JPWO2019222545A5 - - Google Patents

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JPWO2019222545A5
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本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に、詳細に示されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用されている例証的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および付随の図面（本明細書では、「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」や「図（ＦＩＧ．）」とも呼ばれる）を参照して、得られる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ゲノム内の目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能な１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための方法であって、
１組のｇＲＮＡを設計することであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの、目的の前記ゲノム領域内の複数の標的部位中の異なる標的部位から少なくとも３０塩基離れている、前記複数の標的部位からの標的部位にハイブリダイズ可能である、設計すること
を含む方法。
（項目２）
前記標的部位が、前記異なる標的部位から多くても１７０塩基離れている、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記１組のｇＲＮＡ中の少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域に相補的である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記１組のｇＲＮＡ中の少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域に部分的に相補的である、項目１に記載の方法。
（項目５）
目的の前記ゲノム領域に部分的に相補的な前記１組のｇＲＮＡ中の前記少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域と比較して１、２、３、４、５個または５個よりも多いミスマッチを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１７～約４２塩基の長さである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基の長さである、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基のガイド配列を含み、約２２～約８０塩基の長さの定常領域をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの前記ガイド配列が、目的の前記ゲノム領域に選択的にハイブリダイズする、項目８に記載の方法。
（項目１０）
最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１００塩基の長さである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のコード領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
目的の前記ゲノム領域が、前記遺伝子のエクソンを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のファミリーを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子の前記ファミリーからの１つまたは複数のコード領域を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
目的の前記ゲノム領域が、前記ゲノムの非コード領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記非コード領域が、調節エレメントである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記調節エレメントが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
目的の前記ゲノム領域が、５ｋｂ超、１０ｋｂ超、１５ｋｂ超、２０ｋｂ超、５０ｋｂ超、または１００ｋｂ超にわたる、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記１組のｇＲＮＡが、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のｇＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つのｇＲＮＡが、改変を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記改変が、２’－Ｏ－Ｃ １～４ アルキル、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、２’－Ｏ－Ｃ １～３ アルキル－Ｏ－Ｃ １～３ アルキル、例えば、２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－アラビノシル（２’－アラビノ）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノシル（２’－Ｆ－アラビノ）ヌクレオチド、２’－ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’－非ロックド核酸（ＵＬＮＡ）ヌクレオチド、Ｌ形態の糖（Ｌ－糖）および４’－チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記改変が、ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、アルキルホスホネートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合改変である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記改変が、２－チオウラシル（２－チオＵ）、２－チオシトシン（２－チオＣ）、４－チオウラシル（４－チオＵ）、６－チオグアニン（６－チオＧ）、２－アミノアデニン（２－アミノＡ）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（５－メチルＣ）、５－メチルウラシル（５－メチルＵ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（５－アリルＵ）、５－アリルシトシン（５－アリルＣ）、５－アミノアリルウラシル（５－アミノアリルＵ）、５－アミノアリル－シトシン（５－アミノアリルＣ）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（ＵＮＡ）、イソグアニン（イソＧ）、イソシトシン（イソＣ）および５－メチル－２－ピリミジンからなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記複数の標的部位の標的部位が、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ヌクレアーゼが、不活性化Ｃａｓ９である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記１組のｇＲＮＡが、細胞において目的の前記ゲノム領域内の遺伝子をノックアウトするように設計される、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が、ヒト初代細胞、ヒト不死化細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、マウス胚性幹細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記設計することが、コンピュータによって行われる、項目１に記載の方法。
（項目３１）
１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、項目１から２９のいずれか一項に記載の方法によって設計されている、キット。
（項目３２）
ゲノム内の目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能な１組のｇＲＮＡを含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、
前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの、目的の前記ゲノム領域内の複数の標的部位中の異なる標的部位から少なくとも３０塩基離れている、前記複数の標的部位からの標的部位にハイブリダイズ可能である、
キット。
（項目３３）
前記標的部位が、前記異なる標的部位から多くても１７０塩基離れている、項目３２に記載のキット。
（項目３４）
前記１組のｇＲＮＡが、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のｇＲＮＡを含む、項目３２に記載のキット。
（項目３５）
Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択される１つまたは複数のヌクレアーゼをさらに含む、項目３２に記載のキット。
（項目３６）
複数の組のｇＲＮＡをさらに含み、各組のｇＲＮＡが、前記ゲノム内の異なる目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能である、項目３２に記載のキット。
（項目３７）
前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、少なくとも１つのｇＲＮＡにカップリングされている、項目３５に記載のキット。
（項目３８）
ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を選択するための方法であって、
前記遺伝子にハイブリダイズする最初の組のガイドＲＮＡの複数のガイドＲＮＡの各々について、前記ゲノム内の潜在的ガイドＲＮＡハイブリダイズ部位に対するミスマッチの数を数え上げることによってオフターゲット値を計算すること
を含む方法。
（項目３９）
前記複数のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、１００塩基の長さである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記複数のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの約２０塩基が、目的のゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズする、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ミスマッチの前記数が、０である、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
ミスマッチの前記数が、１である、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
ミスマッチの前記数が、２である、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
ミスマッチの前記数が、３である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記計算することが、前記最初の組のガイドＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのミスマッチの前記数の総和を得る、項目３８に記載の方法。
（項目４６）
前記計算することが、ミスマッチの前記数をシャードへと組織化する、項目３８に記載の方法。
（項目４７）
前記オフターゲット値が、参照ゲノムに対して計算される、項目３８に記載の方法。
（項目４８）
前記参照ゲノムが、ヒト参照ゲノムである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記参照ゲノムが、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓからなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記オフターゲット値が、参照ゲノムの１，０００，０００ｂｐにわたり、または参照ゲノムにわたり決定される、項目３８に記載の方法。
（項目５１）
前記オフターゲット値が、ヌクレアーゼの結合部位のデータベースに対して計算される、項目３８に記載の方法。
（項目５２）
