CN112312895A

CN112312895A - 包含内含药物的脂质体组合物及免疫检查点抑制剂的组合医药

Info

Publication number: CN112312895A
Application number: CN201980040973.9A
Authority: CN
Inventors: 下山晋; 五百藏忠明; 森干永; 樋口珠美
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: EP3811931A4; WO2019244979A1; EP3811931A1; TW202015658A; US20210100791A1; JPWO2019244979A1; JP7036919B2; CN112312895B

Abstract

本发明的课题在于提供一种组合脂质体内含药物的脂质体组合物及免疫检查点抑制剂而得到的医药。根据本发明，提供一种组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药的医药。

Description

包含内含药物的脂质体组合物及免疫检查点抑制剂的组合医药

技术领域

本发明涉及一种组合内含药物的脂质体组合物及免疫检查点抑制剂并同时或依次给药的医药。

背景技术

近年来已知癌症利用逃避免疫监视机制的系统。癌症免疫疗法是通过作用于癌症患者所具有的免疫监视机制以增强对癌症的免疫力来抑制癌症的恶化或治疗癌症的疗法。作为在这种逃避系统中使用的分子，已知有CTLA-4、PD-1或其配体(ligand)即PD-L1等免疫检查点分子(专利文献1及2)。

并且，关于人抗PD-1或其抗原结合部分与化学治疗剂的共同给药(co-administration)记载有以下内容：将通过不同机制起作用的两种抗癌剂进行给药，而其对人肿瘤细胞引起细胞毒性作用(专利文献1及2)。然而，在专利文献1及2中，没有关于在人抗PD-1或其抗原结合部分与化学治疗剂的共同给药中，使用过脂质体的抗癌剂的记载。

并且，在Opdivo Q&A的网站中，针对是否可以与化学治疗剂并用的提问，明确回复有因尚未证实与癌症化学治疗剂并用时的有效性和安全性，所以有无法并用(非专利文献1)。

在化学治疗中，对利用脂质体组合物使药物聚集在癌症等疾病部位并经长期间使其曝露的疗法进行了很多研究。

在专利文献3及非专利文献2中记载有在包含鞘磷脂和胆固醇的脂质体中内含拓朴替康(topotecan)而得到的脂质体。

在专利文献4中记载有在包含二氢鞘磷脂和胆固醇的脂质体中内含拓朴替康而得到的脂质体。

在专利文献5中记载有一种制剂，其适合于提高喜树碱的稳定性的脂质体喜树碱制剂，其包含(a)被包封于脂质体中的喜树碱、(b)位于脂质体的外部且pH小于4.5或4.5的第1溶液及(c)位于脂质体内部的第2溶液。并且，记载有脂质体包含二氢鞘磷脂及胆固醇的内容。

在专利文献6中记载有一种系统，其将两亲性药剂有效地填充于脂质体中的系统，其包括以下步骤：在铵化合物或铵盐的存在下调节脂质体悬浮液，并将上述悬浮液用缓冲剂或盐进行稀释，对内部水相与外部水相之间赋予从内侧朝向外侧的铵梯度和脂质体的内侧的pH比外侧的pH位于酸性侧的pH梯度。

在专利文献7中记载有一种脂质体，该脂质体为在硫酸铵的存在下使拓朴替康包封于包含精制氢化大豆磷脂或鞘磷脂、胆固醇及亲水性聚合物衍生物脂质的脂质体而得到。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2006/121168号

专利文献2：日本特开2006-340714号公报

专利文献3：美国专利第7,060,828B2号公报

专利文献4：美国专利第7,811,602B2号公报

专利文献5：日本特表2008-519045号公报

专利文献6：日本特开平2-196713号公报

专利文献7：美国专利第6,355,268B2号公报

非专利文献

非专利文献1：“ONO ONCOLOGY Opdivo Q&A是否可以与化学治疗剂并用？”、[online]、刊登年月日不详、ONO PHARMACEUTICAL CO.,LTD.、[2018年5月2日搜索]、因特网＜URL：https://www.ono-oncology.jp/contents/patient/opdivo_faq/11.html＞

非专利文献2：AACR-EORTC International Conference,San Francisco,California,October 22-26,2007,#C113 A Pharmacokinetics Study of a NovelSphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan inRats,William C.Zamboni et al.

在上述专利文献3、4及5以及非专利文献2中记载有以下内容：通过将拓朴替康包封于包含鞘磷脂或二氢鞘磷脂的脂质体中来抑制拓朴替康在血中的流出，通过提高AUC(AreaUnder the blood concentration-time Curve：血中浓度-时间曲线下的面积)来实现药效的提高。但是，由于未进行构成脂质体的脂质组成及使拓朴替康沉淀的盐的组成的最优化，因此AUC的提高并不足够，要求进一步的改善。

发明内容

发明要解决的技术课题

本发明的课题在于，在并用基于免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法与化学治疗时，将以不同机制发挥作用的两种以上的抗癌剂进行组合而提供治疗效果高、副作用少的两种以上的抗癌剂的组合。

用于解决技术课题的手段

本发明人等反复进行深入研究的结果，发现以下医药可解决上述课题，从而完成了本发明。该医药组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

本发明提供以下。

[1]一种医药，其组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

[2]根据[1]所述的医药，其中药物为拓朴替康或其盐、阿霉素(doxorubicin)或其盐、伊立替康(irinotecan)或其盐、舒尼替尼(sunitinib)或其盐。

[3]根据[1]或[2]所述的医药，其中内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.6以上且1.8以下。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的医药，其中经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺为经聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的医药，其中脂质体膜的构成成分中的经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺的比率为2～10摩尔％。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的脂质体组合物，其中脂质体膜的构成成分中的胆固醇类的比率为35～43摩尔％。

[7]根据[1]至[6]中任一项所述的医药，其粒径为150nm以下。

[8]根据[1]至[7]中任一项所述的医药，其中外水相的pH为5.5～8.5。

[9]根据[1]至[8]中任一项所述的医药，其中二氢鞘磷脂为包含碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂，内含药剂为拓朴替康或其盐。

[10]根据[1]至[9]中任一项所述的医药，其中药物从铵浓度为1mmol/L以下的血浆中的脂质体中的释放速率在37℃下为20％/24小时以下，药物从铵浓度为4～6mmol/L的血浆中的脂质体中的释放速率在37℃下为60％/24小时以上。

[11]根据[1]至[10]中任一项所述的医药，其中免疫检查点抑制剂包含选自PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4的抑制剂中的至少一种。

[12]根据[11]所述的医药，其中上述免疫检查点抑制剂包含选自PD-1、PD-L1及CTLA-4的抑制剂中的至少一种。

[13]根据[1]至[12]中任一项所述的医药，其中给药是在治疗中显示出协同作用的剂量及给药期间。

[14]根据[1]至[13]中任一项所述的医药，其中给药的对象对拓朴替康具有耐性。

[15]一种治疗方法，其为用于治疗目标疾病(优选癌症)的方法，

且基于对象在治疗中显示出协同作用的有效剂量及给药期间，

组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

[16]一种医药，其用于治疗目标疾病(优选癌症)，组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

[17]一种用于制造医药的、组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药的医药的用途。

[18]一种医药，其组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含铵盐，二氢鞘磷脂为具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

[19]一种医药，其组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

发明效果

本发明的医药通过组合脂质体组合物及免疫检查点抑制剂而进行同时或依次给药，具有对癌症的治疗或预防中的至少一种效果。

并且，本发明的医药具有高的AUC或在血液中的半衰期长，即使少量也可维持强的抗肿瘤活性这样的优异的性质，且通过与免疫检查点抑制剂组合而进行同时或依次给药，具有高于与未成为脂质体制剂的抗癌剂及免疫检查点抑制剂并用的情况的显著的意想不到的肿瘤生长抑制效果。

另外，本发明的医药即使为低剂量也具有肿瘤生长抑制效果，因此对于包含括患者的对象而言，能够进行不仅安全性高而且身体的负担少且便利性也高的理想的治疗。

附图说明

图1表示使用MBT-2皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中的肿瘤体积的测量结果。

图2表示使用MBT-2皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中的肿瘤体积的测量结果。

图3表示使用MBT-2皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中的肿瘤体积的测量结果。

图4表示使用MBT-2皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中的肿瘤体积的测量结果。

图5表示CT26.WT皮下移植荷瘤模型小鼠中的基于抗PD-1抗体并用的药效试验中的存活曲线的结果。

图6表示在使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中肿瘤体积的测量结果。

图7表示在使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中肿瘤体积的测量结果。

图8表示在使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中肿瘤体积的测量结果。

图9表示在使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠的药效试验中肿瘤体积的测量结果。

具体实施方式

以下，对本发明详细说明。

本说明书中，只要没有特别限定，％指表示质量百分比。本说明书中，关于组合物中的各成分的量，当在组合物中存在多种对应于各成分的物质时，只要没有特别限定，则指存在于组合物中的对应的多种物质的总量。

