CN116103229B

CN116103229B - 人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系和方法

Info

Publication number: CN116103229B
Application number: CN202310160109.0A
Authority: CN
Inventors: 李中瀚; 熊靖飞
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2023-02-24
Filing date: 2023-02-24
Publication date: 2024-07-23
Anticipated expiration: 2043-02-24
Also published as: CN116103229A

Abstract

本发明公开了人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系和方法，属于生物技术领域。本发明的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系，包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的SAG、LDN193189、bFGF、ROCKi和Knockout serum replacement。本发明的体外扩增方法采用该体外扩增培养体系进行体外扩增。本发明的体外扩增培养体系中各组分成分明确，不含血清，能实现人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外大量扩增。本发明的扩增流程简单、易实现；扩增培养的细胞具有比P0代制备的巩板成骨/软骨间质前体细胞具有更高的相应标记基因的表达；扩增培养的巩板成骨/软骨间质前体细胞仍具有骨/软骨向分化能力。

Description

人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系和方法。

背景技术

哺乳动物体内的骨骼(包括骨及软骨)是一种起支持作用的结缔组织。脊柱、髋骨、下肢等处的骨组织既能够支撑人体重量又具有运动功能，而各种软骨(如透明软骨)规律地分布于身体的空腔部位及关节面处，有效地对其空腔起到支撑作用，并缓解了关节在运动过程中产生的振动及摩擦。尽管如此，骨及软骨的支撑及润滑作用具有一定的容受限度。例如，关节软骨是无血管的,因此其不具备获得丰富的营养或循环祖细胞的条件，并具有近乎无细胞的性质，这使软骨自我修复的能力受到了限制。因此,通常情况下受损的关节软骨无法被功能性组织替代，需要手术干预。各种治疗手段如微骨折术、自体软骨移植等技术虽然在某些方面有各自的优缺点。近年来，多能干细胞来源的具有体外分化潜能的细胞作为疾病治疗的种子细胞开始进入了组织工程研究的视野。多能干细胞至种子细胞的分化路径是对其体内发育机制的模拟。在胚胎发育过程中，骨骼系统来源于各胚层的骨/软骨间质前体细胞。例如，头面部的骨及软骨来源于神经嵴间质细胞；除胸骨外的中轴骨(如脊柱、肋骨、肋软骨等)来源于体节中特化的巩板间质细胞；而四肢骨及胸骨则来源于侧板中胚层及其特化产生的肢体芽间质细胞。

现有技术中，已经实现了由人多能干细胞向成骨/软骨间质细胞的分化。由于发育模式相对清楚，且无复杂的模式分化过程，体外构建的成骨/软骨间质前体细胞分化体系多基于巩板间质前体细胞。例如，Matsuda²等通过调控巩板成骨/软骨间质前体细胞形成过程中各胚层分化相关信号通路，经6天时间将人诱导多能干细胞逐步向原条(PS)、前体节中胚层(PSM)、体节(SM)、巩板成骨/软骨间质前体细胞(SCL)诱导。此外，Loh¹等通过调控相似通路，同样经6天时间将上述多能干细胞逐步向巩板成骨/软骨间质前体细胞(SCL)诱导。但是，这些方法几乎都需要较长的时间，且存在一定的批次效应。在目前的制备方法中，从多能干细胞接种开始至分化完成，所有流程在同一个培养皿中进行，由此带来的细胞过度扩增问题会引起分化效率低下；在实际操作过程中，细胞密度的粗略控制难以保证各批次分化间的重复性。对此，申请人的在先申请专利“人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用”(申请号2022112200412)，公开了可以在4天内完成的人多能干细胞来源的间质前体细胞的制备方法，即人多能干细胞经历PS、PSM后直接分化为SCL。但是利用该分化方法，仅能实现较小规模的种子细胞的制备，无法满足临床治疗对批量细胞制备的要求。

