JPWO2019244979A1 - 薬物を内包するリポソーム組成物および免疫チェックポイント阻害剤を含む組合せ医薬 - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、リポソームが薬物を内包するリポソーム組成物および免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて得られる医薬を提供するである。本発明によれば、（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および（B）免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬が提供される。

Description

本発明は、薬物を内包するリポソーム組成物および免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬に関する。

近年、がんが免疫監視機構を回避するシステムを利用していることが知られるようになってきた。がん免疫療法は、がん患者がもつ免疫監視機構に作用して、がんに対する免疫力を強化することによって、がんの進行を抑制またはがんを治療する療法である。そのような回避システムに利用される分子として、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１等の免疫チェックポイント分子が知られている（特許文献１および２）。

また、ヒト抗ＰＤ−１またはその抗原結合部分と化学療法剤との共投与は、異なるメカニズムで作用する二種の抗がん剤が付与され、それらは、ヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性効果をもたらすと記載がある（特許文献１および２）。しかし、特許文献１および２には、ヒト抗ＰＤ−１またはその抗原結合部分と化学療法剤との共投与において、リポソームを使った抗がん剤について記載はない。

また、オプジーボQ＆Aのサイトにおいて、化学療法剤と併用していいですかとの問いに対して、がん化学療法剤との併用における有効性と安全性は確立していないため、併用できませんと開示がある（非特許文献１）。

化学療法において、リポソーム組成物によって、薬物をがんなどの疾患部位に集積させ、長期間に渡って曝露させることが多く検討されている。

特許文献３および非特許文献２には、スフィンゴミエリンとコレステロールを含むリポソームに、トポテカンを内包させたリポソームが記載されている。
特許文献４には、ジヒドロスフィンゴミエリンとコレステロールを含むリポソームに、トポテカンを内包させたリポソームが記載されている。

特許文献５には、カンプトテシンの安定性を高めるように適合されたリポソームカンプトテシン製剤であって、（ａ）リポソームに封入されたカンプトテシン、（ｂ）リポソームの外部にあり、ｐＨ４．５未満または４．５である第一の溶液、および（ｃ）リポソーム内部にある第２の溶液を含む製剤が記載されている。また、リポソームがジヒドロスフィンゴミエリンおよびコレステロールを含むことが記載されている。

特許文献６には、両親媒性薬剤をリポソームに有効に充填するシステムであって、アンモニウム化合物またはアンモニウム塩の存在下でリポソーム懸濁液を調整し、上記懸濁液を緩衝剤または塩で希釈して、内部水性相と外部水性相との間に、内側から外側に向かうアンモニウム勾配と、リポソームの内側のｐＨが外側のｐＨより酸性側であるようなｐＨ勾配とを与えることを包含する、システムが記載されている。

特許文献７には、精製水素添加大豆リン脂質またはスフィンゴミエリン、コレステロールおよび親水性ポリマー誘導体脂質を含むリポソームに、硫酸アンモニウムの存在下でトポテカンを内包させたリポソームが記載されている。

国際公開第２００６／１２１１６８号 特開２００６−３４０７１４号公報 米国特許第７，０６０，８２８Ｂ２号公報 米国特許第７，８１１，６０２Ｂ２号公報 特表２００８−５１９０４５号公報 特開平２−１９６７１３号公報 米国特許第６，３５５，２６８Ｂ２号公報

"ONO ONCOLOGY オプジーボQ＆A 化学療法剤と併用していいですか？"、［online］、掲載年月日不明、小野薬品工業株式会社、［2018年5月2日検索］、インターネット〈URL：https://www.ono-oncology.jp/contents/patient/opdivo_faq/11.html〉 AACR-EORTC International Conference, San Francisco, California, October 22-26, 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C.Zamboni et al.

上記した特許文献３、４および５並びに非特許文献２には、トポテカンを、スフィンゴミエリンまたはジヒドロスフィンゴミエリンを含むリポソームに内包することにより、血中でのトポテカンの流出を抑制し、ＡＵＣ（AreaUnder the blood concentration-time Curve：血中濃度−時間曲線下面積）を向上させることにより薬効の向上を図ることが記載されている。しかし、リポソームを構成する脂質組成、およびトポテカンを沈殿させる塩の組成の最適化がなされていないため、ＡＵＣの向上は十分なものではなく、更なる改善が求められている。

本発明の課題は、免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法と、化学療法との併用において、異なるメカニズムで作用する二種以上の抗がん剤を組み合せて、治療効果が高く、副作用の少ない二種以上の抗がん剤の組合せを提供することである。

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、
（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬が上記課題を解決することを見出して、本発明を完成した。

本発明は、下記を提供する。
[１]（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬。
［２］薬物がトポテカンまたはその塩、ドキソルビシンまたはその塩、イリノテカンまたはその塩、スニチニブまたはその塩である［１］に記載の医薬。
［３］全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．６以上１．８以下である［１］または［２］に記載の医薬。
［４］親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールで修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンである［１］から［３］の何れか一項に記載の医薬。
［５］リポソーム膜の構成成分における親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率が２〜１０モル％である［１］から［４］の何れか一項に記載の医薬。
［６］リポソーム膜の構成成分におけるコレステロール類の比率が３５〜４３モル％である［１］から［５］の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
［７］粒子径が１５０ｎｍ以下である［１］から［６］の何れか一項に記載の医薬。
［８］外水相のｐＨが５．５〜８．５である［１］から［７］の何れか一項に記載の医薬。
［９］ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を含むジヒドロスフィンゴミエリンで、内包薬剤がトポテカンまたはその塩である［１］から［８］の何れか一項に記載の医薬。
［１０］アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４〜６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において６０％／２４時間以上である［１］から［９］のいずれか１項に記載の医薬。
［１１］免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＴＬＡ−４の阻害剤から選ばれる少なくとも一種を含む［１］から［１０］のいずれか１項に記載の医薬。
［１２］上記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４の阻害剤から選ばれる少なくとも一種を含む［１１］に記載の医薬。
［１３］投与が治療的に相乗作用を示す投与量および投与期間である［１］から［１２］のいずれか１項に記載の医薬。
［１４］投与の対象がトポテカンに対して耐性を持つ［１］から［１３］のいずれか１項に記載の医薬。

[１５] 対象の疾患（好ましくはがん）の治療方法であって、
対象が治療的に相乗作用を示す有効投与量および投与期間において、
（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される治療方法。
[１６] 対象の疾患（好ましくはがん）の治療において使用するための、
（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬。
[１７] 医薬の製造のための、
（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬の使用。

[１８]（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬。

[１９]（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包するリポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬。

本発明の医薬は、リポソーム組成物および免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて同時にまたは逐次に投与されることによって、がんに対する治療または予防の少なくとも１つの効果を有する。
また、本発明の医薬は、高いＡＵＣまたは長い血中半減期を持ち、少量でも強い抗腫瘍活性を有するという優れた性質が維持され、かつ免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて同時にまたは逐次に投与されることによって、リポソーム製剤となっていない抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤との併用の場合よりも上回るという、顕著で予想外な腫瘍増殖抑制効果を持つ。
さらに、本発明の医薬は、低投与量であっても腫瘍増殖抑制効果を持つことから、患者を含む対象にとって、安全性が高いばかりでなく、身体的負担が少なく利便性も高いという、望ましい治療ができるようになる。

