JPWO2017199387A1 - Culturing apparatus and culturing method, and cultured organ produced by this culturing method - Google Patents
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Abstract
被培養物を三次元的に培養することができ、しかも培養された被培養物を、複数の管とともに一体として取り出すことができるようにした培養装置および培養方法、並びにその培養方法により製造された培養臓器を提供する。培養装置を、被培養物Aを収容しうるとともに、培養後に分解可能とした密閉容器2と、密閉容器2内に設けられ、かつ外周面に微小孔が形成された複数の管3、4、5と、複数の管のうちの少なくとも1本の管3または5に培養液Bを供給または循環させる培養液供給装置6、7と、複数の管のうちの少なくとも1本の管4に接続され、該管4の微小孔を通して、被培養物Aから該管4内に浸透してきた老廃物Cを、密閉容器外に排出する排泄装置8とを備えるものとする。A culture apparatus and culture method capable of three-dimensionally culturing a culture subject and allowing the cultured subject to be taken out together with a plurality of tubes, and the culture method. Provide cultured organs. A closed vessel 2 that can accommodate the culture object A and can be disassembled after culture, and a plurality of tubes 3, 4 that are provided in the closed vessel 2 and have micropores formed on the outer peripheral surface thereof. 5, at least one tube 3 or 5 out of the plurality of tubes, the culture solution supply devices 6 and 7 for supplying or circulating the culture solution B, and at least one tube 4 of the plurality of tubes. The excretory device 8 is provided for discharging the waste C that has penetrated into the tube 4 from the culture object A through the micropores of the tube 4 to the outside of the sealed container.
Description
本発明は、組織や細胞等の被培養物を三次元的に培養する培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器に関する。 The present invention relates to a culture apparatus and a culture method for three-dimensionally culturing a culture object such as a tissue or a cell, and a cultured organ produced by this culture method.
被培養物を三次元的に培養する従来の培養装置は、被培養物を筒状に形成するか(例えば特許文献1参照)、または筒状の足場台に保持し(例えば特許文献2または3参照)、それを培養室内に配設し、筒状とした被培養物の内側と外側とに培養液を流通させるようにしたものが多い。
A conventional culture apparatus for three-dimensionally culturing an object to be cultured forms the object to be cultured in a cylindrical shape (see, for example, Patent Document 1) or holds it on a cylindrical scaffolding (for example,
しかし、生体内では血管やリンパ管が組織内を複雑な分岐状または網目状に走行しており、上記のような従来の培養装置においては、このような組織を三次元的に再現することは困難である。
また、臓器としての機能を持つ組織を培養・製造するには長期間の培養が必要である。培養細胞は培養に際して老廃物を産生する。老廃物には細胞毒性のある物質が含まれることがある。そのため、生体内では老廃物や粘液を排泄する排泄路(胆管、膵管、導管など)が存在する。しかし、従来の培養装置では排泄路が設けられておらず、長期間の循環培養は行われていない。However, in the living body, blood vessels and lymphatic vessels run in a complex branch or network in the tissue, and such a tissue can be reproduced three-dimensionally in the conventional culture apparatus as described above. Have difficulty.
In addition, long-term culture is necessary for culturing and producing a tissue having a function as an organ. Cultured cells produce waste products upon culturing. Waste products may contain cytotoxic substances. Therefore, there are excretory tracts (bile ducts, pancreatic ducts, conduits, etc.) that excrete waste and mucus in the living body. However, in the conventional culture apparatus, no excretory route is provided, and long-term circulation culture is not performed.
したがって、これまでの培養装置では、三次元培養(立体培養)は困難であり、シート状の数層の細胞培養しかできず、臓器としての機能を持たせることはできていないのが現状である。 Therefore, three-dimensional culture (three-dimensional culture) is difficult with conventional culture devices, and only a few sheet-shaped cell cultures can be performed, and the function as an organ cannot be provided at present. .
また、生体内では、肝動脈と胆管は併走しているが、血流と胆汁の流れは逆方向であり、濃度勾配や肝細胞の働きの違いにより、効率よく胆汁などの老廃物を胆管に排泄している。 In vivo, the hepatic artery and bile duct run side by side, but the blood flow and bile flow are in opposite directions, and wastes such as bile are efficiently transferred to the bile duct due to the difference in the concentration gradient and the function of hepatocytes. It is excreted.
本発明は、従来の技術が有する上記のような問題点に鑑みてなされたもので、被培養物を収容する密閉容器内に、外周面に微小孔が形成された複数の管を設け、そのいずれかの管に培養液を供給または循環させ、かつ他の管より被培養物の老廃物を排出させることができるようにすることにより、被培養物を三次元的に培養することができ、しかも三次元的に培養された被培養物を、密閉容器から、複数の管とともに一体として取り出すか、または密閉容器とともに、生体内に残置させたりすることができるようにした培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and a plurality of tubes having micropores formed on the outer peripheral surface thereof are provided in a sealed container that accommodates an object to be cultured. By supplying or circulating the culture solution to any of the tubes, and allowing the waste products of the culture to be discharged from the other tubes, the culture can be cultured three-dimensionally, Moreover, a culture apparatus and a culture method in which a culture object cultured three-dimensionally can be taken out together with a plurality of tubes from a sealed container, or left in the living body together with the sealed container, An object of the present invention is to provide a cultured organ produced by this culture method.
本発明によると、上記課題は、次のようにして解決される。
(1)培養装置において、被培養物を投入する密閉可能な投入口を有し、かつ前記被培養物を収容しうる密閉容器と、前記密閉容器内に設けられ、かつ外周面に微小孔が形成された複数の管と、前記複数の管のうちの少なくとも1本の管に接続され、かつ該管に、培養液を供給または循環させることにより、該管を培養液供給管とする培養液供給装置と、前記複数の管のうちの前記培養液供給管を除く他の管の少なくとも1本の管に接続され、該管の微小孔を通して、前記被培養物から該管内に浸透してきた老廃物を、前記密閉容器外に排出することにより、該管を排泄管とする排泄装置とを備えるものとする。According to the present invention, the above problem is solved as follows.
(1) In a culture apparatus, a sealed container having a sealable inlet for feeding a culture object and capable of accommodating the culture object, a micropore provided on the outer peripheral surface provided in the sealed container A culture solution that is connected to at least one of the plurality of tubes and the tube is used as a culture solution supply tube by supplying or circulating the culture solution to the tube. A waste apparatus that is connected to at least one of the plurality of tubes other than the culture solution supply tube of the plurality of tubes and has permeated into the tube through the micropores of the tube. An excretion device having the tube as an excretory tube is provided by discharging an object out of the sealed container.
このような構成によると、密閉容器内に被培養物を収容した状態で、培養液供給装置により、培養液を培養液供給管を通して密閉容器内に供給し、かつ被培養物の老廃物を、排泄管および排泄装置を通して、密閉容器外に排出することにより、密閉容器内において、被培養物を、動物の生体に近似した状態で、三次元的に、長期に亘って培養することができる。
また、例えば排泄管を1本とし、培養液供給管を複数として、そのレイアウトを様々に変更することにより、被培養物を、複雑な血管走行や血流と胆汁の流れと言った生体内での種々の臓器に近似した複雑な構造を再現させつつ、三次元的に培養することができる。According to such a configuration, the culture medium is supplied into the sealed container through the culture solution supply pipe by the culture solution supply device in a state where the culture product is accommodated in the sealed container, and the waste product of the culture object is By discharging to the outside of the sealed container through the excretory tube and the excretory apparatus, the culture target can be cultured in a three-dimensional manner over a long period of time in a state similar to the living body of an animal.
In addition, for example, a single excretory tube, a plurality of culture solution supply tubes, and various layout changes can be performed, so that an object to be cultured can be used in a living body such as complicated blood vessel running or blood flow and bile flow. It is possible to culture three-dimensionally while reproducing a complex structure that approximates various organs.
(2)上記(1)項において、前記密閉容器を、分解可能のものとする。 (2) In the above item (1), the sealed container is decomposable.
このような構成によると、培養作業終了後に、密閉容器を分解することにより、被培養物と管とを一体として、密閉容器から取り出すことができ、取り出したものを、そのまま動物の組織の一部として生体内に移植することができる。
その際、培養液供給管は血管としての役割を果たすため、血管に吻合し、排泄管は、消化管または胆管等に吻合することにより、移植後も動物の肝臓、膵臓等の様々な臓器と同様の機能を維持することが可能となる。According to such a configuration, after completion of the culturing operation, by disassembling the sealed container, the culture object and the tube can be taken out from the sealed container as one body, and the taken-out thing is directly part of the animal tissue. Can be implanted in vivo.
