JPWO2018062015A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、炭素原子数12〜18前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル4級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型4級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物由来の油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
また、炭素原子数が18以上の長鎖脂肪酸は不飽和度によって化学的性質が異なり、様々な用途に用いられている。例えば、エイコサペンタエン酸といった多価不飽和脂肪酸(以下、「PUFA」ともいう)の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。よってPUFAは栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数(鎖長)や不飽和結合数(不飽和度)に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。
特に近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産できる。そして、藻類のうち微細藻類は食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産能力、脂質蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成や蓄積のメカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。
これまでに、脂肪酸の生合成において、脂肪酸の炭素原子数(鎖長)の制御にACPを利用する方法が提案されている。例えば、タバコの葉緑体ゲノム又は核ゲノムに導入した、オリーブ由来のACPをコードする遺伝子を過剰発現させることで、炭素原子数18の不飽和脂肪酸の生産性を向上させる方法が非特許文献1に記載されている。また、ナズナ(Arabidopsis)由来のACPをコードする遺伝子をナズナで過剰に発現させることで、炭素原子数18の不飽和脂肪酸の1種であるα−リノレン酸の生産性を向上させる方法が、非特許文献2に記載されている。
(A)配列番号1の23位〜146位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
また本発明は、前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法に関する。
また本発明は、前記タンパク質(A)〜(C)をコードする遺伝子に関する。
さらに本発明は、前記タンパク質(A)〜(C)をコードする遺伝子を含んでなる、形質転換体に関する。
また本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供する。
本発明者はまず、脂肪酸の合成に関与するタンパク質として、藻類の1種であるナンノクロロプシス属の藻類から、ACPを新たに同定した。そして、新たに同定したACPをコードする遺伝子の発現を促進することで、生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
また本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基を脂肪酸と見做して合計した全脂肪酸(総脂肪酸)の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量(生産量)や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法(Science,1985,vol.227,p.1435-1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]記載の方法が挙げられる。例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
しかし、後述の実施例で示すように、ナンノクロロプシス属の藻類において、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を単に強化しただけでは、長鎖脂肪酸の生産性の変化は確認できなかった。
そこで、細胞内局在予測サイトTargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)を利用して、新たに同定したACPの局在部位の検討を行った。その結果、配列番号1で表されるアミノ酸配列にはミトコンドリア局在シグナルが含まれ、配列番号1の1位〜22位のアミノ酸配列が、ミトコンドリア局在シグナルのアミノ酸配列であると推定された。このことから、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシスの主要な脂肪酸合成の場である葉緑体に局在しないため、脂肪酸の生産性に影響を与えないと推定された。そこで、配列番号1で表されるアミノ酸配列から、ミトコンドリア局在シグナルを削除し、N末端側にナンノクロロプシス内で機能する葉緑体移行シグナル配列を付加したACPの部分配列をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を作製した。その結果、作製した形質転換体が生産する長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
本発明の形質転換体は、野生株自体に比べ、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性、特に、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合が有意に向上する。またその結果、本発明の形質転換体では、生産される脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、本発明の形質転換体は、特定の炭素原子数の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、特に長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数18以上の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数18若しくは20の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数18若しくは20の不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはオレイン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
以下、本明細書において、前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質の発現、又はこれをコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいう。これに対して、前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質の発現、又はこれをコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
なお、本明細書において「長鎖」とは、アシル基の炭素原子数が18以上、好ましくは炭素原子数が18又は20であることをいう。また、形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
後述の実施例で実証されているように、少なくとも配列番号1の23位〜146位までのアミノ酸配列を含んでなる組換えタンパク質は、ACPとして機能する。すなわち、配列番号1のアミノ酸配列において、23位〜146位までの領域がACP活性にとって十分な領域であると考えられる。
また、前記タンパク質(B)として、前記タンパク質(A)のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上38個以下、好ましくは1個以上31個以下、より好ましくは1個以上25個以下、より好ましくは1個以上19個以下、より好ましくは1個以上13個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上7個以下、より好ましくは1個以上5個以下、より好ましくは1個以上4個以下、より好ましくは1個以上3個以下、より好ましくは1個以上2個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつACP活性を有するタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質(C)を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列以外の配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号1の1位〜22位の任意のアミノ酸配列、又はこのアミノ配列に1個又は数個(好ましくは1個以上20個以下、より好ましくは1個以上15個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上5個以下、より好ましくは1個以上3個以下)の変異が導入されたアミノ酸配列、等が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のN末端側に付加されることが好ましい。
あるいは、前記タンパク質(C)として、配列番号1に示すアミノ酸配列において、配列番号1の1位〜22位の任意の位置でN末端側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、前記タンパク質(C)として、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。
(C1)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のN末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。
なお、ビオラキサンチン/クロロフィルa結合タンパク質のN末端側1位〜33位のアミノ酸配列、ACP2のN末端側1位〜44位のアミノ酸配列、NoKASIIIのN末端側1位〜70位のアミノ酸配列、NoKASIIのN末端側1位〜33位のアミノ酸配列、NoKASIVのN末端側1位〜28位のアミノ酸配列、NoTE2のN末端側1位〜73位のアミノ酸配列がそれぞれ、葉緑体移行シグナルであると推定される。さらに、ビオラキサンチン/クロロフィルa結合タンパク質のN末端側1位〜33位のアミノ酸配列、ACP2のN末端側1位〜70位のアミノ酸配列、NoKASIIIのN末端側1位〜70位のアミノ酸配列、NoKASIIのN末端側1位〜70位のアミノ酸配列、NoKASIVのN末端側1位〜70位のアミノ酸配列、NoTE2のN末端側1位〜73位のアミノ酸配列がそれぞれ、ナンノクロロプシス属に属する藻類を宿主として用いた場合、宿主細胞内で葉緑体移行シグナルとして機能するのに十分な配列であることは、本発明者により確認されている。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ODA法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット(タカラバイオ社)、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット(Clonetech社)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡社)等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所(NIES)から入手することができる。
(a)配列番号2の67位〜438位の塩基配列からなるDNA。
(b)前記DNA(a)の塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)前記DNA(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつACP活性を有するタンパク質をコードするDNA。
