JPWO2018139637A1 - 核酸封入aav中空粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 以下の工程を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)の核酸封入中空粒子の製造方法;
(1)(i)AAV逆位末端反復配列(ITR)のA領域の配列、
(ii)AAV ITRのA’領域の配列、及び
(iii)AAV ITRのD領域の配列及び/又はD’領域の配列、を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、
(2)AAVの中空粒子を産生する細胞に(1)の核酸断片を導入する工程、および
(3)(2)の細胞を培養する工程。
[2] 核酸断片が、5’末端から3’末端に向かって、A’領域の配列、A領域の配列及びD’領域の配列を含む、[1]記載の方法。
[3] 核酸断片が、5’末端から3’末端に向かって、D領域の配列、A’領域の配列及びA領域の配列を含む、[1]記載の方法。
[4] 核酸断片が、5’末端から3’末端に向かって、D領域の配列、A’領域の配列、A領域の配列及びD’領域の配列を含む、[1]記載の方法。
[5] 核酸断片を調製する工程が、核酸増幅反応による核酸断片の増幅を含む工程である、[1]記載の方法。
[6] 中空粒子を産生する細胞が、AAVのCap遺伝子、Rep遺伝子及びAAVのヘルパー機能が導入された細胞である、[1]記載の方法。
[7] 以下の工程を含むAAVの核酸封入中空粒子の製造方法;
(a)(i)AAV ITRのA領域−D’領域の配列を少なくとも3つ、又は
(ii)A領域−D’領域に相補的な配列、
を含む核酸を調製する工程、
(b)AAVの中空粒子を産生する細胞に(a)の核酸を導入する工程、
(c)(b)の細胞を培養する工程。
[8] 核酸がプラスミドである、[7]記載の方法。
[9] 中空粒子を産生する細胞が、AAVのCap遺伝子、Rep遺伝子及びAAVのヘルパー機能が導入された細胞である、[7]記載の方法。
(1)(i)AAV ITRのA領域の配列、
(ii)AAV ITRのA’領域の配列、及び
(iii)AAV ITRのD領域の配列及び/又はD’領域の配列、を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、
(2)AAVの中空粒子を産生する細胞に(1)の核酸断片を導入する工程、および
(3)(2)の細胞を培養する工程。
前記(1)工程の直鎖状核酸断片は、(i)ITRのA領域の配列、(ii)ITRのA’領域の配列、及び(iii)D領域の配列及び/又はD’領域の配列を含む。これらの配列は、公知の天然AAV血清型のゲノムDNAの配列(例えば、血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11)が使用できる。各血清型のITRにおいて、A領域、B領域、B’領域、C領域、C’領域、A’領域が特定されている。D領域は、ITRのA’領域の末端のうち、C’領域の反対側(3’末端側又は5’末端側)に存在する。各血清型のD領域の配列及びそのD領域の配列に相補的で逆方向の配列であるD’領域の配列も特定されている。A領域、A’領域、D領域、及びD’領域は、異なる血清型に由来してもよい。さらに、Repとの結合能及びヘアピン形成能を保持する範囲内において、天然のA領域の配列の変異体も使用でき、その場合のA’領域の配列は変異体のA領域の配列と相補的である。また、本発明は天然のD領域の配列の変異体も使用でき、その場合のD’領域の配列は変異体のD領域の配列と相補的である。
(a)(i)AAV ITRのA領域−D’領域の配列を少なくとも3つ、又は
(ii)A領域−D’領域に相補的な配列(D領域−A’領域の配列)、
を含む核酸を調製する工程、
(b)AAVの中空粒子を産生する細胞に(a)の核酸を導入する工程、
(c)(b)の細胞を培養する工程。
前記(1)工程の核酸断片又は前記(a)工程の核酸を、AAVの中空粒子を産生する細胞に導入する。核酸断片又は核酸を導入する細胞は、例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞(例えば、ヒト細胞)などを含む哺乳類細胞、昆虫細胞などの様々な真核細胞が使用できる。本明細書において、AAVや核酸封入中空粒子を産生する細胞をパッケージング細胞又はプロデューサー細胞ともいうことがある。適当な哺乳類細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、HEK293細胞、293EB細胞、COS細胞、HeLa細胞、Vero細胞、3T3マウス線維芽細胞、C3H10T1/2線維芽細胞、CHO細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。適当な昆虫細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、Sf9細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。