At that time, since the culture solution supply tube plays a role as a blood vessel, it is anastomosed to the blood vessel, and the excretory tube is anastomosed to the digestive tract or bile duct, so that various organs such as the liver and pancreas of the animal are transplanted. It is possible to maintain the same function.
(3)上記(1)項において、前記密閉容器を、カプセル状のものとする。 (3) In the above item (1), the sealed container is a capsule.
このような構成によると、カプセル状とした密閉容器を生体内に埋設した状態で、密閉容器内の細胞を立体培養することができる。 According to such a configuration, the cells in the sealed container can be three-dimensionally cultured while the sealed container in the form of a capsule is embedded in the living body.
(4)上記(1)〜(3)項のいずれかにおいて、前記密閉容器内における前記管のいずれかの少なくとも一部を、半透膜からなるものとする。 (4) In any one of the above items (1) to (3), at least a part of any of the tubes in the sealed container is made of a semipermeable membrane.
このような構成によると、管内を循環する培養液から、必要な成分を、半透膜を通して浸透させて、被培養物に供給したり、被培養物の老廃物を、半透膜を通して、管内に抽出したりすることができる。 According to such a configuration, necessary components are permeated through the semipermeable membrane from the culture solution circulating in the tube and supplied to the culture, or the waste product of the culture is passed through the semipermeable membrane in the tube. Or can be extracted.
(5)上記(1)〜(3)項のいずれかにおいて、前記密閉容器内における前記管のいずれかの少なくとも一部を、素焼きの筒体からなるものとする。 (5) In any one of the above items (1) to (3), at least a part of any of the tubes in the sealed container is made of an unglazed cylinder.
このような構成によると、微小孔を有する管を、安価に製造することができる。 According to such a configuration, a tube having micropores can be manufactured at low cost.
(6)上記(1)〜(5)項のいずれかにおいて、前記培養液供給装置が、前記培養液供給管の両端に接続され、かつ前記培養液供給管に培養液を循環させる培養液循環路と、前記培養液循環路に設けられ、かつ培養液を循環させるポンプと、前記培養液循環路に設けられ、かつ循環する培養液をコントロールするコントロールボックスとを備えているものとする。 (6) In any one of the above items (1) to (5), the culture solution supply device is connected to both ends of the culture solution supply pipe and circulates the culture solution in the culture solution supply pipe. It is provided with a path, a pump provided in the culture solution circulation path and circulating the culture solution, and a control box provided in the culture solution circulation path and controlling the circulating culture solution.
このような構成によると、培養液供給装置の構造を簡素化することができるとともに、培養液を、培養液供給管に、連続して、円滑に循環させることができる。 According to such a configuration, the structure of the culture solution supply apparatus can be simplified, and the culture solution can be continuously and smoothly circulated through the culture solution supply pipe.
(7)上記(1)〜(6)項のいずれかにおいて、前記密閉容器の少なくとも一部を透明材料からなるものとする。 (7) In any one of the above items (1) to (6), at least a part of the sealed container is made of a transparent material.
このような構成によると、被培養物の培養時の状況を、外部から視認して、培養の進行状況を容易に知ることができる。 According to such a configuration, it is possible to easily know the progress of the culture by visually recognizing the situation at the time of culturing the culture object.
(8)上記(1)項もしくは(2)項、または上記(2)項を引用する上記(4)〜(7)項のいずれかの培養装置を使用した培養方法において、前記密閉容器内に被培養物を収容した状態で、前記培養液供給装置により、培養液を、前記培養液供給管を通して、前記密閉容器内に供給し、かつ前記被培養物の老廃物を、前記排泄管および排泄装置を通して、前記密閉容器外に排出することにより、前記密閉容器内において、前記被培養物を三次元的に培養し、培養作業終了後に、前記密閉容器を分解することにより、前記被培養物と管とを一体として、前記密閉容器から取り出す。 (8) In the culture method using the culture apparatus according to any one of (4) to (7) above, wherein the above (1) or (2) or (2) is cited, In a state where the culture medium is accommodated, the culture liquid supply device supplies the culture liquid through the culture liquid supply pipe into the sealed container, and the waste product of the culture medium is supplied to the excretory duct and excretion. The culture medium is three-dimensionally cultured in the sealed container by discharging it out of the sealed container through an apparatus, and after the culturing operation, the sealed container is disassembled, The tube and the tube are taken out from the sealed container.
このような培養方法によると、密閉容器内において、被培養物を、動物の生体に近似した状態で、三次元的に、長期に亘って培養することができる。
また、培養作業終了後に、密閉容器を分解して取り出した被培養物と管との一体物を、そのまま動物の組織の一部として生体内に移植することができる。According to such a culturing method, it is possible to cultivate the object to be cultured in a closed container in a three-dimensional manner over a long period of time in a state that approximates the living body of an animal.
Further, after completion of the culturing operation, the integrated body of the culture object and the tube taken out by disassembling the sealed container can be transplanted into the living body as a part of the animal tissue as it is.
(9)上記(1)項もしくは(3)項、または上記(3)項を引用する上記(4)〜(7)項のいずれかの培養装置を使用した培養方法において、前記被培養物を収容した前記密閉容器を生体内に埋設し、かつ前記培養液供給装置と排泄装置とを生体外に配設した状態で、前記培養液供給装置により、培養液を、前記培養液供給管を通して、前記密閉容器内に供給し、かつ前記被培養物の老廃物を、前記排泄管および排泄装置を通して、前記密閉容器外に排出することにより、前記密閉容器内において、前記被培養物を三次元的に培養する。 (9) In the culturing method using the culturing apparatus according to any one of (4) to (7) above, which refers to the above (1) or (3), or (3), In the state where the enclosed sealed container is embedded in the living body and the culture solution supply device and the excretion device are disposed outside the living body, the culture solution is supplied through the culture solution supply pipe by the culture solution supply device. By supplying the waste in the sealed container and discharging the waste product of the cultured object through the excretory tube and the excretory device to the outside of the sealed container, the cultured object is three-dimensionally inside the sealed container. Incubate in
このような培養方法によると、動物の生体内において、密閉容器内の被培養物を、三次元的に、長期に亘って培養することができるので、その生体と同一の環境を苦労して創り出す必要がなく、最適な環境の下で、密閉容器内の被培養物を、効率よく培養することができる。
また、培養作業終了後、培養液供給管や排泄管を、生体の血管や胆管等と接続し直し、かつ密閉容器を生体内に残置するか、または生体内において一定時間の経過後に溶融する材料により形成しておくことにより、移植作業を省略、または簡略化することができる。According to such a culturing method, the object to be cultured in the hermetically sealed container can be cultured in a three-dimensional manner over a long period of time in an animal's living body, so that the same environment as that of the living body is created with difficulty. This is not necessary, and the culture object in the sealed container can be efficiently cultured under an optimum environment.
In addition, after completion of the culturing operation, the culture solution supply tube and excretory tube are reconnected to the blood vessels and bile ducts of the living body and the sealed container is left in the living body or melts after a certain period of time in the living body. Therefore, the transplanting operation can be omitted or simplified.
(10)上記(8)項または(9)項の培養方法により培養された、被培養物と管との一体物よりなる培養臓器。 (10) A cultured organ composed of an integral body of a subject to be cultured and a tube cultured by the culture method according to (8) or (9) above.
このような培養臓器によると、密閉容器から取り出した被培養物と管との一体物を、そのまま培養臓器として、動物の生体内に移植するか、または生体内に残置することができる。
その際、培養液供給管は血管としての役割を果たすため、血管に吻合し、排泄管は、消化管または胆管等に吻合することにより、移植後も動物の肝臓、膵臓等の様々な臓器と同様の機能を維持することが可能となる。According to such a cultured organ, an integrated body of the culture object and the tube taken out from the sealed container can be transplanted as it is as a cultured organ into the living body of an animal or left in the living body.
At that time, since the culture solution supply tube plays a role as a blood vessel, it is anastomosed to the blood vessel, and the excretory tube is anastomosed to the digestive tract or bile duct, so that various organs such as the liver and pancreas of the animal are transplanted. It is possible to maintain the same function.
本発明によると、被培養物を収容する密閉容器内に、外周面に微小孔が形成された複数の管を設け、そのいずれかの管に培養液を供給または循環させ、かつ他の管より被培養物の老廃物を排出させることができるようにすることにより、被培養物を三次元的に培養することができ、しかも三次元的に培養された被培養物を、密閉容器から、複数の管とともに一体として取り出すか、または密閉容器とともに、生体内に残置させたりすることができるようにした培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器を提供することができる。 According to the present invention, a plurality of tubes having micropores formed on the outer peripheral surface are provided in a sealed container that accommodates a culture object, and a culture solution is supplied or circulated to any one of the tubes, and from other tubes. By allowing waste products of the culture to be discharged, the culture can be cultured in a three-dimensional manner, and a plurality of the cultures cultured in a three-dimensional manner can be removed from a sealed container. It is possible to provide a culture device and a culture method that can be taken out together with the tube or left in a living body together with a sealed container, and a culture organ produced by this culture method.