因此，提供一种人多能干细胞来源的巩板成骨间质前体细胞的体外扩增培养体系及体外扩增方法，能在维持巩板成骨间质前体细胞相应基因表达及成骨/软骨能力的前提下，实现细胞的大量扩增，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系，其能实现人多能干细胞来源的巩板成骨间质前体细胞的大量扩增。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系，包括基础培养基，以及添加于所述基础培养基中的SAG、LDN193189、bFGF、ROCKi和Knockout serum replacement。

本发明的部分实施方案中，每升基础培养基中添加SAG浓度为50～250nmol,优选为200nmol；

每升基础培养基中添加LDN193189浓度为150～800nmol，优选为600nmol；

每升基础培养基中添加bFGF浓度为5～20μg，优选为10μg；

每升基础培养基中添加ROCKi浓度为2～10μmol，优选为10μmol；

基础培养基中添加Knockout serum replacement含量为0.2～1.0vol.％，优选为1vol.％。

本发明的部分实施方案中，所述基础培养基为在先申请专利“人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用”(申请号2022112200412)，公开的化学成分明确基础培养基(chemically defined medium with insulin,CDMi)。

本明中的体外扩增培养体系中，SAG(Smoothened agonist)为SHH信号通路激活剂；

本发明中的体外扩增培养体系中，LDN193189为BMP信号通路抑制剂。

本发明中的体外扩增培养体系中，bFGF能广泛促进细胞增殖。

本发明中的体外扩增培养体系中，ROCKi为RhoA相关蛋白激酶通路抑制剂，抑制细胞凋亡。

本发明中的体外扩增培养体系中，Knockout serum replacement为血清替代物。

本发明提供的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，采用上述的体外扩增培养体系进行体外扩增。

本发明的部分实施方案中，包括以下步骤：

步骤1.消化：将人多能干细胞来源的P0代巩板间质前体细胞加入消化酶消化后，吹打为单细胞悬液，离心；

步骤2.重悬：将离心所得的细胞重悬；

步骤3.计数，离心：将重悬后的细胞悬液进行计数，按1.0×10⁵细胞/cm²的密度吸取细胞悬液，离心；

步骤4.传代培养：采用所述培养体系重悬经步骤3离心后的细胞，接种于培养板上进行传代培养。

本发明的部分实施方案中，所述步骤1中的消化酶为Accutase消化酶；

优选地，将P0代巩板间质前体细胞加入消化酶消化后，加入Wash buffer中和，再将细胞吹打为单细胞悬液。

本发明的部分实施方案中，所述步骤2中，采用Wash buffer重悬离心所得的细胞。

本发明的部分实施方案中，所述步骤4中的培养板预先经Matrigel工作液处理；

优选地，在传代前用Matrigel工作液于37℃处理培养板1小时。

本发明的部分实施方案中，所述步骤4的传代培养时，须每天更换培养体系。

本发明的部分实施方案中，所述步骤4中，每3-4天重复步骤1～4，进行传代扩增。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计科学，构思巧妙。本发明的体外扩增培养体系中，各组分成分明确，且不含有血清，能实现人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外大量扩增。

本发明的扩增流程简单、易实现；扩增培养的细胞具有比P0代制备的巩板成骨/软骨间质前体细胞具有更高的相应标记基因的表达；扩增培养的细胞维持了Sox9的表达，其各代数Sox9阳性细胞比例(以流式细胞分析计)皆处于99.0％以上；扩增培养的巩板成骨/软骨间质前体细胞仍具有骨/软骨向分化能力。

附图说明

图1为实施例1的巩板成骨/软骨间质前体细胞体外扩增过程中各代数细胞明场显微图；

图2为体外扩增细胞各巩板成骨/软骨间质前体细胞标记基因的表达情况图；

图3为巩板成骨/软骨间质前体细胞体外扩增过程中Sox9阳性细胞比例的维持情况图(以流式细胞仪分析SOX9表达细胞比例计)；

图4为巩板成骨/软骨间质前体细胞成软骨及成骨能力验证图。

具体实施方式

本发明实施例的人多能干细胞来源的P0代巩板成骨/软骨间质前体细胞采用申请号2022112200412的专利“人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用”的方法制得。