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記データベースが、前記ヌクレアーゼの１０，０００を超えるか、５０，０００を超えるか、１００，０００を超えるか、１５０，０００を超えるか、２００，０００を超えるか、２５０，０００を超えるか、３００，０００を超えるか、３５０，０００を超えるか、４００，０００を超えるか、４５０，０００を超えるか、５００，０００を超えるか、５５０，０００を超えるか、６００，０００を超えるか、６５０，０００を超えるか、７００，０００を超えるか、７５０，０００を超えるか、８００，０００を超えるか、８５０，０００を超えるか、９００，０００を超えるか、９５０，０００を超えるか、または１，０００，０００を超える結合部位を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
ヌクレアーゼ結合部位の前記データベースが、前記ヌクレアーゼの２５００万を超えるか、５０００万を超えるか、７５００万を超えるか、１億を超えるか、１億２５００万を超えるか、１億５０００万を超えるか、１億７５００万を超えるか、２億を超えるか、２億２５００万を超えるか、２億５０００万を超えるか、２億７５００万を超えるか、または３億を超える結合部位を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
ミスマッチの前記数を数え上げることによって前記オフターゲット値を前記計算することが、コンピュータによって行われる、項目３８に記載の方法。
（項目５７）
ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法であって、
前記遺伝子の複数の転写物から転写物を選択することと、
最初の組のｇＲＮＡを識別することであって、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、選択された前記転写物の前記遺伝子内の異なる標的部位にハイブリダイズする、識別することと
を含む方法。
（項目５８）
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１７～約４２塩基の長さである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基の長さである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基のガイド配列および約２２～約８０塩基の長さの定常領域を含む、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの前記ガイド配列が、標的部位に選択的にハイブリダイズする、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１００塩基の長さである、項目５７に記載の方法。
（項目６３）
選択された前記転写物が、データベース中の前記遺伝子の最も豊富な転写物である、項目５７に記載の方法。
（項目６４）
選択された前記転写物が、前記遺伝子の前記複数の転写物の最も長い転写物である、項目５７に記載の方法。
（項目６５）
選択された前記転写物中に存在する前記遺伝子内のコード領域を選択することをさらに含む、項目５７に記載の方法。
（項目６６）
選択された前記コード領域が、初期位置エクソンである、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記初期位置エクソンが、前記遺伝子の前半に存在する、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記初期位置エクソンが、前記遺伝子の第１、第２、第３、第４、第５または第６エクソンである、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
選択された前記コード領域が、前記遺伝子の前記複数の転写物の中で最も豊富な転写物の選択されたエクソンである、項目６５に記載の方法。
（項目７０）
選択された前記エクソンが、前記複数の転写物において１つまたは複数の他のエクソンよりも長い、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
選択された前記エクソンが、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐまたは少なくとも７５ｂｐである、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
選択された前記エクソンが、前記複数の転写物において長さおよび豊富さの両方に基づいて選択される、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
前記最初の組のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲット値を決定することをさらに含む、項目５７に記載の方法。
（項目７４）
前記オフターゲット値が、前記種の前記ゲノムにわたり決定される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ゲノムが、前記種の参照ゲノムである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記種の前記参照ゲノムが、染色体および位置が決定されていないコンティグを含有する完全な参照アセンブリである、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記ゲノム内の複数の標的部位と比較して前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡについてのミスマッチの数を数え上げることによって前記オフターゲット値を決定することをさらに含む、項目７３に記載の方法。
（項目７８）
前記複数の標的部位が、前記ゲノムにわたる全ての可能なＣａｓヌクレアーゼ結合部位を含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記複数の標的部位が、少なくとも１０００個、１０，０００個、１００，０００個、２００，０００個、３００，０００個、４００，０００個、５００，０００個、６００，０００個、７００，０００個、８００，０００個、９００，０００個、１，０００，０００個、２，０００，０００個または３，０００，０００個の標的部位を含む、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記複数の標的部位が、少なくとも１００，０００，０００個、２００，０００，０００個、３００，０００，０００個、４００，０００，０００個、５００，０００，０００個、６００，０００，０００個、７００，０００，０００個、８００，０００，０００個、９００，０００，０００個、１，０００，０００，０００個または１，５００，０００，０００個の標的部位を含む、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
前記数え上げることが、０、１、２、３または４個のミスマッチの数を有する前記最初の組のガイドＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲットハイブリダイゼーション領域を決定することを含む、項目７７に記載の方法。
（項目８２）
前記異なる標的部位の標的部位が、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、項目５７に記載の方法。
（項目８３）
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧである、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
前記ヌクレアーゼが、不活性化Ｃａｓである、項目８２に記載の方法。
（項目８６）
前記種が、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓからなる群から選択される、項目５７に記載の方法。
（項目８７）
オンターゲット効率閾値およびオフターゲット閾値に基づいて前記最初の組のｇＲＮＡからガイドＲＮＡのサブセットを選択することをさらに含む、項目５７に記載の方法。
（項目８８）
前記最初の組のｇＲＮＡの各ガイドＲＮＡについての前記オンターゲット効率閾値が、アジマススコアを計算することによって決定される、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記アジマススコアが、０．４を超える、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記識別することが、前記アジマススコアの閾値およびオフターゲットハイブリダイズ値に基づく、項目８８に記載の方法。
（項目９１）
前記最初の組のｇＲＮＡが、細胞において前記遺伝子をノックアウトする、項目５７に記載の方法。
（項目９２）
前記最初の組のｇＲＮＡが、細胞において前記遺伝子に突然変異をノックインする、項目５７に記載の方法。
（項目９３）
前記細胞が、ヒト初代細胞、ヒト不死化細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、マウス胚性幹細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群から選択される、項目９１または９２に記載の方法。
（項目９４）
前記最初の組のガイドＲＮＡ中の少なくとも１つのガイドＲＮＡからの少なくとも１つのヌクレオチドが、改変を含む、項目５７に記載の方法。
（項目９５）
前記改変が、２’－Ｏ－Ｃ １～４ アルキル、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、２’－Ｏ－Ｃ １～３ アルキル－Ｏ－Ｃ １～３ アルキル、例えば、２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－アラビノシル（２’－アラビノ）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノシル（２’－Ｆ－アラビノ）ヌクレオチド、２’－ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’－非ロックド核酸（ＵＬＮＡ）ヌクレオチド、Ｌ形態の糖（Ｌ－糖）および４’－チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記改変が、ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、アルキルホスホネートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合改変である、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記改変が、２－チオウラシル（２－チオＵ）、２－チオシトシン（２－チオＣ）、４－チオウラシル（４－チオＵ）、６－チオグアニン（６－チオＧ）、２－アミノアデニン（２－アミノＡ）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（５－メチルＣ）、５－メチルウラシル（５－メチルＵ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（５－アリルＵ）、５－アリルシトシン（５－アリルＣ）、５－アミノアリルウラシル（５－アミノアリルＵ）、５－アミノアリル－シトシン（５－アミノアリルＣ）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（ＵＮＡ）、イソグアニン（イソＧ）、イソシトシン（イソＣ）および５－メチル－２－ピリミジンからなる群から選択される、項目９４に記載の方法。
（項目９８）
前記選択することおよび前記識別することが、コンピュータによって行われる、項目５７に記載の方法。
（項目９９）
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、前記最初の組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である、項目５７に記載の方法。
（項目１００）
１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、項目５７から９８のいずれか一項に記載の方法によって設計されている、キット。
（項目１０１）
目的のゲノム領域を編集するための方法であって、目的の前記ゲノム領域を含む細胞の集団を、（ｉ）目的の前記ゲノム領域をターゲティングする少なくとも２つのｇＲＮＡを含む１組のｇＲＮＡ、および（ｉｉ）ヌクレアーゼと接触させることであって、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む前記１組のｇＲＮＡの編集効率が、前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各々の個々の編集効率よりも高い、接触させることを含む方法。
（項目１０２）
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のコード領域である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記コード領域が、前記遺伝子のエクソンである、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
