JPWO2019177118A1 - 多能性幹細胞から各種細胞への段階的製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
多能性幹細胞を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供する。本態様において、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程は好ましくは、
(1)多能性幹細胞をGSK3β阻害剤を含む培地で培養して未分節中胚葉細胞培養物を得る工程、および
(2)未分節中胚葉細胞培養物を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養して体節細胞培養物を得る工程を含んでいる。
体節細胞をGSK3β阻害剤およびBMPを含む培地にて培養する工程(5)を含む、体節細胞から真皮節細胞を製造する方法を提供する。本態様において、体節細胞は多能性幹細胞から上記方法により製造された細胞であっても、他の方法で得られたものであってもよい。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から真皮節細胞を製造する方法が提供される。真皮節細胞は既知方法にてさらに分化誘導して真皮細胞を得ることができる。本態様で得られる真皮節細胞をさらに分化誘導する工程を含む、真皮細胞を製造する方法もまた、本願に含まれる。
(7−1)硬節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程、および
(7−2)工程(7−1)で得られた細胞培養物を、BMPおよびTGFβを含む培地で培養する工程を含む、硬節細胞から靱帯節細胞を製造する方法を提供する。本態様において、硬節細胞は、本願の方法により体節細胞から製造されたものであってよく、この場合に体節細胞は本願の方法により多能性幹細胞から製造されたものであってよい。すなわち、本態様において、体節細胞から靱帯節細胞を製造する方法、および多能性幹細胞から靱帯節細胞を製造する方法が提供される。帯節細胞は既知方法にて更に分化誘導して腱、靱帯を製造することができる。本態様により靱帯節細胞を得、得られた靱帯節細胞を更に分化誘導して腱や靱帯を製造する方法もまた本願に含まれる。
体節細胞をFGFを含む培地で培養する工程を含む、体節細胞から間葉系間質細胞を製造する方法を提供する。本態様における体節細胞は、多能性幹細胞から本願の方法によって誘導したものであっても、他の公知の方法で提供される細胞であってもよい。すなわち、本態様によって、多能性幹細胞から体節細胞を経て間葉性間質細胞を製造する方法が提供される。
本態様において得られる間葉系間質細胞を既知方法にて更に分化を誘導して、軟骨、骨、脂肪細胞を製造することができる。間葉系間質細胞を得、間葉系間質細胞の分化を更に誘導して軟骨、骨、脂肪細胞を製造する方法もまた、本願に含まれる。
本願は多能性幹細胞を提供する工程、および
多能性幹細胞を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供する。
未分節中胚葉細胞を多能性幹細胞から製造する方法は知られており、公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば多能性幹細胞を比較的高濃度のGSK3β阻害剤を含む培地中で培養することによって、比較的高い誘導率で未分節中胚葉細胞へと誘導することができる(非特許文献7および9:Loh et al 2016およびXi 2017)。
体節細胞は、複数の細胞型(真皮節(D)、筋節(MYO)、硬節(SCL)および靭帯節(SYN)など)を生じるトランジェントな幹細胞であり、また、出生後に骨、軟骨および脂肪を生じる間葉系間質細胞(MSC)の起源ともなる細胞である。
(3)体節細胞(SM)から皮筋節細胞(DM)への分化誘導
皮筋節は、体節の背側が分化して形成され、真皮の前駆体である真皮節および骨格筋の前駆体である筋節を生じる。
本願発明のひとつの態様として、多能性幹細胞から上記(1)(2)(3)の工程を経て、皮筋節細胞を得、さらに皮筋節細胞から筋節細胞を得る方法を提供する。筋節細胞は骨格筋細胞の前駆細胞である。筋節細胞は、例えば皮筋節細胞をGSK3β阻害剤を含む培地中で培養することによって、製造できる。
真皮節は、皮筋節から誘導され、背側真皮の前駆体となる。皮筋節細胞をGSK3β阻害剤およびBMPを含む培地にて培養することによって、真皮節細胞を製造することができる。皮筋節細胞から真皮節細胞を製造するにあたり、出発物質として用いる皮筋節細胞は上記(1)〜(2)の工程を経て多能性幹細胞から製造した体節細胞から(3)の工程により製造された皮筋節細胞であっても、他の方法で得た体節細胞から製造されたものであっても、その他の方法で得られた皮筋節細胞であってもよい。皮筋節細胞としてはまた、動物の生体から取得したものであってもよい。
硬節は、体節の腹側が分化して形成され、腱および靱帯の前駆体である靱帯節を生じる。本願発明のひとつの態様として、多能性幹細胞から上記(1)(2)の工程を経て、体節細胞を得、さらに体節細胞から硬節細胞を製造方法を提供する。
靱帯節は、硬節の内側部分から分化し、腱および靱帯を生じる。本願の一態様として、以下の工程を含む硬節細胞から靱帯節細胞を製造する方法を提供する:
(7−1)硬節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程、および
(7−2)工程7−1で得られた細胞を、BMPおよびTGFβを含む培地で培養する工程。
間葉系間質は骨、軟骨、脂肪へと分化することが知られており、間葉系間質細胞は、骨髄、脂肪組織または血液など、身体内の複数の部位から得ることができる多能性細胞である。本願の一つの態様として、体節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程を含む、間葉系間質細胞(体節細胞由来間葉系間質細胞)を製造する方法を提供する。体節細胞は、生体内から単離された細胞でも、他の細胞種から製造された細胞であってもよい。ある態様において体節細胞は、上記(1)(2)の工程により多能性幹細胞から誘導された体節細胞が用いられる。
上記(1)に従い多能性幹細胞(PSC)から未分節中胚葉細胞(PSM)を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞(PSM)から上記(2)に従い体節細胞(SM)を誘導する、
誘導された体節細胞(SM)から上記(3)に従い皮筋節細胞(DM)を誘導する、および
誘導された皮筋節細胞(DM)から上記(4)に従い筋節細胞(MYO)を誘導する。
上記(1)に従い多能性幹細胞(PSC)から未分節中胚葉細胞(PSM)を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞(PSM)から上記(2)に従い体節細胞(SM)を誘導する、