図１は、MBT-2皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図２は、MBT-2皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図３は、MBT-2皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図４は、MBT-2皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図５は、CT26.WT皮下移植担癌モデルマウスでの抗PD-1抗体併用による薬効試験における生存曲線の結果を示す。 図６は、EMT6皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図７は、EMT6皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図８は、EMT6皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図９は、EMT6皮下移植担癌モデルマウスを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、特にことわらない限り、％は、質量百分率を意味する。本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。

本明細書において、特にことわらない限り、各用語は、次の意味を有する。

「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。

対象は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む。ヒト以外の哺乳動物として、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット等が挙げられる。

処置は、所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害または遅延が実現される任意の処置および療法であってよく、進行の速度の低下、進行の速度の休止、状態の好転、状態の治癒もしくは寛解（部分的なものであるか完全なものであるかにかかわらず）、状態の１つもしくは複数の症状および／もしくは徴候の予防、遅延、軽減もしくは停止、または対象もしくは対象の生存が処置の不在下で予測されるものよりも延長されることを含む。

処置は、予防も含む。例えば、がんが発症または再発症しやすいまたはそのリスクがある対象を処置することにより、対象におけるがんの発症または再発症が予防され得るまたは遅延し得る。

処置は、完全ながんの寛解を含めたがんの成長の阻害、および／またはがん転移の阻害を含み得る。がんの成長とは、がんがより発達した形態に変化したことを指す。がんの成長の阻害を測定するための指標として、がん細胞の生存の減少、腫瘍体積または形態の低下（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像診断方法を使用して決定される）、腫瘍の成長の遅延、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型過敏症皮膚試験の成績の改善、細胞溶解性Ｔ−リンパ球の活性の増加、および腫瘍特異的抗原のレベルの低下等が挙げられる。

本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、がん、悪性新生物、がん腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」または「がん」と表現する。また、「腫瘍」または「がん」は、がんの治療後に再発したものを含む。「腫瘍」は、悪性または良性の全ての新生物細胞成長および増殖、ならびに前癌性および癌性の細胞および組織を含む。

「有効量」は、所望の治療的または予防的な結果を達成するために、必要な投与量であって、投与する期間、量を含む。本発明の医薬の「有効量」は、対象（または個体）の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに対象（または個体）において所望の応答を引き出す医薬の能力等に従って変動し得る。

「同時投与」は、組合せ療法における第１の療法と第２の療法とを、約１０分間、約５分間、または約１分間以内のうちのいずれかなど、約１５分間以内の時間間隔で投与することを意味する。第１の療法と第２の療法とを同時に投与する場合、第１の療法および第２の療法を同じ組成物（例えば、第１の療法および第２の療法の両方を含む組成物）中に含有させることもでき、別個の組成物中に含有させる（例えば、第１の療法を１つの組成物中に含有させ、第２の療法を別の組成物中に含有させる）こともできる。

「逐次投与」という用語は、組合せ療法における第１の療法および第２の療法を、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約６０分間またはそれより長い時間（１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間等）のうちのいずれかなど、約１５分間を超える時間間隔で投与することを意味する。本発明において、逐次投与は、第１の療法をまず投与することもでき、第２の療法をまず投与することも含まれる。また、本発明において、逐次投与は、第１の療法の実施後（所定の時間後（例えば、１週間後））に、第２の療法を実施することも含まれる。第１の療法と第２の療法とを別個の組成物中に含有させ、これらを同じパッケージまたはキットに含有させることもでき、異なるパッケージまたはキットに含有させることもできる。

「血中滞留性」とは、リポソーム組成物を投与した対象において、リポソームに封入された状態の薬物が血液中に存在する性質を意味する。

「リポソームの平均粒子径」とは、特に指定しない限り動的光散乱法を用いて測定される平均粒子径（好ましくはキュムラント平均粒子径）を意味する。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、濃厚系粒子アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子社製）、ナノトラックＵＰＡ（日機装社製）およびナノサイザー（マルバーン社製）等が挙げられる。各メーカーの測定装置固有の変換式により、リポソームの体積平均粒子径や数平均粒子径を算出することも可能である。１００ｎｍ付近の粒子を測定するには、静的光散乱法などでは、正確に粒子の分布を捉えることができず、動的光散乱法による測定が好ましい。

（本発明の医薬）
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の医薬の第一の形態は、
（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬である。

本発明の医薬の第二の形態は、
（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである、リポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬である。

本発明の医薬の第三の形態は、
（A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包するリポソーム組成物および
（B）免疫チェックポイント阻害剤
を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬である。

以下の本発明に関する説明は、本発明の医薬の第一から第三までの形態について、適用される。また、本発明は、以下の本発明に関する説明に基づく本発明のある形態の変形及び／又は組み合わせることによって生じる態様を含む。

（（A）リポソーム組成物）
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞体外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。本発明では、リポソーム組成物は、リポソームおよびリポソーム外に含まれる水溶液、成分等を含む組成物を指す。リポソームは、シングルラメラ（単層ラメラ又はユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造であり、個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性及び安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相に含まれる形態をとることを意味する。

リポソームの平均粒子径は１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、２０ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、３０〜３００ｎｍがより好ましく、３０ｎｍ〜２００ｎｍがさらに好ましく、１５０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ〜１５０ｎｍが更に一層好ましく、７０〜１５０ｎｍが特に好ましい。リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。

EPR効果（Enhanced permeability and retention effect）を期待する場合、リポソームの大きさ（平均粒子径）は、実質的に直径が５０〜２００ｎｍであることが好ましく、実質的に直径が５０〜１５０ｎｍであることがより好ましく、実質的に直径が５０〜１００ｎｍであることがさらに好ましい。「実質的に」という用語は、リポソームの個数の少なくとも７５％が指定された直径の範囲内にあることを意味する好ましい。前記少なくとも７５％は、少なくとも８０％であることがより好ましく、少なくとも９０％であることがさらに好ましい。

リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質を含む。脂質として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを任意に使用することができる。脂質として、具体的には、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種又は複数種の成分から構成されてよい。本発明におけるリポソームは、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含む。

脂質二重膜を形成する基材となる脂質として、二本のアシル鎖を有するリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然もしくは合成のリン脂質、またはこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。

本発明において、脂質二重膜を形成する基材となる脂質として、二本のアシル鎖を有するリン脂質、ジヒドロスフィンゴミエリンを用いる。ジヒドロスフィンゴミエリンを使用することにより、血中でのリポソームの滞留性を向上させることができる。
ジヒドロスフィンゴミエリンをリポソーム膜の基材として用いることで、そのリポソーム膜の隔壁性を向上させ、内包した薬物の漏出を防ぐことができる。これは、ジヒドロスフィンゴミエリンが有するアミド結合が、強い水素結合能を持ち、互いに強く相互作用することで強固で隔壁性の高い膜を形成できるためと推測する。また、本発明において同時に用いるコレステロールの水酸基とも強く相互作用し、さらに隔壁性の高い膜を作ることができる。これは、エステル結合を有するＨＳＰＣやレシチンなどの汎用されている脂質では達成し得ない機能になる。
また、アミド結合を有するが、アシル鎖に不飽和結合を有するスフィンゴミエリンに対して、全て飽和されたジヒドロスフィンゴミエリンはその融点が高く、形成される膜の運動性が低くなることから、スフィンゴミエリンに対しても、ジヒドロスフィンゴミエリンは、隔壁性の高い膜を作ることができると推測する。
ジヒドロスフィンゴミエリンは、一般的に分子内に２つの長鎖アルキル基を有しており、炭素数１６の長鎖アルキル基を２つ有するもの、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するもの、炭素数１６と炭素数２０〜２４の長鎖アルキル基を有するものが挙げられる。
ジヒドロスフィンゴミエリンとしては、薬物のリポソームからの漏出防止の観点で、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有する下記化合物を用いることが好ましい。これは、炭素数が多いほど、融点が高くなり隔壁性の高いリポソーム膜を作ることができるためである。