目的の前記ゲノム領域が、ゲノム内の非コード領域である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０５）
前記非コード領域が、調節エレメントである、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記調節エレメントが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントである、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０９）
前記ドナーポリヌクレオチドが、前記細胞の野生型遺伝子型と比較して点突然変異、対立遺伝子、タグまたは外因性エクソンを含む、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記編集効率が、前記接触させることの後の非野生型遺伝子型を含む、細胞の前記集団中の細胞の割合である、項目１０１に記載の方法。
（項目１１１）
前記非野生型遺伝子型が、遺伝子のノックアウトである、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記非野生型遺伝子型が、野生型遺伝子型と比較した挿入または欠失である、項目１１０に記載の方法。
（項目１１３）
細胞の前記集団中の前記細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記非野生型遺伝子型を含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１４）
前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各ｇＲＮＡが、目的の前記ゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズする、項目１０１に記載の方法。
（項目１１５）
前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各ｇＲＮＡが、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
複数の目的のゲノム領域をターゲティングする複数の組のｇＲＮＡを導入することをさらに含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１１７）
前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、細胞の前記集団の複数のサブセットの各々と接触される、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、前記複数の目的のゲノム領域内の異なる目的のゲノム領域をターゲティングする、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも５０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）
細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも７０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１２１）
細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも９０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１２２）
表現型について細胞の前記集団をスクリーニングすることをさらに含む、項目１０１に記載の方法。 The novel features of the invention are shown in detail in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the invention is the following detailed description showing exemplary embodiments in which the principles of the invention are utilized, and accompanying drawings (in the present specification, "Figure"). Or "fig.").
In certain embodiments, for example, the following are provided:
(Item 1)
A method for identifying a set of guide RNAs (gRNAs) that can hybridize to a region of interest in the genome.
By designing a set of gRNAs, each gRNA in the set of gRNAs is a plurality of targets within the genomic region of interest for at least one other guide RNA from the set of guide RNAs. Design to be capable of hybridizing to target sites from the plurality of target sites that are at least 30 bases away from different target sites within the site.
How to include.
(Item 2)
The method of item 1, wherein the target site is at most 170 bases away from the different target sites.
(Item 3)
The method of item 1, wherein the sequence of at least one gRNA in the set of gRNAs is complementary to the genomic region of interest.
(Item 4)
The method of item 1, wherein the sequence of at least one gRNA in the set of gRNAs is partially complementary to the genomic region of interest.
(Item 5)
The sequence of at least one gRNA in the set of gRNAs that is partially complementary to the genomic region of interest is 1, 2, 3, 4, 5 or 5 as compared to the genomic region of interest. The method of item 4, which comprises more mismatches.
(Item 6)
The method of item 1, wherein each gRNA in the set of gRNAs is about 17 to about 42 bases in length.
(Item 7)
The method of item 2, wherein each gRNA in the set of gRNAs is about 20 bases long.
(Item 8)
The method of item 1, wherein each gRNA in the set of gRNAs comprises a guide sequence of about 20 bases and further comprises a constant region having a length of about 22-80 bases.
(Item 9)
8. The method of item 8, wherein the guide sequence of each gRNA in the set of gRNA selectively hybridizes to the genomic region of interest.
(Item 10)
The method of item 1, wherein each gRNA in the first set of gRNAs is about 100 bases long.
(Item 11)
The method according to item 1, wherein the genomic region of interest comprises a coding region of a gene.
(Item 12)
11. The method of item 11, wherein the genomic region of interest comprises an exon of the gene.
(Item 13)
The method of item 1, wherein the genomic region of interest comprises a family of genes.
(Item 14)
13. The method of item 13, wherein the genomic region of interest comprises one or more coding regions from said family of genes.
(Item 15)
The method of item 1, wherein the genomic region of interest comprises a non-coding region of the genome.
(Item 16)
15. The method of item 15, wherein the non-coding region is a regulatory element.
(Item 17)
16. The method of item 16, wherein the regulatory element is a cis-regulatory element or a trans-regulatory element.
(Item 18)
17. The method of item 17, wherein the cis-regulatory element is selected from the group consisting of promoters, enhancers and silencers.
(Item 19)
13. The method of item 13, wherein the genomic region of interest spans more than 5 kb, more than 10 kb, more than 15 kb, more than 20 kb, more than 50 kb, or more than 100 kb.
(Item 20)
The method of item 1, wherein the set of gRNAs comprises at least 2, at least 3 or at least 4 gRNAs.
(Item 21)
The method of item 1, wherein at least one gRNA from the set of guide RNAs comprises a modification.
(Item 22)
The modification is 2'-OC 1 to 4 alkyl, for example, 2'-O-methyl (2'-OMe), 2'-deoxy (2'-H), 2'-OC 1-3. Alkyl- OC 1-3 alkyls such as 2'-methoxyethyl (2'-MOE), 2'-fluoro (2'-F), 2'-amino (2'-NH2), 2'-arabinosyl. (2'-arabino) nucleotides, 2'-F-arabinosyl (2'-F-arabino) nucleotides, 2'-locked nucleic acid (LNA) nucleotides, 2'-unlocked nucleic acid (ULNA) nucleotides, L-form sugars ( 21. The method of item 21, selected from the group consisting of L-sugar) and 4'-thioribosyl nucleotides.
(Item 23)
21. The method of item 21, wherein the modification is an internucleotide binding modification selected from the group consisting of phosphorothioate, phosphonocarboxylate, thiophosphonocarboxylate, alkylphosphonate and phosphorodithioate.
