照領域
１０ 流路
Claims (8)
- 測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、
前記測定対象物質または前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板と、
式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子、
とを含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
- 非発光性高分子粒子が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位以外の構造単位として、スチレン単位、ジビニルベンゼン単位、アクリル酸またはその塩の単位、あるいはメタクリル酸またはその塩の単位を含む、請求項１に記載のキット。
- 発光性標識粒子が、下記式（１）で表される蛍光色素または下記式（１０）で表される蛍光色素を内包した粒子である、請求項１または２に記載のキット。
Ｒ６１〜Ｒ６７は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、Ｒ−ＣＯ−基、カルボキシ基、Ｒ−Ｏ−ＣＯ−基、Ｒ−ＣＯ−Ｏ−基、（ＲＡ）２Ｎ−ＣＯ−基、アミノ基、ニトロ基またはシリル基を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。ＲＡは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロアリール基を示す。
Ｒ６８およびＲ６９は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基またはハロゲン原子を示し、これらはさらに置換基を有していてもよい。
- 発光性標識粒子の平均粒径が５０〜３００ｎｍである、請求項１から３の何れか一項に記載のキット。
- 非発光性高分子粒子の平均粒径が１０〜３００ｎｍである、請求項１から４の何れか一項に記載のキット。
- 非発光性高分子粒子の多分散指数が０．４０以下である、請求項１から５の何れか一項に記載のキット。
- 生体試料中の測定対象物質を測定する方法であって、
生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する発光性標識粒子と、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる構造単位を含む非発光性高分子粒子との混合物を、前記測定対象物質または前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板に接触させて、発光性標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
前記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含む方法。
- 発光性標識粒子の使用量に対する、非発光性高分子粒子の使用量の質量比が１〜１０００倍である、請求項７に記載の方法。
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