また前記DNA(b)として、前記DNA(a)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上112個以下、好ましくは1個以上93個以下、より好ましくは1個以上75個以下、より好ましくは1個以上56個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上27個以下、より好ましくは1個以上23個以下、より好ましくは1個以上19個以下、より好ましくは1個以上15個以下、より好ましくは1個以上12個以下、より好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上4個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACP活性を有する前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNAも好ましい。
さらに前記DNA(b)として、前記DNA(a)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有する前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNAも好ましい。
前記DNA(c)の塩基配列中、前記DNA(a)又は(b)の塩基配列以外の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号2の1位〜66位の任意の塩基配列、又はこの塩基配列に1又は数個(好ましくは1個以上60個以下、より好ましくは1個以上45個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上15個以下、より好ましくは1個以上9個以下)の変異が導入された塩基配列、等が挙げられる。変異としては、塩基の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記DNA(a)又は(b)の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
あるいは、前記DNA(c)として、配列番号2に示す塩基配列において、配列番号2の1位〜66位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるDNAであってもよい。また、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列が、前記DNA(a)又は(b)の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
(c1)前記DNA(a)又は(b)の塩基配列の5'末端側に、宿主細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列を連結したDNA。
NoACP1遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号1に示すアミノ酸配列又は配列番号2に示す塩基配列に基づいてNoACP1遺伝子を、人工的に合成できる。本発明において、葉緑体移行シグナルをコードする塩基配列の下流にNoACP1遺伝子を作動可能に連結させて作製した、NoACP1遺伝子発現用プラスミド又はカセットを用いることが好ましい。
NoACP1遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)]記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア(Escherichia)属の微生物やバシラス(Bacillus)属の微生物、シネコシスティス(Synechocystis)属の微生物、シネココッカス(Synechococcus)属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、赤色酵母(Rhodosporidium toruloides)、又はモルチエレラ・エスピー(Mortierella sp.)が好ましく、大腸菌がより好ましい。
藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス(Chlamydomonas)属の藻類、クロレラ(Chlorella)属の藻類、ファエオダクティラム(Phaeodactylum)属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ(Nannochloropsis gaditana)、ナンノクロロプシス・サリナ(Nannochloropsis salina)、ナンノクロロプシス・オセアニカ(Nannochloropsis oceanica)、ナンノクロロプシス・アトムス(Nannochloropsis atomus)、ナンノクロロプシス・マキュラタ(Nannochloropsis maculata)、ナンノクロロプシス・グラニュラータ(Nannochloropsis granulata)、ナンノクロロプシス・エスピー(Nannochloropsis sp.)等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、西洋アブラナ(Brassica napus)、アブラナ(Brassica rapa)、ココヤシ(Cocos nucifera)、パーム(Elaeis guineensis)、クフェア、ダイズ(Glycine max)、トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、クスノキ(Cinnamomum camphora)、又はヤトロファ(Jatropha curcas)が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript(pBS) II SK(-)(Stratagene社製)、pSTV系ベクター(タカラバイオ社製)、pUC系ベクター(宝酒造社製)、pET系ベクター(タカラバイオ社製)、pGEX系ベクター(GEヘルスケア社製)、pCold系ベクター(タカラバイオ社製)、pHY300PLK(タカラバイオ社製)、pUB110(1986,Plasmid 15(2),p.93-103)、pBR322(タカラバイオ社製)、pRS403(ストラタジーン社製)、及びpMW218/219(ニッポンジーン社製)が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19(タカラバイオ社製)、P66(Chlamydomonas Center)、P-322(Chlamydomonas Center)、pPha-T1(Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照)、及びpJET1(コスモ・バイオ社製)が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるDNA断片(遺伝子発現カセット)を用いて宿主を形質転換することもできる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター(タカラバイオ社製)、pBI系ベクター(クロンテック社製)、及びIN3系ベクター(インプランタイノベーションズ社製)が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
このDNA断片としては、例えば、PCR法により増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
KASは、アシル-ACPとマロニルACPとの縮合反応を触媒し、アシル−ACPの合成に関与する脂肪酸合成酵素の1種である。葉緑体では、アセチル-ACP(又はアセチル-CoA)を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数16又は18のアシル-ACPが合成される。次いで、アシル-ACPチオエステラーゼ(以下、単に「TE」ともいう)の作用によってアシル-ACPのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル-ACP(又はアセチル-CoA)とマロニルACPとの縮合反応により、アセトアセチルACPが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β-ケトアシル-ACPレダクターゼによりアセトアセチルACPのケト基が還元されてヒドロキシブチリルACPが生成する。続いて、β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルACPが脱水され、クロトニルACPが生成する。最後に、エノイル-ACPレダクターゼによりクロトニルACPが還元されて、ブチリルACPが生成する。これら一連の反応により、アセチル-ACPからアシル基の炭素鎖が2個伸長されたブチリルACPが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル-ACPの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素原子数16又は18のアシル-ACPが合成される。
そのため、KASをコードする遺伝子(以下単に、「KAS遺伝子」ともいう)の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル-ACPを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
そのため、KAS IIをコードする遺伝子の発現を促進することで、長鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
炭素原子数18以上の長鎖脂肪酸、特に長鎖のPUFAは、小胞体など、葉緑体外にて多数のデサチュラーゼやエロンガーゼによって合成されることが知られている。そのため、デサチュラーゼやエロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進することでも、長鎖脂肪酸、特に長鎖のPUFAの生産性を一層向上させることができる。
本発明で好ましく用いることができるデサチュラーゼやエロンガーゼは、通常のデサチュラーゼやエロンガーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、国際公開第2012/149457号、米国特許出願公開第2012/0277418号明細書記載のナンノクロロプシス由来デサチュラーゼ、エロンガーゼを好ましく用いることができる。
なお本発明において、これらのデサチュラーゼを単独で用いてもよいし、2種以上を組合せて用いてもよい。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体においてΔ12-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC18:2(Δ9,12)などのPUFAの量の割合がより一層向上する。
また、配列番号39で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上176個以下、好ましくは1個以上154個以下、より好ましくは1個以上132個以下、より好ましくは1個以上110個以下、より好ましくは1個以上88個以下、より好ましくは1個以上66個以下、より好ましくは1個以上44個以下、より好ましくは1個以上36個以下、より好ましくは1個以上22個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号49で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上181個以下、好ましくは1個以上159個以下、より好ましくは1個以上136個以下、より好ましくは1個以上113個以下、より好ましくは1個以上91個以下、より好ましくは1個以上68個以下、より好ましくは1個以上46個以下、より好ましくは1個以上37個以下、より好ましくは1個以上23個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また、配列番号40で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上527個以下、好ましくは1個以上461個以下、より好ましくは1個以上396個以下、より好ましくは1個以上330個以下、より好ましくは1個以上264個以下、より好ましくは1個以上198個以下、より好ましくは1個以上132個以下、より好ましくは1個以上106個以下、より好ましくは1個以上66個以下、より好ましくは1個以上27個以下、より好ましくは1個以上14個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号50で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上544個以下、好ましくは1個以上476個以下、より好ましくは1個以上408個以下、より好ましくは1個以上340個以下、より好ましくは1個以上272個以下、より好ましくは1個以上204個以下、より好ましくは1個以上136個以下、より好ましくは1個以上109個以下、より好ましくは1個以上68個以下、より好ましくは1個以上28個以下、より好ましくは1個以上14個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号40又は50で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体において前述のΔ12-DESとともにΔ6-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC18:3(Δ6,9,12)、ジホモ-γ-リノレン酸(以下、「C20:3(Δ8,11,14)」とも表記する)及びアラキドン酸(以下、「C20:4(Δ5,8,11,14)」とも表記する」)などのPUFAの量の割合がより一層向上する。