(Item 24)
The modifications include 2-thiouracil (2-thioU), 2-thiocytosine (2-thioC), 4-thiouracil (4-thioU), 6-thioguanine (6-thioG), 2-aminoadenin (2). -Amino A), 2-aminopurine, pseudouracil, hypoxanthin, 7-deazaguanine, 7-deaza-8-azaguanine, 7-deazaadenine, 7-deaza-8-azaadenine, 5-methylcytosine (5-methylC) , 5-Methyl uracil (5-Methyl U), 5-Hydroxymethylcytosine, 5-Hydroxymethyl uracil, 5,6-dehydro uracil, 5-Propinyl uracil, 5-Propinyl uracil, 5-Ethynyl cytosine, 5-Ethynyl uracil , 5-allyl uracil (5-allyl U), 5-allyl cytosine (5-allyl C), 5-aminoallyl uracil (5-aminoallyl U), 5-aminoallyl-cytosine (5-aminoallyl C), debase nucleotides , Z base, P base, unstructured nucleic acid (UNA), isoguanine (iso G), isocytosine (iso C) and 5-methyl-2-pyrimidin selected from the group according to item 21.
(Item 25)
The method of item 1, wherein the target site of the plurality of target sites is adjacent to the PAM site of a nuclease selected from the group consisting of Cas9, C2c1, C2c3 and Cpf1.
(Item 26)
25. The method of item 25, wherein the nuclease is Cas9.
(Item 27)
25. The method of item 25, wherein the nuclease is Inactivated Cas9.
(Item 28)
25. The method of item 25, wherein the set of gRNAs is designed to knock out genes within said genomic region of interest in a cell.
(Item 29)
28. The method of item 28, wherein the cells are selected from the group consisting of human primary cells, human immortalized cells, human-induced pluripotent stem cells, mouse embryonic stem cells and Chinese hamster ovary cells.
(Item 30)
The method of item 1, wherein the design is performed by a computer.
(Item 31)
A kit comprising a set of guide RNAs (gRNAs), wherein each gRNA in the set of gRNAs is designed by the method according to any one of items 1 to 29.
(Item 32)
A kit containing a set of gRNAs capable of hybridizing to a target genomic region in the genome, wherein each gRNA in the set of gRNAs is:
Target sites from the plurality of target sites of at least one other guide RNA from the set of guide RNAs, at least 30 bases away from different target sites in the plurality of target sites within the genomic region of interest. Can be hybridized to
kit.
(Item 33)
32. The kit of item 32, wherein the target site is at most 170 bases away from the different target sites.
(Item 34)
32. The kit of item 32, wherein the set of gRNAs comprises at least 2, at least 3 or at least 4 gRNAs.
(Item 35)
32. The kit of item 32, further comprising one or more nucleases selected from the group consisting of Cas9, C2c1, C2c3 and Cpf1.
(Item 36)
32. The kit of item 32, further comprising a plurality of sets of gRNAs, wherein each set of gRNAs is capable of hybridizing to different genomic regions of interest within said genome.
(Item 37)
35. The kit of item 35, wherein the one or more nucleases are coupled to at least one gRNA.
(Item 38)
A method for selecting one or more guide RNAs (gRNAs) to hybridize to a gene in a particular genome.
Calculating off-target values by counting the number of mismatches to potential guide RNA hybridization sites in the genome for each of the plurality of guide RNAs of the first set of guide RNAs that hybridize to the gene.
How to include.
(Item 39)
38. The method of item 38, wherein each gRNA in the plurality of gRNAs is 100 bases long.
(Item 40)
39. The method of item 39, wherein about 20 bases of each gRNA in the plurality of gRNAs hybridize to different target sites within the genomic region of interest.
(Item 41)
38. The method of item 38, wherein the number of mismatches is 0.
(Item 42)
38. The method of item 38, wherein the number of mismatches is 1.
(Item 43)
39. The method of item 39, wherein the number of mismatches is 2.
(Item 44)
43. The method of item 43, wherein the number of mismatches is 3.
(Item 45)
38. The method of item 38, wherein the calculation yields the sum of the numbers of mismatches for each gRNA of the first set of guide RNAs.
(Item 46)
38. The method of item 38, wherein the calculation organizes the number of mismatches into shards.
(Item 47)
38. The method of item 38, wherein the off-target value is calculated for the reference genome.
(Item 48)
47. The method of item 47, wherein the reference genome is a human reference genome.
(Item 49)
47. The method of item 47, wherein the reference genome is selected from the group consisting of Homo sapiens, Mus musculus, Cricetulus zebrafish, Rattus Novegicus, Slender danios and Caenorhabditis elegans.
(Item 50)
38. The method of item 38, wherein the off-target value is determined over 1,000,000 bp of the reference genome or across the reference genome.
(Item 51)
38. The method of item 38, wherein the off-target value is calculated against a database of nuclease binding sites.
(Item 52)
51. The method of item 51, wherein the nuclease is selected from the group consisting of Cas9, C2c1, C2c3 and Cpf1.
(Item 53)
52. The method of item 52, wherein the nuclease is Cas9.
(Item 54)
The database has more than 10,000, more than 50,000, more than 100,000, more than 150,000, more than 200,000, more than 250,000, 300 of the nuclease. Over 000, over 350,000, over 400,000, over 450,000, over 500,000, over 550,000, over 600,000, 650, More than 000, more than 700,000, more than 750,000, more than 800,000, more than 850,000, more than 900,000, more than 950,000, or 1, 51. The method of item 51, comprising a binding site greater than 1,000,000.
(Item 55)
Whether the database of nuclease binding sites exceeds 25 million, 50 million, 75 million, 100 million, 125 million, or 150 million of the nuclease. Items containing more than 175 million, more than 200 million, more than 225 million, more than 250 million, more than 275 million, or more than 300 million binding sites 51.
(Item 56)
38. The method of item 38, wherein the calculation of the off-target value by counting the number of mismatches is performed by a computer.
(Item 57)
A method for designing one or more guide RNAs (gRNAs) to hybridize to genes in certain genomes.
Selecting a transcript from multiple transcripts of the gene,
Identifying the first set of gRNAs, wherein each gRNA in the first set of gRNAs hybridizes to a different target site within the gene of the selected transcript.
How to include.
(Item 58)
58. The method of item 57, wherein each gRNA in the first set of gRNAs is about 17 to about 42 bases in length.
(Item 59)
58. The method of item 58, wherein each gRNA in the first set of gRNAs is about 20 bases long.
(Item 60)
58. The method of item 57, wherein each gRNA in the first set of gRNAs comprises a guide sequence of about 20 bases and a constant region having a length of about 22-80 bases.
(Item 61)
60. The method of item 60, wherein the guide sequence of each gRNA in the first set of gRNAs selectively hybridizes to a target site.
