JPWO2018097189A1

JPWO2018097189A1 - 幹細胞の分離方法及びノルボルネン系重合体で構成される不織布の使用

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Publication number: JPWO2018097189A1
Application number: JP2018552623A
Authority: JP
Inventors: 石塚　保行; 保行石塚; 慧足達
Original assignee: BIO MIRAI KOUBOU CO., LTD.; Zeon Corp
Current assignee: BIO MIRAI KOUBOU CO., LTD.; Zeon Corp
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2019-10-17
Anticipated expiration: 2037-11-22
Also published as: JP7018650B2; WO2018097189A1

Abstract

単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養する。幹細胞を含む組織由来細胞群を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される不織布上で培養する、幹細胞の分離方法を提供する。

Description

本発明は、幹細胞を含む細胞群から幹細胞を分離する幹細胞の分離方法、及びこの方法を実施するためのノルボルネン系重合体で構成される不織布の使用に関する。

近年、幹細胞又は幹細胞から派生した細胞を用いて、ダメージを受けた患者の細胞や組織を修復したり再生したりする幹細胞治療の開発が進んでいる。例えば、特許文献１には、患者から脂肪組織を取得し、濃縮処理により濃縮された幹細胞を患者へ投与する閉鎖系の治療システムが提案されている。

こうした目的に用いられる幹細胞は、脂肪吸引手術により取得された脂肪組織細胞群などから調製される。採取された脂肪組織細胞群から幹細胞を取得するためには、通常、遠心分離処理やコラゲナーゼ等の酵素による処理を行い、脂肪幹細胞や繊維芽細胞や血管内皮細胞や血管平滑筋様細胞などの脂肪組織由来細胞と血液由来細胞とその他の細胞とからなる間質血管細胞群を得る（例えば、特許文献２参照）。

国際公開第０３／０５３３４６号国際公開第２００５／０４２７３０号特開２０１３−０３４４３６号公報特開２００８−１９９８９７号公報

このようにして得られた細胞群にも様々な細胞が含まれており、この中から幹細胞を効率よく単離することが求められている。

不織布を幹細胞の分離に用いる例は多くあり、通常、特許文献３などに記載されているように、不織布は濾過基材として用いられている。しかしながら、この方法では、細胞の懸濁液を調製する必要があり、懸濁液の濃度調整なども必要となる。
一方、細胞の懸濁液を用いない方法として、特許文献４では、ハイドロキシアパタイトで表面をコートした不織布を用いて細胞を培養する方法が提案されている。しかしながら、この方法は、不織布表面のハイドロキシアパタイトが均一にコートされていることを担保することが難しいことに加え、不織布に塗布されたハイドロキシアパタイトが剥離しやすいという問題を有している。

本発明は、かかる従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、組織由来細胞群からの幹細胞の分離方法について鋭意検討を行った。
その結果、少なくとも細胞を培養する面（培養面）がノルボルネン系重合体で構成される不織布上で、脂肪組織由来細胞群を培養すると、表面コート処理などをしなくても脂肪幹細胞のみが不織布表面に接着するため、脂肪幹細胞を選択的に分離培養することができ、結果として、脂肪幹細胞を分離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

かくして本発明によれば、下記（１）、（２）の幹細胞の分離方法、及び（３）のノルボルネン系重合体で構成される不織布の使用が提供される。
（１）幹細胞を含む組織由来細胞群を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される不織布上で培養する、幹細胞の分離方法。
（２）前記組織由来細胞群が、脂肪組織由来の細胞群である、（１）に記載の幹細胞の分離方法。
（３）幹細胞を含む組織由来細胞群から幹細胞を分離するための、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される不織布の使用。

本発明によれば、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することができる。

図１は、実施例１におけるゼオノア不織布上に増殖している培養開始から１８日後の脂肪組織由来の間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の位相差顕微鏡写真である。図２は、実施例１におけるゼオネックス不織布２上に増殖している培養開始から１８日後のＡＳＣの位相差顕微鏡写真である。図３は、実施例１において、フラスコ内で４日間継代培養したＡＳＣの位相差顕微鏡写真である。図４は、実施例２におけるゼオノア不織布上に増殖している培養開始から１８日後の骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）の位相差顕微鏡写真である。図５は、実施例２におけるゼオネックス不織布１上に増殖している培養開始から１８日後のＢＭＳＣの位相差顕微鏡写真である。図６は、実施例２において、フラスコ内で４日間継代培養したＢＭＳＣの位相差顕微鏡写真である。図７は、比較例におけるＢＭＳＣの位相差顕微鏡写真である。図８は、比較例におけるＢＭＳＣの位相差顕微鏡写真である。図９は、実施例３における脂肪細胞が染色された顕微鏡写真である。図１０は、実施例３における骨芽細胞が染色された顕微鏡写真である。図１１は、実施例３における軟骨細胞が染色された顕微鏡写真である。図１２は、実施例３における神経細胞が染色された蛍光顕微鏡写真である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明に用いるノルボルネン系重合体で構成される不織布（以下、単に「本発明に用いる不織布」又は「不織布」ということがある）は、少なくとも培養面が繊維状のノルボルネン系重合体で構成されるものである。
本発明の不織布において、「少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される」とは、少なくとも細胞を培養する面（細胞と接触する部分、例えば、不織布の片面を構成する繊維）が、ノルボルネン系重合体を含むことを意味する。なお、培養面がノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよい。