本说明书中，只要没有特别限定，各术语具有以下含义。

“～”表示将其前后所记载的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。

对象包含人及人以外的哺乳动物。作为人以外的哺乳动物，例如可以举出猴子、狗、猫、牛、马、小鼠、大鼠等。

医治可以为可实现所期望的治疗效果、例如抑制症状恶化或延缓的任意的医治及疗法即可，包含恶化速度减慢、恶化速度停止、症状好转、症状治愈或减缓(不论局部减缓或完全缓解均可)、症状中的1个或多个恶化和/或体征的预防、延缓、减轻或停止、或者对象的存活在未进行医治下比预测的寿命得到延长。

医治还包含预防。例如，通过对癌症容易发作或复发或者有发作或复发的风险的对象进行医治，能够预防或能够延缓对象中的癌症的发作或复发。

医治能够包含包括癌症的完全减缓在内的癌症生长的抑制和/或癌症转移的抑制。癌症的生长是指癌症变为更发达的形式。作为用于测量癌症生长的抑制的指标，可以举出癌细胞存活的减少、肿瘤体积或形式的减小(例如，使用计算机断层扫描(CT)、超声检查或其他成像诊断方法来确定)、肿瘤生长延缓、肿瘤脉管结构的破坏、延缓型过敏症皮肤试验成绩的改善、细胞溶解性T-淋巴细胞活性的增加及肿瘤特异性抗原水平的降低等。

本发明中，将肿瘤、恶性肿瘤、癌症、恶性新生物、癌症肿瘤、肉瘤等统一称为“肿瘤”或“癌症”。并且，“肿瘤”或“癌症”包含癌症的治疗后复发的情况。“肿瘤”包含恶性或良性的所有新生物细胞生长及增殖、以及癌变前及癌细胞及其组织。

“有效量”是为了达到所期望的治疗的或预防的结果所需的剂量，包含给药的时间、量。本发明的医药的“有效量”可根据对象(或个体)的疾病症状、年龄、性别及体重以及在对象(或个体)中引起所期望的反应的医药的能力等而有所变动。

“同时给药”是指将组合疗法中的第1疗法和第2疗法以约10分钟、约5分钟或约1分钟以内中的任一个等约15分钟以内的时间间隔给药。将第1疗法和第2疗法同时给药时，既能够将第1疗法及第2疗法含于相同的组合物(例如，包含第1疗法及第2疗法这两者的组合物)中，也能够含于个别的组合物中(例如，将第1疗法含于1个组合物中且将第2疗法含于另一组合物中)。

“依次给药”这一术语是指将组合疗法中的第1疗法及第2疗法以约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟或比其长的时间(1天、2天、3天、1周、2周、3周等)中的任一个等超过约15分钟的时间间隔给药。本发明中，依次给药既能够先将第1疗法给药，也包含先将第2疗法给药的情况。并且，本发明中，依次给药还包含在实施第1疗法之后(规定的时间之后(例如，1周后))实施第2疗法的情况。既能够将第1疗法和第2疗法含于个别的组合物中，也能够将这些含于相同的包装(package)或试剂盒(kit)中，也能够含于不同的包装或试剂盒中。

“在血液中的滞留”是指在给药了脂质体组合物的对象中被包封于脂质体中的状态的药物存在于血液中的性质。

“脂质体的平均粒径”只要没有特别限定，则指使用动态光散射法测量的平均粒径(优选累积(cumulant)平均粒径)。作为使用动态光散射的市售的测量装置，可以举出浓缩粒度分析仪FPAR-1000(Otsuka Electronics Co.,Ltd.制造)、NANOTRAC UPA(NikkisoCo.,Ltd.制造)及Nanosizer(Malvern公司制造)等。也能够利用各制造商的测量装置固有的转换式来计算脂质体的体积平均粒径或数量平均粒径。在测量100nm附近的粒子时，以静态光散射法等无法准确地掌握粒子的分布，优选基于动态光散射法的测量。

(本发明的医药)

以下，对本发明详细说明。

本发明的医药的第一种形式为以下医药，其组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

本发明的医药的第二种形式为以下医药，其组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含铵盐，二氢鞘磷脂为具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

本发明的医药的第三种形式为以下医药，其组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

以下的与本发明有关的说明适用于本发明的医药的第一至第三种形式。并且，本发明包含通过基于以下的与本发明有关的说明的本发明的一种形式的变形和/或组合而产生的方式。

((A)脂质体组合物)

脂质体为由使用脂质的脂质双层膜形成的封闭囊泡，在该封闭囊泡的空间内具有水相(内水相)。内水相中包含水等。脂质体通常以分散于封闭囊泡外的水溶液(外水相)的状态存在。本发明中，脂质体组合物是指包含脂质体及脂质体外所包含的水溶液、成分等的组合物。脂质体可以为单一层状物(single lamellar)(也被称为单层层状物(singlelayer lamellar)或单层状物(unilamellar)为双层膜为一层的结构。)，也可以为多层层状物(multilayer lamellar)(也被称为多层状物(multilamellar)，洋葱形状的多个双层膜的结构，各个层由含水层隔开。)，但本发明中，从医药用途中的安全性及稳定性的观点而言，优选单一层状物的脂质体。“内含”是指对于脂质体而言，药物呈包含于内水相中的形式。

脂质体的平均粒径为10nm～1000nm，优选20nm～500nm，更优选30～300nm，进一步优选30nm～200nm，更进一步优选150nm以下，例如30nm～150nm，尤其优选70～150nm。脂质体优选球状或与其接近的形式。

当期待EPR效应(Enhanced permeability and retention effect(高渗透长滞留效应))时，关于脂质体的大小(平均粒径)，实质上直径优选50～200nm，实质上直径更优选50～150nm，实质上直径进一步优选50～100nm。“实质上”这一术语是指脂质体的个数至少75％在指定的直径的范围内。所述至少75％更优选至少80％，进一步优选至少90％。

构成脂质体的脂质双层的成分(膜成分)包含脂质。作为脂质，能够任意地使用溶解于水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合溶剂中的脂质。作为脂质，具体而言，可以举出磷脂、磷脂以外的脂质、胆固醇类及它们的衍生物等。这些成分可以由一种或多种成分构成。本发明中的脂质体包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分。

作为成为形成脂质双层膜的基材的脂质，可以举出具有两条酰基链的磷脂，例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝胺酸、磷脂酸肌醇、鞘磷脂、心磷脂等天然或合成的磷脂、或者对它们进行氢化而成的物质(例如，氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC))等。

本发明中，作为成为形成脂质双层膜的基材的脂质，使用具有两条酰基链的磷脂、二氢鞘磷脂。通过使用二氢鞘磷脂，能够提高血中的脂质体的滞留性。

通过将二氢鞘磷脂用作脂质体膜的基材，能够提高该脂质体膜的阻隔性并防止内含的药物的漏出。推测这是因为，二氢鞘磷脂所具有的酰胺键具有强的氢键能，通过彼此强烈地相互作用，能够形成牢固且高阻隔性的膜。并且，还与本发明中同时使用的胆固醇的羟基强烈地相互作用，进而能够制造高阻隔性的膜。这成为以具有酯键的HSPC或卵磷脂等通用的脂质无法达到的功能。

并且，相对于具有酰胺键但在酰基链上具有不饱和键的鞘磷脂，全部饱和的二氢鞘磷脂，其熔点高且所形成的膜的运动性低，因此推测相对于鞘磷脂，二氢鞘磷脂也能够制造高阻隔性的膜。

二氢鞘磷脂一般在分子内具有2个长链烷基，可以举出具有2个碳原子数16的长链烷基的二氢鞘磷脂，具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂，具有碳原子数16和碳原子数20～24的长链烷基的二氢鞘磷脂。

作为二氢鞘磷脂，在防止药物从脂质体中的漏出的观点上，优选使用具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的下述化合物。这是因为，碳原子数越多，熔点变得越高，能够制造高阻隔性的脂质体膜。

[化学式编号1]

作为二氢鞘磷脂，例如可以使用将源自天然物的鞘磷脂利用一般的方法还元而得到的二氢鞘磷脂，也可以使用通过合成而得到的二氢鞘磷脂。源自鸡蛋等天然物的二氢鞘磷脂中，一般具有2个碳原子数16的长链烷基者占据大部分，因此在可以得到高纯度的具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂的观点上，优选使用通过化学合成而得到。

脂质体膜的构成成分(构成脂质体的所有脂质)中的二氢鞘磷脂的比率优选30～80摩尔％，更优选40～70摩尔％，进一步优选50～60摩尔％。

作为经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺中的亲水性高分子，例如可以举出聚乙二醇类、聚甘油类、聚丙二醇类、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、合成聚氨基酸等。上述亲水性高分子分别能够单独使用或者组合使用2种以上。