本发明实施例中所采用的试剂为：

Holo-transferrin工作液：称取15mg Holo-transferrin(美国sigma公司)粉末，向其中加入1mL UP水(美国Invitrogen公司)；

Rh-insulin工作液：称取2mg rh-insulin(中国solarbio公司)粉末，向其中加入1mL 10mM HCL，过滤除菌；

Polyvinyl alcohol工作液：称取500mg Polyvinyl alcohol粉末，向其中加入18mL UP水(美国Invitrogen公司)，搅拌至形成颗粒状悬浮物后，于85摄氏度水浴加热溶解20分钟左右，定容至20mL，过滤除菌；

monothioglycerol工作液：吸取450μmol当量monothioglycerol母液(美国sigma公司)，加入至UP水中，使溶液总体积为1mL，涡旋振荡混匀，过滤除菌；

CDMi基础培养基：IMDM(美国Gibco公司)234.384mL，Ham’s F12(美国Gibco公司)234.384mL，Chemically Defined Lipid Concentrate(美国Gibco公司)5mL，Holo-transferrin工作液500μL，rh-insulin工作液234μL，Polyvinyl alcohol工作液20mL，Pen-strep(美国Gibco公司)5mL，monothioglycerol工作液500μL。

Wash buffer：称取1.5g牛血清白蛋白(BSA，美国sigma公司)加入至500mL DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)中，混匀后过滤除菌。

Matrigel工作液：向12mL DMEM/F12溶液(美国Gibco公司)中加入1mg Matrigel母液(美国Corning公司)并混匀。

Accutase消化液：美国Innovative cell technologies公司。

SAG：美国MCE公司

LDN193189：美国MCE公司

bFGF：美国Preprotech公司

ROCKi：美国MCE公司

KSR：美国thermofisher公司。

实施例1

本实施例公开了本发明的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体的体外扩增方法，具体为：

1.从37℃培养箱取出巩板成骨/软骨间质前体细胞，吸弃培养基。向孔中加入500μL Accutase消化液，将细胞置于37℃培养箱中消化3分钟；消化完成后，向孔中加入4倍体积(2mL)的Wash buffer进行中和，均匀吹打使之成为单细胞悬液。

2.将单细胞悬液吸入一个15mL离心管中，300g离心3分钟，离心完成后用适量Washbuffer重悬细胞。

3.用血球计数板进行计数；取1.0x10⁵细胞/cm²当量细胞于15mL离心管中，用Washbuffer将管中液体补充至2.5mL以上，300g离心3分钟。

4.吸弃上清，向其中加入2mL体外扩增培养体系，并吹打混匀，将细胞吸入经Matrigel工作液处理的6孔培养板中。

用Matrigel工作液处理培养板的方法为：于六孔培养板中加入1mL Matrigel工作液，轻轻晃动培养板，保证液体浸没培养板底部。将培养板放入37摄氏度培养箱中处理1小时。

体外扩增培养体系为：添加SAG 200nM、LDN193189 600nM、bFGF 10ng/mL、ROCKi10μM、KSR 1v.％的CDMi基础培养基。

5.每天为细胞更换新鲜的体外扩增培养体系。从37摄氏度培养箱取出细胞，吸弃体外扩增培养体系。向孔中加入2mL新鲜配置的体外扩增培养体系，放回37摄氏度培养箱中继续培养；

6.每隔3-4天，细胞须按照步骤1-5步再次进行传代。

巩板成骨/软骨间质前体细胞体外扩增过程中P1-P15代细胞显微图如附图1所示。

由附图1可知，在传代过程中，巩板成骨/软骨间质前体细胞维持了稳定的间充质样形态，表明本发明的体外扩增培养体系可支持人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质的存活、增殖及间质细胞状态的维持。

试验例1

本试验例公开了对按实施例1方法扩增培养后的巩板成骨/软骨间质前体细胞进行荧光定量PCR的鉴定。具体方法为：

1.RNA提取

1).将扩增培养后的巩板成骨/软骨间质前体细胞从37℃培养箱中取出，吸去原有培养基，向培养板中加入适量TRI试剂，不断吹打，于常温下静置5-10分钟，待细胞充分裂解；