誘導された体節細胞(SM)から上記(3)に従い皮筋節細胞(DM)を誘導する、および
誘導された皮筋節細胞(DM)から上記(5)に従い真皮節細胞(D)を誘導する。
上記(1)に従い多能性幹細胞(PSC)から未分節中胚葉細胞(PSM)を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞(PSM)から上記(2)に従い体節細胞(SM)を誘導する、および
誘導された体節細胞(SM)から上記(6)に従い硬節細胞(SCL)を誘導する。
上記(1)に従い多能性幹細胞(PSC)から未分節中胚葉細胞(PSM)を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞(PSM)から上記(2)に従い体節細胞(SM)を誘導する、
誘導された体節細胞(SM)から上記(6)に従い硬節細胞(SCL)を誘導する、および
誘導された硬節細胞(SCL)から上記(7)に従い靱帯節細胞(SYN)を誘導する。
上記(1)に従い多能性幹細胞(PSC)から未分節中胚葉細胞(PSM)を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞(PSM)から上記(2)に従い体節細胞(SM)を誘導する、および
誘導された体節細胞(SM)から上記(8)に従い体節細胞由来の間葉系間質細胞(SMMSC)を誘導する。
細胞培養
ヒトiPS細胞は、Takahashi et al., 2007の方法を用いて調製、維持した。具体的にはヒトiPS細胞を、4ng/ml FGF2(WAKO, Osaka, Japan)を添加した霊長類ES細胞培地(ReproCELL, Tokyo, Japan)中のSNLフィーダー細胞上で維持した。特に断りの無い限り、実施例1〜5の全ての実験において、エクソン1のPAX3コード配列の1つの対立遺伝子のひとつとEGFPを置換した201B7−PAX3−GFP iPS細胞を用いた。同一のノックイン設計を有する、PAX3GFP/+ヘテロ接合体マウスは、生存可能で、繁殖性である。GFP発現はマウスの内因性Pax3の発現を意味する(Lagha, M. et al., 2010)。また、実施例1では、種々のiPS細胞系統(201B7、TIG118−4f、414C2、409B2および1231A3)(Koyanagi-Aoi et al., 2013; Nakagawa et al., 2014; Okita et al., 2011; Takahashi et al., 2007に準じて製造された細胞)を用いて、iPS細胞系統の相違による再現性を調べた。
実施例において用いたCDM基礎培地の組成を以下に示す:
Iscove's modified Eagle's Medium/ Ham's F12培地 1:1(GIBCO, Grand Island, NY, USA)に1x chemically defined lipid concentrate (GIBCO)、15mg/mlアポトランスフェリン(Sigma, St. Louis, MO)、450mMモノチオグリセロール(Sigma)、5mg/ml精製BSA(結晶化による99%精製;Sigma)、7mg/mlインスリン(WAKO)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を添加
全RNAを、RNeasyキット(Qiagen, Valencia, CA)で精製し、DNase-oneキット(Qiagen)で処理し、ゲノムDNAを除去した。逆転写を、1μgの全RNAおよびSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen)を用いて、製造者の説明書に従って、行った。RT−qPCRを、Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan)を用いて行い、QunatStudio12K Flex PCRシステム(Applied Biosystems, Forester City, CA)、またはStepOne real-time PCRシステム(Applied Biosystems)を用いて、分析した。
抗体での免疫細胞化学を行う前に、プレート上の細胞を、2%パラホルムアルデヒドで、4℃で10分間固定し、PBSで2回洗浄し、透過処理のための界面活性剤としての0.2%MtOH(Nacalai Tesque)または0.2%tween20(sigma)/PBSと共に、4℃で、15分間インキュベートし、ブロッキングワン(Nacalai Tesque)または1%BSA/PBSで、4℃で1時間処理し、一次抗体で4℃で一晩処理した。次に、試料を、0.2%tween20/PBSで数回洗浄し、二次抗体と共に1時間、室温でインキュベートした。DAPI(1:5000;Sigma)を用いて、核を対比染色した。抗II型コラーゲン抗体の免疫組織化学および、誘導した3DCIペレットの組織学的分析(HE染色、アルシアンブルー染色およびサフラニンO染色)を、Center for Anatomical, Pathological and Forensic Medical Researches, Graduate School of Medicine, Kyoto Universityで行った。試料の観察および評価を、BZ−X700(Keyence, Osaka, Japan)で行った。MHCの免疫細胞化学に関して、BZ−X700のオプティカルセクショニングシステムを用いて、写真を撮影した。
Fluorescence-activated cell sorting(FACS)を、製造者のプロトコルに従って、AriaII(BD)で行った。また、細胞内フローサイトメトリー解析を、製造者のプロトコルに従って、AriaII(BD)で行った。簡潔に述べると、細胞を、抗体染色の前に、固定および透過処理した。各分化マーカーの発現比率を、iPSCまたは誘導された体節細胞と比較することによって、計算した。
ペレット中のGAG含量を、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (Biocolor Ltd., Belfast, UK)で定量化した。DNA含量を、PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen)で定量化した。
