JPWO2019049927A1 - 安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は以下の発明を含む。
項2. 前記塩化マグネシウムの含有量が1.0〜10.0重量%である、項1に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項3. 前記塩化マグネシウムの含有量が1.0〜6.0重量%である、項1に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項4. 前記塩化マグネシウムの含有量が0.01〜2.0mg/uである、項1に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項5. 蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素ともに、塩化マグネシウムを共存させる、安定性向上方法。
項6. 1w/v%となるように水に溶解させた場合のpHが2以上5未満である、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項7. 蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
乾燥酵素組成物を1w/v%となるように水に溶解させた場合のpHが2以上5未満となるように調整する、安定性向上方法。
項8. pH2以上5未満である蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液を用意する工程と、前記酵素液を乾燥させる工程とを含む、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造方法。
本発明は、蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む、安定化された蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物と、所定濃度で水に溶解させた場合のpHが2以上5未満である、安定化された蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物と、を提供する。なお、所定濃度で水に溶解させた場合のpHが2以上5未満である安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物においては、塩化マグネシウムを含んでもよいし、含まなくてもよい。
本発明における蛋白質脱アミド酵素は、プロテイングルタミナーゼとも称され、蛋白質の側鎖のアミド基に作用して、側鎖カルボキシル基とアンモニアとに加水分解する酵素である。至適温度は例えば60℃付近、至適pHは例えばpH6付近である。蛋白質脱アミド酵素が作用する側鎖のアミド基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン残基及びグルタミン残基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、蛋白質脱アミド酵素の基質である蛋白質には、分子量5000以上、好ましくは10,000〜2,000,000の蛋白質が挙げられるが、分子量が5000未満のポリペプチド(ジペプチドを含む)も含む。さらに、蛋白質脱アミド酵素の基質である蛋白質の形態としては、アミノ酸残基のみで構成される蛋白質単体の形態であってもよいし、糖、脂質等と複合した複合蛋白質の形態であってもよい。
本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物には塩化マグネシウムを含むことができる。塩化マグネシウムは、蛋白質脱アミド酵素の安定化剤として用いられる。塩化マグネシウムを安定化剤として用いることにより、本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は優れた安定性を備えることができる。
本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物には、塩化カルシウムがさらに含まれていてもよい。塩化カルシウムは、粉末特性向上剤及び/又は安定化助剤として用いることができる。塩化カルシウムを塩化マグネシウムと併用することによって、本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、より優れた粉末特性(例えば固結及び/又は潮解に対する抑制性)を備えることができる。
本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物には、上述の成分以外に、他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、デキストリン、難消化性デキストリン、デンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、トレハロースなどの糖賦形剤;塩化ナトリウムや塩化カルシウムなどの塩類;パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール等の防腐剤;抗酸化剤;乳タンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質などの各種タンパク質(蛋白質脱アミド酵素を除く);ペプチド;アミノ酸;乳酸菌;ビタミン;ミネラル(上記塩類を除く);油脂;各種エキス(肉エキス、酵母エキスなど);核酸等を含んでいてもよい。
本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物が、蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物である場合、蛋白質脱アミド乾燥組成物を1w/v%の濃度となるように水に溶解させた場合のpH(25℃におけるpH。以下において同様。)としては特に限定されず、たとえば、2以上が挙げられ、8以下が挙げられ、具体的な範囲として、2〜8が挙げられる。さらに、塩化マグネシウムを含まない場合に比べた塩化マグネシウムによる安定性向上効果をより有効に得る観点では、水に溶解させた場合のpHは4以上であることが好ましく、8以下であることが好ましく、具体的な範囲として、4〜8が挙げられる。
本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の形態としては、乾燥状態である限り特に限定されず、例えば、粉末状、顆粒状等が挙げられ、好ましくは粉末状が挙げられる。また、本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物等の態様のものが挙げられ、好ましくは、噴霧乾燥物及び凍結乾燥物が挙げられる。
蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、蛋白質脱アミド酵素を準備する工程、蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液を調製する工程、及び、当該酵素液を乾燥させる工程を含む。
蛋白質脱アミド酵素を準備する工程において、蛋白質脱アミド酵素は、上述の「1−1.蛋白質脱アミド酵素」に記載した由来生物から公知の培養方法で当業者によって適宜製造することができる。培養方法としては、固体培養法及び液体培養法などの培養法が挙げられるが、好ましくは液体培養法が利用される。
酵素液を調製する工程においては、蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造の場合は、蛋白質脱アミド酵素が、塩化マグネシウム、及び必要に応じ、塩化カルシウム及び上述の他の成分からなる群から選択される成分を含む酵素液として調製される。酵素液の調製においては、例えば、塩化マグネシウムを、材料の総重量(乾燥重量換算)に対して例えば1.0〜10.0重量%、又は、蛋白質脱アミド酵素の活性当たりの量として例えば0.01〜2.0mg/u含ませることができる。より具体的には、上述の「1−2.塩化マグネシウム」に記載の量で含ませることができる。またこの場合、酵素液のpHは特に限定されず、たとえば2以上が挙げられ、8以下が挙げられる。さらに、塩化マグネシウムを含まない場合に比べた塩化マグネシウムによる安定性向上効果をより有効に得る観点では、酵素液のpHは4以上に調整することが好ましく、8以下に調整することが好ましい。より具体的には、上述の「1−5.水に溶解させた場合のpH」に記載のpHが挙げられる。また、塩化カルシウムを含ませる場合は、塩化カルシウムを、材料の乾燥重量の総量に対する割合として例えば1.0重量%以上、10.0重量%以下、又は、塩化マグネシウムと塩化カルシウムとの総量100重量部に対する量が15重量部以上、85重量部以下となる量で含ませるこができる。より具体的には、上述の「1−2.塩化カルシウム」に記載の量で含ませることができる。