また、配列番号41で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上190個以下、好ましくは1個以上166個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上95個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上48個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上24個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号51で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上190個以下、好ましくは1個以上166個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上95個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上48個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上24個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また配列番号42で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上570個以下、好ましくは1個以上499個以下、より好ましくは1個以上428個以下、より好ましくは1個以上357個以下、より好ましくは1個以上285個以下、より好ましくは1個以上214個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上114個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上15個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号52で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上572個以下、好ましくは1個以上500個以下、より好ましくは1個以上429個以下、より好ましくは1個以上357個以下、より好ましくは1個以上286個以下、より好ましくは1個以上215個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上115個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上15個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号42又は52で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体においてω3-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC20:5(Δ5,8,11,14,17)などのPUFAの量の割合がより一層向上する。また、前述のΔ12-DESとともにω3-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC20:5(Δ5,8,11,14,17)などのPUFAの量の割合がより一層向上する。
また、配列番号43で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上164個以下、好ましくは1個以上144個以下、より好ましくは1個以上123個以下、より好ましくは1個以上103個以下、より好ましくは1個以上82個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上41個以下、より好ましくは1個以上33個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号53で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上163個以下、好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上123個以下、より好ましくは1個以上102個以下、より好ましくは1個以上82個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上41個以下、より好ましくは1個以上33個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また配列番号44で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上494個以下、好ましくは1個以上432個以下、より好ましくは1個以上370個以下、より好ましくは1個以上309個以下、より好ましくは1個以上247個以下、より好ましくは1個以上185個以下、より好ましくは1個以上124個以下、より好ましくは1個以上99個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上25個以下、より好ましくは1個以上13個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号54で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上490個以下、好ましくは1個以上429個以下、より好ましくは1個以上368個以下、より好ましくは1個以上306個以下、より好ましくは1個以上245個以下、より好ましくは1個以上184個以下、より好ましくは1個以上123個以下、より好ましくは1個以上98個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上25個以下、より好ましくは1個以上13個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号44又は54で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も好ましい。
また、配列番号45で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上211個以下、好ましくは1個以上185個以下、より好ましくは1個以上158個以下、より好ましくは1個以上132個以下、より好ましくは1個以上106個以下、より好ましくは1個以上79個以下、より好ましくは1個以上53個以下、より好ましくは1個以上43個以下、より好ましくは1個以上27個以下、より好ましくは1個以上11個以下、より好ましくは1個以上6個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号55で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上206個以下、好ましくは1個以上181個以下、より好ましくは1個以上155個以下、より好ましくは1個以上129個以下、より好ましくは1個以上103個以下、より好ましくは1個以上78個以下、より好ましくは1個以上52個以下、より好ましくは1個以上42個以下、より好ましくは1個以上26個以下、より好ましくは1個以上11個以下、より好ましくは1個以上6個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また配列番号46で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上633個以下、好ましくは1個以上554個以下、より好ましくは1個以上475個以下、より好ましくは1個以上396個以下、より好ましくは1個以上317個以下、より好ましくは1個以上238個以下、より好ましくは1個以上159個以下、より好ましくは1個以上127個以下、より好ましくは1個以上80個以下、より好ましくは1個以上32個以下、より好ましくは1個以上16個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号56で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上620個以下、好ましくは1個以上542個以下、より好ましくは1個以上465個以下、より好ましくは1個以上387個以下、より好ましくは1個以上310個以下、より好ましくは1個以上233個以下、より好ましくは1個以上155個以下、より好ましくは1個以上124個以下、より好ましくは1個以上78個以下、より好ましくは1個以上31個以下、より好ましくは1個以上16個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号46又は56で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も好ましい。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体においてΔ9-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC18:1(Δ9)などの長鎖脂肪酸の量の割合がより一層向上する。また、前述のΔ12-DESとともにΔ9-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるリノール酸(以下、「C18:2Δ9,12」とも表記する)などの長鎖脂肪酸の量の割合がより一層向上する。
また、配列番号47で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上144個以下、好ましくは1個以上126個以下、より好ましくは1個以上108個以下、より好ましくは1個以上90個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上54個以下、より好ましくは1個以上36個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上18個以下、より好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上4個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号57で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1又は複数個(例えば1個以上136個以下、好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上102個以下、より好ましくは1個以上85個以下、より好ましくは1個以上68個以下、より好ましくは1個以上51個以下、より好ましくは1個以上34個以下、より好ましくは1個以上28個以下、より好ましくは1個以上17個以下、より好ましくは1個以上7個以下、より好ましくは1個以上4個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また配列番号48で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上432個以下、好ましくは1個以上378個以下、より好ましくは1個以上324個以下、より好ましくは1個以上270個以下、より好ましくは1個以上216個以下、より好ましくは1個以上162個以下、より好ましくは1個以上108個以下、より好ましくは1個以上87個以下、より好ましくは1個以上54個以下、より好ましくは1個以上22個以下、より好ましくは1個以上11個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号58で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上410個以下、好ましくは1個以上359個以下、より好ましくは1個以上307個以下、より好ましくは1個以上256個以下、より好ましくは1個以上205個以下、より好ましくは1個以上154個以下、より好ましくは1個以上103個以下、より好ましくは1個以上82個以下、より好ましくは1個以上52個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上11個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号48又は58で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も好ましい。