(Item 62)
58. The method of item 57, wherein each gRNA in the first set of gRNAs is about 100 bases long.
(Item 63)
58. The method of item 57, wherein the selected transcript is the most abundant transcript of the gene in the database.
(Item 64)
58. The method of item 57, wherein the selected transcript is the longest transcript of said plurality of transcripts of the gene.
(Item 65)
58. The method of item 57, further comprising selecting the coding region within the gene present in the selected transcript.
(Item 66)
65. The method of item 65, wherein the selected code region is an initial position exon.
(Item 67)
66. The method of item 66, wherein the initial position exon is present in the first half of the gene.
(Item 68)
66. The method of item 66, wherein the initial position exon is a first, second, third, fourth, fifth or sixth exon of the gene.
(Item 69)
65. The method of item 65, wherein the selected coding region is the selected exon of the most abundant transcript of the plurality of transcripts of the gene.
(Item 70)
69. The method of item 69, wherein the selected exon is longer than one or more other exons in the transcript.
(Item 71)
6. The method of item 69, wherein the selected exon is at least 50 bp, at least 55 bp, at least 60 bp, at least 65 bp, at least 70 bp or at least 75 bp.
(Item 72)
69. The method of item 69, wherein the selected exons are selected based on both length and abundance in the plurality of transcripts.
(Item 73)
58. The method of item 57, further comprising determining off-target values for each gRNA of the first set of gRNAs.
(Item 74)
73. The method of item 73, wherein the off-target value is determined across the genome of the species.
(Item 75)
74. The method of item 74, wherein the genome is the reference genome of the species.
(Item 76)
75. The method of item 75, wherein the reference genome of the species is a complete reference assembly containing a chromosome and unpositioned contig.
(Item 77)
73. The method of item 73, further comprising determining the off-target value by counting the number of mismatches for each gRNA in the first set of gRNAs as compared to a plurality of target sites in the genome.
(Item 78)
77. The method of item 77, wherein the plurality of target sites comprises all possible Casnuclease binding sites across the genome.
(Item 79)
The plurality of target sites are at least 1000, 10,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000. 77, the method of item 77, comprising 800,000, 900,000, 1,000,000, 2,000,000 or 3,000,000 target sites.
(Item 80)
The plurality of target sites are at least 100,000,000, 200,000,000, 300,000,000, 400,000, 500,000,000, 600,000,000, 77. The method of item 77, comprising 700,000,000, 800,000,000, 900,000,000, 1,000,000,000,000 or 1,500,000,000 target sites. ..
(Item 81)
77. Item 77, wherein the counting comprises determining an off-target hybridization region for each gRNA of the first set of guide RNAs having a number of 0, 1, 2, 3 or 4 mismatches. Method.
(Item 82)
58. The method of item 57, wherein the target site of the different target site is flanking the PAM site of a nuclease selected from the group consisting of Cas9, C2c1, C2c3 and Cpf1.
(Item 83)
82. The method of item 82, wherein the nuclease is Cas9.
(Item 84)
82. The method of item 82, wherein the PAM site is NGG.
(Item 85)
82. The method of item 82, wherein the nuclease is an inactivated Cas.
(Item 86)
58. The method of item 57, wherein the species is selected from the group consisting of Homo sapiens, Mus musculus, Cricetulus zebrafish, Rattus Novegicus, Slender danios and Caenorhabditis elegans.
(Item 87)
58. The method of item 57, further comprising selecting a subset of guide RNAs from the first set of gRNAs based on on-target efficiency thresholds and off-target thresholds.
(Item 88)
87. The method of item 87, wherein the on-target efficiency threshold for each guide RNA of the first set of gRNAs is determined by calculating an azimuth score.
(Item 89)
88. The method of item 88, wherein the azimuth score is greater than 0.4.
(Item 90)
88. The method of item 88, wherein the identification is based on the threshold of the azimus score and the off-target hybridization value.
(Item 91)
57. The method of item 57, wherein the first set of gRNAs knocks out the gene in a cell.
(Item 92)
58. The method of item 57, wherein the first set of gRNAs knocks a mutation into the gene in a cell.
(Item 93)
Item 91 or 92. The method of item 91 or 92, wherein the cells are selected from the group consisting of human primary cells, human immortalized cells, human-induced pluripotent stem cells, mouse embryonic stem cells and Chinese hamster ovary cells.
(Item 94)
58. The method of item 57, wherein at least one nucleotide from at least one guide RNA in the first set of guide RNAs comprises a modification.
(Item 95)
The modification is 2'-OC 1 to 4 alkyl, for example, 2'-O-methyl (2'-OMe), 2'-deoxy (2'-H), 2'-OC 1-3. Alkyl- OC 1-3 alkyls such as 2'-methoxyethyl (2'-MOE), 2'-fluoro (2'-F), 2'-amino (2'-NH2), 2'-arabinosyl. (2'-arabino) nucleotides, 2'-F-arabinosyl (2'-F-arabino) nucleotides, 2'-locked nucleic acid (LNA) nucleotides, 2'-unlocked nucleic acid (ULNA) nucleotides, L-form sugars ( The method of item 94, which is selected from the group consisting of L-sugar) and 4'-thioribosyl nucleotides.
(Item 96)
94. The method of item 94, wherein the modification is an internucleotide binding modification selected from the group consisting of phosphorothioate, phosphonocarboxylate, thiophosphonocarboxylate, alkylphosphonate and phosphorodithioate.
(Item 97)
The modifications include 2-thiouracil (2-thioU), 2-thiocytosine (2-thioC), 4-thiouracil (4-thioU), 6-thioguanine (6-thioG), 2-aminoadenin (2). -Amino A), 2-aminopurine, pseudouracil, hypoxanthin, 7-deazaguanine, 7-deaza-8-azaguanine, 7-deazaadenine, 7-deaza-8-azaadenine, 5-methylcytosine (5-methylC) , 5-Methyl uracil (5-Methyl U), 5-Hydroxymethylcytosine, 5-Hydroxymethyl uracil, 5,6-dehydro uracil, 5-Propinyl uracil, 5-Propinyl uracil, 5-Ethynyl cytosine, 5-Ethynyl uracil , 5-allyl uracil (5-allyl U), 5-allyl cytosine (5-allyl C), 5-aminoallyl uracil (5-aminoallyl U), 5-aminoallyl-cytosine (5-aminoallyl C), debase nucleotides , Z base, P base, unstructured nucleic acid (UNA), isoguanine (iso G), isocytosine (iso C) and 5-methyl-2-pyrimidin selected from the group of item 94.