前記(B)で核酸断片又は核酸を導入した細胞の培養は、細胞に応じて公知の培養条件で行うことができる。例えば温度30〜37℃、湿度95%、CO2濃度5〜10%での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望の細胞の増殖、核酸封入中空粒子の産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、CO2濃度で実施してもよい。
本発明は、前記(1)工程の核酸断片又は前記(a)工程の核酸が封入された中空粒子を提供する。本発明の中空粒子は天然の完全なAAVゲノムを保持しておらず、AAVのRep遺伝子及び/又はAAVのCap遺伝子の配列を含む核酸を保持していない。好適には、本発明の中空粒子はさらに、天然の完全なITRを保持しておらず、A領域、A’領域、B領域、B’領域、C領域、C’領域、D領域からなる群より選択される少なくとも1つの領域の配列を保持していない。さらに、本発明は前記の核酸封入中空粒子を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の方法で得られる核酸封入中空粒子の少なくとも一つを含むことを特徴とする。
(1)AD’搭載プラスミドの構築
AAV2ゲノムDNAのITRに存在するAD’配列(A領域−D’領域にわたる61bp:配列番号1)を含み、その両端に制限酵素AflIIIの認識配列を有する二本鎖DNAを、それぞれ化学合成した両鎖をアニーリングさせることにより調製した。この二本鎖DNAをpAcGFP1−N1 Vector(クロンテック、タカラバイオUSA社製)のCMVプロモーターの上流にあるAflIIIサイトに、AD’配列が5’から3’に順向き挿入されたプラスミドAD−F、逆向きに挿入されたプラスミドAD−Rを調製した。さらに、3つのAD’配列が順向きに挿入されたプラスミドAD−3Fを調製した。また、陰性コントロールとして人工遺伝子を挿入しないプラスミドAD(−)を調製した。さらに、陽性コントロールとして、AcGFP遺伝子を搭載するAAVゲノムを生成するプラスミドss−AAV、プラスミドds−AAVを調製した。プラスミドss−AAVは、AAV Helper−Free System(Agilent Technologies社製)のpAAV−MSCベクターのマルチクローニングサイトにAcGFP遺伝子が挿入されている。プラスミドds−AAVは、Arun Srivastava博士より供与されたプラスミドpdsAAV−CB−eGFPのeGFP遺伝子をAcGFPに置換している。各プラスミドの概略図を図1に示す。図1中、AD’配列は「AD」と記載している。
実施例1−(1)で得た各プラスミドを1μg/μLに調製し、AAV9のCapとAAV2のRepを発現するpAAV2/9 Vector(配列番号11)及びpAd5N(Agilent Technologies)とともに、Polyethyleneimine”Max”(コスモバイオ社製)を用いて293EB細胞(国際公開第2012/144446号パンフレット)にトランスフェクションした。トランスフェクション後、293EB細胞を1/100容量のGlutaMax(Gibco社製)を含むDMEM培地中で、37℃、5%CO2で3日間培養した。
実施例1−(2)で培養した293EB細胞の培養上清から、塩化セシウム密度勾配遠心法にて核酸封入AAV中空粒子(AAV様粒子)を精製した。
実施例1−(3)で培養上清から得られたそれぞれのAAV様粒子を、CHO−K1細胞に以下のごとく感染させた。感染前日、2.8×104cellのCHO−K1細胞を48ウェルプレート上に播種した。翌日、実施例1−(3)で得たそれぞれのAAV様粒子を4.0×105v.g./cellで感染させた。感染後、CHO−K1細胞を37℃、5%CO2で3日間した後、AcGFPの発現を蛍光顕微鏡で観察した(図2)。図2に示すように、AD’配列が逆向きに搭載されたプラスミドおよび3つのAD’配列が順向きに搭載されたプラスミドは、順向きのAD’配列搭載プラスミドに比べて、効果的に中空粒子に取り込まれ、感染細胞におけるAcGFPの発現が確認された。AD’配列を含むプラスミドが導入された細胞からAcGFP遺伝子を含有するAAV様粒子が産生されたことが示された。
(1)AD配列を含むDNA断片の調製