前述したように、TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はPUFAの合成やトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、TEの発現を促進することで、好ましくはTE遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるTEは、アシル-ACPチオエステラーゼ活性(以下、「TE活性」ともいう)を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
また、KAS遺伝子、デサチュラーゼ遺伝子、エロンガーゼ遺伝子、及びTE遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のNoACP1遺伝子の発現を促進させる方法と同様に、前記各種遺伝子を宿主に導入する方法、前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域(プロモーター、ターミネーター等)を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件20〜25℃、白色光を連続照射又は明期16時間・暗期8時間等の光条件下で1〜2か月間栽培することができる。
培地に接種する藻類の量は適宜選択することができ、生育性の点から、培地当り1%(vol/vol)以上が好ましい。また、その上限値は50%(vol/vol)以下が好ましく、10%(vol/vol)以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、1〜50%(vol/vol)が好ましく、1〜10%(vol/vol)がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、5〜40℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、10℃以上が好ましく、15℃以上がより好ましい。またその上限値は35℃以下が好ましく、30℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは10〜35℃であり、より好ましくは15〜30℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、100ルクス以上が好ましく、300ルクス以上がより好ましく、1000ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、50000ルクス以下が好ましく、10000ルクス以下がより好ましく、6000ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは100〜50000ルクスの範囲、より好ましくは300〜10000ルクスの範囲、さらに好ましくは1000〜6000ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、24時間のうち明期は8時間以上が好ましく、10時間以上がより好ましい。またその上限値は、24時間以下が好ましく、18時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは8〜24時間、より好ましくは10〜18時間、さらに好ましくは12時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から0.03%(大気条件と同程度)以上が好ましく、0.05%以上がより好ましく、0.1%以上がさらに好ましく、0.3%以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、10%以下が好ましく、5%以下がより好ましく、3%以下がさらに好ましく、1%以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、0.03〜10%が好ましく、0.05〜5%がより好ましく、0.1〜3%がさらに好ましく、0.3〜1%がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から0.01質量%以上が好ましく、0.05質量%以上がより好ましく、0.1質量%以上がさらに好ましい。またその上限値は、5質量%以下が好ましく、2質量%以下がより好ましく、1質量%以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、0.01〜5質量%が好ましく、0.05〜2質量%がより好ましく、0.1〜1質量%がさらに好ましい。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間(例えば150日程度)行なってもよい。3日以上が好ましく、7日以上がより好ましい。またその上限値は、90日以下が好ましく、30日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは3〜90日間、より好ましくは3〜30日間、さらに好ましくは7〜30日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養又は振とう培養が好ましく、通気撹拌培養がより好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましい。具体的には、炭素原子数18以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素原子数18若しくは20の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数18若しくは20の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、オレイン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
(A)配列番号1の23位〜146位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、好ましくは93%以上、より好ましくは94%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつACP活性を有するタンパク質。
<3>前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
<5>前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
<6>前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
<7>前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入し、遺伝子の発現を促進させる、前記<4>〜<6>のいずれか1項記載の方法。
<9>前記形質転換体における、前記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質の細胞内の濃度が、宿主との比較で増加している、前記<1>〜<8>のいずれか1項記載の方法。
<10>前記タンパク質(B)が、前記タンパク質(A)のアミノ酸配列に、1又は複数個、好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上31個以下、より好ましくは1個以上25個以下、より好ましくは1個以上19個以下、より好ましくは1個以上13個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上7個以下、より好ましくは1個以上5個以下、より好ましくは1個以上4個以下、より好ましくは1個以上3個以下、より好ましくは1個以上2個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<1>〜<9>のいずれか1項記載の方法。
<11>前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)である、前記<1>〜<10>のいずれか1項記載の方法。
(C1)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のN末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。
<12>前記葉緑体移行シグナルペプチドが、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のVCP1の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のACPの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIVの葉緑体移行シグナル配列、若しくはナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のアシル-ACPチオエステラーゼの葉緑体移行シグナル配列、又はこれらいずれか1つの葉緑体移行シグナル配列に1個若しくは数個、好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上6個以下、より好ましくは1個以上4個以下、より好ましくは1個以上2個以下、の変異が導入されたアミノ酸配列からなるペプチドである、前記<11>項記載の方法。
(a)配列番号2の67位〜438位の塩基配列からなるDNA。
(b)前記DNA(a)の塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、好ましくは93%以上、より好ましくは94%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)前記DNA(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつACP活性を有するタンパク質をコードするDNA。
<14>前記DNA(b)が、前記DNA(a)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上112個以下、より好ましくは1個以上93個以下、より好ましくは1個以上75個以下、より好ましくは1個以上56個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上27個以下、より好ましくは1個以上23個以下、より好ましくは1個以上19個以下、より好ましくは1個以上15個以下、より好ましくは1個以上12個以下、より好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上4個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつACP活性を有する前記タンパク質(A)若しくは(B)をコードするDNA、又は前記DNA(a)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有する前記タンパク質(A)若しくは(B)をコードするDNA、である、前記<13>項記載の方法。
<15>前記遺伝子(c)が下記DNA(c1)からなる遺伝子である、前記<13>又は<14>項記載の方法。
(c1)前記DNA(a)又は(b)の塩基配列の5'末端側に、宿主細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列を連結したDNA。
<16>前記葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列が、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のVCP1の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のACPの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIVの葉緑体移行シグナル配列、又はナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のアシル-ACPチオエステラーゼの葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列である、前記<15>項記載の方法。
<18>前記微生物が微細藻類である、前記<17>項記載の方法。
<19>前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記<18>項記載の方法。