本発明に用いる不織布は、通常、細胞を培養するのに用いられる様々な容器の中に入れて用いることができる。不織布は容器底面から浮いていても、容器底面に沈んでいても良い。また、細胞は不織布の片面のみに接着していても、両面に接着していても良いが、細胞の保持性の観点から、不織布は容器の底面全面を覆い、不織布の片面のみに細胞を接着させ、増殖させることが望ましい。
不織布を入れる容器の材質は特に制限されず、細胞培養用のポリスチレン製容器やガラス容器などの従来公知の容器を用いることができる。

本発明に用いる不織布を構成するノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体単位を、ノルボルネン系重合体を構成する全単量体単位に対して５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上含む重合体である。より具体的には、ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。

開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の一種若しくは二種以上の混合物を開環重合して得られる開環重合体、ノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体とを開環重合して得られる開環重合体、及び、これらの水素化物などが挙げられる。
付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の一種若しくは二種以上の混合物を付加重合して得られる付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体とを付加重合して得られる付加重合体などが挙げられる。
これらの中でも、本願発明の効果がより得られ易いことから、ノルボルネン系単量体の一種若しくは二種以上の混合物を開環重合して得られる開環重合体の水素化物、又は、ノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体とを開環重合して得られる開環重合体の水素化物が好ましく、ノルボルネン系単量体の一種若しくは二種以上の混合物を開環重合して得られる開環重合体の水素化物がより好ましい。

ノルボルネン系重合体の合成に使用可能なノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（慣用名ノルボルネン）、５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５，５−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチリデン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−ビニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メチル−５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン等の２環式単量体；
トリシクロ［４．３．０^１，６．１^２，５］デカ−３，７−ジエン（慣用名ジシクロペンタジエン）、２−メチルジシクロペンタジエン、２，３−ジメチルジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
テトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８，９−ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチル−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデン−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−メチル−８−カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、
７，８−ベンゾトリシクロ［４．３．０．１^２，５］デカ−３−エン（慣用名メタノテトラヒドロフルオレン：１，４−メタノ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４−メタノ−８−メチル−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−クロロ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−ブロモ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
これらのノルボルネン系単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、１，５−シクロデカジエン、１，５，９−シクロドデカトリエン、１，５，９，１３−シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。

ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等の炭素数２〜２０のα−オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０^２，１０．０^３，８］テトラデカ−３，５，７，１２−テトラエン（３ａ，５，６，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノ−１Ｈ−インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４−ヘキサジエン、４−メチル−１，４−ヘキサジエン、５−メチル−１，４−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α−オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらのその他の単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。
開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウムなどの金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデンなどの金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウムなどの遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素−炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。

ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。
付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。

ノルボルネン系重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００〜５００，０００、より好ましくは８，０００〜２００，０００、特に好ましくは１０，０００〜１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。

ノルボルネン系重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０〜３００℃、好ましくは１００〜２８０℃、特に好ましくは１１５〜２５０℃、さらに好ましくは１３０〜２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
本発明においてガラス転移温度は、ＪＩＳＫ７１２１に基づいて測定されたものである。

ノルボルネン系重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、不織布を構成する樹脂成分として、ノルボルネン系重合体に加えて、任意で、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。ここで、ノルボルネン系重合体に対して軟質重合体を混合して用いる場合には、ノルボルネン系重合体である脂環構造含有重合体１００質量部に対して、通常０．０１〜２０質量部、好ましくは０．０５〜１０質量部、より好ましくは０．０５〜５質量部である。

また、不織布を構成する樹脂成分として、ノルボルネン系重合体、及び上述した配合剤の一つである軟質重合体以外に、その他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。ノルボルネン系重合体に混合されるその他の重合体の量は、ノルボルネン系重合体１００質量部に対して、通常２００質量部以下、好ましくは１５０質量部以下、より好ましくは１００質量部以下である。
ノルボルネン系重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれもノルボルネン系重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。