ジヒドロスフィンゴミエリンとしては、例えば、天然物由来のスフィンゴミエリンを一般的な手法で還元することにより得られるジヒドロスフィンゴミエリンを用いてもよく、合成することにより得られるジヒドロスフィンゴミエリンを用いても良い。鶏卵など天然物由来のジヒドロスフィンゴミエリンは、一般的に炭素数１６の長鎖アルキル基を２つ有するものが大半を占めるため、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンが純度高く得られる点で、化学合成により得られるものを使用した方が好ましい。

リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する全脂質）におけるジヒドロスフィンゴミエリンの比率は好ましくは３０〜８０モル％であり、より好ましくは４０〜７０モル％であり、さらに好ましくは５０〜６０モル％である。

親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンにおける親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。

これらの中でも、組成物の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類およびポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびそれらの誘導体がより好ましい。

汎用性および血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体がさらに好ましい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体としては、メトキシポリエチレングリコールなどが挙げられるが、特に限定されない。

ポリエチレングリコール類の分子量は、特に限定されないが、５００〜１０，０００ダルトンであり、好ましくは１，０００〜７，０００ダルトンであり、より好ましくは２，０００〜５，０００ダルトンである。

ジアシルホスファチジルエタノールアミンにおけるアシルの炭素数は１６以上が好ましく、例えば炭素数１６以上３０以下が好ましく、炭素数１６以上２４以下がより好ましく、炭素数２０がさらに好ましい。

ポリエチレングリコール類で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンとしては、例えば、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）およびジステアロイルグリセロール−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールが挙げられる。

リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する全脂質）において、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率は、好ましくは１〜１５モル％であり、より好ましくは２〜１０モル％である。

コレステロール類として、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロールおよびその誘導体を挙げることができる。例えば、コレステロールが好ましい。リポソームの平均粒子径を１００ｎｍ以下に微細化していくと、脂質膜の曲率が高くなることがある。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなる。脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロール等を添加することが有効である。

リポソームにおいて、コレステロールの添加は、リポソームの膜のすきまを埋めること等により、リポソームの膜の流動性を下げることが期待される。

リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する脂質）におけるコレステロールの比率は、好ましくは２０モル％〜５０モル％であり、より好ましくは３０モル％〜４５モル％であり、さらに好ましくは３５〜４３モル％である。

リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸またはジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤等の添加剤、例えば、界面活性剤等を含まないことが好ましい。

（薬物）
本発明のリポソーム組成物は、薬物を内包する。
薬物の種類は特に限定されないが、以下に例示する抗がん剤を使用することができる。具体的には、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびエピルビシンなどのアントラサイクリン系抗がん剤；
シスプラチンおよびオキサリプラチンなどのシスプラチン系抗がん剤；
パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン系抗がん剤；
ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系抗がん剤；
ブレオマイシンなどのブレオマイシン系抗がん剤；
シロリムスなどのシロリムス系抗がん剤；
トポテカン（ノギテカンとも言う）、イリノテカン、カレニテシン（登録商標）（ＢＮＰ１３５０とも言う）、エキサテカン 、ルートテカン、ギマテカン（ＳＴ１４８１とも言う）およびベロテカン（ＣＫＤ６０２とも言う）などのカンプトテシン系抗がん剤；
ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド系抗がん剤；
ならびに
イマチニブ（グリベック（登録商標））、エベロリムス（アフィニトール（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、タミバロテン（アムノレイク（登録商標））、トレチノイン（ベサノイド（登録商標））、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））およびラパチニブ（タイケルブ（登録商標））などの分子標的薬が挙げられる。
上記の中でもトポテカン（ノギテカンとも言う）、ドキソルビシン、イリノテカンまたはスニチニブが好ましく、トポテカンがより好ましい。

トポテカンとして、
一般名：ノギテカン塩酸塩（Nogitecan Hydrochloride）；
化学名：（ +）（- 4S）-10［-（dimethylamino）methyl］-4-ethyl-4，9-dihydroxy-1H -pyrano［3’，4’：6，7］indolizino［1，2-b ］quinoline-3，14（4H ，12H ）-dione monohydrochloride
が好ましく適用でき、例えば、商品名ハイカムチン（登録商標）が挙げられる。

薬物は、塩の形態として使用してもよい。
薬物の塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。

塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、ホウ酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。

酸性基における塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ、Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。

リポソーム組成物における薬物の含有量は特に限定されないが、リポソーム組成物に対して０．０２５〜２０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．２５〜１０ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。

リポソーム膜を形成する脂質に対するリポソーム内包された薬物量は、リポソームからの放出速度、リポソーム内部の浸透圧や沈殿した薬物によるリポソーム形状の観点から、モル比で０．１〜１．５が好ましく、０．２〜０．３がより好ましい。

脂質に対する薬物量のモル比が低すぎる場合、単位薬物量に対するリポソーム膜の面積が大きくなることで薬物のリポソームからの放出速度が大きくなり、血中滞留性を向上する機能が損なわれる。一方で、脂質に対する薬物量のモル比が高すぎる場合は、リポソーム内部の浸透圧が薬物の溶解量が増加することで上昇しリポソームが破壊される、または薬物がリポソーム内部で沈殿する場合は沈殿した固形物が大きく成長してリポソーム形状が変形することになる。

（内水相における硫酸アンモニウム）
本発明におけるリポソームの内水相は、硫酸アンモニウムを含む。また、本発明の第一の形態であるリポソーム組成物においては、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比は０．３６以上であり、好ましくは０．４以上である。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比は、より好ましくは０．４以上１．８以下であり、さらに好ましくは０．６以上１．８以下である。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比を上記の通りに設定することにより、血中でのリポソームからの薬物の漏出を抑制することができる。

全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が低すぎると、薬物の硫酸塩による固形物の形成が不完全となり、リポソーム内でリポソーム膜の透過性が高くなる溶解状態の薬物の濃度が高まり、薬物がリポソームから漏出し易くなり、血中滞留性向上の効果を損なう。また、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が高すぎると、リポソーム内部の浸透圧が高くなり、リポソーム構造の破壊を招くため、薬物がリポソームから漏出し易くなり、血中滞留性向上の効果を損なう。

また、本発明においてリポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率（硫酸イオンの内水相率）が、少なくとも８０％であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、同時に、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率（薬物の内水相率）が、少なくとも８０％であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。

リポソーム中の薬物濃度は、例えば、液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により測定することができる。また、リポソームの内水相の硫酸イオン濃度は、例えば、イオンクロマトグラフィにより測定することができる。