全RNAを、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて調製した。cDNAを、GeneChip WT (Whole Transcript) Sense Target Labeling and Control Reagents Kitを用いて、製造者(Affymetrix, Santa Clara, CA)によって記載されるように、合成した。GeneChip Human Gene 1.0 ST expression arrayとのハイブリダイゼーション、洗浄、スキャニングを、製造者(Affymetrix)のプロトコルに従って、行った。発現値を、RMA要約法を用いて計算し、得られたデータを、ヒートマップおよび主成分分析(PCA)のために、GeneSpring GX 14.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)で分析した。PCA分析を、(統計的有意性を伴って、2倍高い)発現値において行った。統計解析を、Benjamini and Hochberg False Discovery Rate (BH-FDR 50.01)多重検定補正での一元配置分散分析を用い、次いでテューキーのHSD事後検定(GeneSpring GX)を用いて行った。
全ての実験の統計的有意性を、GraphPad Prism7 (GraphPad Software, inc., La Jolla, CA, USA)を用いて計算した。0.05未満のP値を、統計的に有意と見なした。
図2Aに実施例1〜4の概要を示す。
フィーダー細胞から分泌される増殖因子および培地中に含まれる増殖因子の影響を最小限にするため、iPS細胞培養物からSNLフィーダー細胞を除去し、ヒトiPS細胞を、マトリゲル(BD, Bedford, MA, USA)で被覆したディッシュ上に播種した(1.3x106細胞/10cmディッシュ)。mTeSR1培地(STEMCELL Technology, Vancouver, Canada)を含むフィーダーフリー条件下で3日間培養した。その後、iPS細胞を、CDM基礎培地に4種類の因子を1つずつ、および適宜組み合わせて添加した培地にて4日間培養した(図2B)。添加した因子は下記のとおりである。2以上の因子を組み合わせて用いる場合には、各記号を並べて示す:
S:10μM SB431542(TGFβ阻害剤;Sigma)
C:10μM CHIR99021(GSK3β阻害剤;WAKO)
D:2μM DMH1(BMP阻害剤;Tocris, Bristol, UK)
F:20ng/ml FGF2
実施例1のSCDF条件でiPS細胞を4日間培養し、FACSでソーティングした全1.0x105個のDLL1+ 未分節中胚葉細胞を、マトリゲルで被覆した12ウェルプレートの1つのウェル上に播種し、体節細胞の誘導を行った(図3A)。体節細胞誘導は、SB431542および/または5μM CHIR99021を添加したCDM基礎培地中で、4日間行った。培地は、体節細胞誘導の3日目に交換した。PAX3−GFPの発現を体節細胞のマーカーとして用いた。
S10:SB431542 10μM
C1:CHIR99021 1μM
C5:CHIR99021 5μM
C10:CHIR99021 10μM
D2:DMH1 2μM
F20:FGF2 20ng/ml
I10:IWR1 10μM
抗PARAXIS(TCF15)抗体を用いた免疫組織化学によっても図3Bに示したFACSを用いて得られた結果と同じく、体節細胞(SM)であることを示すPARAXIS発現細胞がC4、S10C1、S10C5およびS10C5D2で認められ、その割合はS10C5群で最も高いことが確認された。
またCDH11(上皮性体節細胞のマーカー)の発現を免疫組織化学によって調べたところ、CHIR99021を含む条件(S10C5)においてのみ、CDH11の発現が細胞−細胞ジャンクションに認められた。
FACSソーティング後のPAX3+細胞の生存数の低かったため、得られた細胞は、ソーティングなしで、実施例3で用いた。
図4Aに概略を示す。
体節細胞誘導に用いた培地から、皮筋節細胞誘導用培地に交換してさらに培養を続けた。WNTシグナル伝達の阻害〜活性化のため、10μMのIWR1(Cayman chemical, Michigan, USA)(I10)またはCHIR99021(0、0.1、1および5μM)(C0,C0.1,C1およびC5)を用いた。BMP活性の制御のため、BMP4(R&D, Minneapolis, KA, USA)(0、0.1、1および10ng/ml)(B0,B0.1,B1およびB10)および10μMのDMH1(Tocris)(D10)を用いた。
上記(3)で得た皮筋節細胞から直接筋節細胞を誘導することを試みた。(3)で得た皮筋節細胞培養物の培地を、CDM基礎培地にCHIR99021を5μM添加した培地に交換し、さらに培養した。培地は3日毎に交換し、30日間培養した。6日毎に培養細胞を少量採取し、筋原性マーカーであるMYOD、MYOGおよびPAX7の経時的発現を調べた。培地交換後18〜30日後に筋原性マーカーの誘導が認められた。一方、皮筋節細胞マーカーであるALX4の発現は経時的に減少した(図4D)。また、MYODおよびMYOGの発現を免疫細胞化学によって調べた。皮節細胞から筋節細胞への誘導効率を、MYOD陽性細胞およびMYOG陽性細胞の数に基づき計算したところ、約22%であった。
生体において皮筋節細胞はまた真皮節細胞へ分化し、真皮節細胞は背中の真皮へと分化するが、インビトロで皮筋節細胞から真皮節細胞を経て真皮へと誘導するプロトコルは確立されていない。上記(3)の皮筋節細胞誘導培地(C5B10)中、継代せずに11日目(SMから3日目)以降、皮筋節細胞が生じた後も培養を続けた。種々の細胞マーカーの発現をRT−qPCRによって調べた結果、DM生成から6日後にPAX3およびPARAXIS(皮筋節細胞および体節細胞マーカー:SM/DM markers)ならびにPAX7およびNCAD(皮筋節細胞および筋節細胞マーカー:DM/MYO markers)の発現レベルが減少した(図4E上段)。そこで、皮筋節細胞から真皮節細胞の誘導を、皮筋節細胞を皮筋節細胞誘導培地(上記(3)の培地)で引き続き培養することによって行った。皮筋節細胞が生成した後、9日間引き続き培養を行い、培地を3日毎に交換した。PDGFRαは、真皮節細胞(D)と皮膚線維芽細胞(DF)において発現し(Orr-Urtreger et al., 1992)、EN1は、真皮節細胞(D)および皮筋節細胞(DM)において発現する(Ahmed et al., 2006)ことが知られている。PDGFRαおよびEN1の発現を、RT−qPCR(図4E下段)および免疫細胞化学(データ示さず)によって調べ、これらのマーカーが、真皮節細胞誘導工程の9日目において主に発現することがわかった。ALX4およびMSX1(皮筋節細胞と真皮節細胞のマーカー:DM/D markers)ならびにCOL1A2(真皮節細胞と皮膚繊維が細胞のマーカー:D/DFmarkers)の発現はまた、真皮節細胞誘導工程の9日目において上昇した(図4E下段)。抗PDGFRαおよび抗EN1でFACS分析を行い、真皮節細胞培養物の69.5±1.4%がPDGFRα+であり、PDGFRα+細胞の92.7±0.4%がEN1+であることを確認した(図4F)。かかる結果から、真皮節細胞(D)が誘導されたことが確認された。