酵素液を乾燥させる工程では、上述の工程で得られた酵素液を乾燥させる。乾燥の手法としては、例えば凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥等が挙げられる。これによって、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物が得られる。
本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、各種蛋白質に作用させることにより、蛋白質中のアミド基を直接脱アミドすることができる。その結果生じた脱アミド化蛋白質は、負電荷の増加に伴い、pIの低下、水和力の上昇、静電反発力の上昇がもたらされる。更に蛋白質の高次構造の変化により、表面疎水性の上昇がもたらされる。これらの効果により、可溶性・分散性の向上、起泡性・泡沫安定性の向上、乳化性・乳化安定性の向上など、蛋白質の機能性の改善がもたらされる。
本発明は、蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる方法も提供する。具体的には、本発明の安定性向上方法は、乾燥酵素組成物において、蛋白質脱アミド酵素とともに、塩化マグネシウムを共存させることを特徴とする。又は、本発明の安定性向上方法は、蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物を1w/v%となるように水に溶解させた場合のpHが2以上5未満となるように調整すること(具体的には、上述の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造方法における酵素液を調製する工程で記載したように、酵素液のpHを2以上5未満に調整することによって行うことができる。)を特徴とする。
以下の試験例において、蛋白質脱アミド酵素としては、天野エンザイム株式会社製蛋白質脱アミド酵素製剤「Protein−glutaminase“Amano”500」(クリセオバクテリウム属由来)、500u/gを用いた。「Protein−glutaminase“Amano”500」は、蛋白質脱アミド酵素以外にデキストリンを含み、活性が500u/gとなるように調整された酵素製剤である。なお、蛋白質脱アミド酵素は、以下の方法で取得してもよい。クリセオバクテリウム・エスピー No.9670(Chryseobacterium sp. No.9670)を、特許文献2に記載の方法に準じ、LB Base培地(Gibco社製)で25℃、2〜7日間振盪培養し、その後遠心上清を得る。培養終了後、培養液を遠心分離(12000rpm、4℃、20分間)し、上清を粗酵素液として得、限外ろ過(UF)濃縮(SEP-0013)、塩析、フェニールセファロース、セファクリルS−100により処理し酵素を精製する。
以下の試験例において、蛋白質脱アミド酵素を含む組成物における蛋白質脱アミド酵素活性は以下のように測定した。なお、以下において、基質であるZ−Gln−Glyは、N−ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミニルグリシンを表す。
1.30mM Z−Gln−Glyを含む0.2Mリン酸緩衝液(pH6.5)1.0mlへ0.002% Triton−Xを含む0.2Mリン酸緩衝液(pH6.5)を用いて適当に希釈した試料溶液0.1mlを添加し、37℃にて10分間インキュベートした後、0.4Mトリクロロ酢酸1.0ml添加し、反応を停止した。
2.テストキットアンモニア(wako純薬)にて遊離アンモニア量を定量した。
具体的には、反応液0.2mlを精製水0.8mlと混合した後に、発色試液A(0.43Mフェノール、0.5Mペンタシアノニトリル鉄(III)酸ナトリウム二水塩溶液)1.0mlを加えて混合し、更に発色試液B(0.89M水酸化カリウム水溶液)0.5mlを加えて混合し、そこへ発色試液C(炭酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液)1.0mlを加えて混合した後に、37℃にて20分間インキュベートした。その後、波長630nmによる吸光度(A1)を測定した。
3.ブランクとして試料溶液0.1mlへ0.4Mトリクロロ酢酸1.0ml添加した後に、30mM Z−Gln−Glyを含む0.2Mリン酸緩衝液(pH6.5)1.0mlを混合した溶液も同様の発色操作を行い、吸光度(A2)を測定した。
4.1分間に1μmolのアンモニアを生成する酵素量を1uとし、蛋白質脱アミド酵素活性(PG活性)を次式より算出した。
PG活性(u/g)= F x (A1-A2) x (1/17.03) x (2.1/0.1) x (1/10) x N
F:アンモニア検量線の作成により算出される定数
17.03:アンモニア分子量
2.1:反応液総量
0.1:試料添加量
10:反応時間(分)
N:希釈倍数
(1)蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の調製
「Protein−glutaminase“Amano”500」(天野エンザイム株式会社製)(500u/g)を水に溶解し、塩化マグネシウムを、表1に示す配合(蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、塩化マグネシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量(乾燥重量換算)に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの蛋白質脱アミド酵素製剤の重量)となるように溶解させ、酵素液を得た。また、比較例として、塩化マグネシウムを含まない(無添加)酵素液、及び塩化マグネシウムをシステイン又は塩化カルシウムに置き換えた酵素液も同様に、表1に示す配合(タンパク質脱アミド酵素及びデキストリンを含む蛋白質脱アミド酵素製剤、並びに、蛋白質脱アミド酵素、デキストリン及びシステイン又は塩化カルシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量(乾燥重量換算)に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの重量)で調製した。これらの酵素液は、1M塩酸及び1M水酸化ナトリウムを用いてpH6.0(25℃)に調整した。
得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋(凸版印刷株式会社)に入れ、ヒートシールで密封した後、−20℃及び60℃それぞれの温度条件にて2日保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性(%)を、−20℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する60℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
(1)蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の調製
塩化マグネシウムの重量割合を2.5重量%としたことを除いて、試験例1と同様に同様に、噴霧乾燥品として蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物(実施例2)を調製し、以下の安定評価試験に供した。また、試験例1で得られた、無添加の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物(比較例1)及び当該重量割合が6.5重量%である蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物(実施例1)についても、以下の安定性評価試験に供した。