<20>前記微細藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、及びナンノクロロプシス・エスピーからなる群より選ばれる、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、及びナンノクロロプシス・ガディタナからなる群より選ばれる、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータである、前記<18>又は<19>項記載の方法。
<21>前記微生物が大腸菌である、前記<17>項記載の方法。
<23>前記KASが、配列番号27に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記<22>項記載の方法。
<24>前記形質転換体において、デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記<1>〜<23>のいずれか1項記載の方法。
<25>前記デサチュラーゼが、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、Δ5-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも1つのデサチュラーゼ、好ましくはΔ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも1つのデサチュラーゼ、より好ましくはΔ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる2つ以上のデサチュラーゼ、である、前記<24>項記載の方法。
<26>前記Δ12-DESが、配列番号39若しくは49で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号39若しくは49で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質、配列番号39で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上176個以下、好ましくは1個以上154個以下、より好ましくは1個以上132個以下、より好ましくは1個以上110個以下、より好ましくは1個以上88個以下、より好ましくは1個以上66個以下、より好ましくは1個以上44個以下、より好ましくは1個以上36個以下、より好ましくは1個以上22個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号49で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上181個以下、好ましくは1個以上159個以下、より好ましくは1個以上136個以下、より好ましくは1個以上113個以下、より好ましくは1個以上91個以下、より好ましくは1個以上68個以下、より好ましくは1個以上46個以下、より好ましくは1個以上37個以下、より好ましくは1個以上23個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質、である、前記<25>項記載の方法。
<27>前記Δ12-DESをコードする遺伝子が、配列番号40若しくは50で表される塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、配列番号40若しくは50で表される塩基配列との同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号40で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上527個以下、好ましくは1個以上461個以下、より好ましくは1個以上396個以下、より好ましくは1個以上330個以下、より好ましくは1個以上264個以下、より好ましくは1個以上198個以下、より好ましくは1個以上132個以下、より好ましくは1個以上106個以下、より好ましくは1個以上66個以下、より好ましくは1個以上27個以下、より好ましくは1個以上14個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号50で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上544個以下、好ましくは1個以上476個以下、より好ましくは1個以上408個以下、より好ましくは1個以上340個以下、より好ましくは1個以上272個以下、より好ましくは1個以上204個以下、より好ましくは1個以上136個以下、より好ましくは1個以上109個以下、より好ましくは1個以上68個以下、より好ましくは1個以上28個以下、より好ましくは1個以上14個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、又は、配列番号40若しくは50で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、である、前記<25>又は<26>項記載の方法。
<28>前記Δ6-DESが、配列番号41若しくは51で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号41若しくは51で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質、配列番号41で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上190個以下、好ましくは1個以上166個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上95個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上48個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上24個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号51で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上190個以下、好ましくは1個以上166個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上95個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上48個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上24個以下、より好ましくは1個以上10個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質、である、前記<25>〜<27>のいずれか1項記載の方法。
<29>前記Δ6-DESをコードする遺伝子が、配列番号42若しくは52で表される塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、配列番号42若しくは52で表される塩基配列との同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号42で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上570個以下、好ましくは1個以上499個以下、より好ましくは1個以上428個以下、より好ましくは1個以上357個以下、より好ましくは1個以上285個以下、より好ましくは1個以上214個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上114個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上15個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号52で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上572個以下、好ましくは1個以上500個以下、より好ましくは1個以上429個以下、より好ましくは1個以上357個以下、より好ましくは1個以上286個以下、より好ましくは1個以上215個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上115個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上15個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、又は、配列番号42若しくは52で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、である、前記<25>〜<28>のいずれか1項記載の方法。
<30>前記ω3-DESが、配列番号43若しくは53で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号43若しくは53で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質、配列番号43で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上164個以下、好ましくは1個以上144個以下、より好ましくは1個以上123個以下、より好ましくは1個以上103個以下、より好ましくは1個以上82個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上41個以下、より好ましくは1個以上33個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号53で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上163個以下、好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上123個以下、より好ましくは1個以上102個以下、より好ましくは1個以上82個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上41個以下、より好ましくは1個以上33個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上9個以下、より好ましくは1個以上5個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質、である、前記<25>〜<29>のいずれか1項記載の方法。
<31>前記ω3-DESをコードする遺伝子が、配列番号44若しくは54で表される塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、配列番号44若しくは54で表される塩基配列との同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号44で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上494個以下、好ましくは1個以上432個以下、より好ましくは1個以上370個以下、より好ましくは1個以上309個以下、より好ましくは1個以上247個以下、より好ましくは1個以上185個以下、より好ましくは1個以上124個以下、より好ましくは1個以上99個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上25個以下、より好ましくは1個以上13個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号54で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上490個以下、好ましくは1個以上429個以下、より好ましくは1個以上368個以下、より好ましくは1個以上306個以下、より好ましくは1個以上245個以下、より好ましくは1個以上184個以下、より好ましくは1個以上123個以下、より好ましくは1個以上98個以下、より好ましくは1個以上62個以下、より好ましくは1個以上25個以下、より好ましくは1個以上13個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、又は、配列番号44若しくは54で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、である、前記<25>〜<30>のいずれか1項記載の方法。