以下、本発明の培養装置の第1の実施形態を、図1を参照して説明する。
この培養装置は、被培養物Aを投入するための密閉可能な投入口1(複数でもよい)を有し、かつ被培養物Aを収容しうるとともに、培養後に分解しうるようにした密閉容器2と、密閉容器2内に設けられ、かつ外周面に微小孔(図示略)が設けられた複数の管3、4、5と、複数の管3、4、5のうちの少なくとも1本、この実施形態においては2本の管3、5に接続され、かつこれらの管3、5に、培養液Bを供給または循環させることにより、これらの管3、5を培養液供給管とするようにした2系統の培養液供給装置6、7と、複数の管3、4、5のうちの上記培養液供給管3、5を除く他の管の少なくとも1本の管4に接続され、この管4における微小孔を通して、被培養物Aから該管4内に浸透してきた老廃物Cを、密閉容器2外に排出することにより、この管4を排泄管とするようにした排泄装置8とを備えている。Hereinafter, a first embodiment of the culture apparatus of the present invention will be described with reference to FIG.
The culture apparatus has a sealable inlet 1 (or a plurality of sealable inlets) for charging the culture object A, can accommodate the culture object A, and can be decomposed after the culture. 2, a plurality of
密閉容器2の投入口1は、被培養物Aを密閉容器2内に投入した後、密閉蓋1aにより密閉しうるようになっている。または、密閉蓋1aをゴム等の弾性体よりなるものとし、そこに注射針(図示略)等を穿刺して、細胞等の被培養物Aを密閉容器2内に注入することもある。
The inlet 1 of the
密閉容器2は、透明なアクリル板、またはガラス板等よりなる直方体の箱状のものとしてあるが、縦型もしくは横型の円柱体、またはその他の形状とすることができる。
また、密閉容器2の一部のみを透明材料により形成し、残部を不透明材料に形成することもできる。
この実施形態においては、密閉容器2をアクリル板により形成し、培養後に、任意の部位をカッター等により切断することによって、分解できるようにしてある。
なお、密閉容器2を、複数の分割体(図示略)よりなるものとし、それらの相互間を、間にパッキン(図示略)を挟んで、ボルト・ナット(図示略)等をもって結合して形成し、培養後に、ボルト・ナットを緩めるか、または結合部分から外して、複数の分割体を互いに分離できるようにしてもよい。The
Moreover, only a part of the sealed
In this embodiment, the
The sealed
各管3、4、5の本数、長さ、外形、内径、材質、微小孔の径等は、培養条件に応じて定められる。
例えば、各管3、4、5の材質は、半透膜、または素焼きの筒体、人工血管等とすることができる。密閉容器2内における各管3、4、5の一部のみを、半透膜、または素焼きの筒体等とし、他部は、合成樹脂製の筒体とすることもできる。
各管3、4、5の外径は数mm〜数十mm、微小孔の平均孔径は100〜10,000Åとするのが好ましい。
また、各管3、4、5の材質、寸法、および微小孔の平均孔径等は、それぞれの用途に応じて、互いに異ならせることもある。
さらに、各管3、4、5は、可撓性を有することが望ましいが、必須ではない。The number, length, outer shape, inner diameter, material, micropore diameter, etc. of each
For example, the material of each
The outer diameter of each of the
In addition, the materials, dimensions, average pore diameters, and the like of the
Furthermore, each
各管3、4、5は、この実施形態においては、密閉容器2を左右方向に貫通して、両端部が密閉容器2の両側方より突出するようにしてある。
密閉容器2の外側における各管3、4、5から、後述する培養液B等が外部に漏出しないようにするため、各管3、4、5における微小孔を設ける範囲を、密閉容器2内に制限するか、または各管3、4、5の全体に微小孔を設けた上で、密閉容器2外の部分の外周面を気密および液密にコーティングするか、もしくは密閉容器2外の部分に、可撓性のチューブ(図示略)を外嵌しておくのがよい。In this embodiment, each of the
In order to prevent the culture medium B, which will be described later, from leaking outside from the
各培養液供給装置6、7は、培養液供給管3、5の両端に接続され、かつ培養液供給管3、5に培養液Bを循環させる培養液循環路9と、培養液循環路9に設けられ、かつ培養液Bを循環させるポンプ10と、培養液循環路9に設けられ、かつ循環する培養液Bの温度、圧力、酸素濃度、成分分布等をコントロールするコントロールボックス11とを備えている。
Each culture
また、各培養液供給装置6、7は、培養液循環路9中に液体溜め12を備えており、培養液循環路9は、この液体溜め12から、コントロールボックス11とポンプ10とを経て、各培養液供給管3、5の一端に至る給液管9aと、各培養液供給管3、5の他端から、液体溜め12に至る排液管9bとからなっている。
Each of the culture
排泄装置8は、密閉容器2外に設けられた老廃物収容容器13と、排泄管4の一端に接続され、排泄管4内に溜まった老廃物Cを、老廃物収容容器13に送給する送給管14とを備えている。
排泄管4の他端は、栓体15により閉塞されている。The
The other end of the
次に、上記培養装置を使用して実施される本発明の培養方法の実施要領の例について説明する。
図1に示すように、密閉容器2の投入口1を開いて、そこから被培養物Aを密閉容器2内に投入し、その後、密閉蓋1aにより、投入口1を密閉する。Next, the example of the execution point of the culture | cultivation method of this invention implemented using the said culture | cultivation apparatus is demonstrated.
As shown in FIG. 1, the inlet 1 of the sealed
被培養物Aは、例えば次のようなものとすることができる。
(1) 複数の細胞を分散させて、液状またはゲル状の培養液に浮遊させたもの
(2) 小型の細胞集塊を、液状またはゲル状の培養液に浮遊させたものThe culture object A can be as follows, for example.
(1) Multiple cells dispersed and suspended in liquid or gel culture
(2) Small cell clumps suspended in a liquid or gel culture solution
被培養物Aを密閉容器2内に投入し、投入口1を密閉した後、培養液供給装置6、7により、各培養液供給管3、5に、培養液Bを循環させる。
すると、培養液B中に含まれる必要成分は、各培養液供給管3、5の微小孔を通して、密閉容器2内の被培養物A側に浸透し、被培養物Aの培養が促進される。
培養液Bとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブリリン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン、血液等の1種または2種以上を含む公知のものとすることができる。The culture medium A is introduced into the sealed
Then, the necessary components contained in the culture medium B permeate the culture medium A in the sealed
The culture solution B may be a known one containing one or more of collagen, elastin, proteoglycan, fibrillin, fibronectin, laminin, chitin, chitosan, blood and the like.
被培養物Aの老廃物Cは、排泄管4の微小孔を通して、排泄管4内に浸透し、かつ送給管14を通して、老廃物収容容器13内に溜められる。
このように、被培養物Aの老廃物Cが、排泄管4および送給管14を通って、密閉容器2外に排出されるので、老廃物Cが被培養物Aに滞留することはなく、被培養物Aを長期に亘って、効率よく立体培養することができる。
また、この培養方法によると、密閉容器2内において、被培養物Aを、動物の生体内における種々の臓器の複雑な構造に近似した状態で、三次元的に、長期に亘って培養することができる。The waste product C of the culture object A penetrates into the
Thus, since the waste C of the culture A passes through the
Further, according to this culture method, in the sealed
培養作業終了後、密閉容器2を分解することにより、培養された被培養物Aと管3、4、5とを一体として、密閉容器2から取り出し、取り出した一体物を培養臓器として、そのまま生体内に移植することができる。
その際、培養液供給管3、5は血管としての役割を果たすため、血管に吻合し、排泄管4は、消化管または胆管等に吻合することにより、移植後も動物の肝臓、膵臓等の様々な臓器と同様の機能を維持することが可能となる。After completion of the culturing operation, the sealed
At this time, since the culture
図2〜図6は、本発明の培養装置の第2の実施形態を示す。
この第2の実施形態においては、密閉容器20を、円筒部20aの両端に、半球部20b、20bを連設したカプセル状のものとしてあり、円筒部20aの一部には、被培養物Aを密閉容器20内に投入するための密閉可能な投入口21が設けられている。2-6 shows 2nd Embodiment of the culture apparatus of this invention.