図5Aに概略を示す。
体節細胞から硬節細胞への誘導を、既知方法(Zhao et al., 2014)により行った。具体的には、体節細胞誘導培地を硬節細胞誘導培地(100nM SAG(SHH活性化剤;Calbiochem, La Jolla, CA, USA)および0.6μM LDN193189(BMP阻害剤;Stemgent, Cambridge, MA, USA)を含むCDM基礎培地)と交換して3日間培養した。培地は2日目に交換した。
全1.0x106個の誘導された硬節細胞(SCL)を、10ng/ml BMP7(R&D)および10ng/ml TGFβ3(R&D)を添加した、0.5mlの軟骨形成基礎培地(DMEM:F12(Invitrogen)に1%(v/v)ITS+Premix(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)、0.1μMデキサメタゾン(WAKO)、0.17mM L−アスコルビン酸2−リン酸セスキマグネシウム水和物(Sigma)、0.35mMプロリン(Sigma)、0.15%(v/v)グルコース(Sigma)、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM GlutaMax (Invitrogen)、1%(v/v)FBS))に懸濁し、15mlのチューブ(Corning Inc., Corning, NY, USA)内に移行し、遠心してペレットを形成し、37℃、5%CO2中でインキュベートした。培地を3日毎に交換した。
全4.0x105個の誘導された硬節細胞を、マトリゲルで被覆した12ウェルプレート上に播種し、次いで、MSC go rapid骨形成培地(Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel)を用いて、2次元で骨細胞への分化を誘導した。骨細胞誘導の18日目(iPS細胞から29日目)の細胞におけるPAX1、RUNX2、COL1A1、OSXおよびOPNの発現(図5D)並びに細胞のアリザリンレッド染色(データ示さず)により、硬節細胞が骨細胞へ分化したことを確認した。
硬節の背側の部分は、靱帯節として定義されており、靱帯節は、腱および靱帯の原基である(Brent et al., 2003)。硬節細胞から靱帯節への誘導プロトコルは本願の前には知られていなかった。誘導した硬節細胞を、0.25%トリプシン−EDTA(GIBCO)でディッシュから取り出し、全5.0x104細胞を、マトリゲルで被覆した24ウェルプレートの1つのウェル上に播種し、次いで靱帯節細胞誘導を行った。
各誘導された細胞の遺伝子発現プロファイルを調べた。ヒートマップ解析図を図6Aに、PCAプロットを図6Bに示す。これらの図より、各段階の細胞への優先的かつ段階的な分化が示され、この結果は各手法の理論的根拠を支持する。
体節細胞は、間葉系間質細胞の前駆体となり得るが、ヒト多能性幹細胞から体節細胞を介して間葉系間質細胞を誘導したとの報告は今までなかった。体節細胞から間葉系間質細胞を誘導すべく、体節細胞誘導培地を体節細胞由来間葉系間質細胞誘導培地(10%ウシ胎仔血清(Nichirei Inc., Tokyo, Japan)および4ng/ml FGF2(WAKO)を含む、αMEM(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan))に交換してさらに培養した(図7A)。0.25%トリプシン−EDTA(GIBCO)を用いて容器より培養細胞を剥離し、4日毎に継代を行った。細胞は、2x104細胞/cm3の密度となるよう、組織培養ディッシュ上に播種した。
iPS細胞の有望な用途の一つは、患者特異的なiPS細胞での疾患モデリングである。実施例4および5において、硬節細胞由来の軟骨細胞および体節細胞由来間葉系間質細胞由来の軟骨細胞の2つの異なる種類の軟骨細胞の誘導に成功した。このプロトコルを、遺伝的変異によって生じる、進行性骨化性線維異形成症(FOP)患者の体細胞から作成したiPS細胞に適用した(FOP−iPS細胞)。FOPは、主に生後の患者の軟組織における軟骨内骨化によって特徴付けられる、難治性希少疾患であり、ACVR1に変異が生じて過剰に働くことに起因することが知られている。本発明者らを含む研究グループは先に、FOP−iPS由来の神経堤細胞から誘導した間葉系間質細胞を用い、間葉系間質細胞から軟骨形成の亢進が認められることを報告している(Hino et al., 2015; Matsumoto et al., 2015)。同様にFOP−iPS細胞由来の体節細胞から誘導された間葉系間質細胞に由来する軟骨細胞では、軟骨形成が亢進するが、硬節細胞由来の胚性軟骨細胞では、軟骨形成の亢進は無いことが予測される。
全1.5x105個の誘導された間葉系間質細胞または硬節細胞を、5μLの軟骨形成基本培地(DMEM:F12(Invitrogen)、1%(v/v)ITS+Premix(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)、0.1μMデキサメタゾン(WAKO)、0.17mM L−アスコルビン酸2−りん酸セスキマグネシウム水和物(Sigma)、0.35mMプロリン(Sigma)、0.15%(v/v)グルコース(Sigma)、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM GlutaMax (Invitrogen)、1%(v/v)FBS)に懸濁し、次いで、フィブロネクチンで被覆した24ウェルプレートの1つのウェルに移行した(BD Biosciences)。37℃、5%CO2中での1時間のインキュベーション後、細胞は微小集積(micromass)を形成した。
これらの結果を図8Mにまとめた。FOP表現型という細胞種の特異性を示し、我々のプロトコルが疾患モデリング、表現型分析および薬剤の発見に使用できることを示す。
硬節細胞をゼノフリー条件下で誘導されたiPS細胞から、ゼノフリー環境下で誘導した。具体的には、iPS細胞としてゼノフリー条件下で誘導された1231A3を用いた。まず実施例1のSCDF条件でiPS細胞を4日間培養し、未分節中胚葉細胞を誘導した。培地にはStemFit(登録商標) AK03(C液不含)培地(味の素株式会社、以下、AK03(−C)培地)を用いた。次に体節細胞誘導のため、FACSでソーティングした全1.0x105個のDLL1+ 未分節中胚葉細胞を、10μM SB431542および5μM CHIR99021を添加したAK03(−C)培地を含むiMatrix511(ニッピ株式会社)で被覆された12ウェルプレートの各ウェルに播種し、4日間培養した。培地を体節細胞誘導の3日目に交換した。硬節細胞の誘導のため、培地を100nM SAGおよび0.6μM LDN193189を含むAK03(−C)培地に交換し、さらに3日間培養した。硬節細胞誘導の2日目に培地を交換した。