<32>前記Δ5-DESが、配列番号45若しくは55で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号45若しくは55で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質、配列番号45で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上211個以下、好ましくは1個以上185個以下、より好ましくは1個以上158個以下、より好ましくは1個以上132個以下、より好ましくは1個以上106個以下、より好ましくは1個以上79個以下、より好ましくは1個以上53個以下、より好ましくは1個以上43個以下、より好ましくは1個以上27個以下、より好ましくは1個以上11個以下、より好ましくは1個以上6個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号55で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上206個以下、好ましくは1個以上181個以下、より好ましくは1個以上155個以下、より好ましくは1個以上129個以下、より好ましくは1個以上103個以下、より好ましくは1個以上78個以下、より好ましくは1個以上52個以下、より好ましくは1個以上42個以下、より好ましくは1個以上26個以下、より好ましくは1個以上11個以下、より好ましくは1個以上6個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質、である、前記<25>〜<31>のいずれか1項記載の方法。
<33>前記Δ5-DESをコードする遺伝子が、配列番号46若しくは56で表される塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、配列番号46若しくは56で表される塩基配列との同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号46で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上633個以下、好ましくは1個以上554個以下、より好ましくは1個以上475個以下、より好ましくは1個以上396個以下、より好ましくは1個以上317個以下、より好ましくは1個以上238個以下、より好ましくは1個以上159個以下、より好ましくは1個以上127個以下、より好ましくは1個以上80個以下、より好ましくは1個以上32個以下、より好ましくは1個以上16個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号56で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上620個以下、好ましくは1個以上542個以下、より好ましくは1個以上465個以下、より好ましくは1個以上387個以下、より好ましくは1個以上310個以下、より好ましくは1個以上233個以下、より好ましくは1個以上155個以下、より好ましくは1個以上124個以下、より好ましくは1個以上78個以下、より好ましくは1個以上31個以下、より好ましくは1個以上16個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、又は、配列番号46若しくは56で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、である、前記<25>〜<32>のいずれか1項記載の方法。
<34>前記Δ9-DESが、配列番号47若しくは57で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号47若しくは57で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質、配列番号47で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上144個以下、好ましくは1個以上126個以下、より好ましくは1個以上108個以下、より好ましくは1個以上90個以下、より好ましくは1個以上72個以下、より好ましくは1個以上54個以下、より好ましくは1個以上36個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上18個以下、より好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上4個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号57で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、1若しくは複数個(例えば1個以上136個以下、好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上102個以下、より好ましくは1個以上85個以下、より好ましくは1個以上68個以下、より好ましくは1個以上51個以下、より好ましくは1個以上34個以下、より好ましくは1個以上28個以下、より好ましくは1個以上17個以下、より好ましくは1個以上7個以下、より好ましくは1個以上4個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質、である、前記<25>〜<33>のいずれか1項記載の方法。
<35>前記Δ9-DESをコードする遺伝子が、配列番号48若しくは58で表される塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、配列番号48若しくは58で表される塩基配列との同一性が60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号48で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上432個以下、好ましくは1個以上378個以下、より好ましくは1個以上324個以下、より好ましくは1個以上270個以下、より好ましくは1個以上216個以下、より好ましくは1個以上162個以下、より好ましくは1個以上108個以下、より好ましくは1個以上87個以下、より好ましくは1個以上54個以下、より好ましくは1個以上22個以下、より好ましくは1個以上11個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、配列番号58で表される塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは複数個(例えば1個以上410個以下、好ましくは1個以上359個以下、より好ましくは1個以上307個以下、より好ましくは1個以上256個以下、より好ましくは1個以上205個以下、より好ましくは1個以上154個以下、より好ましくは1個以上103個以下、より好ましくは1個以上82個以下、より好ましくは1個以上52個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上11個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、又は、配列番号48若しくは58で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、である、前記<25>〜<34>のいずれか1項記載の方法。
<36>前記形質転換体において、エロンガーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記<1>〜<35>のいずれか1項記載の方法。
<37>前記形質転換体において、TE遺伝子の発現を促進させた、前記<1>〜<36>のいずれか1項記載の方法。
<38>前記TEが、配列番号37及び59〜61のいずれか1つに示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質である、前記<37>項記載の方法。
<40>f/2培地を用いて前記藻類を培養する、前記<1>〜<39>のいずれか1項記載の方法。
<42>前記<41>項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
<43>前記DNA(a)〜(c)、並びに(c1)のいずれか1つからなる遺伝子。
<44>前記<42>又は<43>項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はDNAカセット。
<46>前記<42>又は<43>項記載の遺伝子の発現を促進させた、形質転換体。
<47>前記KAS遺伝子の発現を促進させた、前記<45>又は<46>項記載の形質転換体。
<48>前記デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記<45>〜<47>のいずれか1項記載の形質転換体。
<49>前記エロンガーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記<45>〜<48>のいずれか1項記載の形質転換体。
<50>前記TE遺伝子の発現を促進させた、前記<45>〜<49>のいずれか1項記載の形質転換体。
<51>前記<42>〜<44>のいずれか1項記載の遺伝子、組換えベクター又はDNAカセットを導入する、形質転換体の作製方法。
<52>前記KAS遺伝子を導入する、前記<51>項記載の形質転換体の作製方法。
<53>前記デサチュラーゼ遺伝子を導入する、前記<51>又は<52>のいずれか1項記載の形質転換体の作製方法。
<54>前記エロンガーゼ遺伝子を導入する、前記<51>〜<53>のいずれか1項記載の形質転換体の作製方法。
<55>前記TE遺伝子を導入する、前記<51>〜<54>のいずれか1項記載の形質転換体の作製方法。
<56>前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記<45>〜<55>のいずれか1項記載の形質転換体、又はその作製方法。
<57>前記微生物が微細藻類である、前記<56>項記載の形質転換体、又はその作製方法。
<58>前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記<57>項記載の形質転換体、又はその作製方法。
<59>前記微細藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、及びナンノクロロプシス・エスピーからなる群より選ばれる、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、及びナンノクロロプシス・ガディタナからなる群より選ばれる、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータである、前記<57>又は<58>項記載の藻類又はその作製方法。
<60>前記微生物が大腸菌である、前記<56>項記載の形質転換体、又はその作製方法。
<62>前記脂質が、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数18以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数18若しくは20の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数18若しくは20の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはオレイン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記<61>項記載の使用。
(1)ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子(配列番号3)、及び文献(Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012)に記載されている、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列(配列番号4)を人工合成した。合成したDNA断片を鋳型として、表1に示す5及び配列番号6のプライマー対、配列番号7及び配列番号8のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株(独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手)のゲノムを鋳型として、表1に示すプライマー番号9及びプライマー番号10のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列(配列番号11)を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示すプライマー番号12及びプライマー番号13のプライマー対を用いてPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株の全RNAを抽出し、SuperScript(商標)III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(invitrogen社製)を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、表1に示すプライマー番号14及びプライマー番号15のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号2の塩基配列からなる遺伝子断片(NoACP1遺伝子)を取得した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表1に示すプライマー番号16及びプライマー番号17のプライマー対、並びにプライマー番号18及びプライマー番号19のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、LDSPプロモーター配列(配列番号20)及びVCP1ターミネーター配列(配列番号21)を取得した。
さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表1に示すプライマー番号22及びプライマー番号13のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット(チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列)及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
なお、本発現プラスミドはLDSPプロモーター配列、NoACP1遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
前記NoACP1遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表1に示すプライマー番号10及びプライマー番号16のプライマー対を用いてPCRを行い、NoACP1遺伝子発現カセット(LDSPプロモーター配列、NoACP1遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片)を増幅した。
増幅したDNA断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
f/2液体培地(NaNO3 75mg、NaH2PO4・2H2O 6mg、ビタミンB12 0.5μg、ビオチン 0.5μg、チアミン 100μg、Na2SiO3・9H2O 10mg、Na2EDTA・2H2O 4.4mg、FeCl3・6H2O 3.16mg、FeCl3・6H2O 12μg、ZnSO4・7H2O 21μg、MnCl2・4H2O 180μg、CuSO4・5H2O 7μg、Na2MoO4・2H2O 7μg/人工海水1L)にて24時間回復培養を行った。その後、2μg/mLのゼオシン含有f/2寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて2〜3週間培養した。得られたコロニーの中から、NoACP1遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株をPCR法により選抜した。
選抜した株を、f/2培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地(以下、「N15P5培地」という)20mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて3〜4週間振盪培養し、前培養液とした。それぞれ独立した3ラインの藻類の前培養液を、f/2培地の窒素濃度を30倍、リン濃度を30倍に増強した培地(以下、「N30P30培地」という)に植継ぎ(10%植継ぎ)、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて11日間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。
培養液0.5mLに、内部標準として1mg/mLのトリヘプタデカン酸グリセリル(Glyceryl triheptadecanoate、シグマアルドリッチ製)クロロホルム溶液を50μL添加後、クロロホルム0.5mL及びのメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層(下層)を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム(メタノール溶液)0.7mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。さらに、14%三フッ化ホウ素溶液(SIGMA社製)1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、及び飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
<ガスクロマトグラフィー条件>
分析装置:7890A(Agilent technology社製)
キャピラリーカラム:DB-1 MS(30m×200μm×0.25μm、J&W Scientific社製)
移動相:高純度ヘリウム
オーブン温度:150℃保持0.5分→150〜220℃(40℃/min昇温)→220〜320℃(20℃/min昇温)→320℃保持2分(ポストラン2分)
注入口温度:300℃
注入方法:スプリット注入(スプリット比:75:1)
注入量:1μL
洗浄バイアル:メタノール・クロロホルム
検出方法:FID
検出器温度:300℃
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準であるトリヘプタデカン酸グリセリル由来のC17脂肪酸メチルエステルのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
その結果を表2に示す。なお、以下の表において、「TFA」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成(%TFA)」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を示す。また、「n」は0〜5の整数であり、例えば「C18:n」と記載した場合には、組成がC18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C18:4及びC18:5の脂肪酸を表す。
(1)NoACP1の細胞内局在の予測
細胞内局在予測サイトTargetPを利用し、NoACP1が細胞内でどの部位に局在するを予測した。
その結果、NoACP1は高いスコア(0.943)でミトコンドリアに局在することが示唆された。そして、配列番号1の1〜22位のアミノ酸配列が、ミトコンドリア局在シグナルのアミノ酸配列であると推定された。
比較例で作製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のcDNAを鋳型として、表1に示すプライマー番号23及びプライマー番号24に示すプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号25の塩基配列からなるVCP1葉緑体移行シグナル断片を取得した。
また、比較例で作製したNoACP1遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表1に示すプライマー番号26及び表1に示すプライマー番号17のプライマー対を用いてPCRを行い、ミトコンドリア局在シグナルを削除したNoACP1(Δ1-22)遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列、LDSPプロモーター配列からなるDNA断片を得た。
得られたDNA断片とVCP1葉緑体移行シグナル断片を比較例と同様の方法にて連結し、葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、LDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、ミトコンドリア局在シグナルを削除したNoACP1(Δ1-22)遺伝子(配列番号2の67〜441位の塩基配列)、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
なお、VCP1葉緑体移行シグナルがナンノクロロプシスの細胞内でタンパク質を葉緑体に局在化させられることは、Protist.,2015, vol. 166(1), p. 161-171に示されている。
構築した葉緑体移行シグナル連結NoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表1に示すプライマー番号10及びプライマー番号16のプライマー対を用いてPCRを行い、葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現カセット(LDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、ミトコンドリア局在シグナルを削除したNoACP1(Δ1-22)遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片)を増幅した。増幅した断片を比較例と同様の方法にて精製し、生成した断片を用いて、比較例と同様にナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株の形質転換を行った。
得られた藻類を、f/2培地の窒素濃度を5倍、リン濃度を5倍に増強した培地(以下、「N5P5培地」という)に播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて3週間振盪培養し、前培養液とした。得られた前培養液をN5P5培地に植継ぎ(10%植継ぎ)、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて14日間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に試験を行った。
得られた培養液を用いて、比較例と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。結果を表3に示す。
葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子を導入した形質転換体と野生株(NIES2145)を前述の条件と同じ条件下で14日間培養し、脂質抽出を行った。そして、下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。その結果を表4に示す。なお、表4において「C20:n」はC20:3、C20:4、及びC20:5脂肪酸の割合の総和を示す。
<ガスクロマトグラフィー条件>
分析装置:7890A(Agilent technology社製)
キャピラリーカラム:DB-WAX(10m×100μm×0.10μm、J&W Scientific社製)
移動相:高純度ヘリウム
オーブン温度:100℃保持0.5分→100〜250℃(20℃/min昇温)→250℃保持3分(ポストラン:1分)
注入口温度:300℃
注入方法:スプリット注入(スプリット比:50:1)
注入量:5μL
洗浄バイアル:メタノール
検出方法:FID
検出器温度:350℃
(1)デサチュラーゼ遺伝子の取得
比較例で作製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のcDNAを鋳型として、表1に示す配列番号62及び配列番号63のプライマー対、配列番号64及び配列番号65のプライマー対、配列番号66及び配列番号67のプライマー対、並びに配列番号68及び配列番号69のプライマー対を用いてPCRを行い、Δ9-DES遺伝子(配列番号48)、Δ12-DES遺伝子(配列番号40)、Δ6-DES遺伝子(配列番号42)、並びにω3-DES遺伝子(配列番号44)をそれぞれ増幅した。得られた断片をそれぞれ比較例と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に連結し、デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、これら発現用プラスミドはLDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ(Δ9-DES、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES)遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子(配列番号70)を鋳型とし、表1に示す配列番号71及び配列番号72のプライマー対を用いてPCRを行い、パロモマイシン耐性遺伝子断片を取得した。
また、前記デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型とし、表1に示す配列番号73及び配列番号74のプライマー対を用いてPCRを行った。得られたそれぞれの断片と、パロモマイシン耐性遺伝子断片とを比較例と同様の方法で融合し、各種デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド(パロモマイシン耐性)を構築した。