In the second embodiment, the sealed
投入口21には、密閉蓋22が着脱可能として設けられている。
密閉蓋22の表面は、密閉蓋22を投入口21に適正に装着したとき、密閉容器20の円筒部20aの外面と整合するようにしておくのが好ましい。
密閉容器20および密閉蓋22は、可撓性を有する合成樹脂材料、生体との適合性のよいコラーゲン繊維等を含む生体材料、さらには、生体内に埋設して、予め定めた培養時間より長い時間が経過することにより溶融するような材料とするのが好ましい。具体的な材料としては、例えば、ナイロン、強化ガラス、強化プラスチック、シリコンゴム、シリコンプロテーゼ等を使用することができる。A sealing
The surface of the
The
密閉容器20内には、図3および図6に示すように、上記と同様の生体材料により形成された複数の隔壁23が、左右方向に適宜の間隔をもって設けられている。
各隔壁23には、複数の小孔24が、予め定めた配置で、またはランダムに設けられている。As shown in FIGS. 3 and 6, a plurality of
Each
密閉容器20内は、各隔壁23によって複数のセル25に区画されている。
各隔壁23に設けた複数の小孔24は、各セル25、25間の被培養物Aや培養液Bの移動を許容するとともに、いずれかの小孔24を挿通する、後述する細管23a〜26aを、密閉容器20内の予め定めた位置に保持する作用を有している。各隔壁23に設ける複数の小孔24の形状や寸法は適宜変更可能であり、また、隔壁23によって、各セル25、25間の被培養物Aや培養液Bの移動を遮断することもある。The sealed
A plurality of
密閉容器20には、4本の管26〜29が、長手方向に貫通するようにして設けられている。
第2の実施形態においては、各管26〜29は、図3に示すように、密閉容器20の両側端の半球部20bを、気密および液密に貫通する大径管26a〜29aと、密閉容器20内において、両端部が互いに束ねられて、図3および図5に示すように、ゴム等の伸縮性材料により形成された接続管30をもって大径管26a〜29aに接続された複数の小径管26b〜29bとからなっている。
この小径管26b〜29bの外周面に、第1の実施形態における管3、4、5に設けられているのと同様の微小孔(図示略)が設けられている。The sealed
In the second embodiment, as shown in FIG. 3, each of the pipes 26 to 29 is sealed with large-
On the outer peripheral surfaces of the small-
図5に示すように、複数の小径管26b〜29bの端部同士を束ねた部分の相互間および接続管30との間には、シール材31を介在させて、接合部の気密性および液密性を保つようにするのが好ましい。
As shown in FIG. 5, a sealing
各小径管26b〜29bは、各隔壁23のいずれかの小孔24を挿通することにより、密閉容器20内の予め定めた位置に保持され、互いに絡まったり、凝集したりすることがないようにされている。
Each small-
図示は省力してあるが、4本の管26〜29のうちの3本、例えば管26、28、29の両端は、第1の実施形態における管3または5に接続された培養液供給装置6または7と同様の培養液供給装置(図示略)に接続され、残りの管27の一端は、第1の実施形態における管4に接続された排泄装置8と同様の排泄装置(図示略)に接続され、かつ管27の他端は、第1の実施形態における栓体15と同様の栓体(図示略)が圧嵌されて、閉塞されている。
したがって、この例では、管26、28、29は培養液供給管をなし、管27は排泄管をなしている。
なお、密閉容器20内で細胞が生着し易くしたり、管26、27、28、29内に血栓などが詰まることを防止したりするため、密閉容器20内に生着用の繊維を封入したり、密閉容器20の内面や隔壁23の表面等に、微小繊維を植毛したり、またはそれらの表面を細胞が生着し易い材料によりコーティングしたり、もしくは管26、27、28、29内を細胞が生着し難い材料によりコーティングしたりするのが望ましい。Although the illustration is labor-saving, the culture solution supply apparatus in which three of the four tubes 26 to 29, for example, both ends of the tubes 26, 28, and 29 are connected to the
Accordingly, in this example, the tubes 26, 28, and 29 are culture medium supply tubes, and the tube 27 is an excretory tube.
In order to facilitate the engraftment of cells in the sealed
次に、本発明の培養装置の第2の実施形態を使用して実施される本発明の培養方法の実施要領の例について説明する。
図2〜図4に示す状態から、密閉蓋22を密閉容器20の投入口21から外して、投入口21を開き、そこから被培養物Aを密閉容器20内に投入し、その後、密閉蓋22を投入口21に装着して、投入口21を密閉する。Next, an example of a procedure for carrying out the culture method of the present invention performed using the second embodiment of the culture apparatus of the present invention will be described.
2 to 4, the sealing
次いで、管26、28、29の両端を培養液供給装置に接続し、管27の一端を、排泄装置に接続し、かつ管27の他端に栓体を圧嵌して、その端部を閉塞する。 Next, both ends of the tubes 26, 28, and 29 are connected to the culture solution supply device, one end of the tube 27 is connected to the excretory device, and a stopper is press-fitted to the other end of the tube 27, Block.
この状態で、密閉容器20と、それに接続された管26〜29とを、動物の生体(図示略)内に埋設する。
次いで、各培養液供給装置におけるポンプ(図1におけるポンプ10参照)を作動させて、管26、28、29に、上述したのと同様の培養液Bを循環させる。In this state, the sealed
Next, the pump (see
各管26、28、29に循環させる培養液Bは、同一のものとすることもできるし、互いに異なる種類のものとすることもできる。 The culture medium B to be circulated through each of the tubes 26, 28, 29 can be the same or different types.
このようにして、培養液供給管である各管26、28、29に培養液Bを循環させつつ、排泄管である管27における小径管27bの微小孔を通して、小径管27b内に浸透してきた被培養物Aの老廃物Cを、大径管27aを通して、密閉容器20外に排出することにより、第1の実施形態におけるのと同様に、密閉容器20内において、老廃物Cが被培養物Aに滞留することなく、被培養物Aを長期に亘って、効率よく立体培養することができる。
In this way, while circulating the culture solution B through each of the tubes 26, 28, and 29 serving as the culture solution supply tubes, the medium has penetrated into the
また、この培養方法によると、密閉容器20を生体内に埋設して、その中の被培養物Aを立体培養することができるので、温度等の環境を生体と同一に保つことができる。
Moreover, according to this culture method, since the sealed
培養作業終了後は、例えば、管26を生体の動脈、管28を同じく門脈、管29を同じく胆管、管27を同じく肝静脈に吻合し(被培養物Aを肝細胞とした場合)、密閉容器20をそのまま生体内に残置し、培養した細胞を、そのまま生体の一部とすることができる。
After completion of the culturing operation, for example, the tube 26 is anastomosed to the living body, the tube 28 is also the portal vein, the tube 29 is the same bile duct, and the tube 27 is also anastomosed to the liver vein (when the culture A is a hepatocyte), The sealed
この場合に、密閉容器20を、生体内に埋設して、一定時間経過することにより溶融するような材料により形成しておくと、密閉容器20を生体から取り出す必要がなくなる。
In this case, if the sealed
なお、管26〜29の本数、各管26〜29における大径管26a〜29aに対する小径管26b〜29bの本数および直径、その分岐の仕方、それらの配置等は、培養しようとする被培養物Aの種類や移植先の状況等に応じて、多様に変化させて実施することができる。
The number of tubes 26 to 29, the number and diameter of the
本発明は、上記実施形態のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲を逸脱することなく、例えば、次のような幾多の変形した態様での実施が可能である。
(1) 培養液供給管3または5の一端を閉塞し、他端から培養液Bを密閉容器内に供給するようにする。
(2) 管3、5のいずれか一方を省略し、それに伴って、それに接続されている培養液供給装置6、7のいずれか一方をも省略する。
(3) 管3、5のいずれか一方をリンパ管とする。
(4) 管3を血管、管4を排泄管、管5をリンパ管とする。
(5) 排泄管4を1本とし、培養液供給管3、5を複数として、そのレイアウトを種々変更することにより、被培養物Aを、複雑な血管走行や血流と胆汁の流れと言った生体内での種々の臓器に近似した複雑な構造を再現しつつ、三次元的に培養する。
(6) 各管3、4、5の向きを互いに異ならせて、密閉容器2に設ける。The present invention is not limited only to the above-described embodiments, and can be implemented in various modified modes as follows, for example, without departing from the scope of the claims.