(Item 98)
58. The method of item 57, wherein the selection and identification is performed by a computer.
(Item 99)
Item 57, wherein each gRNA in the first set of gRNAs is capable of hybridizing to a target site that is at least 30 bases away from the target site of at least one other guide RNA from the first set of guide RNAs. The method described.
(Item 100)
A kit comprising a set of guide RNAs (gRNAs), wherein each gRNA in the set of gRNAs is designed by the method according to any one of items 57-98.
(Item 101)
A method for editing a genomic region of interest, a set of gRNAs comprising a population of cells containing said genomic region of interest, (i) at least two gRNAs targeting said genomic region of interest, and (. ii) A method comprising contacting with a nuclease, wherein the editing efficiency of the set of gRNAs containing at least two gRNAs is higher than the individual editing efficiency of each of the at least two gRNAs.
(Item 102)
The method according to item 101, wherein the genomic region of interest is a coding region of a gene.
(Item 103)
102. The method of item 102, wherein the coding region is an exon of the gene.
(Item 104)
The method of item 101, wherein the genomic region of interest is a non-coding region within the genome.
(Item 105)
104. The method of item 104, wherein the non-coding region is a regulatory element.
(Item 106)
105. The method of item 105, wherein the regulatory element is a cis-regulatory element or a trans-regulatory element.
(Item 107)
106. The method of item 106, wherein the cis-regulatory element is selected from the group consisting of promoters, enhancers and silencers.
(Item 108)
101. The method of item 101, further comprising contacting the cells with a donor polynucleotide.
(Item 109)
108. The method of item 108, wherein the donor polynucleotide comprises a point mutation, allele, tag or exogenous exon as compared to the wild-type genotype of the cell.
(Item 110)
10. The method of item 101, wherein the editing efficiency is the proportion of cells in the population of cells, including the non-wild type genotype after contacting.
(Item 111)
110. The method of item 110, wherein the non-wild-type genotype is a gene knockout.
(Item 112)
110. The method of item 110, wherein the non-wild-type genotype is an insertion or deletion compared to a wild-type genotype.
(Item 113)
110. The method of item 110, wherein at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% of the cells in the population of cells comprises the non-wild type genotype.
(Item 114)
10. The method of item 101, wherein each gRNA of at least two gRNAs hybridizes to a different target site within said genomic region of interest.
(Item 115)
The method of item 114, wherein each gRNA of the at least two gRNAs is capable of hybridizing to a target site at least 30 bases away from the target site of at least one other guide RNA from the set of guide RNAs. ..
(Item 116)
101. The method of item 101, further comprising introducing a plurality of sets of gRNAs targeting a plurality of genomic regions of interest.
(Item 117)
The method of item 116, wherein each of the plurality of sets of gRNAs is contacted with each of the plurality of subsets of the population of cells.
(Item 118)
17. The method of item 117, wherein each of the plurality of sets of gRNAs targets different genomic regions of interest within the plurality of genomic regions of interest.
(Item 119)
An item in which at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% of the cells in at least 50% of the plurality of subsets of the population of cells comprises a non-wild type genotype. The method according to 117.
(Item 120)
An item in which at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% of the cells in at least 70% of the plurality of subsets of the population of cells comprises a non-wild type genotype. The method according to 117.
(Item 121)
An item in which at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% of the cells in at least 90% of the plurality of subsets of the population of cells comprises a non-wild type genotype. The method according to 117.
(Item 122)
101. The method of item 101, further comprising screening the population of cells for a phenotype.

Claims (42)

目的のゲノム領域内の遺伝子を編集するための方法であって、前記方法は、 A method for editing a gene in a genomic region of interest, wherein the method is:
（ａ）目的の前記ゲノム領域内の遺伝子を含む細胞を、１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させることであって、前記１組のｇＲＮＡは、 (A) A cell containing a gene in the genomic region of interest is brought into contact with a set of guide RNAs (gRNAs), wherein the set of gRNAs is:
（ｉ）目的の前記ゲノム領域の第１の部位とハイブリダイズするように構成されており、ヌクレアーゼと相互作用して第１の二本鎖切断部位を生成することができる、第１のｇＲＮＡ； (I) A first gRNA that is configured to hybridize to a first site of said genomic region of interest and is capable of interacting with a nuclease to generate a first double-strand break site;
（ｉｉ）目的の前記ゲノム領域の第２の部位とハイブリダイズするように構成されており、前記ヌクレアーゼと相互作用して第２の二本鎖切断部位を生成することができる、第２のｇＲＮＡ、および (Ii) A second gRNA that is configured to hybridize to a second site of the genomic region of interest and is capable of interacting with the nuclease to generate a second double-strand break site. ,and
（ｉｉｉ）目的の前記ゲノム領域の第３の部位とハイブリダイズするように構成されており、前記ヌクレアーゼと相互作用して第３の二本鎖切断部位を生成することができる、第３のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡおよび第３のｇＲＮＡは異なっており、各々、互いに少なくとも１０塩基対離れている部位にハイブリダイズする、こと、ならびに (Iii) A third gRNA that is configured to hybridize to a third site of the genomic region of interest and is capable of interacting with the nuclease to generate a third double-stranded cleavage site. The first gRNA, the second gRNA and the third gRNA are different and each hybridize to a site at least 10 base pairs apart from each other, and
（ｂ）前記１組のｇＲＮＡおよび前記ヌクレアーゼを前記細胞に導入して、前記遺伝子を改変する編集を生成することであって、前記１組のｇＲＮＡの編集効率が、前記ｇＲＮＡの各々の個々の編集効率よりも高い、こと (B) Introducing the set of gRNAs and the nuclease into the cells to generate edits that modify the genes, wherein the editing efficiency of the set of gRNAs is individual for each of the gRNAs. Higher than editing efficiency