（外水相のｐＨ）
本発明のリポソーム組成物は、薬物を内包するリポソームと、上記リポソームを分散する水性溶媒（外水相）とを含むことができる。外水相のｐＨは、中性であることが好ましく、具体的にｐＨ５．５〜８．５程度であることが好ましい。

薬物の漏出を極度に抑制し過ぎると、患部、特に腫瘍部での薬物の漏出をも抑制し、期待するほどの薬効が得られない場合がある。
本発明のリポソーム組成物は、血中での薬剤漏出を抑制し、十分な量の薬物を腫瘍部に送達させ、さらに腫瘍部では速やかに薬物を放出する驚くべき機構を兼ね備えている。

腫瘍部では、血中などその他臓器に比べてアンモニウム濃度が高いという性質があり（例えば、Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and medicien, 11(2015) 1841-1850）、本発明のリポソーム組成物は、腫瘍のようにグルタミン代謝が亢進しアンモウム濃度が高い（５ｍｍｏｌ／Ｌ）環境で、薬物のリリースが非常に増大することがある。

本発明のリポソーム組成物は、アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４〜６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が６０％以上であり、より好ましくは、アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において１５％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４〜６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が７０％以上である。

（リポソーム組成物の製造方法）
本発明のリポソーム組成物の製造方法は、特に限定されないが、一例として、
（ａ）油相の調製；
（ｂ）水相の調製；
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成；
（ｄ）エクストルーダーによる整粒；
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換；
（ｆ）リモートローディングによる薬物のリポソーム粒子への内包；および
（ｇ）透析による外水相薬物の除去：
の工程により製造することができる。（ｄ）エクストルーダーによる整粒は、行ってもよいし、行わなくてもよい。

＜（ａ）油相の調製＞
（ａ）油相の調製においては、リポソームを構成する各成分（親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類）と有機溶媒とを混合し、混合物を加温して上記成分を溶解することにより油相を製造することができる。
油相において使用する有機溶媒は特に限定されないが、例えば、水と任意に混じりあう水溶性有機溶媒を用いることができる。

水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールおよびｔ−ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等が挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、エタノール、メタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。

リポソームを構成する各成分の濃度は、特に限定されず適宜調整することが可能である。

＜（ｂ）水相の調製＞
水相としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液または糖類（スクロースなど）の水溶液およびこれらの混合物（水性溶媒）を使用することができる。本発明において、後述するリモートローディングによって薬物をリポソーム粒子へ内包させる場合には、水相として硫酸アンモニウム水溶液を使用することが好ましい。

緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液およびグッドバッファー等が挙げられる。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物であってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。

生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％（質量／体積パーセント）含有する食塩水、ＰＢＳおよびトリス緩衝生理食塩水等が挙げられる。

本発明において、水相とは、外水相および内水相の両方を包含する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。例えば注射剤の場合においては、バイアル瓶またはプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液またはその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、リポソームの脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。

＜（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成＞
乳化工程では、油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化することができる。脂質が有機溶媒に溶解している油相および水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相および水相がＯ／Ｗ型（水中油型）に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発によって除去することにより、リポソームが形成される。または、油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。

撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波または機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理またはマイクロフルイダイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。

乳化工程は、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶媒を含む乳化工程で微粒子化する工程である。高せん断は、乳化機の撹拌羽根の周速で定義され、５ｍ／ｓ〜３２ｍ／ｓが好ましく、特に２０ｍ／ｓ〜３０ｍ／ｓが好ましい。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。

リポソームを製造する際の乳化工程の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５〜４０℃の脂質を使用する場合、３５℃〜７０℃とすることが好ましい。

乳化工程においては、リポソームを含む水溶液から有機溶媒と水を蒸発させてもよい。ここで言う蒸発とは、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去してもよいし、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発するものでもよい。

蒸発の方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒と水を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、および真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。

＜（ｄ）エクストルーダーによる整粒＞
得られたリポソームは、透析法、ろ過法またはエクストルージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。
エクストルージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液およびフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。
なお、エクストルーダーによる整粒は行ってもよいし、行わなくてもよい。

＜（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換＞
本発明において、リモートローディングによって薬物をリポソーム粒子へ内包させる場合には、透析によりリポソーム外水相液を置換してもよい。透析液として、０．０５〜５質量％のＮａＣｌ水溶液を使用することができるが、特に限定されない。上記した透析液を用いて、リポソーム液を透析することにより、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得ることができる。

＜（ｆ）リモートローディング法による薬物のリポソーム粒子への内包＞
本発明においては、リモートローディング法によって薬物をリポソーム粒子へ内包させることが好ましい。

本発明においてリモートローディング法とは、薬物が内包されていない空リポソームを製造し、リポソーム外液に薬物を加えることによりリポソームに薬物を導入する方法を意味する。リモートローディングの方法については、特に限定されないが、アンモニウム塩を用いた方法が好ましく、硫酸アンモニウムを用いた方法がより好ましい。

リモートローディング法では、外液に加えられた薬物が、能動的にリポソームへと移行し、リポソームへと取り込まれる。このドライビングフォースとしては、溶解度勾配、イオン勾配、ｐＨ勾配等が用いられている。例えば、リポソーム膜を隔てて形成されるイオン勾配を用いて薬物をリポソーム内部に導入する方法がある。例えば、Ｎａ⁺／Ｋ⁺濃度勾配を利用してリモートローディング法により予め形成されているリポソーム中に薬物を添加する技術がある。

イオン勾配の中でもプロトン濃度勾配が一般的に用いられ、例えば、リポソーム膜の内側（内水相）ｐＨが、外側（外水相）ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ態様が挙げられる。ｐＨ勾配は、具体的に、アンモニウムイオン勾配の濃度勾配等により形成することができる。

＜（ｇ）透析による外水相薬物の除去＞
薬物を内包したリポソーム液は、リポソームに含まれなかった薬物を除去するために、透析を行ってもよい。例えば、所定濃度のスクロース／ヒスチジンバッファーを透析液として用いて、薬物を内包したリポソーム液に対して、透析を行うことにより、外水相に存在する薬物を除去し、透析液で外水相を置換したリポソーム組成物を得ることができる。

＜無菌ろ過＞
上記で得られたリポソーム組成物は、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜またはメンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。

リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程および後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５〜３０℃程度で製造されることが好ましい。

＜無菌充填＞
無菌ろ過の後に得られたリポソーム組成物は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。

（リポソーム組成物）
本発明のリポソーム組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、およびｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。

等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。

安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスロースのような糖類が挙げられる。

酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等が挙げられる。安定化剤および酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。

ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。

本発明のリポソーム組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。

本発明のリポソーム組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。

リポソーム組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部および薬液中のガスを窒素等の不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下で行うことが挙げられる。

本発明のリポソーム組成物の投与経路としては、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴等の静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射および髄腔内注射を挙げることができる。投与方法としては、シリンジまたは点滴による投与が挙げられる。

本発明のリポソーム組成物の投与量および投与回数は、薬物の種類、患者の状態などに応じて適宜設定すればよく、有効成分である薬物質量として、１日あたり、一般的には０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で設定することができる。有効成分である薬物質量として、１回あたり、２ｍｇ〜１０ｍｇの範囲で設定することができる。ただし、これらの投与量に限定されるものではない。