(1) One end of the culture
(2) Either one of the
(3) Either one of the
(4) The
(5) With one
(6) The
A 被培養物
B 培養液
C 老廃物
1 投入口
1a密閉蓋
2 密閉容器
3 管(培養液供給管)
4 管(排泄管)
5 管(培養液供給管)
6、7 培養液供給装置
8 排泄装置
9 培養液循環路
9a給液管
9b排液管
10 ポンプ
11 コントロールボックス
12 液体溜め
13 老廃物収容容器
14 送給管
15 栓体
20 密閉容器
20a円筒部
20b半球部
21 投入口
22 密閉蓋
23 隔壁
24 小孔
25 セル
26、28、29 管(培養液供給管)
27 管(排泄管)
26a〜29a 大径管
26b〜29b 小径管
30 接続管
31 シール材A Culture object B Culture solution C Waste 1
4 tubes (excretion tube)
5 tubes (culture solution supply tube)
6, 7 Culture
27 tubes (excretion tubes)
26a to 29a
本発明は、組織や細胞等の被培養物を三次元的に培養する培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器に関する。 The present invention relates to a culture apparatus and a culture method for three-dimensionally culturing a culture object such as a tissue or a cell, and a cultured organ produced by this culture method.
被培養物を三次元的に培養する従来の培養装置は、被培養物を筒状に形成するか(例えば特許文献1参照)、または筒状の足場台に保持し(例えば特許文献2または3参照)、それを培養室内に配設し、筒状とした被培養物の内側と外側とに培養液を流通させるようにしたものが多い。
A conventional culture apparatus for three-dimensionally culturing an object to be cultured forms the object to be cultured in a cylindrical shape (see, for example, Patent Document 1) or holds it on a cylindrical scaffolding (for example,
しかし、生体内では血管やリンパ管が組織内を複雑な分岐状または網目状に走行しており、上記のような従来の培養装置においては、このような組織を三次元的に再現することは困難である。
また、臓器としての機能を持つ組織を培養・製造するには長期間の培養が必要である。培養細胞は培養に際して老廃物を産生する。老廃物には細胞毒性のある物質が含まれることがある。そのため、生体内では老廃物や粘液を排泄する排泄路(胆管、膵管、導管など)が存在する。しかし、従来の培養装置では排泄路が設けられておらず、長期間の循環培養は行われていない。
However, in the living body, blood vessels and lymphatic vessels run in a complex branch or network in the tissue, and such a tissue can be reproduced three-dimensionally in the conventional culture apparatus as described above. Have difficulty.
In addition, long-term culture is necessary for culturing and producing a tissue having a function as an organ. Cultured cells produce waste products upon culturing. Waste products may contain cytotoxic substances. Therefore, there are excretory tracts (bile ducts, pancreatic ducts, conduits, etc.) that excrete waste and mucus in the living body. However, in the conventional culture apparatus, no excretory route is provided, and long-term circulation culture is not performed.
したがって、これまでの培養装置では、三次元培養(立体培養)は困難であり、シート状の数層の細胞培養しかできず、臓器としての機能を持たせることはできていないのが現状である。 Therefore, three-dimensional culture (three-dimensional culture) is difficult with conventional culture devices, and only a few sheet-shaped cell cultures can be performed, and the function as an organ cannot be provided at present. .
また、生体内では、肝動脈と胆管は併走しているが、血流と胆汁の流れは逆方向であり、濃度勾配や肝細胞の働きの違いにより、効率よく胆汁などの老廃物を胆管に排泄している。 In vivo, the hepatic artery and bile duct run side by side, but the blood flow and bile flow are in opposite directions, and wastes such as bile are efficiently transferred to the bile duct due to the difference in the concentration gradient and the function of hepatocytes. It is excreted.
本発明は、従来の技術が有する上記のような問題点に鑑みてなされたもので、被培養物を収容する密閉容器内に、外周面に微小孔が形成された複数の管を設け、そのいずれかの管に培養液を供給または循環させ、かつ他の管より被培養物の老廃物を排出させることができるようにすることにより、被培養物を三次元的に培養することができ、しかも三次元的に培養された被培養物を、密閉容器から、複数の管とともに一体として取り出すか、または密閉容器とともに、生体内に残置させたりすることができるようにした培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and a plurality of tubes having micropores formed on the outer peripheral surface thereof are provided in a sealed container that accommodates an object to be cultured. By supplying or circulating the culture solution to any of the tubes, and allowing the waste products of the culture to be discharged from the other tubes, the culture can be cultured three-dimensionally, Moreover, a culture apparatus and a culture method in which a culture object cultured three-dimensionally can be taken out together with a plurality of tubes from a sealed container, or left in the living body together with the sealed container, An object of the present invention is to provide a cultured organ produced by this culture method.
本発明によると、上記課題は、次のようにして解決される。
(1)培養装置において、被培養物を投入する密閉可能な投入口を有し、かつ前記被培養物を収容しうる密閉容器と、前記密閉容器内に設けられ、かつ外周面に微小孔が形成された複数の管と、前記複数の管のうちの少なくとも1本の管に接続され、かつ該管に、培養液を供給または循環させることにより、該管を培養液供給管とする培養液供給装置と、前記複数の管のうちの前記培養液供給管を除く他の管の少なくとも1本の管に接続され、該管の微小孔を通して、前記被培養物から該管内に浸透してきた老廃物を、前記密閉容器外に排出することにより、該管を排泄管とする排泄装置と、前記密閉容器内に設けられ、前記密閉容器内を複数のセルに区画するとともに、複数の小孔を有し、前記複数の小孔のいずれかに前記管を挿通させ、かつ残りの小孔により、互いに隣接するセル間の前記被培養物または前記培養液の移動を許容するようにした隔壁とを備えるものとする。
According to the present invention, the above problem is solved as follows.
(1) In a culture apparatus, a sealed container having a sealable inlet for feeding a culture object and capable of accommodating the culture object, a micropore provided on the outer peripheral surface provided in the sealed container A culture solution that is connected to at least one of the plurality of tubes and the tube is used as a culture solution supply tube by supplying or circulating the culture solution to the tube. A waste apparatus that is connected to at least one of the plurality of tubes other than the culture solution supply tube of the plurality of tubes and has permeated into the tube through the micropores of the tube. By discharging an object out of the sealed container, an excretory device using the tube as an excretory pipe, and provided in the sealed container, the inside of the sealed container is divided into a plurality of cells, and a plurality of small holes are formed. Having the tube inserted through any of the plurality of small holes, One by the remaining small holes, it is assumed and a partition wall so as to permit the movement of the culture or the culture broth between adjacent cells to each other.
このような構成によると、密閉容器内に被培養物を収容した状態で、培養液供給装置により、培養液を培養液供給管を通して密閉容器内に供給し、かつ被培養物の老廃物を、排泄管および排泄装置を通して、密閉容器外に排出することにより、密閉容器内において、被培養物を、動物の生体に近似した状態で、三次元的に、長期に亘って培養することができる。
また、例えば排泄管を1本とし、培養液供給管を複数として、そのレイアウトを様々に変更することにより、被培養物を、複雑な血管走行や血流と胆汁の流れと言った生体内での種々の臓器に近似した複雑な構造を再現させつつ、三次元的に培養することができる。
According to such a configuration, the culture medium is supplied into the sealed container through the culture solution supply pipe by the culture solution supply device in a state where the culture product is accommodated in the sealed container, and the waste product of the culture object is By discharging to the outside of the sealed container through the excretory tube and the excretory apparatus, the culture target can be cultured in a three-dimensional manner over a long period of time in a state similar to the living body of an animal.
In addition, for example, a single excretory tube, a plurality of culture solution supply tubes, and various layout changes can be performed, so that an object to be cultured can be used in a living body such as complicated blood vessel running or blood flow and bile flow. It is possible to culture three-dimensionally while reproducing a complex structure that approximates various organs.
(2)上記(1)項において、前記密閉容器を、分解可能のものとする。 (2) In the above item (1), the sealed container is decomposable.
このような構成によると、培養作業終了後に、密閉容器を分解することにより、被培養物と管とを一体として、密閉容器から取り出すことができ、取り出したものを、そのまま動物の組織の一部として生体内に移植することができる。
その際、培養液供給管は血管としての役割を果たすため、血管に吻合し、排泄管は、消化管または胆管等に吻合することにより、移植後も動物の肝臓、膵臓等の様々な臓器と同様の機能を維持することが可能となる。
According to such a configuration, after completion of the culturing operation, by disassembling the sealed container, the culture object and the tube can be taken out from the sealed container as one body, and the taken-out thing is directly part of the animal tissue. Can be implanted in vivo.
At that time, since the culture solution supply tube plays a role as a blood vessel, it is anastomosed to the blood vessel, and the excretory tube is anastomosed to the digestive tract or bile duct, so that various organs such as the liver and pancreas of the animal are transplanted. It is possible to maintain the same function.
(3)上記(1)項において、前記密閉容器を、カプセル状のものとする。 (3) In the above item (1), the sealed container is a capsule.