其中，从组合物在血液中滞留的观点而言，优选聚乙二醇类、聚甘油类及聚丙二醇类，更优选聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)、聚丙二醇(PPG)及它们的衍生物。

从通用性及在血液中的滞留的观点而言，进一步优选聚乙二醇(PEG)及其衍生物。作为聚乙二醇(PEG)的衍生物，可以举出甲氧基聚乙二醇等，但没有特别限定。

聚乙二醇类的分子量虽没有特别限定，但为500～10,000道尔顿，优选1,000～7,000道尔顿，更优选2,000～5,000道尔顿。

二酰基磷酯酰乙醇胺中的酰基的碳原子数优选16以上，例如优选碳原子数16以上且30以下，更优选碳原子数16以上且24以下，进一步优选碳原子数20。

作为经聚乙二醇类修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺，例如可以举出1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺-PEG2000(Nippon Oil&Fats GmbH制造)、1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺-PEG5000(Nippon Oil&Fats GmbH制造)及二硬脂酰甘油-PEG2000(Nippon Oil&FatsGmbH制造)等1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。

在脂质体膜的构成成分(构成脂质体的所有脂质)中，经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺的比率优选1～15摩尔％，更优选2～10摩尔％。

作为胆固醇类，能够举出将以环五氢菲(cyclopentahydrophenanthrene)为基本骨架，其一部分或所有的碳经氢化的胆固醇及其衍生物。例如，优选胆固醇。若将脂质体的平均粒径微细化至100nm以下，则有时脂质膜的曲率能够得到提高。在脂质体中排列的膜的应变也变大。为了填平由脂质所引起的膜的应变(膜稳定化效果)，添加胆固醇等为有效。

期待在脂质体中胆固醇的添加通过填平脂质体的膜的间隙等来降低脂质体的膜的流动性。

脂质体膜的构成成分(构成脂质体的脂质)中的胆固醇的比率优选20摩尔％～50摩尔％，更优选30摩尔％～45摩尔％，进一步优选35～43摩尔％。

在脂质体中除了上述成分以外，为了改善在血液中的滞留还可以添加亲水性高分子等、作为膜结构的稳定剂的脂肪酸或二乙酰磷酸酯等、作为抗氧化剂的α-生育酚等。本发明中，优选不包含在医药用途中以静脉注射用途的使用未被认可的分散助剂等添加剂例如表面活性剂等。

(药物)

本发明的脂质体组合物内含药物。

药物的种类虽没有特别限定，但能够使用以下例示的抗癌剂。具体而言，可以举出以下：阿霉素、道诺霉素及表柔比星(epirubicin)等蒽环(anthracycline)系抗癌剂；

顺铂(cisplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin)等顺铂系抗癌剂；

紫杉醇(paclitaxel)及多西他赛(docetaxel)等紫衫烷(taxane)系抗癌剂；

长春新碱(vincristine)及长春碱(vinblastine)等长春花生物碱(vincaalkaloid)系抗癌剂；

博莱霉素(bleomycin)等博来霉素系抗癌剂；

西罗莫司(sirolimus)等西罗莫司系抗癌剂；

拓朴替康(也称为nogitecan)、伊立替康(irinotecan)、卡尼特素(karenitecin)(注册商标)(也称为BNP1350)、依喜替康(exatecan)、勒托替康(lurtotecan)、吉马替康(gimatecan)(也称为ST1481)及贝洛替康(belotecan)(也称为CKD602)等喜树碱系抗癌剂；

长春新碱等长春花生物碱系抗癌剂；以及

伊马替尼(imatinib)(Gleevec(注册商标))、依维莫司(everolimus)(Afinitor(注册商标))、埃罗替尼(erlotinib)(Tarceva(注册商标))、吉非替尼(gefitinib)(Iressa(注册商标))、舒尼替尼(sunitinib)(Sutent(注册商标))、索拉非尼(sorafenib)(Nexavar(注册商标))、达沙替尼(dasatinib)(Sprycel(注册商标))、他米巴罗汀(tamibarotene)(Amnolake(注册商标))、视网酸(tretinoin)(Vesanoid(注册商标))、硼替佐米(bortezomib)(Velcade(注册商标))及拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb(注册商标))等分子靶向药。

在上述的中，优选拓朴替康(也称为nogitecan)、阿霉素、伊立替康或舒尼替尼，更优选拓朴替康。

作为拓朴替康，能够优选地使用

一般名称：盐酸拓朴替康(Nogitecan Hydrochloride)；

化学名称：(+)(-4S)-10[-(dimethylamino)methyl]-4-ethyl-4,9-dihydroxy-1H-pyrano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-3,14(4H,12H)-dionemonohydrochloride((+)(-4S)-10[-(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮单盐酸盐)，例如可以举出商品名Hycamtin(注册商标)。

药物也可以以盐的形式使用。

作为药物的盐，能够举出众所周知的氨基等碱性基、羟基及羧基等酸性基中的盐。

作为碱性基中的盐，例如可以举出与盐酸、氢溴酸、磷酸、硼酸、硝酸及硫酸等无机酸的盐；与甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、草酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、天冬胺酸、三氯乙酸及三氟乙酸等有机羧酸的盐；以及与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、均三甲苯磺酸及萘磺酸等磺酸的盐。

作为酸性基中的盐，例如可以举出与钠及钾等碱金属的盐；与钙及镁等碱土金属的盐；铵盐；以及与三甲胺、三乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二乙基胺、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙基胺、1-二苯羟甲胺及N,N’-二苄基乙二胺等含氮有机碱的盐等。

脂质体组合物中的药物的含量虽没有特别限定，但相对于脂质体组合物，优选0.025～20mg/ml，更优选0.25～10mg/ml。

在从脂质体的释放速率、脂质体内部的渗透压或由沉淀的药物所引起的脂质体形状的观点上，相对于形成脂质体膜的脂质的脂质体包封的药物量以摩尔比优选0.1～1.5，更优选0.2～0.3。

当相对于脂质的药物量的摩尔比过低时，相对于单位用药量的脂质体膜的面积变大，因此药物从脂质体的释放速率变快，提高在血液中的滞留的功能受损。另一方面，当相对于脂质的药物量的摩尔比过高时，脂质体内部的渗透压因药物的溶解量增加而上升，从而脂质体被破坏，或者，当药物在脂质体内部沉淀时，沉淀的固形物生长为较大而脂质体形状变形。

(内水相中的硫酸铵)

本发明中的脂质体的内水相包含硫酸铵。并且，在作为本发明的第一形式的脂质体组合物中，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上，优选0.4以上。内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比更优选0.4以上且1.8以下，进一步优选0.6以上且1.8以下。通过如上述那样设定内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比，能够抑制在血中药物从脂质体中漏出。

若内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比过低，则基于药物中的硫酸盐形成固形物变得不完整，在脂质体内脂质体膜的通过性变高的溶解状态的药物的浓度升高，药物变得容易从脂质体中漏出，损害提高在血液中的滞留的效果。并且，若内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比过高，则脂质体内部的渗透压变高，导致脂质体结构的破坏，因此药物变得容易从脂质体中漏出，损害提高在血液中的滞留的效果。

并且，本发明中，脂质体的内水相中所包含的硫酸离子相对于脂质体组合物整体的硫酸离子的比率(硫酸离子的内水相率)优选至少80％，更优选90％以上，同时，脂质体的内水相中所包含的药物相对于脂质体组合物整体的药物的比率(药物的内水相率)优选至少80％，更优选90％以上。

脂质体中的药物浓度例如能够通过液相色谱/紫外可视吸光度检测法进行测量。并且，脂质体的内水相的硫酸离子浓度例如能够通过离子色谱进行测量。

(外水相的pH)

本发明的脂质体组合物能够包含内含药物的脂质体及分散上述脂质体的水性溶剂(外水相)。外水相的pH优选中性，具体而言，优选pH5.5～8.5左右。

若极度抑制药物的漏出，则还会抑制患部、尤其肿瘤部中的药物的漏出，存在无法得到所期待的药效的情况。

本发明的脂质体组合物兼备抑制在血中的药剂漏出，将足够的量的药物递送至肿瘤部，进而在肿瘤部快速释放药物的惊人的机制。

在肿瘤部，具有高于血中等其他内脏器官铵浓度的性质(例如，Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and medicien,11(2015)1841-1850)，本发明的脂质体组合物在如肿瘤那样谷氨酰胺代谢增强而铵浓度高的(5mmol/L)环境中，有时药物的释放变得非常大。

本发明的脂质体组合物中，药物从铵浓度为1mmol/L以下的血浆中的脂质体中的释放速率在37℃下为20％/24小时以下，药物从铵浓度为4～6mmol/L的血浆中的脂质体中的释放速率为60％以上，更优选药物从铵浓度为1mmol/L以下的血浆中的脂质体中的释放速率在37℃下为15％/24小时以下，药物从铵浓度为4～6mmol/L的血浆中的脂质体中的释放速率为70％以上。