（（B）免疫チェックポイント阻害剤）
「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイント分子あるいはそのリガンドに作用することにより、当該免疫チェックポイント分子によるシグナル伝達を阻害する薬剤をいう。免疫チェックポイント阻害剤の標的分子として、例えば、Ｔ細胞や抗原提示細胞の表面に提示される、免疫チェックポイント分子およびそのリガンドが挙げられ、具体的には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＮＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４８、ＣＤ８０、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ６０、ＣＤ８６またはＶＩＳＴＡ等の分子が含まれるが、本発明はこれらに限定されない。本発明において、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはそれに対するリガンドであるＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２等、および細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）から選択される少なくとも一つを阻害する剤であることが好ましい。ＰＤ−１ (Programmed death-1, CD279) は、リンパ球の活性化シグナルの亢進／抑制に働く CD28/CTLA-4 ファミリーに属する50〜55 kDa のI型膜たんぱく質である。また、ＰＤ−Ｌ１（別名：Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（別名：Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）は抗原提示細胞の表面上に発現しているＰＤ−１のリガンドである。

免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞や抗原提示細胞の表面に提示される、免疫チェックポイント分子およびそのリガンドの機能を阻害できる物質であればよく、公知の、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体等の少なくとも一種を用いることができる。抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体等は、例えばBio X Cell社等から購入することができる。免疫チェックポイント阻害剤は、具体的には、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、免疫チェックポイント阻害剤として、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ２抗体の少なくとも１つと、抗ＣＴＬＡ−４抗体とを併用することも可能である。

本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、経口または非経口投与によって対象に投与することができるが、好ましくは非経口投与である。投与方法は、具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。また、対象の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき対象の体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。または、患者あたり0.001 mg/bodyから100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、本発明のリポソーム組成物と組み合わせて同時にまたは逐次に投与される場合、治療的に相乗作用を示すように有効投与量および投与期間を選択することができる。しかし、本発明では、これらの投与量に制限されるものではない。

（免疫チェックポイント阻害剤の添加剤等）
本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、対象に投与するために、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体等の他に、薬学的に許容される水溶液などの媒体、塩、保存剤、緩衝剤などを含めた添加剤を添加することで作成できる。詳細には、上記した本発明のリポソーム組成物の添加剤等が同様に適用できる。

本発明の医薬は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して不応性のがんを有する対象を治療するために用いられることができる。例えば、免疫チェックポイント阻害剤の投与により所望の薬効が認められなかった対象に対して、本発明の医薬による治療をすることができる。

本発明の医薬の作用機構は不明であるが、以下のように推測するが、これに限定されるものではない。薬物を内包するリポソームが、腫瘍の周囲に存在する新生血管を構成する内皮細胞の隙間を透過し、腫瘍組織に集まり、滞留するEPR効果によって、腫瘍細胞に対し、優れた増殖抑制効果を有するものと推測される。
また、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１、PD-L2等の免疫チェックポイント分子の機能を阻害することで、がんに対する免疫力を強化することによって、がんの進行を抑制またはがんを治療できるものと推測される。
さらに、本発明の医薬は、薬物を内包するリポソーム組成物および免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて同時にまたは逐次に投与されることによって、各単剤（薬物を内包するリポソーム組成物または免疫チェックポイント阻害剤）に比べてこれらの単剤を併用することによって、強い抗腫瘍効果（例えば、腫瘍増殖抑制効果等）を有する。

本発明の医薬は、薬物を内包するリポソーム組成物および免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬であり、好ましくは抗がん剤として使用することができる。
本発明の医薬の適用対象であるがんの種類は、特に限定されないが、例えば、肺がん（特に、小細胞肺がん）、卵巣がん、小児固形腫瘍、子宮頸がん、乳がん、前立腺がん、子宮体がん、胃（胃腺）がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、頚部扁平上皮がん、食道がん、膀胱がん、メラノーマ、大腸がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮がん、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、骨髄転移がん、肉腫、軟部組織腫、瘍慢性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ等が挙げられる。

耐性は、がん細胞が抗がん剤に抵抗性(耐性)を示すことであり、これには治療の始めから抗がん剤が効かない自然耐性と、治療を続けていくうちに最初は有効であった抗がん剤が、効果がみられないまたは効果が減弱する状態を指す。具体的には、初期には抗がん剤に反応したが、その後治療中に応答性の低下を示すか、または細胞が抗がん剤を用いた治療の過程で増殖し続けているという点で抗がん剤に対する適切な応答を示さなかった性質を示す。

本発明の医薬は、トポテカン耐性がんに優れた効果を発揮できる。乳癌耐性タンパク質(ＢＣＲＰ)は、ＡＴＰ-結合カセット(ＡＢＣ)輸送タンパク質ファミリーのメンバーである。この輸送タンパク質は癌細胞から抗がん剤の流出を導き、細胞内の抗がん剤の濃度を減少させ、したがって、これらの耐性癌細胞における薬剤の望ましい抗癌効果を減少させ、または消失させる。本発明の医薬は、腫瘍組織に集まり、滞留するEPR効果によって、腫瘍細胞に対し、高濃度かつ長期間のトポテカンによる暴露を達成することで、トポテカン耐性がんに対して、優れた効果を発揮することができるものと推測される。

（腫瘍体積）
本発明では、腫瘍体積を測定するために、モデルとなる動物（好ましくはマウスもしくはラット）に対して腫瘍を移植できる。腫瘍の体積の増殖抑制は、使用される薬物、リポソームを構成する脂質等の組合せ、及び有効量に依存する。腫瘍体積の増殖抑制とは、腫瘍成長を抑制し得るか、腫瘍静止を達成し得るか、及び実質的若しくは完全な腫瘍退縮の少なくとも一つを意味する。

本発明のリポソーム組成物を哺乳動物等の対象に投与する場合、モデル動物に対して、処置グループ及びコントロールグループに分配して、腫瘍細胞が定着するよう、腫瘍細胞移植の例えば、腫瘍細胞が１００〜１０００ｍｍに成長した後、開始できる。

例えば、モデル動物がマウスの場合、本発明のリポソーム組成物の評価として、各グループのマウスを最低体重に達するまで毎日全体として体重を測定できる。
サンプリング時のための最終屠殺まで、腫瘍が２０００ｍｍ³に達するまで又は動物が死亡するまでノギス等で腫瘍を測定できる。哺乳動物の対象の中の腫瘍体積は、任意の当分野で認められている方法を用いて測定され得る。
例えば、ノギスの測定を用いて、式：（ａ×ｂ²）×０．５（式中、“ａ”は最大直径であって、“ｂ”は短径の長さである）を用いて腫瘍体積を評価できる。また、ヒトでは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）走査、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）走査のような画像診断などの手法により腫瘍体積を測定することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。本発明は当業者により種々の変更や修飾が可能であろうことは理解される。そのような変更や修飾が本発明の範囲を逸脱するものでない限り、それらは本発明に包含される。実施例で用いた各種試薬は、特に記載の無い限り市販品を使用した。

ＳＭは、スフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＭ−１０、日油製）を示す。
鶏卵由来ＤＨＳＭは、鶏卵由来のＳＭを水素添加することで得たジヒドロスフィンゴミエリン（Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＭ−１０（日油製）に対し水素添加した合成品）を示す。この鶏卵由来ＤＨＳＭは、炭素数１６のアルキル鎖の２つ有したものが、全体の７０〜８０％であり、残りはアルキル鎖長の異なるＤＨＳＭを含む混合物である。
全合成ＤＨＳＭは、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有する下記化合物が９８％以上含むように化学合成により作製されたジヒドロスフィンゴミエリン（Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）を示す。