このような構成によると、カプセル状とした密閉容器を生体内に埋設した状態で、密閉容器内の細胞を立体培養することができる。 According to such a configuration, the cells in the sealed container can be three-dimensionally cultured while the sealed container in the form of a capsule is embedded in the living body.
(4)上記(1)〜(3)項のいずれかにおいて、前記密閉容器内における前記管のいずれかの少なくとも一部を、半透膜からなるものとする。 (4) In any one of the above items (1) to (3), at least a part of any of the tubes in the sealed container is made of a semipermeable membrane.
このような構成によると、管内を循環する培養液から、必要な成分を、半透膜を通して浸透させて、被培養物に供給したり、被培養物の老廃物を、半透膜を通して、管内に抽出したりすることができる。 According to such a configuration, necessary components are permeated through the semipermeable membrane from the culture solution circulating in the tube and supplied to the culture, or the waste product of the culture is passed through the semipermeable membrane in the tube. Or can be extracted.
(5)上記(1)〜(3)項のいずれかにおいて、前記密閉容器内における前記管のいずれかの少なくとも一部を、素焼きの筒体からなるものとする。 (5) In any one of the above items (1) to (3), at least a part of any of the tubes in the sealed container is made of an unglazed cylinder.
このような構成によると、微小孔を有する管を、安価に製造することができる。 According to such a configuration, a tube having micropores can be manufactured at low cost.
(6)上記(1)〜(5)項のいずれかにおいて、前記培養液供給装置が、前記培養液供給管の両端に接続され、かつ前記培養液供給管に培養液を循環させる培養液循環路と、前記培養液循環路に設けられ、かつ培養液を循環させるポンプと、前記培養液循環路に設けられ、かつ循環する培養液をコントロールするコントロールボックスとを備えているものとする。 (6) In any one of the above items (1) to (5), the culture solution supply device is connected to both ends of the culture solution supply pipe and circulates the culture solution in the culture solution supply pipe. It is provided with a path, a pump provided in the culture solution circulation path and circulating the culture solution, and a control box provided in the culture solution circulation path and controlling the circulating culture solution.
このような構成によると、培養液供給装置の構造を簡素化することができるとともに、培養液を、培養液供給管に、連続して、円滑に循環させることができる。 According to such a configuration, the structure of the culture solution supply apparatus can be simplified, and the culture solution can be continuously and smoothly circulated through the culture solution supply pipe.
(7)上記(1)〜(6)項のいずれかにおいて、前記密閉容器の少なくとも一部を透明材料からなるものとする。 (7) In any one of the above items (1) to (6), at least a part of the sealed container is made of a transparent material.
このような構成によると、被培養物の培養時の状況を、外部から視認して、培養の進行状況を容易に知ることができる。 According to such a configuration, it is possible to easily know the progress of the culture by visually recognizing the situation at the time of culturing the culture object.
(8)上記(1)項もしくは(2)項、または上記(2)項を引用する上記(4)〜(7)項のいずれかの培養装置を使用した培養方法において、前記密閉容器内に被培養物を収容した状態で、前記培養液供給装置により、培養液を、前記培養液供給管を通して、前記密閉容器内に供給し、かつ前記被培養物の老廃物を、前記排泄管および排泄装置を通して、前記密閉容器外に排出することにより、前記密閉容器内において、前記被培養物を三次元的に培養し、培養作業終了後に、前記密閉容器を分解することにより、前記被培養物と管とを一体として、前記密閉容器から取り出す。 (8) In the culture method using the culture apparatus according to any one of (4) to (7) above, wherein the above (1) or (2) or (2) is cited, In a state where the culture medium is accommodated, the culture liquid supply device supplies the culture liquid through the culture liquid supply pipe into the sealed container, and the waste product of the culture medium is supplied to the excretory duct and excretion. The culture medium is three-dimensionally cultured in the sealed container by discharging it out of the sealed container through an apparatus, and after the culturing operation, the sealed container is disassembled, The tube and the tube are taken out from the sealed container.
このような培養方法によると、密閉容器内において、被培養物を、動物の生体に近似した状態で、三次元的に、長期に亘って培養することができる。
また、培養作業終了後に、密閉容器を分解して取り出した被培養物と管との一体物を、そのまま動物の組織の一部として生体内に移植することができる。
According to such a culturing method, it is possible to cultivate the object to be cultured in a closed container in a three-dimensional manner over a long period of time in a state that approximates the living body of an animal.
Further, after completion of the culturing operation, the integrated body of the culture object and the tube taken out by disassembling the sealed container can be transplanted into the living body as a part of the animal tissue as it is.
(9)上記(1)項もしくは(3)項、または上記(3)項を引用する上記(4)〜(7)項のいずれかの培養装置を使用した培養方法において、前記被培養物を収容した前記密閉容器を生体内に埋設し、かつ前記培養液供給装置と排泄装置とを生体外に配設した状態で、前記培養液供給装置により、培養液を、前記培養液供給管を通して、前記密閉容器内に供給し、かつ前記被培養物の老廃物を、前記排泄管および排泄装置を通して、前記密閉容器外に排出することにより、前記密閉容器内において、前記被培養物を三次元的に培養する。 (9) In the culturing method using the culturing apparatus according to any one of (4) to (7) above, which refers to the above (1) or (3), or (3), In the state where the enclosed sealed container is embedded in the living body and the culture solution supply device and the excretion device are disposed outside the living body, the culture solution is supplied through the culture solution supply pipe by the culture solution supply device. By supplying the waste in the sealed container and discharging the waste product of the cultured object through the excretory tube and the excretory device to the outside of the sealed container, the cultured object is three-dimensionally inside the sealed container. Incubate in
このような培養方法によると、動物の生体内において、密閉容器内の被培養物を、三次元的に、長期に亘って培養することができるので、その生体と同一の環境を苦労して創り出す必要がなく、最適な環境の下で、密閉容器内の被培養物を、効率よく培養することができる。
また、培養作業終了後、培養液供給管や排泄管を、生体の血管や胆管等と接続し直し、かつ密閉容器を生体内に残置するか、または生体内において一定時間の経過後に溶融する材料により形成しておくことにより、移植作業を省略、または簡略化することができる。
According to such a culturing method, the object to be cultured in the hermetically sealed container can be cultured in a three-dimensional manner over a long period of time in an animal's living body, so that the same environment as that of the living body is created with difficulty. This is not necessary, and the culture object in the sealed container can be efficiently cultured under an optimum environment.
In addition, after completion of the culturing operation, the culture solution supply tube and excretory tube are reconnected to the blood vessels and bile ducts of the living body and the sealed container is left in the living body or melts after a certain period of time in the living body. Therefore, the transplanting operation can be omitted or simplified.
(10)上記(8)項または(9)項の培養方法により培養された、被培養物と管との一体物よりなる培養臓器。 (10) A cultured organ composed of an integral body of a subject to be cultured and a tube cultured by the culture method according to (8) or (9) above.
このような培養臓器によると、密閉容器から取り出した被培養物と管との一体物を、そのまま培養臓器として、動物の生体内に移植するか、または生体内に残置することができる。
その際、培養液供給管は血管としての役割を果たすため、血管に吻合し、排泄管は、消化管または胆管等に吻合することにより、移植後も動物の肝臓、膵臓等の様々な臓器と同様の機能を維持することが可能となる。
According to such a cultured organ, an integrated body of the culture object and the tube taken out from the sealed container can be transplanted as it is as a cultured organ into the living body of an animal or left in the living body.
At that time, since the culture solution supply tube plays a role as a blood vessel, it is anastomosed to the blood vessel, and the excretory tube is anastomosed to the digestive tract or bile duct, so that various organs such as the liver and pancreas of the animal are transplanted. It is possible to maintain the same function.
本発明によると、被培養物を収容する密閉容器内に、外周面に微小孔が形成された複数の管を設け、そのいずれかの管に培養液を供給または循環させ、かつ他の管より被培養物の老廃物を排出させることができるようにすることにより、被培養物を三次元的に培養することができ、しかも三次元的に培養された被培養物を、密閉容器から、複数の管とともに一体として取り出すか、または密閉容器とともに、生体内に残置させたりすることができるようにした培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器を提供することができる。 According to the present invention, a plurality of tubes having micropores formed on the outer peripheral surface are provided in a sealed container that accommodates a culture object, and a culture solution is supplied or circulated to any one of the tubes, and from other tubes. By allowing waste products of the culture to be discharged, the culture can be cultured in a three-dimensional manner, and a plurality of the cultures cultured in a three-dimensional manner can be removed from a sealed container. It is possible to provide a culture device and a culture method that can be taken out together with the tube or left in a living body together with a sealed container, and a culture organ produced by this culture method.