(脂质体组合物的制造方法)

本发明的脂质体组合物的制造方法虽没有特别限定，但作为一例，能够通过以下步骤进行制造：

(a)制备油相；

(b)水相的制备；

(c)基于乳化的脂质体粒子形成；

(d)基于挤出机的整粒；

(e)基于透析的脂质体外水相液的置换；

(f)基于远程装载(remote loading)使药物内含于脂质体粒子中；及

(g)基于透析的外水相药物的去除。

(d)可以进行也可以不进行基于挤出机的整粒。

＜(a)油相的制备＞

在(a)油相的制备中，混合构成脂质体的各成分(经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类)和有机溶剂，并对混合物进行升温而溶解上述成分，因此能够制造油相。

在油相中所使用的有机溶剂虽没有特别限定，但例如能够使用与水任意地混合的水溶性有机溶剂。

作为水溶性有机溶剂，例如可以举出甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇及叔丁醇等醇类、甘油、乙二醇及丙二醇等二醇类、聚乙二醇等聚亚烷基二醇类等。其中，优选醇类。作为醇类，优选选自乙醇、甲醇、2-丙醇及叔丁醇中的至少一种，更优选选自乙醇、2-丙醇及叔丁醇中的至少一种，进一步优选乙醇。

构成脂质体的各成分的浓度虽没有特别限定，但能够适当地进行调节。

＜(b)水相的制备＞

作为水相，能够使用水(蒸馏水、注射用水等)、生理盐水、各种缓冲液或糖类(蔗糖等)的水溶液及它们的混合物(水性溶剂)。本发明中，当通过后述的远程装载使药物内含于脂质体粒子中时，作为水相，优选使用硫酸铵水溶液。

作为缓冲液，并不限定于有机系、无机系，可以优选地使用在接近体液的氢离子浓度附近具有缓冲作用的缓冲液，可以举出磷酸缓冲液、Tris缓冲液(tris buffer)、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液及Good's缓冲液等。脂质体的内水相可以为在制造脂质体时分散脂质体的水溶液，也可以为新添加的水、生理盐水、各种缓冲液或糖类的水溶液及它们的混合物。用作外水相或内水相的水优选不包含杂质(尘土、化学物质等)。

生理盐水是指被调节为与人体等渗的无机盐溶液，可以进一步具有缓冲功能。作为生理盐水，可以举出含有0.9w/v％(质量/体积百分比)的氯化钠的盐水、PBS及Tris缓冲生理盐水等。

本发明中，水相包含外水相及内水相这两者。

本发明中的外水相是指分散脂质体的水溶液。例如在注射剂的情况下，经小玻璃瓶(vial)或预填充式注射器(prefilled syringe)包装而保管的脂质体的分散液中占据脂质体的外侧的溶液成为外水相。并且，关于在利用所附带的分散用液或其他溶解液给药时使用时分散的溶液，也同样地，脂质体的分散液中占据脂质体的外侧的溶液成为外水相。

本发明中的内水相是指将脂质体的脂质双层膜隔开的封闭囊泡内的水相。

＜(c)基于乳化的脂质体粒子形成＞

在乳化步骤中，能够混合油相和水相并搅拌包含脂质的水溶液来进行乳化。通过混合并搅拌脂质溶解于有机溶剂中的油相及水相来进行乳化，可制备油相及水相以O/W型(水包油型)乳化的乳化液。混合后，通过蒸发来去除源自油相的有机溶剂的一部分或全部，从而形成脂质体。或者，油相中的有机溶剂的一部分或全部在搅拌/乳化的过程中蒸发而形成脂质体。

作为搅拌的方法，为了粒子微细化而使用超声波或机械剪切力。并且，为了粒径的均匀化，能够进行通过一定孔径的过滤器的挤出机处理或微流化器(microfluidizer)处理。若使用挤出机等，则能够将次生形成的多囊脂质体(multivesicular liposome)分解而制成单囊脂质体。

乳化步骤只要为乳化的步骤，则并不受限定，但优选施加高剪切力而在包含有机溶剂的乳化步骤中进行微粒化的步骤。高剪切力以乳化机的搅拌叶片的圆周速度来定义，优选5m/s～32m/s，尤其优选20m/s～30m/s。根据需要，能够通过使在乳化步骤中所使用的有机溶剂蒸发(进行去溶剂)来形成脂质体。

制造脂质体时的乳化步骤的液温能够适当地进行调节，优选将混合油相和水相时的液温设为所使用的脂质的相变温度以上，例如当使用相变温度为35～40℃的脂质时，优选设为35℃～70℃。

在乳化步骤中，可以使有机溶剂和水从包含脂质体的水溶液中蒸发。在此所说的蒸发可以将源自油相的有机溶剂和源自水相的水的一部分或全部进行蒸发而强制地去除，源自油相的有机溶剂和源自水相的水的一部分或全部也可以在搅拌/乳化的过程中自然蒸发。

蒸发的方法虽没有特别限定，但例如只要进行通过加热有机溶剂和水而使其蒸发的步骤、在乳化后静置或持续进行缓慢的搅拌的步骤及进行真空脱气的步骤中的至少一个即可。

＜(d)基于挤出机的整粒＞

所得到的脂质体能够使用透析法、过滤法或挤出处理等而使粒径变得均匀。

挤出处理是指通过使脂质体通过具有细孔的过滤器而实施物理剪切力来进行微粒化的步骤。在使脂质体通过时，通过将脂质体分散液及过滤器保温为构成脂质体的膜的相变温度以上的温度，能够迅速地进行微粒化。

另外，基于挤出机的整粒可以进行，也可以不进行。

＜(e)基于透析的脂质体外水相液的置换＞

本发明中，当通过远程装载而使药物内含于脂质体粒子时，可以通过透析来置换脂质体外水相液。作为透析液，能够使用0.05～5质量％的NaCl水溶液，但没有特别限定。通过使用上述透析液对脂质体液进行透析，去除存在于外水相中的硫酸铵，能够得到由透析液置换了外水相的脂质体。

＜(f)基于远程装载法使药物内含于脂质体粒子中＞

本发明中，优选通过远程装载法使药物内含于脂质体粒子中。

本发明中，远程装载法是指制造未内含药物的空白脂质体，通过向脂质体外液中加入药物而向脂质体中导入药物的方法。关于远程装载的方法虽没有特别限定，但优选使用铵盐的方法，更优选使用硫酸铵的方法。

在远程装载法中，加入到外液中的药物主动转移到脂质体中而被吸入脂质体中。作为其驱动力(driving force)，使用溶解度梯度、离子梯度、pH梯度等。例如，有使用隔着脂质体膜而形成的离子梯度将药物导入到脂质体内部的方法。例如，有利用Na⁺/K⁺浓度梯度，通过远程装载法向预先形成的脂质体中添加药物的技术。

在离子梯度的中，一般使用质子浓度梯度，例如可以举出具有脂质体膜的内侧(内水相)pH低于外侧(外水相)pH的pH梯度的方式。具体而言，pH梯度能够通过铵离子梯度的浓度梯度等来形成。

＜(g)基于透析的外水相药物的去除＞

为了去除未包含于脂质体中的药物，内含药物的脂质体液可以进行透析。例如，通过将规定浓度的蔗糖/组胺酸缓冲液用作透析液而对内含药物的脂质体液进行透析，去除存在于外水相中的药物，能够得到由透析液置换了外水相的脂质体组合物。

＜无菌过滤＞

上述中所得到的脂质体组合物优选进行无菌过滤。作为过滤的方法，能够使用中空纤维膜、反渗透膜或膜过滤器(membrance filter)等从包含脂质体的水溶液中去除不需要的物质。本发明中，优选利用具有能够灭菌的孔径的过滤器(优选0.2μm的过滤灭菌过滤器)进行过滤。

为了防止由脂质体的变形所引起的对平均粒径的影响，无菌过滤步骤及后述的无菌填充步骤优选在构成脂质体的脂质的相变温度以下进行。例如，当脂质的相变温度在50℃附近时，优选0～40℃左右，更具体而言，优选在5～30℃左右进行制造。

＜无菌填充＞

无菌过滤之后所得到的脂质体组合物优选作为医疗用途而进行无菌填充。无菌填充的方法能够适用公知的方法。通过向容器中进行无菌填充，能够制备作为医疗用而优选的脂质体组合物。

(脂质体组合物)

本发明的脂质体组合物中，关于给药途径，可以包含医药上可接受的等渗剂、稳定剂、抗氧化剂及pH调节剂中的至少一种。

作为等渗剂虽没有特别限定，但例如可以举出如氯化钠、氯化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等的无机盐类、如甘油、甘露醇、山梨糖醇等的多元醇类、如葡萄糖、果糖、半乳糖或蔗糖等的糖类。