ＰＥＧリン脂質（表中ではＰＥＧと表記）としては、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油製（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧとする）を使用した。
コレステロール（表中ではＣｈｏｌと表記）としては、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＨＰ(日本精化社製)を使用した。

＜比較例１〜１０＞
（ａ）油相の調製
比較例１については、ＳＭ、ＰＥＧリン脂質、コレステロールをそれぞれ１１．５２ｇ、４．３２ｇ、４．３２ｇ秤量した。比較例２〜１０については、表１に記載の比率になるように、ＳＭまたは鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＰＥＧリン脂質、コレステロールの量を変更した。この脂質を３８１ｍＬのエタノールと混合し、６５℃で溶解し油相とした。

（ｂ１）水相１の調製
硫酸アンモニウム２５．２ｇを水１１１８．５gに溶解し、水相１を調製した。
（ｂ２）水相２の調製
硫酸アンモニウム５．０４ｇを水２２３．７gに溶解し、水相２を調製した。

（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
（ｂ１）で調製した水相１を６５℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後、精密乳化分散機にて、周速２６ｍ／ｓにて６０分間混合した。つづいて、室温の水相２を添加した後、６５℃で加温しながら周速０．１ｍ／ｓで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が６００ｍＬまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。

（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として３．１５質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。

（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で６０分間加温した。

（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。

＜比較例１１および１２＞
（ａ）油相の調製
比較例１１については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、およびコレステロールをそれぞれ、０．５１７ｇおよび０．２３３ｇ秤量した。比較例１２については、表１に記載の比率になるように、ＳＭ、およびコレステロールの量を変更した。リポソームをＤｉＩ（１，１’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１.５ｍＬとし、秤量した脂質とこの有
機溶媒を混合し、６５℃に加温して脂質を溶解し油相とした。

（ｂ）水相の調製
硫酸アンモニウム０．９ｇおよびスクロース２．１６ｇを水１３．５ｇに溶解し、水相を調製した。

（ｃ）油相と水相混合によるリポソーム粒子形成
（ｂ）で調製した水相を６５℃に加温し、マグネチックスターラーで攪拌する（３０００ｒｐｍ）。（ａ）で調製した油相全量をホットプレートで６５℃に加温し、油相全量をシリンジで吸って５分間ホットプレートで加温する。加温してある水相に、油相を３０秒かけて滴下する。

（ｄ）エクストルーダーによる整粒
７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。

（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として０．０９質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）または（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。

（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で１２０分間加温した。

（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロースおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。

＜実施例１〜８＞
（ａ）油相の調製
実施例１については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＰＥＧリン脂質（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油製、以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧとする）、およびコレステロールをそれぞれ１１．５２ｇ、４．３２ｇ、および４．３２ｇ秤量した。実施例２〜８については、表２に記載の比率になるように、ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。この脂質を３８１ｍＬのエタノールと混合し、６５℃で溶解し油相とした。

（ｂ１）水相１の調製
硫酸アンモニウム２５．２ｇを水１１１８．５gに溶解し、水相１を調製した。
（ｂ２）水相２の調製
硫酸アンモニウム５．０４ｇを水２２３．７gに溶解し、水相２を調製した。

（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
（ｂ１）で調製した水相１を６５℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後、精密乳化分散機にて、周速２６ｍ／ｓにて６０分間混合した。つづいて、室温の水相２を添加した後、６５℃で加温しながら周速０．１ｍ／ｓで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が６００ｍＬまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。

（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として３．１５質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。

（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で６０分間加温した。

（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。

＜実施例９および１０＞
（ａ）油相の調製
実施例９については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、コレステロールをそれぞれ０．４１２ｇ、０．１５３ｇ、および０．１５３ｇ秤量した。実施例１０については、表２に記載の比率になるように、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。リポソームをＤｉＩで標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１１．２５ｍＬとし、さらに酢酸エチル３．７５ｍＬを加えた。秤量した脂質とこの有機溶媒を混合し、６０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。

（ｂ）水相の調製
硫酸アンモニウム０．９ｇを水４０ｇに溶解し、水相を調製した。

（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
（ｂ）で調製した水相を７０℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後（容積比：水相／油相＝８／３）、乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ−３、日本精機製作所製）にて、３０００ｒｐｍ（ｒｏｔａｔｉｏｎ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ：１／６０ｓ-¹）にて３０分間混合した。つづいて、６５℃で加温しながら３００ｒｐｍで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が１５ｇまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。

（ｄ）エクストルーダーによる整粒
７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。

（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として０．０９質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）または（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。

（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で１２０分間加温した。

（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。

［物性測定および評価］
＜平均粒子径＞
本発明において、平均粒子径とは、動的光散乱法により測定されるキュムラント平均粒子径を意味する。表に記載の各実施例および比較例の平均粒子径は、オートサンプラー付き濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００ＡＳ（大塚電子社製）により動的光散乱法で測定したキュムラント平均粒子径である。測定結果を表１および表２に示す。

＜トポテカン濃度測定＞
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）装置 Ｎｅｘｅｒａ−ｉ ＬＣ−２０４０Ｃ（島津社製）にて、サンプルを測定し、トポテカン濃度を定量した結果を表１および表２に示す。具体的な測定方法は、次のとおりである。
表１及び２のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率は、比較例１０を除くと少なくとも９５％であった。比較例１０は５９％であった。

リポソーム製剤中のトポテカン量の測定
調製したリポソーム液をメタノールに溶かしフィルターろ過した試料溶液、およびトポテカン塩酸塩を希釈調製した検量線標準溶液を用いて、液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により測定した。
内水相トポテカン濃度は、全水相トポテカン濃度から外水相トポテカン濃度を引いて算出した。
各水相のトポテカン濃度は以下のように測定した。
（全水相トポテカン濃度）
リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、メタノール９５０μＬを加え、ボルテックスで1分間攪拌した。その液より１００μＬを測り取り、ミリＱ水を９００μＬ加え、ボルテックスを1分間攪拌し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
（外水相トポテカン濃度）
リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、９．４ｗｔ％スクロース/１０ｍＭヒスチジン水溶液４５０μＬを加え希釈する。その希釈液１００μＬにＰＢＳ ２００μＬ添加し、転倒混和した。この分散液を超遠心分離（２００，０００ｇ, ２０℃, ６０分間）し、上清をＨＰＬＣ分析サンプルとした。超遠心分離機は、日立製ｈｉｍａｃ ＣＰ８０ＷＸを使用した。
ａ）検量線標準液の調製
トポテカン塩酸塩約２０ｍｇを量り、２０ｍＬの１０質量％メタノール水溶液に溶かした。この液にミリＱ水を加えて、トポテカン塩酸濃度０．１、１．０、５．０、１０．０、２０．０、５０．０、または１００．０ｐｐｍの溶液を調製し、検量線標準液とした。
ｂ）試料溶液の調製
（１）試料（リポソーム製剤溶液）約５０μＬをマイクロマン（ＭＩＣＲＯＭＡＮ（登録商標））で量りとり、これにマイクロマンで量りとった約９５０μＬのメタノールを加えた。このとき、約１分間振とうし、溶液が透明になることを目視で確認した。
（２）上記（１）の溶液１００μＬをマイクロマンで量りとり、マイクロピペットで量りとった約９００μＬのミリＱ水を加えた。この液を約１分間振とうした後、約１分間超音波処理をし、さらに約１０秒間振とうした。
（３）上記（２）の溶液をＤＩＳＭＩＣ（登録商標）フィルター（穴径０．４５μｍ）でろ過した溶液を試料溶液とした。
ｃ）測定
液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により以下の条件で測定した。
測定波長：３８２ｎｍ、カラム：資生堂ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＡＣＲ ３μｍ_３．０ｍｍ＊７５ｍｍ
カラム温度：４０℃付近の一定温度
移動相Ａ、Ｂはいずれも水／メタノール／トリフルオロ酢酸混液で、移動相の送液は移動相ＡおよびＢの混合比を変えて濃度勾配を制御した。
流量：毎分１．０ｍＬ、注入量：１０μＬ、オートサンプラー温度：２５℃付近の一定温度で測定を行った。