ノルボルネン系重合体と、配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機などを用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法などが挙げられる。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。

本発明に用いる不織布を製造する方法に格別な制限はなく、一般的な不織布の製造方法を採用することができる。
なかでも、後述する好ましい繊維径、目付量及び表面被覆率を有する不織布を製造する場合、メルトブロー法を用いる方法が好適に採用される。

本発明で用いる不織布の繊維径は、好ましくは１０〜２０μｍである。ここで繊維径は、不織布の表面をデジタルマイクロスコープＶＨＸ−１０００（キーエンス社製）を用いて、撮影し、測定した値である。
不織布の目付量は、好ましくは０．８ｍｇ／ｃｍ^２〜１．０ｍｇ／ｃｍ^２である。ここで目付量は、３ｃｍ四方の不織布の重量から単位面積当たりの重量を算出した値である。
不織布の表面被覆率は、好ましくは５０％〜９５％である。ここで表面被覆率は、前記デジタルマイクロスコープで撮影した画像を、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いて、画像全体の面積から繊維が存在していない空隙部を除いた面積を画像全体の面積から除して換算した値である。

本発明に用いる不織布は、通常、滅菌処理して用いられる。滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法；高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、任意に選択することができる。

本発明に用いる不織布上で培養される幹細胞を含む組織由来細胞群は、幹細胞を含む複数種類の細胞を含む組織由来の細胞群であれば、特に限定されない。例えば、細胞治療に供する間葉系血管細胞群、脂肪由来細胞群、骨髄由来細胞群などが挙げられる。また、これらの細胞群から、一部の細胞が既に分離されたものであっても良い。

かかる不織布を用いて、組織由来細胞群より幹細胞を分離するための培地は、分離対象となる幹細胞を増殖させることのできる培地を用いれば良く、特に未分化性を維持したまま増殖させることのできる培地を用いるのが好ましい。このような培地は市販されており、例えば、脂肪由来幹細胞であれば、コージンバイオ社製のＫＢＭＡＤＳＣシリーズなどが挙げられ、骨髄由来幹細胞であれば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製のＳｔｅｍｌｉｎｅ、間葉系幹細胞増殖培地シリーズなどが挙げられる。

培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、タンパク質等の誘導因子、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。

細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃〜３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。

本発明は、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される不織布上で、組織由来細胞群を培養すると、脂肪幹細胞のみが接着して培養することができ、結果として、脂肪幹細胞を分離することができるというものである。

分離された幹細胞は、幹細胞治療用途に用いるほか、更に分化誘導培地にて培養することにより分化細胞を得、創薬用途や医療用途に利用することができる。

本発明の方法により単離された幹細胞を分化誘導する場合に用いられる培地は、幹細胞の分化誘導に適した培地を用いれば良く、基礎培地に分化誘導するための添加剤を加えた培地や、市販の分化誘導培地を用いることができる。

分化誘導するための添加剤としては、細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチンなどの細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝又は２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内又はミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；ウィルスベクターなどと組み合わせて細胞内に導入することができるＤＮＡやＲＮＡ；等が挙げられる。
これらの添加剤は、一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
市販の分化誘導培地としては、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製「ＳｔｅｍＣｅｌｌＫｉｔｓ」などが挙げられる。

以下、本発明を、実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。

＜ノルボルネン系重合体で構成される不織布＞
ノルボルネン系重合体（ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ、日本ゼオン社製；ノルボルネン系開環重合体水素化物）、及び、ノルボルネン系重合体（ゼオネックス（登録商標）５０００、日本ゼオン社製；ノルボルネン系開環重合体水素化物）を用いて、メルトブロー法で、以下の条件により、ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ製の不織布（以下「ゼオノア不織布」という）、及び、ゼオネックス（登録商標）５０００製の、２種の不織布(以下、「ゼオネックス不織布１」、「ゼオネックス不織布２」という）を、それぞれ作製した。

＜ゼオノア不織布＞
・樹脂：ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ
・ノズル温度：２９３℃
・ダイス温度：２９８℃
・回転数：１００ｒｐｍ
・コンベアースピード：１４．５ｍ／ｍｉｎ
・紡糸口金からコレクターまでの距離（以下、「ＤＣＤ」という）：４５ｍｍ

＜ゼオネックス不織布１＞
・樹脂：ゼオネックス（登録商標）５０００
・ノズル温度：３００℃
・ダイス温度：２９０℃
・回転数：１００ｒｐｍ
・コンベアースピード：１４．２ｍ／ｍｉｎ
・ＤＣＤ：８５ｍｍ