作为稳定剂虽没有特别限定，但例如可以举出如甘油、甘露醇、山梨糖醇、半乳糖或蔗糖等的糖类。

作为抗氧化剂虽没有特别限定，但例如可以举出抗坏血酸、尿酸、生育酚同系物(例如，维生素E、生育酚α、β、γ、δ这4个异构物)半胱胺酸、EDTA(亚乙二胺四乙酸)等。稳定剂及抗氧化剂分别能够单独使用或者组合使用2种以上。

作为pH调节剂，可以举出氢氧化钠、柠檬酸、乙酸、三乙醇胺、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等。

本发明的脂质体组合物可以含有医药上的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、胶原、琼脂、二甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、半乳糖、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、氯化钠、糖类、活体内分解性聚合物、无血清培养基、作为医药添加物而可接受的添加物。

填充本发明的脂质体组合物的容器虽没有特别限定，但优选氧通过性低的材质。例如，可以举出塑料容器、玻璃容器、由将铝箔、铝蒸镀膜、氧化铝蒸镀膜、氧化硅蒸镀膜、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚偏二氯乙烯等作为阻气层而具有的积层膜所形成的背面等，根据需要，也能够通过采用使用着色玻璃、铝箔或铝蒸镀膜等的背面等来遮光。

在填充脂质体组合物的容器中，为了防止由存在于容器内部空间的氧所引起的氧化，优选用氮等惰性气体来置换容器内部空间及药液中的气体。例如，可以举出对注射液进行氮鼓泡(bubbling)并在氮氛围下向容器中进行填充。

作为本发明的脂质体组合物的给药途径，优选肠胃外给药。例如，能够举出滴注等静脉内注射(静注)、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射及鞘内注射。作为给药方法，可以举出基于注射器或滴注的给药。

本发明的脂质体组合物的剂量及给药次数只要根据药物的种类、患者的状态等适当地设定即可，作为有效成分的药物质量，每天一般能够设定在0.01mg/kg～100mg/kg的范围。作为有效成分的药物质量，每次能够设定在2mg～10mg的范围。但是，并不限定于这些剂量。

((B)免疫检查点抑制剂)

“免疫检查点抑制剂”是指通过作用于免疫检查点分子或其配体而抑制基于该免疫检查点分子的信号传递的药剂。作为免疫检查点抑制剂的靶向分子，例如可以举出在T细胞或抗原呈现细胞的表面上呈现的免疫检查点分子及其配体，具体而言，包含PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、PD-L1、PD-L2、BTNL2、B7-H3、B7-H4、CD48、CD80、2B4、BTLA、CD160、CD60、CD86或VISTA等分子，但本发明并不限定于这些。本发明中，免疫检查点抑制剂优选抑制选自程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或对其的配体的PD-L1、PD-L2等及细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)中的至少一个的药剂。PD-1(Programmed death(程序性死亡)-1，CD279)属于对淋巴细胞的活性化信号的增强/抑制起作用的CD28/CTLA-4家族的50～55kDa的I型膜蛋白。并且，PD-L1(别名：B7-H1、CD274)及PD-L2(别名：B7-DC、CD273)为在抗原呈现细胞的表面上表达的PD-1的配体。

免疫检查点抑制剂只要为在T细胞或抗原呈现细胞的表面上呈现的能够抑制免疫检查点分子及其配体的功能的物质即可，能够使用公知的抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体及抗CTLA-4抗体等中的至少一种。抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体等例如能够从Bio X Cell公司等购买。具体而言，免疫检查点抑制剂可以举出尼沃单抗(nivolumab)、派立珠单抗((pembrolizumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、阿替珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、曲美目单抗(tremelimumab)等，但并不限定于这些。并且，作为免疫检查点抑制剂，也能够并用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及抗PD-L2抗体中的至少1个和抗CTLA-4抗体。

本发明的免疫检查点抑制剂能够通过经口或肠胃外给药而给药给对象，但优选肠胃外给药。具体而言，给药方法可以举出注射给药、鼻腔给药，肺部给药，透皮给药等。注射给药例如可以举出静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等。并且，能够根据对象的年龄、症状适当地选择给药方法。作为剂量，例如每一次给药时，对象的体重每1kg能够在0.0001mg至1000mg的范围选择剂量。或者，每个患者能够在0.001mg/body至100000mg/body的范围选择剂量。当本发明的免疫检查点抑制剂与本发明的脂质体组合物组合而进行同时或依次给药时，能够以在治疗中显现出协同作用的方式选择有效剂量及给药期间。但是，本发明中，并不限于这些剂量。

(免疫检查点抑制剂的添加剂等)

关于本发明的免疫检查点抑制剂，为了给药给对象，能够通过除了添加抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体等以外，还添加包括药学上可接受的水溶液等介质、盐、防腐剂、缓冲剂等在内的添加剂来进行制作。详细而言，同样能够适用上述本发明的脂质体组合物的添加剂等。

本发明的医药能够用于治疗具有对基于免疫检查点抑制剂的治疗呈难以治疗的癌症的对象。例如，能够对通过免疫检查点抑制剂的给药未出现所期望的药效的对象进行基于本发明的医药的治疗。

本发明的医药的作用机制尚不明确，但以下推测，但是并不限定于此。推测内含药物的脂质体通过构成存在于肿瘤周围的新生血管的内皮细胞的间隙，并聚集在肿瘤组织中，通过滞留的EPR效应而对肿瘤细胞具有优异的增殖抑制效果。

并且，免疫检查点抑制剂抑制CTLA-4、PD-1或其配体的PD-L1、PD-L2等免疫检查点分子的功能，因此增强对癌症的免疫力，从而能够抑制癌症的恶化或治疗癌症。

另外，本发明的医药组合内含药物的脂质体组合物及免疫检查点抑制剂而进行同时或依次给药，因此与各单剂(内含药物的脂质体组合物或免疫检查点抑制剂)相比，通过将这些单剂并用而具有强的抗肿瘤效果(例如，肿瘤生长抑制效果等)。

本发明的医药为组合内含药物的脂质体组合物及免疫检查点抑制剂而进行同时或依次给药的医药，优选能够用作抗癌剂。

作为本发明的医药的适用对象的癌症的种类虽没有特别限定，但例如可以举出肺癌(尤其是小细胞肺癌)、卵巢癌、小儿实体肿瘤、子宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、宫颈鳞状上皮癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大肠癌、肾细胞癌、非霍奇金淋(Hodgkin)淋巴瘤、尿路上皮癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、成人T细胞白血病、骨髓转移癌、肉瘤、软组织肿瘤、慢性粒单核细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴等。

耐性为癌细胞对抗癌剂显示出抵抗性(耐性)，其指从治疗一开始抗癌剂就没有效果的自然耐性和在持续治疗的期间最初有效果的抗癌剂显示不出效果或效果减弱的状态。具体而言，表示初期对抗癌剂有反应，但在其后的治疗中显示出反应性的降低，或者在细胞在使用抗癌剂的治疗的过程中继续增殖的观点上对抗癌剂显示不出适当的反应的性质。

本发明的医药能够对拓朴替康耐性癌症发挥优异的效果。乳腺癌症耐性蛋白(BCRP)为ATP-结合盒(ABC)转运蛋白家族的成员。该转运蛋白从癌细胞诱导抗癌剂的流出，使细胞内的抗癌剂的浓度减小，因此使这些耐性癌细胞中的药剂的优选的抗癌症效果减小或消失。推测本发明的医药聚集在肿瘤组织中，通过滞留的EPR效应，对肿瘤细胞达到高浓度且长期间的基于拓朴替康的暴露，因此能够对拓朴替康耐性癌症发挥优异的效果。

(肿瘤体积)

本发明中，为了测量肿瘤体积，对成为模型的动物(优选小鼠或大鼠)移植肿瘤。肿瘤体积的增殖抑制取决于所使用的药物、构成脂质体的脂质等的组合及有效量。肿瘤体积的增殖抑制是指能够抑制肿瘤生长、或者能够达到肿瘤静止及实质上或完全的肿瘤消退中的至少一个。

当将本发明的脂质体组合物给药给哺乳动物等对象时，对于模型动物，分配为处理组及对照组(control group)，在肿瘤细胞移植的例如肿瘤细胞生长为100～1000mm以使肿瘤细胞固定之后能够开始给药。

例如，当模型动物为小鼠时，作为本发明的脂质体组合物的评价，能够对各组的小鼠，整体上每天测量体重，直至达到最低体重。

能够用游标卡尺(vernier)等测量肿瘤，直至取样时的最终屠宰、游标卡尺肿瘤达到2000mm³或动物死亡。哺乳动物对象中的肿瘤体积能够使用任意的在该领域中认可的方法来进行测量。

例如，能够通过游标卡尺的测量，使用式：(a×b²)×0.5(式中，“a”为最大直径，“b”为短径的长度)来评价肿瘤体积。并且，在人的情况下，能够通过如计算机断层扫描法(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描等的成像诊断等方法来测量肿瘤体积。