配列番号4に記載するオリゴヌクレオチドFull、配列番号5に記載するオリゴヌクレオチドPlus、配列番号6に記載するオリゴヌクレオチドMinusを化学合成し、さらに、それぞれの相補鎖も化学合成し、それぞれアニーリングさせることにより二本鎖DNAを調製した。図3に各二本鎖DNAの構成を示す。AAVのITRのA領域の配列、D’領域の配列、A’領域の配列(A領域に相補的な配列)、D領域の配列(D’領域に相補的な配列)をそれぞれA配列、D’配列、A’配列、D配列と称し、図3中ではそれぞれA、D(+)、A’、D(−)と示す。図3に示すように、オリゴヌクレオチドFullは5’末端から順に、D配列及びA’配列、ループ配列、A配列、D’配列からなる。オリゴヌクレオチドPlusは5’末端から順に、A’配列、ループ配列、A配列、D’配列からなる。オリゴヌクレオチドMinusは5’末端から順に、D配列、A’配列、ループ配列、A配列からなる。D配列を配列番号7に、A’配列を配列番号8に、A配列を配列番号9に、D’配列を配列番号10にそれぞれ示す。
実施例2−(1)で得た各DNA断片75ngを、pAAV2/9 Vector及びpAd5N(pHelper Vector)とともに、Polyethyleneimine”Max”を用いて293EB細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション2日後、293EB細胞をグルコース、重炭酸ナトリウム、1/100容量のGlutaMaxを含むDMEM/F12(ThermoFisher社)培地に交換した。その後、37℃、5%CO2で5日間培養した。
実施例2−(2)で培養した293EB細胞の培養上清を回収後、上清にDNaseIを添加し、遊離DNAの分解を行った。分解後、上記同様にAL buffer (Qiagen社製)を加えて、AAVキャプシドを溶解し、パッケージングされたDNAの抽出を行った。AAV様粒子に含まれるDNA断片コピー数は、3’senseプライマー(配列番号12)と3’antisenseプライマー(配列番号13)を使用した定量PCRにより解析した(図4)。図4に示すように、AAVのITR由来する配列を含むDNA断片を導入することにより、当該DNA断片のAAV中空粒子へのパッケージングが起こることが示された。このようなDNA断片はPCRにより大量に調製することができ、AAV様粒子をより簡便に調製することができる。
SEQ ID NO: 2: AcGFP−f
SEQ ID NO: 3: AcGFP−r
SEQ ID NO: 4: Oligonucleotide Full
SEQ ID NO: 5: Oligonucleotide Plus
SEQ ID NO: 6: Oligonucleotide Minus
SEQ ID NO: 7: D region sequence
SEQ ID NO: 8: A’ region sequence
SEQ ID NO: 9: A region sequence
SEQ ID NO: 10: D’ region sequence
SEQ ID NO: 11: pAAV2/9 Vector
SEQ ID NO: 12: 3’ sense primer
SEQ ID NO: 13: 3’ antisense primer
Claims (9)
- 以下の工程を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)の核酸封入中空粒子の製造方法;
(1)(i)AAV逆位末端反復配列(ITR)のA領域の配列、
(ii)AAV ITRのA’領域の配列、及び
(iii)AAV ITRのD領域の配列及び/又はD’領域の配列、を含む直鎖状核酸断片を調製する工程、
(2)AAVの中空粒子を産生する細胞に(1)の核酸断片を導入する工程、および
(3)(2)の細胞を培養する工程。 - 核酸断片が、5’末端から3’末端に向かって、A’領域の配列、A領域の配列及びD’領域の配列を含む、請求項1記載の方法。
- 核酸断片が、5’末端から3’末端に向かって、D領域の配列、A’領域の配列及びA領域の配列を含む、請求項1記載の方法。
- 核酸断片が、5’末端から3’末端に向かって、D領域の配列、A’領域の配列、A領域の配列及びD’領域の配列を含む、請求項1記載の方法。
- 核酸断片を調製する工程が、核酸増幅反応による核酸断片の増幅を含む工程である、請求項1記載の方法。
- 中空粒子を産生する細胞が、AAVのCap遺伝子、Rep遺伝子及びAAVのヘルパー機能が導入された細胞である、請求項1記載の方法。
- 以下の工程を含むAAVの核酸封入中空粒子の製造方法;
(a)(i)AAV ITRのA領域−D’領域の配列を少なくとも3つ、又は
(ii)A領域−D’領域に相補的な配列、
を含む核酸を調製する工程、
(b)AAVの中空粒子を産生する細胞に(a)の核酸を導入する工程、
(c)(b)の細胞を培養する工程。 - 核酸がプラスミドである、請求項7記載の方法。
- 中空粒子を産生する細胞が、AAVのCap遺伝子、Rep遺伝子及びAAVのヘルパー機能が導入された細胞である、請求項7記載の方法。
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