2).相分离。按氯仿：TRI试剂＝1:5的比例向管中加入氯仿，剧烈摇晃15秒后于常温静置4-10分钟；

3).12000g离心15分钟(2-8℃)。取最上层(无色透明)进行RNA沉淀；

4).按异丙醇：TRI试剂＝1:2的比例向一个新的EP管中加入异丙醇，加入等量含RNA的透明上清；于涡旋振荡器上振荡10秒后常温静置10分钟；

5).12000g离心10分钟(2-8℃)，弃去上清；

6).乙醇洗涤。用无酶水配制75％乙醇。按75％乙醇：TRI试剂＝1.5:1的比例加入无水乙醇，轻轻上下颠倒EP管，12000g离心4分钟(2-8℃环境)，弃上清；

7).重复步骤6)；

8).将EP管至于常温下晾干，向其中加入适量56℃的无酶水溶解RNA；

9).用Nanodrop等定量设备进行RNA浓度测定；

2.反转录及实时荧光定量PCR

1).利用商品化反转录试剂盒将所提取的100-1000ng的RNA反转录为cDNA；

2).将cDNA用无酶水按照1:4-1:10的比例进行稀释；

3).以ACTB(编码β-actin)为内参基因，利用商品化的qPCR试剂盒(中国Vazyme公司)对巩板间质前体细胞相关标记基因(Sox9、Pax1、Pax9、Nkx3-2、Twist1)进行定量；结果如附图2所示。

由附图2可知，与未分化的人多能干细胞(hPSC)及P0代巩板间成骨/软骨质前体细胞(SCL-like-cells)相比较，巩板成骨/软骨间质前体细胞的分子标记在扩增细胞(ExpSCL)中高表达，表明本发明的体外扩增培养体系可在分子水平上维持人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的特性。

试验例2

本试验例公开了对按实施例1方法扩增培养后的巩板成骨/软骨间质前体细胞进行流式分析鉴定，具体方法为：

1).将传代培养的巩板成骨/软骨间质前体细胞从37℃培养箱中取出，吸去上清。

2).用Accutase消化液于37℃消化3分钟；

3).用4倍体积的Wash buffer终止消化。将细胞吹打为单细胞悬液，收集于离心管后，300g于2-8℃离心3分钟；

4).吸弃上清，用预冷的PBS重悬细胞；

5).用70μm的细胞筛去掉细胞团块即可上流式细胞仪分析。

结果以流式细胞仪分析SOX9表达细胞比例计，如附图3所示，SOX9在各代数巩板成骨/软骨间质前体细胞中稳定表达，表明本发明维持了巩板间质前体细胞的身份。

试验例3

本试验例对按实施例1的方法体外扩增的巩板成骨/软骨间质前体细胞成软骨及骨的鉴定，具体为：

采用按实施例1的方法体外扩增培养的第三代巩板成骨/软骨间质前体细胞，按申请号2022112200412的专利“人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用”说明书试验例3的方法进行软骨球分化及细胞移植。