得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋(凸版印刷株式会社)に入れ、ヒートシールで密封した後、−20℃及び40℃それぞれの温度条件にて1ヶ月保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性(%)を、−20℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する40℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
「Protein−glutaminase“Amano”500」(天野エンザイム株式会社製)(500u/g)を水に溶解し、塩化マグネシウム、又は塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを、表3に示す配合(蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、及び塩化マグネシウムを含む、又はさらに塩化カルシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤を含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量(乾燥重量換算)に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの蛋白質脱アミド酵素製剤の重量)となるように溶解させ、酵素液を得た。酵素液は、1M塩酸及び1M水酸化ナトリウムを用いてpH6(25℃)に調整した。
得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋(凸版印刷株式会社)に入れ、ヒートシールで密封した後、−20℃及び40℃それぞれの温度条件にて1ヶ月保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性(%)を、−20℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する40℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋(凸版印刷株式会社)に入れ、ヒートシールで密封した後、40℃の温度条件にて1ヶ月保存した後、粉末の外観を目視で観察し、以下の基準に基づいて粉末特性を評価した。
○:固結及び潮解が観察されなかった。
△:軽度の固結又は潮解が観察された。
×:重度の固結又は潮解が観察された。
(1)蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の調製
「Protein−glutaminase“Amano”500」(天野エンザイム株式会社製)(500u/g)を水に溶解し、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを、表4に示す配合(蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量(乾燥重量換算)に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの蛋白質脱アミド酵素製剤の重量)となるように溶解させ、酵素液を得た。なお、表4で「無添加」と記載された例では、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含まない酵素液を得た。これらの酵素液は、1M塩酸及び/又は1M水酸化ナトリウムを用いてpH(25℃)を2、3、4、5、6、7及び8に調整した。
なお、得られた蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物(pH2、3、4、5、6、7及び8それぞれの酵素液から得られたもの)を再び1w/v%となるように水に再溶解させると、再溶解後のpH(25℃)は、それぞれ、2、3、4、5、6、7及び8であった。
得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋(凸版印刷株式会社)に入れ、ヒートシールで密封した後、−20℃及び40℃それぞれの温度条件にて1ヶ月保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性(%)を、−20℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する40℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
(1)蛋白質脱アミド酵素液状組成物の調製
「Protein−glutaminase“Amano”500」(天野エンザイム株式会社製)(500u/g)をBrixが25%となるように水に溶解し、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを、表5に示す量(蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムの総重量(乾燥重量換算)に対する量、及び、乾燥製剤とした場合の蛋白質脱アミド酵素活性当たりの重量)となるように溶解させ、酵素液を得た。なお、表6で「無添加」と記載された例では、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含まない酵素液を得た。酵素液は、1M塩酸及び/又は1M水酸化ナトリウムを用いてpH(25℃)を6及び7に調整することで、蛋白質脱アミド酵素液状組成物を得た。
得られた液状品をポリプロピレンチューブに入れ、蓋をした後、40℃にて1ヶ月保存した。保存後の保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性(%)を、保存前のの蛋白質脱アミド酵素活性に対する保存後の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
Claims (8)
- 蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
- 前記塩化マグネシウムの含有量が1.0〜10.0重量%である、請求項1に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
- 前記塩化マグネシウムの含有量が1.0〜6.0重量%である、請求項1に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
- 前記塩化マグネシウムの含有量が0.01〜2.0mg/uである、請求項1に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
- 蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素ともに、塩化マグネシウムを共存させる、安定性向上方法。 - 1w/v%となるように水に溶解させた場合のpHが2以上5未満である、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
- 蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
乾燥酵素組成物を1w/v%となるように水に溶解させた場合のpHが2以上5未満となるように調整する、安定性向上方法。 - pH2以上5未満である蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液を用意する工程と、前記酵素液を乾燥させる工程とを含む、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造方法。
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