実施例7における靱帯節細胞誘導8日目の細胞をアキレス腱断裂モデルラットに移植し、移植治療効果を4週間観察した。
Ahmed, M.U., Cheng, L., and Dietrich, S. (2006). Establishment of the epaxial-hypaxial boundary in the avian myotome. Dev Dyn 235, 1884-1894.
Benazeraf, B., and Pourquie, O. (2013). Formation and segmentation of the vertebrate body axis. Annual review of cell and developmental biology 29, 1-26.
Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155.
Brent, A.E., Schweitzer, R., and Tabin, C.J. (2003). A somitic compartment of tendon progenitors. Cell 113, 235-248.
Brent, A.E., and Tabin, C.J. (2002). Developmental regulation of somite derivatives: muscle, cartilage and tendon. Current opinion in genetics & development 12, 548-557.
Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., and Relaix, F. (2003). The formation of skeletal muscle: from somite to limb. Journal of anatomy 202, 59-68.
Chal, J., Oginuma, M., Al Tanoury, Z., Gobert, B., Sumara, O., Hick, A., Bousson, F., Zidouni, Y., Mursch, C., Moncuquet, P., et al. (2015). Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nat Biotechnol 33, 962-969.
Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain, M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol 27, 275-280.
Chapman, S.C., Brown, R., Lees, L., Schoenwolf, G.C., and Lumsden, A. (2004). Expression analysis of chick Wnt and frizzled genes and selected inhibitors in early chick patterning. Dev Dyn 229, 668-676.
Chapman, S.C., Schubert, F.R., Schoenwolf, G.C., and Lumsden, A. (2002). Analysis of spatial and temporal gene expression patterns in blastula and gastrula stage chick embryos. Developmental biology 245, 187-199.
Chong, J.J., Yang, X., Don, C.W., Minami, E., Liu, Y.W., Weyers, J.J., Mahoney, W.M., Van Biber, B., Cook, S.M., Palpant, N.J., et al. (2014). Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature 510, 273-277.
Dey, D., Bagarova, J., Hatsell, S.J., Armstrong, K.A., Huang, L., Ermann, J., Vonner, A.J., Shen, Y., Mohedas, A.H., Lee, A., et al. (2016). Two tissue-resident progenitor lineages drive distinct phenotypes of heterotopic ossification. Science translational medicine 8, 366ra163.
Fasano, C.A., Chambers, S.M., Lee, G., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2010). Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 6, 336-347.
Faure, S., de Santa Barbara, P., Roberts, D.J., and Whitman, M. (2002). Endogenous patterns of BMP signaling during early chick development. Developmental biology 244, 44-65.
Fomenou, M.D., Scaal, M., Stockdale, F.E., Christ, B., and Huang, R. (2005). Cells of all somitic compartments are determined with respect to segmental identity. Dev Dyn 233, 1386-1393.
Fukuta, M., Nakai, Y., Kirino, K., Nakagawa, M., Sekiguchi, K., Nagata, S., Matsumoto, Y., Yamamoto, T., Umeda, K., Heike, T., et al. (2014). Derivation of mesenchymal stromal cells from pluripotent stem cells through a neural crest lineage using small molecule compounds with defined media. PLoS One 9, e112291.