なお、これら発現用プラスミドはLDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ(Δ9-DES、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES)遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表1に示す配列番号75及び配列番号76のプライマー対、並びに配列番号77及び配列番号78のプライマー対を用いてPCRを行い、グルタミン合成酵素プロモーター(配列番号79)断片、及びLDSPターミネーター(配列番号80)断片をそれぞれ増幅した。
また、前記Δ9-DES遺伝子発現用プラスミド、ω3-DES遺伝子発現用プラスミド、及びΔ6-DES遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表1に示す配列番号82及び配列番号83のプライマー対、配列番号84及び配列番号85のプライマー対、並びに配列番号86及び配列番号87のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、Δ9-DES遺伝子断片、ω3-DES遺伝子断片、及びΔ6-DES遺伝子断片をそれぞれ取得した。
さらに、前記Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド(パロモマイシン耐性)を鋳型として、表1に示す配列番号81及び配列番号13のプライマー対を用いてPCRを行った。得られた増幅断片、グルタミン合成酵素プロモーター断片、LDSPターミネーター断片、及びデサチュラーゼ遺伝子断片(Δ9-DES遺伝子断片、ω3-DES遺伝子断片、Δ6-DES遺伝子断片)とそれぞれ融合し、2種類のデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド(パロモマイシン耐性)を構築した。
なお、これらのプラスミドは、グルタミン合成酵素プロモーター配列、各種デサチュラーゼ(Δ9-DES、ω3-DES、Δ6-DES)遺伝子、LDSPターミネーター配列、LDSPプロモーター配列、Δ12-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
構築したデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド(パロモマイシン耐性)を鋳型として、表1に示すプライマー番号10及びプライマー番号16のプライマー対を用いてPCRを行い、デサチュラーゼ遺伝子発現カセット(LDSPプロモーター配列、デサチュラーゼ(Δ9-DES、Δ12-DES、ω3-DES)遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片)を増幅した。
増幅した断片を比較例と同様の方法にて精製し、精製した断片を用いて、比較例と同様の方法で、実施例1で作製したSvcp1-NoACP1(Δ1-22)株の形質転換を行った。
増幅した断片を比較例と同様の方法にて精製し、精製した断片を用いて、比較例と同様の方法で、実施例1で作製したSvcp1-NoACP1(Δ1-22)株の形質転換を行った。
選抜した形質転換体を、N15P5培地4mL(組織培養用マイクロプレート、IWAKI)に播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて3〜4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液0.4mLをN5P5培地4mL(組織培養用マイクロプレート、IWAKI)に植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて3週間振盪培養した。なお、比較対照として、野生株及びSvcp1-NoACP1(Δ1-22)株についても同様の実験を行った。
得られた培養液を用いて、比較例と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。3週目の総脂肪酸の生産量及び脂肪酸組成の結果を表5に示す。なお、各形質転換体につき独立した3〜4ラインの評価を行ったので、表5にはその平均値及び標準誤差を「平均値±標準誤差」の形で示す。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株と比較して、C18:2(Δ9,12)量の割合がより一層向上した。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株と比較して、C20:5(Δ5,8,11,14,17)量の割合がより一層増加した。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びΔ9-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株やSvcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ9-DES遺伝子を導入した株、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株と比較して、C18:2(Δ9,12)量の割合がさらにより一層向上した。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株やSvcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株と比較して、C20:5(Δ5,8,11,14,17)量及びC20:n量の割合がさらにより一層向上した。
さらに、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株やSvcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株と比較して、C18:3(Δ6,9,12)量やC20:n(特にC20:3(Δ8,11,14)及びC20:4(Δ5,8,11,14))量の割合がより一層向上した。
Claims (27)
- 下記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
(A)配列番号1の23位〜146位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。 - 下記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
(A)配列番号1の23位〜146位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。 - 下記タンパク質(A)〜(C)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
(A)配列番号1の23位〜146位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。 - 前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
(C1)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のN末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。 - 前記形質転換体において、デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記デサチュラーゼが、Δ12-デサチュラーゼ、Δ6-デサチュラーゼ、ω3-デサチュラーゼ、及びΔ9-デサチュラーゼからなる群より選ばれる少なくとも1つのデサチュラーゼである、請求項5記載の方法。
- 前記Δ12-デサチュラーゼが、配列番号39若しくは49で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号39若しくは49で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項6記載の方法。
- 前記Δ6-デサチュラーゼが、配列番号41若しくは51で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号41若しくは51で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項6記載の方法。
- 前記ω3-デサチュラーゼが、配列番号43若しくは53で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号43若しくは53で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項6記載の方法。
- 前記Δ9-デサチュラーゼが、配列番号47若しくは57で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号47若しくは57で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項6記載の方法。
- 前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記微生物が微細藻類である、請求項11記載の方法。
- 前記微細藻類がナンノクロロプシス(Nannochloropsis)属に属する藻類である、請求項12記載の方法。
- 前記脂肪酸又は脂質が長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 下記タンパク質(A)〜(C)、並びに(C1)。
(A)配列番号1の23位〜146位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
(C1)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のN末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。 - 請求項15記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項16記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はDNAカセット。
- 請求項16又は17記載の遺伝子、組換えベクター又はDNAカセットを含んでなる、形質転換体。
- デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、請求項18記載の形質転換体。
- 前記デサチュラーゼが、Δ12-デサチュラーゼ、Δ6-デサチュラーゼ、ω3-デサチュラーゼ、及びΔ9-デサチュラーゼからなる群より選ばれる少なくとも1つのデサチュラーゼである、請求項19記載の形質転換体。
- 前記Δ12-デサチュラーゼが、配列番号39若しくは49で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号39若しくは49で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項19記載の形質転換体。
- 前記Δ6-デサチュラーゼが、配列番号41若しくは51で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号41若しくは51で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項19記載の形質転換体。
- 前記ω3-デサチュラーゼが、配列番号43若しくは53で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号43若しくは53で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項19記載の形質転換体。
- 前記Δ9-デサチュラーゼが、配列番号47若しくは57で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号47若しくは57で表されるアミノ酸配列と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項19記載の形質転換体。
- 前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項18〜24のいずれか1項記載の形質転換体。
- 前記微生物が微細藻類である、請求項25記載の形質転換体。
- 前記微細藻類がナンノクロロプシス(Nannochloropsis)属に属する藻類である、請求項26記載の形質転換体。
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