＜ゼオネックス不織布２＞
・樹脂：ゼオネックス（登録商標）５０００
・ノズル温度：２９８℃
・ダイス温度：２９０℃
・回転数：１００ｒｐｍ
・コンベアースピード：１４．２ｍ／ｍｉｎ
・ＤＣＤ：５２ｍｍ

得られた不織布の繊維径、目付量及び表面被覆率は以下の通りである。
・ゼオノア不織布：繊維径１０．０５μｍ、目付量０．９８ｍｇ／ｃｍ^２、表面被覆率９１％
・ゼオネックス不織布１：繊維径１５．０５μｍ、目付量０．９４ｍｇ／ｃｍ^２、表面被覆率５８％
・ゼオネックス不織布２：繊維径１３．３３μｍ、目付量０．８１ｍｇ／ｃｍ^２、表面被覆率８２％

［実施例１］
＜脂肪組織からのＡＳＣの分離＞
ヒトより摘出した直径約３ｍｍの脂肪組織を４分割し、このものを直径２ｃｍの円形に切り取られたゼオノア不織布及びゼオネックス不織布２に乗せた後、この組織が乗った不織布をそれぞれ別の細胞培養用ポリスチレン製ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）、コーニング社製、直径３５ｍｍのＴＣＰＳ）に入れた。
その後、当該ディッシュに、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）、シグマアルドリッチ社製）を入れ、５％ＣＯ_２雰囲気３７℃の条件で培養した。
いずれの不織布上でも、７〜１０日後に、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）が分離増殖し始めたのが確認できた。ＡＳＣの分離増殖を確認したら培地を交換し、培養を継続し、培養開始から１８日後、ＡＳＣを不織布からトリプシン−ＥＤＴＡで剥がした後、２７９．８ｍＬの細胞培養用フラスコ（型番「Ｔ−７５」、エッペンドルフ社製）に移し、同じ培地で４日間継代培養すると９０％コンフルエントになった。
ゼオノア不織布及びゼオネックス不織布２上に増殖している培養開始から１８日後のＡＳＣの位相差顕微鏡写真（倍率６４倍）を図１及び図２に示す。いずれの不織布上にもＡＳＣが増殖していることが確認される。
また、細胞培養用フラスコに移して４日間継代培養した時の位相差顕微鏡写真（倍率６４倍）を図３に示す。ＡＳＣが増殖していることが確認される。

［実施例２］
＜骨髄液からのＢＭＳＣの分離＞
ヒトより採取した骨髄液１０ｍｌに、ＨａｎｋｓＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を当量加え、良く攪拌して骨髄液希釈液を調製した。直径２ｃｍの円形に切り取られたゼオノア不織布及びゼオネックス不織布１を、１００μｍのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）型番３５２３６０、コーニング社製）にそれぞれセットし、先に調製した骨髄液希釈液を通し、ＨＢＳＳで２回洗浄した後、不織布をそれぞれ別の細胞培養用ポリスチレン製ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）、コーニング社製、直径３５ｍｍのＴＣＰＳ）に入れた。その後、当該ディッシュに、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）；シグマアルドリッチ社製）を入れ、５％ＣＯ_２雰囲気３７℃の条件で培養した。
いずれの不織布でも、７〜１０日後に、骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）が分離増殖し始めたのが確認できた。ＢＭＳＣの分離増殖を確認した後、培地を交換し、さらに培養を継続した。培養開始から１８日後、ＢＭＳＣを不織布からトリプシン−ＥＤＴＡで剥がした後、２７９．８ｍＬの細胞培養用フラスコ（型番「Ｔ−７５」、エッペンドルフ社製）に移し、同じ培地で、４日間継代培養すると９０％コンフルエントになった。
ゼオノア不織布及びゼオネックス不織布１上に増殖している、培養開始から１８日後のＢＭＳＣの位相差顕微鏡写真（倍率６４倍）を図４及び図５に示す。いずれの不織布上にもＢＭＳＣが増殖していることが確認される。
また、このＢＭＳＣを細胞培養用フラスコに移して４日間継代培養したときの位相差顕微鏡写真（倍率６４倍）を図６に示す。ＢＭＳＣが増殖していることが確認される。