实施例

以下，举出实施例对本发明进行具体的说明，但本发明并不受它们的任何限定。可理解本发明能够由本领域技术人员进行各种变更或修饰。这种变更或修饰只要不脱离本发明的范围，则它们包含于本发明中。只要没有特别记载，实施例中所使用的各种试剂使用了市售品。

SM表示鞘磷脂(Sphingomyelin)(COATSOME NM-10，NOF CORPORATION制造)。

鸡蛋来源DHSM表示通过将源自鸡蛋的SM进行氢化而得到的二氢鞘磷脂(Dihydrosphingomyelin)(对COATSOME NM-10(NOF CORPORATION制造)进行氢化而成的合成品)。该鸡蛋来源DHSM具有2个碳原子数16的烷基链为整体的70～80％且剩余部分包含烷基链长不同的DHSM的混合物。

总合成DHSM表示以包含98％以上的具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的下述化合物的方式通过化学合成而制作的二氢鞘磷脂(Dihydrosphingomyelin)。

[化学式编号2]

作为PEG磷脂(表中，标记为PEG)，使用了SUNBRIGHT DSPE-020CN(NOFCORPORATION制造，以下设为DSPE-PEG)。

作为胆固醇(表中，标记为Chol)，使用了Cholesterol HP(NIPPON FINE CHEMICALCO.,LTD.制造)。

＜比较例1～10＞

(a)油相的制备

关于比较例1，将SM、PEG磷脂、胆固醇分别称取了11.52g、4.32g、4.32g。关于比较例2～10，以成为表1中所记载的比率的方式改变了SM或鸡蛋来源DHSM、PEG磷脂、胆固醇的量。将该脂质与381mL的乙醇进行混合并于65℃下溶解而制成了油相。

(b1)水相1的制备

将硫酸铵25.2g溶解于水1118.5g而制备出水相1。

(b2)水相2的制备

将硫酸铵5.04g溶解于水223.7g而制备出水相2。

(c)基于乳化的脂质体粒子形成

将在(b1)中所制备出的水相1升温至65℃，并添加在(a)中所制备出的油相总量之后，利用精密乳化分散机以圆周速度26m/s混合了60分钟。接着，添加室温的水相2之后，一边在65℃下升温一边以圆周速度0.1m/s持续搅拌，因此使有机溶剂和水蒸发，在溶液浓缩至600mL的时点停止升温和搅拌而停止了蒸发。

(e)基于透析的脂质体外水相液的置换

作为透析液，使用了3.15质量％的NaCl水溶液。使用该透析液，在室温下通过错流过滤(cross flow filtration)对在(c)中所得到的溶液去除存在于外水相中的硫酸铵，得到了由透析液置换了外水相的脂质体。

(f)基于远程装载使拓朴替康内含于脂质体粒子中

向拓朴替康盐酸盐(Biocompounds公司制造)中加入注射用水而设为5mg/mL。另外，一边足够搅拌溶液一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调节为约3并使拓朴替康溶解。向该拓朴替康溶液中以1/1的容积比加入脂质体之后，在60℃下升温了60分钟。

(g)基于透析的外水相拓朴替康的去除

作为透析液，制备出由9.4质量％蔗糖、10mmol/L组胺酸构成的蔗糖/组胺酸缓冲液。使用该透析液，在室温下使用错流过滤对在(f)中所得到的溶液去除存在于外水相中的拓朴替康，得到了由透析液置换了外水相的含有拓朴替康的脂质体。

＜比较例11及12＞

(a)油相的制备

关于比较例11，将鸡蛋来源DHSM及胆固醇分别称取了0.517g及0.233g。关于比较例12，以成为表1中所记载的比率的方式改变了SM及胆固醇的量。为了用DiI(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine Perchlorate(1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚菁高氯酸盐))标记脂质体，称取相对于所有脂质成为0.2mol％的分量的DiI，并将其溶解于乙醇中。向该DiI乙醇溶液中加入乙醇，并以总量计设为1.5mL，混合所秤量的脂质和该有机溶剂，升温至65℃并溶解脂质而制成油相。

(b)水相的制备

将硫酸铵0.9g及蔗糖2.16g溶解于水13.5g而制备出水相。

(c)基于油相与水相混合的脂质体粒子形成

将在(b)中所制备出的水相升温至65℃，用磁力搅拌器进行搅拌(3000rpm)。用加热板将在(a)中所制备出的油相总量升温至65℃，用注射器抽吸油相总量并用加热板升温5分钟。向升温的水相中经30秒滴加油相。

(d)基于挤出机的整粒

通过在70℃的升温下使用挤出机(Mini Extruder，Avanti Polar Lipids公司制造)使在(c)中所得到的溶液依次通过过滤器而进行了整粒。

(e)基于透析的脂质体外水相液的置换

作为透析液，使用了0.09质量％的NaCl水溶液。使用该透析液对在(c)或(d)中所得到的溶液在室温下进行透析，去除存在于外水相中的硫酸铵，得到了由透析液置换了外水相的脂质体。

(f)基于远程装载使拓朴替康内含于脂质体粒子中

向拓朴替康盐酸盐(Biocompounds公司制造)中加入注射用水而设为5mg/mL。另外，一边足够搅拌溶液一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调节为约3并使拓朴替康溶解。向该拓朴替康溶液中以1/1的容积比加入脂质体之后，在60℃下升温了120分钟。

(g)基于透析的外水相拓朴替康的去除

作为透析液，制备出由9.4质量％蔗糖及10mmol/L组胺酸构成的蔗糖/组胺酸缓冲液。使用该透析液对在(f)中所得到的溶液在室温下进行透析，去除存在于外水相中的拓朴替康，得到了由透析液置换了外水相的含有拓朴替康的脂质体。

＜实施例1～8＞

(a)油相的制备

关于实施例1，将鸡蛋来源DHSM、PEG磷脂(SUNBRIGHT DSPE-020CN、NOFCORPORATION制造，以下设为DSPE-PEG)及胆固醇分别称取了11.52g、4.32g及4.32g。关于实施例2～8，以成为表2中所记载的比率的方式改变了DHSM、DSPE-PEG及胆固醇的量。将该脂质与381mL的乙醇进行混合并于65℃下溶解而制成了油相。

(b1)水相1的制备

将硫酸铵25.2g溶解于水1118.5g而制备出水相1。

(b2)水相2的制备

将硫酸铵5.04g溶解于水223.7g而制备出水相2。

(c)基于乳化的脂质体粒子形成

将在(b1)中所制备出的水相1升温至65℃，并添加在(a)中所制备出的油相总量之后，利用精密乳化分散机以圆周速度26m/s混合了60分钟。接着，添加室温的水相2之后，一边于65℃下升温一边以圆周速度0.1m/s持续搅拌，因此使有机溶剂和水蒸发，在溶液浓缩至600mL的时点停止升温和搅拌而停止了蒸发。

(e)基于透析的脂质体外水相液的置换

作为透析液，使用了3.15质量％的NaCl水溶液。使用该透析液，在室温下通过错流过滤对在(c)中所得到的溶液去除存在于外水相中的硫酸铵，得到了由透析液置换了外水相的脂质体。

(f)基于远程装载使拓朴替康内含于脂质体粒子中

(g)基于透析的外水相拓朴替康的去除

作为透析液，制备出由9.4质量％蔗糖、10mmol/L组胺酸构成的蔗糖/组胺酸缓冲液。使用该透析液，在室温下通过错流过滤对在(f)中所得到的溶液去除存在于外水相中的拓朴替康，得到了由透析液置换了外水相的含有拓朴替康的脂质体。

＜实施例9及10＞

(a)油相的制备

关于实施例9，将鸡蛋来源DHSM、DSPE-PEG、胆固醇分别称取了0.412g、0.153g及0.153g。关于实施例10，以成为表2中所记载的比率的方式改变了鸡蛋来源DHSM、DSPE-PEG及胆固醇的量。为了用DiI标记脂质体，称取相对于所有脂质成为0.2mol％的分量的DiI，并将其溶解于乙醇中。向该DiI乙醇溶液中加入乙醇，以总量计设为11.25mL，进而加入了乙酸乙酯3.75mL。混合所秤量的脂质和该有机溶剂，升温至60℃并溶解脂质而制成油相。

(b)水相的制备

将硫酸铵0.9g溶解于水40g而制备出水相。

(c)基于乳化的脂质体粒子形成

将在(b)中所制备出的水相升温至70℃，并添加在(a)中所制备出的油相总量之后(容积比:水相/油相＝8/3)，利用乳化机(Excel Auto homomixe ED-3，NISSEICorporation制造)以3000rpm(rotation per minute(每分钟转速)：1/60s^-1)混合了30分钟。接着，一边于65℃下升温一边以300rpm持续搅拌，因此使有机溶剂和水蒸发，在溶液浓缩至15g的时停止升温和搅拌而停止了蒸发。