＜硫酸イオン濃度測定＞
イオンクロマト装置 ８８３ Ｂａｓｉｃ ＩＣ ｐｌｕｓ（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）にて、サンプルを測定し、硫酸イオン濃度を定量した。トポテカンに対する硫酸イオンのモル比を測定した結果を表１および表２に示す。表１及び２のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも９０％であった。
内水相硫酸イオン濃度は、全水相硫酸イオン濃度から外水相硫酸イオン濃度を引き算して、算出した。各水相の硫酸イオン濃度は以下のように測定した。
（全水相硫酸イオン濃度）
リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、メタノール９５０μＬを加え、超音波処理を１５秒実施し、混和した。その液より９０μＬを測り取り、注射用水（光製薬製）を８１０μＬを加え、超音波処理を30秒実施し、混和した。この溶液に酢酸エチル９００μＬ添加し、よく振って酢酸エチル相へ脂質類を抽出した。水相の液を適量は測り取り、イオンクロマト分析に使用した。
（外水相硫酸イオン濃度）
リポソーム分散液を１００μＬ測り取り、５％ブドウ糖液（大塚製薬製）９００μＬを加え希釈した。その液４５０μＬを限外ろ過にて処理し、ろ液をイオンクロマト分析サンプルとした。
遠心条件は、７４００ｇ、５℃、３０分。遠心分離機は、日立製himac CF15RXIIを使用した。

＜ＡＵＣの測定＞
調製したトポテカン含有リポソームを投与したマウス（投与量は薬物量として１ｍｇ／ｋｇ）については、投与後０．２５、２、６、２４時間で採血した。血液は８００×ｇ、１０分間遠心し、血漿を回収した。採取した血漿について、液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、トポテカン濃度の定量を行った。得られたトポテカン濃度推移より薬物動態解析ソフトＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Ｃｅｒｔａｒａ）を用いて単回投与後の無限時間までの血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。ＡＵＣの単位は、時間×ｎｇ／ｍＬ（表中では、hr*ng/mLと表記）である。なお、非特許文献１に記載のリポソームのＡＵＣは、６８１５２時間×ｎｇ／ｍＬと計算される。

表１および表２の結果から分かるように、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロールを含むリポソーム組成物において、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である実施例１〜１０において、ＡＵＣの測定値が２０００００以上となり、高い血中滞留性を達成できることが示された。

一方、ジヒドロスフィンゴミエリンを使用しない比較例１から８、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６未満である比較例９および１０、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンを使用しない比較例１１および１２においては、ＡＵＣの測定値が２０００００未満であり、実施例１から１０よりも劣ることが示された。

（トポテカン内包リポソーム組成物（以下、本発明のリポソーム組成物、またはLipoともいう）の組成）
トポテカン塩酸塩20mg
HSPC（注1） 95.8mg
MPEG-DSPE（注2） 31.9mg
コレステロール 31.9mg
硫酸アンモニウム 20mg
L-ヒスチジン 15.5mg
精製白糖 940mg
pH調整剤 適量

本発明のリポソーム組成物は、上述した実施例に基づいて製造した。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上あることを確認した。

抗PD-L1抗体は、Bio X Cell社社、InVivoMAb anti-mouse PD-L1を使用した。
10 mMヒスチジン/9.4 %スクロース溶液は、スクロース9.4 g/100mLである水溶液に、ヒスチジン濃度が10 mMとなるようにした溶液である。
MBT-2細胞は、JCRB細胞バンクより入手した。

（MBT-2皮下移植担癌モデルマウスでの抗PD-L1抗体併用による薬効試験）
被検物質として、抗PD-L1抗体（以下、PD-L1 Abともいう）および本発明のトポテカン内包リポソーム組成物（以下、Lipoともいう）を用いた。PD-L1 Abの希釈には、Bio X Cell社InVivoPure pH6.5 Dilution Buffer（以下、Ab希釈液ともいう）を用いた。Lipoの希釈には、10 mMヒスチジン/9.4 %スクロース溶液（以下、Lipo希釈液ともいう）を用いた。

マウス膀胱癌細胞株であるMBT-2細胞3×10⁶個を雌性C3H/HeNマウスの脇腹部皮下に移植し、皮下腫瘍を形成させた。腫瘍体積を指標として、PD-L1 Ab単独、Lipo単独、およびPD-L1 AbとLipoの併用による皮下腫瘍増殖の抑制効果を評価した。PD-L1 AbおよびAb希釈液に関しては、腹腔内投与にて週2回、計3週間投与した。本発明のリポソーム組成物およびその希釈液に関しては、尾静脈投与にて週1回、計3週間投与した。3週間の投与が終了した後は休薬し、3週間腫瘍体積の測定を継続した。

群構成として、
群1はAb希釈液と本発明のリポソーム組成物の希釈液の投与群、
群2はPD-L1 Ab（10 mg/kg）と本発明のリポソーム組成物の希釈液の投与群、
群3はAb希釈液と本発明のリポソーム組成物（1 mg/kg）の投与群、
群4はPD-L1 Ab（10 mg/kg）と本発明のリポソーム組成物（1 mg/kg）の投与群
とした。
群1〜3が比較例、群4が実施例に相当する。群構成および投与量を表３に示す。表３において、Lipoは本発明のリポソーム組成物、腹は腹腔内投与、尾は尾静脈投与、2回/Wx3は週2回を3週間の投与、1回/Wx3は週1回を3週間の投与、をそれぞれ意味する。また、各群の個体ごとの腫瘍体積の推移を図１〜４に示す。

各群において試験終了日まで完全寛解状態を維持した個体数と完全寛解率（%）を表４に示す。

群1および群3では、完全寛解状態を維持した個体はいなかった。群2では9個体中の1個体が完全寛解を維持した。群4では9個体中の4個体が完全寛解を維持した。

以上の結果から、本発明のリポソーム組成物はPD-L1 Abとの併用において、本発明のリポソーム組成物またはPD-L1 Ab単独の効果に対して優れた増殖抑制効果を示した。また、本発明のリポソーム組成物はPD-L1 Abとの併用は、完全寛解となる状態が観察されるという顕著で予想外な効果を示すことが分かった。