を含む方法。How to include. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡが、前記遺伝子にハイブリダイズするように構成されている、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the first gRNA, the second gRNA and the third gRNA are configured to hybridize to the gene. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡが、前記遺伝子のエクソンにハイブリダイズするように構成されている、請求項２に記載の方法。 The method of claim 2, wherein the first gRNA, the second gRNA and the third gRNA are configured to hybridize to an exon of the gene. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡまたは前記第３のｇＲＮＡが、調節エレメントにハイブリダイズするように構成されている、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the first gRNA, the second gRNA or the third gRNA is configured to hybridize to a regulatory element. 前記調節エレメントが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントである、請求項４に記載の方法。 The method of claim 4, wherein the regulatory element is a cis-regulatory element or a trans-regulatory element. 前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。 The method of claim 5, wherein the cis-regulatory element is selected from the group consisting of promoters, enhancers and silencers. 前記細胞にドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, further comprising introducing a donor polynucleotide into the cell. 前記ドナーポリヌクレオチドが、前記細胞の野生型遺伝子型と比較して点突然変異、対立遺伝子、タグまたは外因性エクソンを含む、請求項７に記載の方法。 7. The method of claim 7, wherein the donor polynucleotide comprises a point mutation, allele, tag or exogenous exon as compared to the wild-type genotype of the cell. 前記編集が、前記遺伝子のノックアウトである、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the edit is a knockout of the gene. 前記ノックアウトが、前記遺伝子の機能を除去する、請求項９に記載の方法。 The method of claim 9, wherein the knockout removes the function of the gene. 前記編集が、野生型遺伝子型と比較した挿入または欠失である、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the edit is an insertion or deletion compared to a wild-type genotype. 前記編集が、挿入であり、前記遺伝子の機能を改善する、請求項１１に記載の方法。 11. The method of claim 11, wherein the edit is an insertion and improves the function of the gene. 前記第１、第２および第３のｇＲＮＡの各々が、前記１組のｇＲＮＡからの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である、請求項１に記載の方法。 1 according to claim 1, wherein each of the first, second and third gRNAs is capable of hybridizing to a target site that is at least 30 bases away from the target site of the other guide RNA from the set of gRNAs. the method of. 複数の目的のゲノム領域をターゲティングする複数の組のｇＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, further comprising introducing a plurality of sets of gRNAs targeting a plurality of genomic regions of interest. 前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、細胞の前記集団の複数のサブセットの各々と接触される、請求項１４に記載の方法。 14. The method of claim 14, wherein each of the plurality of sets of gRNAs is contacted with each of the plurality of subsets of the population of cells. 前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、前記複数の目的のゲノム領域内の異なる目的のゲノム領域をターゲティングする、請求項１５に記載の方法。 15. The method of claim 15, wherein each of the plurality of sets of gRNAs targets different genomic regions of interest within the plurality of genomic regions of interest. 表現型について細胞の前記集団をスクリーニングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, further comprising screening the population of cells for a phenotype. 前記最初の組のｇＲＮＡの各ガイドＲＮＡについてのオンターゲット効率閾値が、０．４を超えるアジマススコアである、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the on-target efficiency threshold for each guide RNA of the first set of gRNAs is an azimuth score greater than 0.4. 前記接触させることが、前記細胞をリボ核タンパク質複合体としての前記１組のｇＲＮＡでトランスフェクションすることを含む、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein contacting comprises transfecting the cells with the set of gRNAs as a ribonucleoprotein complex. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３またはＣｐｆ１である、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the nuclease is Cas9, C2c1, C2c3 or Cpf1. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the nuclease is a Cas9 nuclease. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のガイドＲＮＡが、５’末端改変および３’末端改変を含む、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the first gRNA, the second gRNA and the third guide RNA comprise a 5'end modification and a 3'end modification. 前記５’末端改変が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および２’－Ｏ－メチル糖改変を含み、前記３’末端改変が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および２’－Ｏ－メチル糖改変を含む、請求項２２に記載の方法。 22. The method described. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡが、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡが、５’末端改変および３’末端改変を含み、前記５’末端改変が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および２’－Ｏ－メチル糖改変を含み、前記３’末端改変が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および２’－Ｏ－メチル糖改変を含み、前記第１の結合部位と前記第２の結合部位とは、３０～８０塩基対離れており、前記第２の結合部位と前記第３の結合部位とは、３０～８０塩基対離れており、前記第１の結合部位、前記第２の結合部位および前記第３の結合部位は、遺伝子のエクソンにあり、前記エクソンは、前記遺伝子の前半内にあり、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９を含み、前記編集は欠失であり、前記欠失は、少なくとも１０塩基対である、請求項１に記載の方法。 The first gRNA, the second gRNA and the third gRNA are a single guide RNA (sgRNA), and the first gRNA, the second gRNA and the third gRNA are 5 The'terminal modification and the 3'end modification include a phosphorothioate internucleotide bond and a 2'-O-methyl sugar modification, and the 3'end modification comprises a phosphorothioate internucleotide bond and a 2'-O. -Containing a methyl sugar modification, the first binding site and the second binding site are separated by 30 to 80 base pairs, and the second binding site and the third binding site are 30 to 30 to. They are 80 base pairs apart, the first binding site, the second binding site and the third binding site are in the exson of the gene, the exson is in the first half of the gene, and the nuclease is. , Cas9, wherein the edit is a deletion, the deletion being at least 10 base pairs, according to claim 1. 前記第１のｇＲＮＡが、前記第２のｇＲＮＡにハイブリダイズ可能な結合部位から３０～８０塩基対離れている結合部位にハイブリダイズするように構成されており、前記第２のｇＲＮＡが、前記第３のｇＲＮＡにハイブリダイズ可能な結合部位から３０～８０塩基対離れている結合部位にハイブリダイズするように構成されている、請求項１に記載の方法。 The first gRNA is configured to hybridize to a binding site that is 30 to 80 base pairs away from the binding site capable of hybridizing to the second gRNA, and the second gRNA is the second gRNA. The method according to claim 1, wherein the method is configured to hybridize to a binding site that is 30 to 80 base pairs away from the binding site capable of hybridizing to the gRNA of 3. 細胞内の目的のゲノム領域内の遺伝子を改変するためのシステムであって、前記システムは、 A system for modifying a gene in a gene of interest in a cell, said system.
（ａ）（ｉ）目的のゲノム領域とハイブリダイズするように構成されており、ヌクレアーゼと相互作用して第１の二本鎖切断部位を生成することができる、第１のｇＲＮＡ、（ｉｉ）目的の前記ゲノム領域とハイブリダイズするように構成されており、前記ヌクレアーゼと相互作用して第２の二本鎖切断部位を生成することができる、第２のｇＲＮＡ、および（ｉｉｉ）目的の前記ゲノム領域とハイブリダイズするように構成されており、前記ヌクレアーゼと相互作用して第３の二本鎖切断部位を生成する、第３のガイドＲＮＡを含む１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡは異なっており、それぞれ、前記遺伝子内の互いに少なくとも１０塩基対離れている部位にハイブリダイズする、１組のｇＲＮＡ、ならびに (A) A first gRNA, (ii) that is configured to hybridize to a genomic region of interest and is capable of interacting with a nuclease to generate a first double-strand break site. A second gRNA that is configured to hybridize to the genomic region of interest and is capable of interacting with the nuclease to generate a second double-strand break site, and (iii) the said of interest. A set of guide RNAs (gRNAs) containing a third guide RNA that is configured to hybridize to the genomic region and interacts with the nuclease to generate a third double-strand break site. , The first gRNA, the second gRNA and the third gRNA are different, a set of gRNAs that hybridize to sites in the gene that are at least 10 base pairs apart from each other, and a set of gRNAs, respectively.