Galli, L.M., Willert, K., Nusse, R., Yablonka-Reuveni, Z., Nohno, T., Denetclaw, W., and Burrus, L.W. (2004). A proliferative role for Wnt-3a in chick somites. Developmental biology 269, 489-504.
Gouti, M., Delile, J., Stamataki, D., Wymeersch, F.J., Huang, Y., Kleinjung, J., Wilson, V., and Briscoe, J. (2017). A Gene Regulatory Network Balances Neural and Mesoderm Specification during Vertebrate Trunk Development. Developmental cell 41, 243-261 e247.
Hardy, K.M., Yatskievych, T.A., Konieczka, J., Bobbs, A.S., and Antin, P.B. (2011). FGF signalling through RAS/MAPK and PI3K pathways regulates cell movement and gene expression in the chicken primitive streak without affecting E-cadherin expression. BMC developmental biology 11, 20.
Hino, K., Horigome, K., Nishio, M., Komura, S., Nagata, S., Zhao, C., Jin, Y., Kawakami, K., Yamada, Y., Ohta, A., et al. (2017). Activin-A enhances mTOR signaling to promote aberrant chondrogenesis in fibrodysplasia ossificans progressiva. The Journal of clinical investigation 127, 3339-3352.
Hino, K., Ikeya, M., Horigome, K., Matsumoto, Y., Ebise, H., Nishio, M., Sekiguchi, K., Shibata, M., Nagata, S., Matsuda, S., et al. (2015). Neofunction of ACVR1 in fibrodysplasia ossificans progressiva. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 15438-15443.
Hirsinger, E., Duprez, D., Jouve, C., Malapert, P., Cooke, J., and Pourquie, O. (1997). Noggin acts downstream of Wnt and Sonic Hedgehog to antagonize BMP4 in avian somite patterning. Development 124, 4605-4614.
Hubaud, A., and Pourquie, O. (2014). Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature reviews Molecular cell biology 15, 709-721.
Iimura, T., Yang, X., Weijer, C.J., and Pourquie, O. (2007). Dual mode of paraxial mesoderm formation during chick gastrulation. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 2744-2749.
Ikeya, M., and Takada, S. (1998). Wnt signaling from the dorsal neural tube is required for the formation of the medial dermomyotome. Development 125, 4969-4976.
Jiang, Y.J., Aerne, B.L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., and Lewis, J. (2000). Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature 408, 475-479.
Jouve, C., Iimura, T., and Pourquie, O. (2002). Onset of the segmentation clock in the chick embryo: evidence for oscillations in the somite precursors in the primitive streak. Development 129, 1107-1117.
Kam, R.K., Deng, Y., Chen, Y., and Zhao, H. (2012). Retinoic acid synthesis and functions in early embryonic development. Cell & bioscience 2, 11.
Koyanagi-Aoi, M., Ohnuki, M., Takahashi, K., Okita, K., Noma, H., Sawamura, Y., Teramoto, I., Narita, M., Sato, Y., Ichisaka, T., et al. (2013). Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 20569-20574.
Lagha, M., Sato, T., Regnault, B., Cumano, A., Zuniga, A., Licht, J., Relaix, F., and Buckingham, M. (2010). Transcriptome analyses based on genetic screens for Pax3 myogenic targets in the mouse embryo. BMC genomics 11, 696.
Lee, J.Y., Zhou, Z., Taub, P.J., Ramcharan, M., Li, Y., Akinbiyi, T., Maharam, E.R., Leong, D.J., Laudier, D.M., Ruike, T., et al. (2011). BMP-12 treatment of adult mesenchymal stem cells in vitro augments tendon-like tissue formation and defect repair in vivo. PLoS One 6, e17531.
Loh, K.M., Chen, A., Koh, P.W., Deng, T.Z., Sinha, R., Tsai, J.M., Barkal, A.A., Shen, K.Y., Jain, R., Morganti, R.M., et al. (2016). Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell 166, 451-467.
Marcelle, C., Stark, M.R., and Bronner-Fraser, M. (1997). Coordinate actions of BMPs, Wnts, Shh and noggin mediate patterning of the dorsal somite. Development 124, 3955-3963.
Maretto, S., Cordenonsi, M., Dupont, S., Braghetta, P., Broccoli, V., Hassan, A.B., Volpin, D., Bressan, G.M., and Piccolo, S. (2003). Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 3299-3304.
Matsumoto, Y., Hayashi, Y., Schlieve, C.R., Ikeya, M., Kim, H., Nguyen, T.D., Sami, S., Baba, S., Barruet, E., Nasu, A., et al. (2013). Induced pluripotent stem cells from patients with human fibrodysplasia ossificans progressiva show increased mineralization and cartilage formation. Orphanet journal of rare diseases 8, 190.
Matsumoto, Y., Ikeya, M., Hino, K., Horigome, K., Fukuta, M., Watanabe, M., Nagata, S., Yamamoto, T., Otsuka, T., and Toguchida, J. (2015). New Protocol to Optimize iPS Cells for Genome Analysis of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva. Stem Cells 33, 1730-1742.
Moriyama, A., Kii, I., Sunabori, T., Kurihara, S., Takayama, I., Shimazaki, M., Tanabe, H., Oginuma, M., Fukayama, M., Matsuzaki, Y., et al. (2007). GFP transgenic mice reveal active canonical Wnt signal in neonatal brain and in adult liver and spleen. Genesis 45, 90-100.