（CT26.WT皮下移植担癌モデルマウスでの抗PD-1抗体併用による薬効試験）
抗PD-1抗体は、Bio X Cell社、InVivoMAb anti-mouse PD-1を使用した。10 mMヒスチジン/9.4 %スクロース溶液は、スクロース9.4 g/100mLである水溶液に、ヒスチジン濃度が10 mMとなるように調製した溶液である。CT26.WT細胞は、ATCC社より入手した。

被験物質として、抗PD-1抗体（以下、PD-1 Abともいう）および本発明のトポテカン内包リポソーム組成物（Lipo）を用いた。PD-1 Abの希釈には、Bio X Cell社InVivoPure pH7.0 Dilution Buffer（以下、Ab希釈液ともいう）を用いた。Lipoの希釈には、10 mMヒスチジン/9.4 %スクロース溶液（以下、Lipo希釈液ともいう）を用いた。

マウス大腸癌細胞株であるCT26.WT細胞1×10⁶個を雌性BALB/cCrSlcマウスの脇腹部皮下に移植し、皮下腫瘍を形成させた。移植13日後より、PD-1 Ab単独、Lipo単独、およびPD-1 AbとLipoの併用による処置を実施し、皮下腫瘍増殖の抑制に伴う生存期間の延長効果を評価した。PD-1 AbおよびAb希釈液に関しては、腹腔内投与にて週2回、計3週間投与した。本発明のリポソーム組成物（Lipo）およびその希釈液に関しては、尾静脈投与にて週1回、計3週間投与した。3週間の投与が終了した後は休薬し、3週間腫瘍体積の測定を継続した。腫瘍体積が2,000 ｍｍ³を超えたマウスについては、動物福祉の観点から安楽死処置を行った。Kaplan-Meier法による生存分析を行い、Log-Rank検定にて有意差を判定した。

群構成として、
群1はAb希釈液とLipo希釈液の投与群、
群2はPD-1 Ab（10 mg/kg）とLipo希釈液の投与群、
群3はAb希釈液と本発明のリポソーム組成物（2 mg/kg）の投与群、
群4はPD-1 Ab（10 mg/kg）と本発明のリポソーム組成物（2 mg/kg）の投与群
とした。
群1〜3が比較例、群4が実施例に相当する。群構成および投与量を表５に示す。表５において、Lipoは本発明のリポソーム組成物、腹は腹腔内投与、尾は尾静脈投与、2回/W x 3は週2回を3週間の投与、1回/W x 3は週1回を3週間の投与、をそれぞれ意味する。また、各群の生存曲線を図５に示す。

各群における移植時から起算した生存期間中央値、試験終了日の生存率（%）を表６、Log-Rank検定の結果を表７にそれぞれ示す。p値が0.05未満の場合に、統計学的に有意差ありと判断した。

群４は、比較例である群１〜3の各群に対して、統計学的に有意な生存期間の延長効果を示し、試験終了日において、75 % の個体が生存していた。

以上の結果から、本発明のリポソーム組成物はPD-1 Abとの併用において、本発明のリポソーム組成物単独またはPD-1 Ab単独の効果に対して、優れた生存延長効果を示すことが明らかとなった。

（EMT6モデルマウスでの抗CTLA-4抗体併用による薬効試験）
抗CTLA-4抗体は、Bio X Cell社、InVivoMAb anti-mouse CTLA-4を使用した。

被験物質として、抗CTLA-4抗体（以下、CTLA-4 Ab ともいう）および本発明のトポテカン内包リポソーム組成物（Lipo）を用いた。CTLA-4 Ab の希釈には、Bio X Cell社InVivoPure pH7.0 Dilution Buffer（以下、Ab 希釈液ともいう）を用いた。Lipoの希釈には、大塚製薬工場社5 %糖液（以下、Lipo 希釈液ともいう）を用いた。

マウス乳癌細胞株であるEMT6細胞2.25×10⁶個を雌性Balb/cマウスの脇腹部皮下に移植し、皮下腫瘍を形成させた。腫瘍体積を指標として、CTLA-4 Ab単独、Lipo単独、およびCTLA-4 AbとLipoの併用による皮下腫瘍増殖の抑制効果を評価した。CTLA-4 AbおよびAb希釈液に関しては、腹腔内投与にて週2回、計3週間投与した。本発明のリポソーム組成物およびその希釈液に関しては、尾静脈投与にて週1回、計3週間投与した。3週間の投与が終了した後は休薬し、腫瘍体積の測定は継続した。

群構成として、
群1はAb希釈液と本発明のリポソーム組成物の希釈液の投与群、
群2はCTLA-4 Ab（10 mg/kg）と本発明のリポソーム組成物の希釈液の投与群、
群3はAb希釈液と本発明のリポソーム組成物（4 mg/kg）の投与群、
群4はCTLA-4 Ab（10 mg/kg）と本発明のリポソーム組成物（4 mg/kg）の投与群
とした。
群1〜3が比較例、群4が実施例に相当する。群構成および投与量を表８に示す。表８において、Lipoは本発明のリポソーム組成物、腹は腹腔内投与、尾は尾静脈投与、2回/Wx3は週2回を3週間の投与、1回/Wx3は週1回を3週間の投与、をそれぞれ意味する。また、各群の個体ごとの腫瘍体積の推移を図６〜９に示す。

以上の結果から、本発明の医薬はがんに対する予防または治療を行うために非常に有用であり、予想外の腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。
特に、トポテカンを内包するリポソーム組成物と、免疫チェックポイント阻害剤としてPD-1、PD-L1およびCTLA-4 を阻害する少なくとも１つの抗体とを組み合わせて投与することによる、新たな医薬の提供が可能となった。

本発明の医薬は、がんに対する予防または治療するための医薬として有用である。本発明の投与方法は、がんに対する予防または治療するための医薬の投与方法として有用である。さらに本発明の治療方法は、がんに対する予防または治療するための治療方法として有用である。

Claims (14)

1. （A）リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物および
   （B）免疫チェックポイント阻害剤
   を組み合わせて同時にまたは逐次に投与される医薬。
2. 薬物がトポテカンまたはその塩、ドキソルビシンまたはその塩、イリノテカンまたはその塩、スニチニブまたはその塩である請求項１に記載の医薬。
3. 全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．６以上１．８以下である請求項１または２に記載の医薬。
4. 親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールで修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンである請求項１から３の何れか一項に記載の医薬。
5. リポソーム膜の構成成分における親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率が２〜１０モル％である請求項１から４の何れか一項に記載の医薬。
6. リポソーム膜の構成成分におけるコレステロール類の比率が３５〜４３モル％である請求項１から５の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
7. 粒子径が１５０ｎｍ以下である請求項１から６の何れか一項に記載の医薬。
8. 外水相のｐＨが５．５〜８．５である請求項１から７の何れか一項に記載の医薬。
9. ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を含むジヒドロスフィンゴミエリンで、内包薬剤がトポテカンまたはその塩である請求項１から８の何れか一項に記載の医薬。
10. アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４〜６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において６０％／２４時間以上である請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の医薬。
11. 前記免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＴＬＡ−４の阻害剤から選ばれる少なくとも一種を含む請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の医薬。
12. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４の阻害剤から選ばれる少なくとも一種を含む請求項１１に記載の医薬。
13. 前記投与が治療的に相乗作用を示す投与量および投与期間である請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の医薬。
14. 前記投与の対象がトポテカンに対して耐性を持つ請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の医薬。

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