以下、本発明の培養装置の第1の実施形態を、図1を参照して説明する。
この培養装置は、被培養物Aを投入するための密閉可能な投入口1(複数でもよい)を有し、かつ被培養物Aを収容しうるとともに、培養後に分解しうるようにした密閉容器2と、密閉容器2内に設けられ、かつ外周面に微小孔(図示略)が設けられた複数の管3、4、5と、複数の管3、4、5のうちの少なくとも1本、この実施形態においては2本の管3、5に接続され、かつこれらの管3、5に、培養液Bを供給または循環させることにより、これらの管3、5を培養液供給管とするようにした2系統の培養液供給装置6、7と、複数の管3、4、5のうちの上記培養液供給管3、5を除く他の管の少なくとも1本の管4に接続され、この管4における微小孔を通して、被培養物Aから該管4内に浸透してきた老廃物Cを、密閉容器2外に排出することにより、この管4を排泄管とするようにした排泄装置8とを備えている。
Hereinafter, a first embodiment of the culture apparatus of the present invention will be described with reference to FIG.
The culture apparatus has a sealable inlet 1 (or a plurality of sealable inlets) for charging the culture object A, can accommodate the culture object A, and can be decomposed after the culture. 2, a plurality of
密閉容器2の投入口1は、被培養物Aを密閉容器2内に投入した後、密閉蓋1aにより密閉しうるようになっている。または、密閉蓋1aをゴム等の弾性体よりなるものとし、そこに注射針(図示略)等を穿刺して、細胞等の被培養物Aを密閉容器2内に注入することもある。
The inlet 1 of the
密閉容器2は、透明なアクリル板、またはガラス板等よりなる直方体の箱状のものとしてあるが、縦型もしくは横型の円柱体、またはその他の形状とすることができる。
また、密閉容器2の一部のみを透明材料により形成し、残部を不透明材料に形成することもできる。
この実施形態においては、密閉容器2をアクリル板により形成し、培養後に、任意の部位をカッター等により切断することによって、分解できるようにしてある。
なお、密閉容器2を、複数の分割体(図示略)よりなるものとし、それらの相互間を、間にパッキン(図示略)を挟んで、ボルト・ナット(図示略)等をもって結合して形成し、培養後に、ボルト・ナットを緩めるか、または結合部分から外して、複数の分割体を互いに分離できるようにしてもよい。
The
Moreover, only a part of the sealed
In this embodiment, the
The sealed
各管3、4、5の本数、長さ、外形、内径、材質、微小孔の径等は、培養条件に応じて定められる。
例えば、各管3、4、5の材質は、半透膜、または素焼きの筒体、人工血管等とすることができる。密閉容器2内における各管3、4、5の一部のみを、半透膜、または素焼きの筒体等とし、他部は、合成樹脂製の筒体とすることもできる。
各管3、4、5の外径は数mm〜数十mm、微小孔の平均孔径は100〜10,000Åとするのが好ましい。
また、各管3、4、5の材質、寸法、および微小孔の平均孔径等は、それぞれの用途に応じて、互いに異ならせることもある。
さらに、各管3、4、5は、可撓性を有することが望ましいが、必須ではない。
The number, length, outer shape, inner diameter, material, micropore diameter, etc. of each
For example, the material of each
The outer diameter of each of the
In addition, the materials, dimensions, average pore diameters, and the like of the
Furthermore, each
各管3、4、5は、この実施形態においては、密閉容器2を左右方向に貫通して、両端部が密閉容器2の両側方より突出するようにしてある。
密閉容器2の外側における各管3、4、5から、後述する培養液B等が外部に漏出しないようにするため、各管3、4、5における微小孔を設ける範囲を、密閉容器2内に制限するか、または各管3、4、5の全体に微小孔を設けた上で、密閉容器2外の部分の外周面を気密および液密にコーティングするか、もしくは密閉容器2外の部分に、可撓性のチューブ(図示略)を外嵌しておくのがよい。
In this embodiment, each of the
In order to prevent the culture medium B, which will be described later, from leaking outside from the
各培養液供給装置6、7は、培養液供給管3、5の両端に接続され、かつ培養液供給管3、5に培養液Bを循環させる培養液循環路9と、培養液循環路9に設けられ、かつ培養液Bを循環させるポンプ10と、培養液循環路9に設けられ、かつ循環する培養液Bの温度、圧力、酸素濃度、成分分布等をコントロールするコントロールボックス11とを備えている。
Each culture
また、各培養液供給装置6、7は、培養液循環路9中に液体溜め12を備えており、培養液循環路9は、この液体溜め12から、コントロールボックス11とポンプ10とを経て、各培養液供給管3、5の一端に至る給液管9aと、各培養液供給管3、5の他端から、液体溜め12に至る排液管9bとからなっている。
Each of the culture
排泄装置8は、密閉容器2外に設けられた老廃物収容容器13と、排泄管4の一端に接続され、排泄管4内に溜まった老廃物Cを、老廃物収容容器13に送給する送給管14とを備えている。
排泄管4の他端は、栓体15により閉塞されている。
The
The other end of the
次に、上記培養装置を使用して実施される本発明の培養方法の実施要領の例について説明する。
図1に示すように、密閉容器2の投入口1を開いて、そこから被培養物Aを密閉容器2内に投入し、その後、密閉蓋1aにより、投入口1を密閉する。
Next, the example of the execution point of the culture | cultivation method of this invention implemented using the said culture | cultivation apparatus is demonstrated.
As shown in FIG. 1, the inlet 1 of the sealed
被培養物Aは、例えば次のようなものとすることができる。
(1) 複数の細胞を分散させて、液状またはゲル状の培養液に浮遊させたもの
(2) 小型の細胞集塊を、液状またはゲル状の培養液に浮遊させたもの
The culture object A can be as follows, for example.
(1) Multiple cells dispersed and suspended in liquid or gel culture
(2) Small cell clumps suspended in a liquid or gel culture solution
被培養物Aを密閉容器2内に投入し、投入口1を密閉した後、培養液供給装置6、7により、各培養液供給管3、5に、培養液Bを循環させる。
すると、培養液B中に含まれる必要成分は、各培養液供給管3、5の微小孔を通して、密閉容器2内の被培養物A側に浸透し、被培養物Aの培養が促進される。
培養液Bとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブリリン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン、血液等の1種または2種以上を含む公知のものとすることができる。
The culture medium A is introduced into the sealed
Then, the necessary components contained in the culture medium B permeate the culture medium A in the sealed
The culture solution B may be a known one containing one or more of collagen, elastin, proteoglycan, fibrillin, fibronectin, laminin, chitin, chitosan, blood and the like.
被培養物Aの老廃物Cは、排泄管4の微小孔を通して、排泄管4内に浸透し、かつ送給管14を通して、老廃物収容容器13内に溜められる。
このように、被培養物Aの老廃物Cが、排泄管4および送給管14を通って、密閉容器2外に排出されるので、老廃物Cが被培養物Aに滞留することはなく、被培養物Aを長期に亘って、効率よく立体培養することができる。
また、この培養方法によると、密閉容器2内において、被培養物Aを、動物の生体内における種々の臓器の複雑な構造に近似した状態で、三次元的に、長期に亘って培養することができる。
The waste product C of the culture object A penetrates into the
Thus, since the waste C of the culture A passes through the
Further, according to this culture method, in the sealed
培養作業終了後、密閉容器2を分解することにより、培養された被培養物Aと管3、4、5とを一体として、密閉容器2から取り出し、取り出した一体物を培養臓器として、そのまま生体内に移植することができる。
その際、培養液供給管3、5は血管としての役割を果たすため、血管に吻合し、排泄管4は、消化管または胆管等に吻合することにより、移植後も動物の肝臓、膵臓等の様々な臓器と同様の機能を維持することが可能となる。
After completion of the culturing operation, the sealed
At this time, since the culture
図2〜図6は、本発明の培養装置の第2の実施形態を示す。
この第2の実施形態においては、密閉容器20を、円筒部20aの両端に、半球部20b、20bを連設したカプセル状のものとしてあり、円筒部20aの一部には、被培養物Aを密閉容器20内に投入するための密閉可能な投入口21が設けられている。
2-6 shows 2nd Embodiment of the culture apparatus of this invention.