Nakagawa, M., Taniguchi, Y., Senda, S., Takizawa, N., Ichisaka, T., Asano, K., Morizane, A., Doi, D., Takahashi, J., Nishizawa, M., et al. (2014). A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep 4, 3594.
Nimmagadda, S., Geetha Loganathan, P., Huang, R., Scaal, M., Schmidt, C., and Christ, B. (2005). BMP4 and noggin control embryonic blood vessel formation by antagonistic regulation of VEGFR-2 (Quek1) expression. Developmental biology 280, 100-110.
Okita, K., Matsumura, Y., Sato, Y., Okada, A., Morizane, A., Okamoto, S., Hong, H., Nakagawa, M., Tanabe, K., Tezuka, K., et al. (2011). A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature methods 8, 409-412.
Orr-Urtreger, A., Bedford, M.T., Do, M.S., Eisenbach, L., and Lonai, P. (1992). Developmental expression of the alpha receptor for platelet-derived growth factor, which is deleted in the embryonic lethal Patch mutation. Development 115, 289-303.
Patwardhan, V., Gokhale, M., and Ghaskadbi, S. (2004). Acceleration of early chick embryo morphogenesis by insulin is associated with altered expression of embryonic genes. Int J Dev Biol 48, 319-326.
Pryce, B.A., Watson, S.S., Murchison, N.D., Staverosky, J.A., Dunker, N., and Schweitzer, R. (2009). Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development 136, 1351-1361.
Rhinn, M., and Dolle, P. (2012). Retinoic acid signalling during development. Development 139, 843-858.
Sakurai, H., Inami, Y., Tamamura, Y., Yoshikai, T., Sehara-Fujisawa, A., and Isobe, K. (2009). Bidirectional induction toward paraxial mesodermal derivatives from mouse ES cells in chemically defined medium. Stem cell research 3, 157-169.
Sakurai, H., Sakaguchi, Y., Shoji, E., Nishino, T., Maki, I., Sakai, H., Hanaoka, K., Kakizuka, A., and Sehara-Fujisawa, A. (2012). In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells. PLoS One 7, e47078.
Schwarting, T., Lechler, P., Struewer, J., Ambrock, M., Frangen, T.M., Ruchholtz, S., Ziring, E., and Frink, M. (2015). Bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) influences tendon-bone integration in vitro. PLoS One 10, e0116833.
Sheng, G. (2015). The developmental basis of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs). BMC developmental biology 15, 44.
Streit, A., and Stern, C.D. (1999). Establishment and maintenance of the border of the neural plate in the chick: involvement of FGF and BMP activity. Mechanisms of development 82, 51-66.
Sudheer, S., Liu, J., Marks, M., Koch, F., Anurin, A., Scholze, M., Senft, A.D., Wittler, L., Macura, K., Grote, P., et al. (2016). Different Concentrations of FGF Ligands, FGF2 or FGF8 Determine Distinct States of WNT-Induced Presomitic Mesoderm. Stem Cells 34, 1790-1800.
Sumi, T., Tsuneyoshi, N., Nakatsuji, N., and Suemori, H. (2008). Defining early lineage specification of human embryonic stem cells by the orchestrated balance of canonical Wnt/beta-catenin, Activin/Nodal and BMP signaling. Development 135, 2969-2979.
Tajbakhsh, S., Borello, U., Vivarelli, E., Kelly, R., Papkoff, J., Duprez, D., Buckingham, M., and Cossu, G. (1998). Differential activation of Myf5 and MyoD by different Wnts in explants of mouse paraxial mesoderm and the later activation of myogenesis in the absence of Myf5. Development 125, 4155-4162.
Takada, S., Stark, K.L., Shea, M.J., Vassileva, G., McMahon, J.A., and McMahon, A.P. (1994). Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes & development 8, 174-189.
Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872.
Takemoto, T., Uchikawa, M., Yoshida, M., Bell, D.M., Lovell-Badge, R., Papaioannou, V.E., and Kondoh, H. (2011). Tbx6-dependent Sox2 regulation determines neural or mesodermal fate in axial stem cells. Nature 470, 394-398.
Tanaka, A., Woltjen, K., Miyake, K., Hotta, A., Ikeya, M., Yamamoto, T., Nishino, T., Shoji, E., Sehara-Fujisawa, A., Manabe, Y., et al. (2013). Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One 8, e61540.
Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., and Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (New York, NY) 282, 1145-1147.
Umeda, K., Zhao, J., Simmons, P., Stanley, E., Elefanty, A., and Nakayama, N. (2012). Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells. Sci Rep 2, 455.
Xi, H., Fujiwara, W., Gonzalez, K., Jan, M., Liebscher, S., Van Handel, B., Schenke-Layland, K., and Pyle, A.D. (2017). In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs. Cell Rep 18, 1573-1585.
Yoshikawa, Y., Fujimori, T., McMahon, A.P., and Takada, S. (1997). Evidence that absence of Wnt-3a signaling promotes neuralization instead of paraxial mesoderm development in the mouse. Developmental biology 183, 234-242.
Zhao, J., Li, S., Trilok, S., Tanaka, M., Jokubaitis-Jameson, V., Wang, B., Niwa, H., and Nakayama, N. (2014). Small molecule-directed specification of sclerotome-like chondroprogenitors and induction of a somitic chondrogenesis program from embryonic stem cells. Development 141, 3848-3858.