（ｂ）ヌクレアーゼ (B) Nuclease
を含むシステム。System including. 前記第１のｇＲＮＡが、第１の複合体を形成するように前記ヌクレアーゼと複合体を形成し、前記第２のｇＲＮＡが、第２の複合体を形成するように前記ヌクレアーゼと複合体を形成し、前記第３のｇＲＮＡが、第３の複合体を形成するように前記ヌクレアーゼと複合体を形成する、請求項２６に記載のシステム。 The first gRNA forms a complex with the nuclease to form a first complex, and the second gRNA forms a complex with the nuclease to form a second complex. 26. The system of claim 26, wherein the third gRNA forms a complex with the nuclease to form a third complex. 所望の遺伝子編集配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含み、ＤＮＡ修復プロセスによる目的の前記ゲノム領域における前記二本鎖切断部位の修復が、前記所望の遺伝子編集配列の組込みをもたらす、請求項２６に記載のシステム。 26. Claim 26, further comprising a donor polynucleotide comprising the desired gene editing sequence, wherein repair of the double-stranded cleavage site in the genomic region of interest by a DNA repair process results in integration of the desired gene editing sequence. System. 前記所望の遺伝子編集配列が、前記細胞の野生型遺伝子型と比較して点突然変異、対立遺伝子、タグまたは外因性エクソンを含む、請求項２８に記載のシステム。 28. The system of claim 28, wherein the desired gene editing sequence comprises a point mutation, allele, tag or exogenous exon as compared to the wild-type genotype of the cell. 目的の別のゲノム領域にハイブリダイズするように構成されている別の組のｇＲＮＡをさらに含み、目的の前記ゲノム領域と目的の前記別のゲノム領域とは異なっており、前記細胞が、前記別の組のｇＲＮＡと接触される、請求項２６に記載のシステム。 It further comprises another set of gRNAs that are configured to hybridize to another genomic region of interest, and the said genomic region of interest is different from the other genomic region of interest. 26. The system of claim 26, which is contacted with a set of gRNAs. 目的の別のゲノム領域にハイブリダイズするように構成されている別の組のｇＲＮＡをさらに含み、別の細胞が、前記別の組のｇＲＮＡと接触され、前記細胞と前記別の細胞とは異なっており、前記１組のｇＲＮＡと前記別の組のｇＲＮＡとは異なっており、目的の前記ゲノム領域と目的の前記別のゲノム領域とは異なっている、請求項２６に記載のシステム。 It further comprises another set of gRNAs that are configured to hybridize to another set of genomic regions of interest, and another cell is contacted with the other set of gRNAs, which makes the cell different from the other cell. 26. The system of claim 26, wherein the set of gRNAs is different from the other set of gRNAs, and the genomic region of interest is different from the other genomic region of interest. 前記システムが、前記細胞をリボ核タンパク質複合体としての前記１組のｇＲＮＡでトランスフェクション可能なトランスフェクション試薬をさらに含む、請求項２６に記載のシステム。 26. The system of claim 26, wherein the system further comprises a transfection reagent capable of transfecting the cells with the set of gRNAs as a ribonuclear protein complex. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡが、５’末端改変および３’末端改変を含む、請求項２６に記載のシステム。 26. The system of claim 26, wherein the first gRNA, the second gRNA and the third gRNA comprise a 5'end modification and a 3'end modification. 前記５’末端改変が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および２’－Ｏ－メチル糖改変を含み、前記３’末端改変が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および２’－Ｏ－メチル糖改変を含む、請求項３３に記載のシステム。 33. The 5'end modification comprises a phosphorothioate internucleotide bond and a 2'-O-methyl sugar modification, and the 3'end modification comprises a phosphorothioate internucleotide bond and a 2'-O-methyl sugar modification. The system described. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃ２ｃ１ヌクレアーゼ、Ｃ２ｃ３ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含む、請求項２６に記載のシステム。 26. The system of claim 26, wherein the nuclease comprises a Cas9 nuclease, a C2c1 nuclease, a C2c3 nuclease or a Cpf1 nuclease. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３５に記載のシステム。 35. The system of claim 35, wherein the nuclease is a Cas9 nuclease. 前記編集が、欠失、インデルまたはノックアウトである、請求項２６に記載のシステム。 26. The system of claim 26, wherein the edit is a deletion, indel or knockout. 前記第１のｇＲＮＡが、前記第２のｇＲＮＡにハイブリダイズ可能な結合部位から３０～１５０塩基対離れている結合部位にハイブリダイズするように構成されており、前記第２のｇＲＮＡが、前記第３のｇＲＮＡにハイブリダイズ可能な結合部位から３０～１５０塩基対離れている結合部位にハイブリダイズするように構成されている、請求項２６に記載のシステム。 The first gRNA is configured to hybridize to a binding site 30 to 150 base pairs away from the binding site capable of hybridizing to the second gRNA, and the second gRNA is the second gRNA. 26. The system of claim 26, which is configured to hybridize to a binding site 30 to 150 base pairs away from the binding site capable of hybridizing to the gRNA of 3. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡが、前記遺伝子内のエクソンにハイブリダイズするように構成されている、請求項３８に記載のシステム。 38. The system of claim 38, wherein the first gRNA, the second gRNA and the third gRNA are configured to hybridize to exons within the gene. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡまたは前記第３のｇＲＮＡが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントにハイブリダイズするように構成されている、請求項２６に記載のシステム。 26. The system of claim 26, wherein the first gRNA, the second gRNA or the third gRNA is configured to hybridize to a cis-regulatory element or a trans-regulatory element. 前記結合部位を少なくとも３０塩基対離して配置することにより前記結合部位を３０塩基対未満離して配置するのと比較して編集効率の増加がもたらされる、請求項２６に記載のシステム。 26. The system of claim 26, wherein placing the binding sites at least 30 base pairs apart results in an increase in editing efficiency as compared to placing the binding sites less than 30 base pairs apart. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡおよび前記第３のｇＲＮＡの組み合わせでの使用が、前記遺伝子を改変するための前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡまたは前記第３のｇＲＮＡのいずれか１つの個々の使用よりも高い編集効率をもたらす、請求項２６に記載のシステム。 Use in combination of the first gRNA, the second gRNA and the third gRNA can be either the first gRNA, the second gRNA or the third gRNA for modifying the gene. 26. The system of claim 26, which provides higher editing efficiency than one individual use.
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