(d)基于挤出机的整粒

(e)基于透析的脂质体外水相液的置换

(f)基于远程装载的拓朴替康向脂质体粒子中的内含

(g)基于透析的外水相拓朴替康的去除

作为透析液，制备出由9.4质量％蔗糖、10mmol/L组胺酸构成的蔗糖/组胺酸缓冲液。使用该透析液对在(f)中所得到的溶液在室温下进行透析，去除存在于外水相中的拓朴替康，得到了由透析液置换了外水相的含有拓朴替康的脂质体。

[物性测量及评价]

＜平均粒径＞

本发明中，平均粒径是指通过动态光散射法测量的累积平均粒径。表中所记载的各实施例及比较例的平均粒径为通过带有自动进样器的浓缩粒度分析仪FPAR-1000AS(Otsuka Electronics Co.,Ltd.制造)并利用动态光散射法测量出的累积平均粒径。将测量结果示于表1及表2。

＜拓朴替康浓度测量＞

利用HPLC(高速液相色谱)装置Nexera-i LC-2040C(Shimadzu Corporation制造)测量样品，将定量拓朴替康浓度的结果示于表1及表2。具体的测量方法以下。

在表1及2的脂质体中，除了比较例10以外，脂质体的内水相中所包含的药物相对于脂质体组合物整体的药物的比率为至少95％。比较例10为59％。

脂质体制剂中的拓朴替康量的测量

使用将所制备出的脂质体液溶解于甲醇中并进行过滤器过滤而得到的试样溶液及稀释拓朴替康盐酸盐而制备出的校准曲线标准溶液，通过液相色谱/紫外可视吸光度检测法进行了测量。

内水相拓朴替康浓度为从总水相拓朴替康浓度减去外水相拓朴替康浓度而计算出。

各水相的拓朴替康浓度以以下方式进行了测量。

(总水相拓朴替康浓度)

称取脂质体分散液50μL，并加入甲醇950μL，用Vortex搅拌了1分钟。从该溶液中称取100μL，并加入Mili-Q水900μL，用Vortex搅拌1分钟，将其作为HPLC分析用样品。

(外水相拓朴替康浓度)

称取脂质体分散液50μL，加入9.4wt％蔗糖/10mM组胺酸水溶液450μL并进行稀释。向该稀释液100μL中添加PBS 200μL并进行了倒置混合。对该分散液进行超离心分离(200,000g，20℃，60分钟)，将上清液作为HPLC分析样品。超离心分离机使用了Hitachi,Ltd.制造的himac CP80WX。

a)校准曲线标准液的制备

量取拓朴替康盐酸盐约20mg，将其溶解于20mL的10质量％甲醇水溶液中。向该溶液中加入Mili-Q水而制备拓朴替康盐酸浓度0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0或100.0ppm的溶液，将其作为校准曲线标准液。

b)试样溶液的制备

(1)用MICROMAN(注册商标)称取试样(脂质体制剂溶液)约50μL，并向其中加入了用MICROMAN称取的约950μL的甲醇。此时，振荡约1分钟，以肉眼确认到溶液变为透明。

(2)用MICROMAN称取上述(1)的溶液100μL，并加入了用微量吸管称取的约900μL的Mili-Q水。将该溶液振荡约1分钟之后，进行约1分钟超声波处理，进而振荡了约10秒钟。

(3)将用DISMIC(注册商标)过滤器(孔径0.45μm)过滤上述(2)的溶液而得到的溶液作为试样溶液。

c)测量

通过液相色谱/紫外可视吸光度检测法在以下条件下进行了测量。

测量波长：382nm、管柱：资生堂CAPCELLPAK C18 ACR3μm_3.0mm*75mm

管柱温度：40℃附近的一定温度

移动相A、B均为水/甲醇/三氟乙酸混液，移动相的送液中通过改变移动相A及B的混合比来控制了浓度梯度。

流量：每分钟1.0mL、注入量：10μL、自动进样器温度：25℃附近的一定温度下进行了测量。

＜硫酸离子浓度测量＞

利用离子色谱装置883Basic IC plus(Metrohm公司制造)测量样品，对硫酸离子浓度进行了定量。将测量了硫酸离子相对于拓朴替康的摩尔比的结果示于表1及表2。在表1及表2的脂质体中，脂质体的内水相中所包含的硫酸离子相对于脂质体组合物整体的硫酸离子的比率为至少90％。

内水相硫酸离子浓度为从总水相硫酸离子浓度减去外水相硫酸离子浓度而计算出。各水相的硫酸离子浓度以以下方式进行了测量。

(总水相硫酸离子浓度)

称取脂质体分散液50μL，并加入甲醇950μL，实施15秒超声波处理而进行了混合。从该溶液中称取90μL，并加入注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.制造)810μL，实施30秒超声波处理而进行了混合。向该溶液中添加乙酸乙酯900μL，并足够振荡而将脂质类提取到乙酸乙酯相中。称取适量的水相的溶液，将其用于离子色谱分析。

(外水相硫酸离子浓度)

称取脂质体分散液100μL，加入5％葡萄糖液(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.制造)900μL并进行了稀释。通过超滤对该溶液450μL进行处理，将滤液作为离子色谱分析样品。

离心条件为7400g、5℃、30分钟。离心分离机使用了Hitachi,Ltd.制造的himacCF15RXII。

＜AUC的测量＞

对给药所制备出的含有拓朴替康的脂质体的小鼠(剂量以药物量计为1mg/kg)，在给药后0.25、2、6、24小时进行了采血。血液以800×g离心10分钟，并回收了血浆。对所采取的血浆，使用液相色谱/质谱分析/质谱分析(LC/MS/MS)进行了拓朴替康浓度的定量。根据所得到的拓朴替康浓度变化，使用药物动态分析软体WinNonlin(注册商标)(Certara)计算出单次给药后的无限时间为止的血中浓度-时间曲线下面积(AUC)。AUC的单位为小时×ng/mL(表中，标记为hr*ng/mL)。另外，非专利文献1中所记载的脂质体的AUC被计算为68152小时×ng/mL。

[表1]

[表2]

由表1及表2的结果可知，在包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇作为脂质体膜的构成成分的脂质体组合物中，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的实施例1～10中，AUC的测量值成为200000以上，表示能够达到高的在血液中的滞留。

另一方面，在未使用二氢鞘磷脂的比较例1至8、内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比小于0.36的比较例9及10、未使用经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺的比较例11及12中，AUC的测量值小于200000，表示低于实施例1至10。

(拓朴替康内含脂质体组合物(以下，也称为本发明的脂质体组合物或Lipo)的组成)

拓朴替康盐酸盐20mg

HSPC(注1)95.8mg

MPEG-DSPE(注2)31.9mg

胆固醇31.9mg

硫酸铵20mg

L-组胺酸15.5mg

精制白糖940mg

pH调节剂适量

本发明的脂质体组合物是根据上述实施例进行了制造。确认到内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上。

抗PD-L1抗体使用了Bio X Cell公司制造的InVivoMAb anti-mouse PD-L1。

10mM组胺酸/9.4％蔗糖溶液为在蔗糖9.4g/100mL的水溶液中组胺酸浓度成为10mM的溶液。

从JCRB细胞银行获得了MBT-2细胞。

(在MBT-2皮下移植荷瘤模型小鼠中基于抗PD-L1抗体并用的药效试验)

作为被验物质，使用了抗PD-L1抗体(以下，也称为PD-L1 Ab)及本发明的拓朴替康内含脂质体组合物(以下，也称为Lipo)。PD-L1 Ab的稀释中使用了Bio X Cell公司的InVivoPure pH6.5 Dilution Buffer(以下，也称为Ab稀释液)。Lipo的稀释中使用了10mM组胺酸/9.4％蔗糖溶液(以下，也称为Lipo稀释液)。

将作为小鼠膀胱癌细胞株的MBT-2细胞3×10⁶个移植到雌性C3H/HeN小鼠的侧腹部皮下而形成了皮下肿瘤。将肿瘤体积作为指标，评价了基于单独的PD-L1 Ab、单独的Lipo及PD-L1 Ab与Lipo的并用的皮下肿瘤生长的抑制效果。关于PD-L1 Ab及Ab稀释液，通过腹腔内给药来给药了一周2次、共计3周。关于本发明的脂质体组合物及其稀释液，通过尾静脉给药来给药了一周1次、共计3周。3周的给药结束之后停药，继续进行了3周肿瘤体积的测量。

作为群构成，设为以下：

群1为Ab稀释液和本发明的脂质体组合物的稀释液的给药群、

群2为PD-L1 Ab(10mg/kg)和本发明的脂质体组合物的稀释液的给药群、群3为Ab稀释液和本发明的脂质体组合物(1mg/kg)的给药群、

群4为PD-L1 Ab(10mg/kg)和本发明的脂质体组合物(1mg/kg)的给药群。

群1～3相当于比较例，群4相当于实施例。将群构成及剂量示于表3。在表3中，Lipo表示本发明的脂质体组合物，腹表示腹腔内给药，尾表示尾静脉给药，2次/Wx3表示一周2次给药3周，1次/Wx3表示一周1次给药3周。并且，将各群的每个个体的肿瘤体积的变化示于图1～4。