Claims (30)
- 多能性幹細胞を提供する工程、および
多能性幹細胞を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法。 - 多能性幹細胞を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程が、
(1)多能性幹細胞をGSK3β阻害剤を含む培地で培養して未分節中胚葉細胞培養物を得る工程、および
(2)未分節中胚葉細胞培養物を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養して体節細胞培養物を得る工程を含む、請求項1記載の方法。 - (2)の工程に用いる培地が、更にTGFβ阻害剤を含む、請求項2記載の方法。
- GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項1〜3いずれかに記載の方法。
- (2)の工程におけるCHIR99021の濃度が、0.1μM〜50μMである、請求項4に記載の方法。
- TGFβ阻害剤が、SB431542である、請求項3〜5何れかに記載の方法。
- (1)の工程の培養期間が1〜7日間、(2)の工程の培養期間が1〜7日間である、請求項2〜6のいずれかに記載の方法。
- (1)の工程の培養期間が4日間、(2)の工程の培養期間が4日間である、請求項2〜7のいずれかに記載の方法。
- 多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項1〜8いずれかに記載の方法。
- 多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜10いずれかに記載の方法で体節細胞を得、さらに(3)体節細胞をGSK3β阻害剤およびBMPを含む培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞から皮筋節細胞を製造する方法。
- 請求項11記載の方法で皮筋節細胞を得、さらに(4)皮筋節細胞をGSK3β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から筋節細胞を製造する方法。
- 請求項11記載の方法で皮筋節細胞を得、さらに(5)皮筋節細胞をGSK3β阻害剤およびBMPを含む培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞から真皮節細胞を製造する方法。
- 体節細胞を提供する工程、および
体節細胞をGSK3β阻害剤およびBMPを含む培地にて培養する工程を含む、体節細胞から真皮節細胞を製造する方法。 - 得られた真皮節細胞培養物を、FACSにより純化する工程をさらに含む、請求項13または14に記載の方法。
- GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項13〜15いずれかに記載の方法。
- BMPがBMP4である、請求項13〜16いずれかに記載の方法。
- 請求項1〜10いずれかに記載の方法で体節細胞を得、さらに(6)体節細胞をソニックヘッジホッグ活性化剤およびBMP阻害剤を含む培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞から硬節細胞を製造する方法。
- 請求項18に記載の方法で硬節細胞を得、さらに
(7−1)硬節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程、および
(7−2)工程(7−1)で得られた細胞培養物を、BMPおよびTGFβを含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から靱帯節細胞を製造する方法。 - 体節細胞を提供する工程、
(6)体節細胞をヘッジホッグ活性化剤およびBMP阻害剤を含む培地にて培養して硬節細胞を製造する工程、
(7−1)硬節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程、および
(7−2)工程(7−1)で得られた細胞培養物を、BMPおよびTGFβを含む培地で培養する工程を含む、体節細胞から靱帯節細胞を製造する方法。 - 硬節細胞を提供する工程、
(7−1)硬節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程、および
(7−2)工程(7−1)で得られた細胞培養物を、BMPおよびTGFβを含む培地で培養する工程を含む、硬節細胞から靱帯節細胞を製造する方法。 - 靱帯節細胞培養物を、FACSにより純化する工程をさらに含む、請求項19〜21いずれかに記載の靱帯節細胞を製造する方法。
- (7−1)の工程に用いる培地が更にTGFβを含む、請求項19〜22いずれかに記載の方法。
- FGFがFGF8である、請求項19〜23いずれかに記載の方法。
- BMPがBMP7である、請求項19〜24いずれかに記載の方法。
- TGFβがTGFβ3である、請求項19〜25いずれかに記載の方法。
- 請求項1〜10いずれかに記載の方法で体節細胞を得、さらに
(8)体節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から間葉系間質細胞を製造する方法。 - 体節細胞を提供する工程、および
体節細胞を、FGFを含む培地で培養する工程を含む、体節細胞から間葉系間質細胞を製造する方法。 - FGFがFGF2である、請求項27または28に記載の方法。
- ゼノフリー条件下で誘導された多能性幹細胞を提供する工程、
(1)多能性幹細胞をGSK3β阻害剤を含む培地で培養して未分節中胚葉細胞培養物を得る工程、
(2)未分節中胚葉細胞培養物を、GSK3β阻害剤を含む培地で培養して体節細胞培養物を得る工程、
(6)体節細胞をソニックヘッジホッグ活性化剤およびBMP阻害剤を含む培地で培養して硬節細胞培養物を得る工程、
(7−1)硬節細胞培養物を、FGFを含む培地で培養する工程、および
(7−2)工程(7−1)で得られた細胞培養物を、BMPおよびTGFβを含む培地で培養する工程を含み、各工程がゼノフリー条件下で行われる、多能性幹細胞から靱帯節細胞を製造する方法。
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
ANAT EMBRYOL, vol. Vol. 211, Suppl. 1, JPN6019019420, 26 September 2006 (2006-09-26), pages 21 - 30, ISSN: 0005000560 * |
BIRTH DEFECTS RESEARCH (PART C), vol. 99, JPN6019019412, 23 September 2013 (2013-09-23), pages 203 - 222, ISSN: 0005000561 * |
CELL, vol. 166, JPN6019019408, 14 July 2016 (2016-07-14), pages 451 - 467, ISSN: 0005000557 * |
DEVELOPMENT, vol. 141, JPN6019019409, 7 October 2014 (2014-10-07), pages 3848 - 3858, ISSN: 0005000558 * |
DEVELOPMENT, vol. Vol. 145, dev165431, JPN6019019418, 23 August 2018 (2018-08-23), ISSN: 0005000562 * |
第17回日本再生医療学会総会 [ONLINE], JPN6019019414, 23 February 2018 (2018-02-23), pages 767, ISSN: 0005000559 * |
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