［比較例］
中芯ポリエチレン外層ポリプロピレン不織布（１０ｍｍ×３２ｍｍ）を６穴プレート入れ、そこにＢＭＳＣの懸濁液、３ｍＬ（０．４５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３日間培養した。培地は２％ＦＢＳを添加した間葉系幹細胞増殖培地〔シグマアルドリッチ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）〕を用いた。
その結果、中芯ポリエチレン外層ポリプロピレン不織布上には、ＭＳＣが僅かに接着しているだけで（図７）、プレート底面には１００％コンフルエントな状態で接着しており（図８）、幹細胞の分離効果が得られなかった。

［実施例３］
実施例１において、ゼオノア不織布及びゼオネックス不織布２上で分離され、その後継代されたＡＳＣ（以下、「継代ＡＳＣ）という）の分化誘導実験を、以下の通り行った。
（１）脂肪細胞への分化
継代ＡＳＣを２４ウェルマルチプレート（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７、コーニング社製）に、１．９×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）、シグマアルドリッチ社製）を入れ、５％ＣＯ_２雰囲気３７℃の条件で培養した。２４時間後、培地を捨て、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄してから、脂肪細胞分化培地（型番ＢＢＤＭ２、ＤＳファーマバイオメディカル社製）に交換して１週間培養した。その後、脂肪細胞培養用培地（型番ＢＢＡＭ１、ＤＳファーマバイオメディカル社製）に交換して、１週間培養した後、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ染色した。脂肪細胞が染色された顕微鏡写真を図９に示す。
図９から、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ染色された脂肪滴を持つ脂肪細胞が見られ、実施例１で得られた継代ＡＳＣは、脂肪細胞への分化能を有することが確認された。

（２）骨芽細胞への分化
継代ＡＳＣを２４ウェルマルチプレート（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７、コーニング社製）に、１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）、シグマアルドリッチ社製）を入れ、５％ＣＯ_２雰囲気３７℃の条件で培養した。その後、培地を骨芽細胞分化培地（型番ＢＢＯＢ１、ＤＳファーマバイオメディカル社製）に交換して、細胞の密集度６０％程度（約６０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で２週間培養した。その後、細胞をＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄ染色した。骨芽細胞が染色された顕微鏡写真を図１０に示す。
図１０から、細胞とその周囲がＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄで薄い赤で染色されたことから、カルシウムの沈着が認められ、実施例１で得られた継代ＡＳＣは、骨芽細胞への分化能も有することが確認された。

（３）軟骨細胞への分化
２４ウェルマルチプレート（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７、コーニング社製）に、１．６×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した継代ＡＳＣを５μＬ滴下して、２時間後に、軟骨細胞分化培地（ＳｔｅｍＰｒｏＣｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎＫｉｔ；型番Ａ１００７０−０１、コーニング社製）を添加し、５％ＣＯ_２雰囲気３７℃の条件で培養した。その後、４〜５日間隔で培地交換しながら２週間培養した。得られた細胞をＡｌｃｉａｎＢｌｕｅ染色した。軟骨細胞が染色された顕微鏡写真を図１１に示す。
図１１から、細胞とその周囲がＡｌｃｉａｎＢｌｕｅで青く染色されたことから、軟骨に多く含まれる酸性ムコ多糖の沈着が認められ、実施例１で得られた継代ＡＳＣは、軟骨細胞への分化能も有することが確認された。

（４）神経細胞への分化
継代ＡＳＣを２４ウェルマルチプレート（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７、コーニング社製）に、４．８×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）、シグマアルドリッチ社製）を入れ、５％ＣＯ_２雰囲気３７℃の条件で培養した。培養を開始してから４８時間後、培地を捨て、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄してから、神経細胞分化培地（ＨｙＣｌｏｎｅＡｄｖａｎｃｅＳＴＥＭＮｅｕｒａｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＫｉｔ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）に交換して、細胞の密集度３０％程度（約３０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で２日間培養したところ、神経突起が確認できた。そこで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）でラベリングした、マウス抗β−ＴｕｂｕｌｉｎＣｌａｓｓＩＩＩ抗体（フナコシ社より入手）で蛍光染色した。神経細胞が染色された蛍光顕微鏡写真を図１２に示す。
図１２から、細胞体及び突起が緑色に染色されていることから、成熟哺乳動物の神経細胞であることが認められ、実施例１で得られた継代ＡＳＣは、神経細胞への分化能も有することが確認された。

以上の結果から、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される不織布を用いることで、組織から幹細胞を容易に単離し、増殖させることができること、増殖させた幹細胞が高い分化能を有することがわかる。

Claims

幹細胞を含む組織由来細胞群を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される不織布上で培養する、幹細胞の分離方法。
組織由来細胞群が、脂肪組織由来である請求項１記載の幹細胞の分離方法。
幹細胞を含む組織由来細胞群から幹細胞を分離するための、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される不織布の使用。