[表3]

将在各群中直至试验结束日为止维持了完全减缓状态的个体数和完全减缓率(％)示于表4。

[表4]

在群1及群3中，不存在维持了完全减缓状态的个体。在群2中，9个个体中的1个个体维持了完全减缓。在群4中，9个个体中的4个个体维持了完全减缓。

根据以上结果，在本发明的脂质体组合物与PD-L1 Ab并用时，相对于单独的本发明的脂质体组合物或PD-L1 Ab的效果，显示出优异的增殖抑制效果。并且，可知本发明的脂质体组合物与PD-L1 Ab的并用显示出可观察到完全减缓的状态这样的显著且意想不到的效果。

(在CT26.WT皮下移植荷瘤模型小鼠中基于抗PD-1抗体并用的药效试验)

抗PD-1抗体使用了Bio X Cell公司的InVivoMAb anti-mouse PD-1。10mM组胺酸/9.4％蔗糖溶液为以在蔗糖9.4g/100mL的水溶液中组胺酸浓度成为10mM的方式制备的溶液。从ATCC公司获得了CT26.WT细胞。

作为被验物质，使用了抗PD-1抗体(以下，也称为PD-1Ab)及本发明的拓朴替康内含脂质体组合物(Lipo)。PD-1Ab的稀释中使用了Bio X Cell公司的InVivoPure pH7.0Dilution Buffer(以下，也称为Ab稀释液)。Lipo的稀释中使用了10mM组胺酸/9.4％蔗糖溶液(以下，也称为Lipo稀释液)。

将作为小鼠大肠癌细胞株的CT26.WT细胞1×10⁶个移植到雌性BALB/cCrSlc小鼠的侧腹部皮下而形成了皮下肿瘤。从移植13天后，实施基于单独的PD-1Ab、单独的Lipo及PD-1Ab与Lipo的并用的处理，并评价了皮下肿瘤生长的抑制所伴随的存活时间的延长效果。关于PD-1Ab及Ab稀释液，通过腹腔内给药来给药了一周2次、共计3周。关于本发明的脂质体组合物(Lipo)及其稀释液，通过尾静脉给药来给药了一周1次、共计3周。3周的给药结束之后停药，继续进行了3周肿瘤体积的测量。对于肿瘤体积超过2,000mm³的小鼠，从动物伦理的观点而言，进行了安乐死处理。进行基于Kaplan-Meier(卡本-麦尔)法的存活分析，通过Log-Rank(对数秩)测试判定了结。

作为群构成，设为以下：

群1为Ab稀释液和Lipo稀释液的给药群、

群2为PD-1Ab(10mg/kg)和Lipo稀释液的给药群、

群3为Ab稀释液和本发明的脂质体组合物(2mg/kg)的给药群、

群4为PD-1Ab(10mg/kg)和本发明的脂质体组合物(2mg/kg)的给药群。

群1～3相当于比较例，群4相当于实施例。将群构成及剂量示于表5。在表5中，Lipo表示本发明的脂质体组合物，腹表示腹腔内给药，尾表示尾静脉给药，2次/Wx3表示一周2次给药3周，1次/Wx3表示一周1次给药3周。并且，将各群的存活曲线示于图5。

[表5]

将各群中的从移植时开始的中位数存活时间、试验结束日的存活率(％)示于表6，将Log-Rank测试的结果示于表7。当p值小于0.05时，判断为在统计学上有显著差异。

[表6]

群	存活时间中位数	结束日的存活率
			1	27	0％
2	31	28.6％
			3	39.5	0％
4	ND＞52	75％

[表7]

比较群	P值	显著差异
			1vs2	P＝0.1227	无
1vs3	P＝0.0001	有
			1vs4	P＝0.0001	有
2vs3	P＝0.8334	无
			2vs4	P＝0.0281	有
3vs4	P＝0.0020	有

群4相对于比较例的群1～3的各群，显示出在统计学上显著的存活时间的延长效果，在试验结束日75％的个体存活。

根据以上结果明确了本发明的脂质体组合物在与PD-1Ab并用时，相对于单独的本发明的脂质体组合物或单独的PD-1Ab的效果，显示出优异的存活延长效果。

(在EMT6模型小鼠中基于抗CTLA-4抗体并用的药效试验)

抗CTLA-4抗体使用了Bio X Cell公司的InVivoMAb anti-mouse CTLA-4。

作为被验物质，使用了抗CTLA-4抗体(以下，也称为CTLA-4Ab)及本发明的拓朴替康内含脂质体组合物(Lipo)。CTLA-4Ab的稀释中使用了Bio X Cell公司的InVivoPurepH7.0 Dilution Buffer(以下，也称为Ab稀释液)。Lipo的稀释中使用了OtsukaElectronics Co.,Ltd.的5％糖液(以下，也称为Lipo稀释液)。

将作为小鼠乳腺癌细胞株的EMT6细胞2.25×10⁶个移植到雌性Balb/c小鼠的侧腹部皮下而形成了皮下肿瘤。将肿瘤体积作为指标，评价了基于单独的CTLA-4Ab、单独的Lipo及CTLA-4Ab与Lipo的并用的皮下肿瘤生长的抑制效果。关于CTLA-4Ab及Ab稀释液，通过腹腔内给药来给药了一周2次、共计3周。关于本发明的脂质体组合物及其稀释液，通过尾静脉给药来给药了一周1次、共计3周。3周的给药结束之后停药，继续进行了肿瘤体积的测量。

作为群构成，设为以下：

群1为Ab稀释液和本发明的脂质体组合物的稀释液的给药群、

群2为CTLA-4Ab(10mg/kg)和本发明的脂质体组合物的稀释液的给药群、

群3为Ab稀释液和本发明的脂质体组合物(4mg/kg)的给药群、

群4为CTLA-4Ab(10mg/kg)和本发明的脂质体组合物(4mg/kg)的给药群。

群1～3相当于比较例，群4相当于实施例。将群构成及剂量示于表8。在表8中，Lipo表示本发明的脂质体组合物，腹表示腹腔内给药，尾表示尾静脉给药，2次/Wx3表示一周2次给药3周，1次/Wx3表示一周1次给药3周。并且，将各群的每个个体的肿瘤体积的变化示于图6～9。

[表8]

根据以上结果显示出，本发明的医药为了进行对癌症的预防或治疗而非常有效，具有意想不到的肿瘤生长抑制效果。

尤其，能够提供基于组合内含拓朴替康的脂质体组合物与作为免疫检查点抑制剂的抑制PD-1、PD-L1及CTLA-4的至少1个抗体而给药的新的医药。

产业上的可利用性

本发明的医药作为用于对癌症的预防或治疗的医药而有效。本发明的给药方法作为用于对癌症的预防或治疗的医药的给药方法而有效。另外，本发明的治疗方法作为用于对癌症的预防或治疗的治疗方法而有效。

Claims

1.一种医药，其组合(A)作为脂质体膜的构成成分包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类，且内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.36以上的脂质体组合物及(B)免疫检查点抑制剂并进行同时或依次给药。

2.根据权利要求1所述的医药，其中，

药物是拓朴替康或其盐、阿霉素或其盐、伊立替康或其盐、舒尼替尼或其盐。

3.根据权利要求1或2所述的医药，其中，

内水相硫酸离子相对于总水相药物的摩尔比为0.6以上且1.8以下。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的医药，其中，

经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺为经聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的医药，其中，

脂质体膜的构成成分中的经亲水性高分子修饰的二酰基磷酯酰乙醇胺的比率为2～10摩尔％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的脂质体组合物，其中，

脂质体膜的构成成分中的胆固醇类的比率为35～43摩尔％。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的医药，其粒径为150nm以下。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的医药，其中，

外水相的pH为5.5～8.5。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的医药，其中，

二氢鞘磷脂为包含碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂，内含药剂为拓朴替康或其盐。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的医药，其中，

药物从铵浓度为1mmol/L以下的血浆中的脂质体中的释放速率在37℃下为20％/24小时以下，药物从铵浓度为4～6mmol/L的血浆中的脂质体中的释放速率在37℃下为60％/24小时以上。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的医药，其中，

所述免疫检查点抑制剂包含选自PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4的抑制剂中的至少一种。

12.根据权利要求11所述的医药，其中，

所述免疫检查点抑制剂包含选自PD-1、PD-L1及CTLA-4的抑制剂中的至少一种。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的医药，其中，

所述给药是在治疗中显示出协同作用的剂量及给药期间。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的医药，其中，

所述给药的对象对拓朴替康具有耐性。