一、COL II染色

1.将移植后的软骨样品从小鼠中取出，置于OCT胶中，并将其立即放入-80摄氏度冰箱中包埋，待胶水凝固后用冰冻切片机切片，切片厚度为6μm；

2.切片完成后，将切片置于4％多聚甲醛溶液中固定8分钟；

3.用胃蛋白酶(美国sigma公司)对其进行抗原修复，于37摄氏度孵箱中处理30分钟；

4.用5％牛血清白蛋白溶液(PBS配制)于室温封闭1小时；

5.吸弃封闭液，用COL II抗体(美国invitrogen公司，稀释比例1:200)进行染色，4摄氏度冰箱孵育过夜；

6.PBS洗三次，每次三分钟；

7.加入适量二抗(稀释比为1:400，用封闭液稀释)，于常温染色1小时；

8.吸去二抗，用PBS洗3次，每次3分钟；

9.擦干PBS，用含DAPI的封片剂进行染核、封片。

二、阿利新蓝染色

1).取固定后的切片一张，用0.1N HCl处理2分钟；

2).用1％阿利新蓝(美国sigma公司)溶液染色30分钟；

3).将切片于蒸馏水中浸洗10秒，继续用0.1NN HCl浸洗2分钟以去除非特异性染色；

4).用蒸馏水洗去残留的盐酸后，滴加苏木精染色4分钟显核。4分钟后用自来水冲4分钟返蓝；

5).95％乙醇脱水1分钟；100％乙醇脱水1分钟；二甲苯透明；

6).中性树脂封片。

三、番红-固绿染色

1).取固定后的切片一张，用苏木素染色2分钟，4分钟后用自来水冲4分钟返蓝；

2).用1％固绿溶液(美国Sigma公司)染色1分30s；

3).用1％冰醋酸溶液分化15秒，除去固绿的非特异性染色；

4).用5％番红(美国sigma公司)染色1分钟；

5).95％乙醇快速浸洗脱水；100％乙醇脱水1分钟；二甲苯透明1分钟后中性树脂封片；

四、体外成骨分化的染色

1).将成骨诱导分化的细胞从37摄氏度培养箱中取出，用4％的多聚甲醛溶液于室温固定8分钟；

2).吸弃固定液，用PBS涮洗孔板；

3).吸弃PBS，直接加入茜素红(美国sigma公司)染色液于室温染色2分钟；

4).吸去染色液，用蒸馏水涮洗细胞3次，每次5分钟以去除非特异性染色；

5).直接用光学显微镜拍照。体外扩增培养的巩板间质前体细胞经成骨分化后茜素红染色及成软骨分化后阿利新蓝染色、番红-固绿染色、Col II染色鉴定图如附图4所示，由附图4可以看出，体外扩增培养的巩板成骨/软骨间质前体细胞维持了成软骨及成骨分化潜能。

上述实施例仅为本发明较优实施例，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系，其特征在于，所述培养体系由CDMi基础培养基以及添加于所述CDMi基础培养基中的SAG、LDN193189、bFGF、ROCKi和Knockout serum replacement组成，所述SAG为SHH信号通路激活剂；

每升CDMi基础培养基中添加SAG 50~250 nmol，LDN193189 150~800 nmol，bFGF 5~20μg，ROCKi 2~10 μmol；

培养体系中Knockout serum replacement 含量为0.2~1.0% vol。

2. 根据权利要求1所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增培养体系，其特征在于，每升CDMi基础培养基中添加SAG 200nmol、 LDN193189600nmol、bFGF 10 μg、ROCKi 10 μmol；

培养体系中Knockout serum replacement 含量为1.0 % vol.。

3.一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的体外扩增培养体系进行体外扩增。

4.根据权利要求3所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1. 消化：将P0代巩板成骨/软骨间质前体细胞加入消化酶消化后，吹打为单细胞悬液，离心；

步骤2. 重悬：将离心所得的细胞重悬；

步骤3. 计数，离心：将重悬后的细胞悬液进行计数，按1.0×10⁵细胞/cm²的密度吸取细胞悬液，离心；

步骤4. 传代培养：采用所述培养体系重悬经步骤3离心后的细胞，接种于培养板上进行传代培养。

5.根据权利要求4所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤1中的消化酶为Accutase消化酶。

6. 根据权利要求5所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤1中，将P0代巩板成骨/软骨间质前体细胞加入消化酶消化3分钟后，加入Wash buffer 中和，再将细胞吹打为单细胞悬液。

7. 根据权利要求4~6任意一项所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤2中，采用Wash buffer重悬离心所得的细胞。

8.根据权利要求4~6任意一项所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤4中的培养板预先经Matrigel工作液处理。

9.根据权利要求8所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤4中，在传代前用Matrigel工作液于37℃处理培养板1小时。

10.根据权利要求4~6任意一项所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤4的传代培养时，须每天更换培养基。

11.根据权利要求10所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤4中，每3-4天重复步骤1~4，进行传代扩增。