In the second embodiment, the sealed
投入口21には、密閉蓋22が着脱可能として設けられている。
密閉蓋22の表面は、密閉蓋22を投入口21に適正に装着したとき、密閉容器20の円筒部20aの外面と整合するようにしておくのが好ましい。
密閉容器20および密閉蓋22は、可撓性を有する合成樹脂材料、生体との適合性のよいコラーゲン繊維等を含む生体材料、さらには、生体内に埋設して、予め定めた培養時間より長い時間が経過することにより溶融するような材料とするのが好ましい。具体的な材料としては、例えば、ナイロン、強化ガラス、強化プラスチック、シリコンゴム、シリコンプロテーゼ等を使用することができる。
A sealing
The surface of the
The
密閉容器20内には、図3および図6に示すように、上記と同様の生体材料により形成された複数の隔壁23が、左右方向に適宜の間隔をもって設けられている。
各隔壁23には、複数の小孔24が、予め定めた配置で、またはランダムに設けられている。
As shown in FIGS. 3 and 6, a plurality of
Each
密閉容器20内は、各隔壁23によって複数のセル25に区画されている。
各隔壁23に設けた複数の小孔24は、各セル25、25間の被培養物Aや培養液Bの移動を許容するとともに、いずれかの小孔24を挿通する、後述する細管23a〜26aを、密閉容器20内の予め定めた位置に保持する作用を有している。各隔壁23に設ける複数の小孔24の形状や寸法は適宜変更可能であり、また、隔壁23によって、各セル25、25間の被培養物Aや培養液Bの移動を遮断することもある。
The sealed
A plurality of
密閉容器20には、4本の管26〜29が、長手方向に貫通するようにして設けられている。
第2の実施形態においては、各管26〜29は、図3に示すように、密閉容器20の両側端の半球部20bを、気密および液密に貫通する大径管26a〜29aと、密閉容器20内において、両端部が互いに束ねられて、図3および図5に示すように、ゴム等の伸縮性材料により形成された接続管30をもって大径管26a〜29aに接続された複数の小径管26b〜29bとからなっている。
この小径管26b〜29bの外周面に、第1の実施形態における管3、4、5に設けられているのと同様の微小孔(図示略)が設けられている。
The sealed
In the second embodiment, as shown in FIG. 3, each of the pipes 26 to 29 is sealed with large-
On the outer peripheral surfaces of the small-
図5に示すように、複数の小径管26b〜29bの端部同士を束ねた部分の相互間および接続管30との間には、シール材31を介在させて、接合部の気密性および液密性を保つようにするのが好ましい。
As shown in FIG. 5, a sealing
各小径管26b〜29bは、各隔壁23のいずれかの小孔24を挿通することにより、密閉容器20内の予め定めた位置に保持され、互いに絡まったり、凝集したりすることがないようにされている。
Each small-
図示は省力してあるが、4本の管26〜29のうちの3本、例えば管26、28、29の両端は、第1の実施形態における管3または5に接続された培養液供給装置6または7と同様の培養液供給装置(図示略)に接続され、残りの管27の一端は、第1の実施形態における管4に接続された排泄装置8と同様の排泄装置(図示略)に接続され、かつ管27の他端は、第1の実施形態における栓体15と同様の栓体(図示略)が圧嵌されて、閉塞されている。
したがって、この例では、管26、28、29は培養液供給管をなし、管27は排泄管をなしている。
なお、密閉容器20内で細胞が生着し易くしたり、管26、27、28、29内に血栓などが詰まることを防止したりするため、密閉容器20内に生着用の繊維を封入したり、密閉容器20の内面や隔壁23の表面等に、微小繊維を植毛したり、またはそれらの表面を細胞が生着し易い材料によりコーティングしたり、もしくは管26、27、28、29内を細胞が生着し難い材料によりコーティングしたりするのが望ましい。
Although the illustration is labor-saving, the culture solution supply apparatus in which three of the four tubes 26 to 29, for example, both ends of the tubes 26, 28, and 29 are connected to the
Accordingly, in this example, the tubes 26, 28, and 29 are culture medium supply tubes, and the tube 27 is an excretory tube.
In order to facilitate the engraftment of cells in the sealed
次に、本発明の培養装置の第2の実施形態を使用して実施される本発明の培養方法の実施要領の例について説明する。
図2〜図4に示す状態から、密閉蓋22を密閉容器20の投入口21から外して、投入口21を開き、そこから被培養物Aを密閉容器20内に投入し、その後、密閉蓋22を投入口21に装着して、投入口21を密閉する。
Next, an example of a procedure for carrying out the culture method of the present invention performed using the second embodiment of the culture apparatus of the present invention will be described.
2 to 4, the sealing
次いで、管26、28、29の両端を培養液供給装置に接続し、管27の一端を、排泄装置に接続し、かつ管27の他端に栓体を圧嵌して、その端部を閉塞する。 Next, both ends of the tubes 26, 28, and 29 are connected to the culture solution supply device, one end of the tube 27 is connected to the excretory device, and a stopper is press-fitted to the other end of the tube 27, Block.
この状態で、密閉容器20と、それに接続された管26〜29とを、動物の生体(図示略)内に埋設する。
次いで、各培養液供給装置におけるポンプ(図1におけるポンプ10参照)を作動させて、管26、28、29に、上述したのと同様の培養液Bを循環させる。
In this state, the sealed
Next, the pump (see
各管26、28、29に循環させる培養液Bは、同一のものとすることもできるし、互いに異なる種類のものとすることもできる。 The culture medium B to be circulated through each of the tubes 26, 28, 29 can be the same or different types.
このようにして、培養液供給管である各管26、28、29に培養液Bを循環させつつ、排泄管である管27における小径管27bの微小孔を通して、小径管27b内に浸透してきた被培養物Aの老廃物Cを、大径管27aを通して、密閉容器20外に排出することにより、第1の実施形態におけるのと同様に、密閉容器20内において、老廃物Cが被培養物Aに滞留することなく、被培養物Aを長期に亘って、効率よく立体培養することができる。
In this way, while circulating the culture solution B through each of the tubes 26, 28, and 29 serving as the culture solution supply tubes, the medium has penetrated into the
また、この培養方法によると、密閉容器20を生体内に埋設して、その中の被培養物Aを立体培養することができるので、温度等の環境を生体と同一に保つことができる。
Moreover, according to this culture method, since the sealed
培養作業終了後は、例えば、管26を生体の動脈、管28を同じく門脈、管29を同じく胆管、管27を同じく肝静脈に吻合し(被培養物Aを肝細胞とした場合)、密閉容器20をそのまま生体内に残置し、培養した細胞を、そのまま生体の一部とすることができる。
After completion of the culturing operation, for example, the tube 26 is anastomosed to the living body, the tube 28 is also the portal vein, the tube 29 is the same bile duct, and the tube 27 is also anastomosed to the liver vein (when the culture A is a hepatocyte), The sealed
この場合に、密閉容器20を、生体内に埋設して、一定時間経過することにより溶融するような材料により形成しておくと、密閉容器20を生体から取り出す必要がなくなる。
In this case, if the sealed
なお、管26〜29の本数、各管26〜29における大径管26a〜29aに対する小径管26b〜29bの本数および直径、その分岐の仕方、それらの配置等は、培養しようとする被培養物Aの種類や移植先の状況等に応じて、多様に変化させて実施することができる。
The number of tubes 26 to 29, the number and diameter of the
本発明は、上記実施形態のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲を逸脱することなく、例えば、次のような幾多の変形した態様での実施が可能である。
(1) 培養液供給管3または5の一端を閉塞し、他端から培養液Bを密閉容器内に供給するようにする。
(2) 管3、5のいずれか一方を省略し、それに伴って、それに接続されている培養液供給装置6、7のいずれか一方をも省略する。
(3) 管3、5のいずれか一方をリンパ管とする。
(4) 管3を血管、管4を排泄管、管5をリンパ管とする。
(5) 排泄管4を1本とし、培養液供給管3、5を複数として、そのレイアウトを種々変更することにより、被培養物Aを、複雑な血管走行や血流と胆汁の流れと言った生体内での種々の臓器に近似した複雑な構造を再現しつつ、三次元的に培養する。
(6) 各管3、4、5の向きを互いに異ならせて、密閉容器2に設ける。
The present invention is not limited only to the above-described embodiments, and can be implemented in various modified modes as follows, for example, without departing from the scope of the claims.
(1) One end of the culture
(2) Either one of the
(3) Either one of the
(4) The
(5) With one
(6) The
A 被培養物
B 培養液
C 老廃物
1 投入口
1a密閉蓋
2 密閉容器
3 管(培養液供給管)
4 管(排泄管)
5 管(培養液供給管)
6、7 培養液供給装置
8 排泄装置
9 培養液循環路
9a給液管
9b排液管
10 ポンプ
11 コントロールボックス
12 液体溜め
13 老廃物収容容器
14 送給管
15 栓体
20 密閉容器
20a円筒部
20b半球部
21 投入口
22 密閉蓋
23 隔壁
24 小孔
25 セル
26、28、29 管(培養液供給管)
27 管(排泄管)
26a〜29a 大径管
26b〜29b 小径管
30 接続管
31 シール材
A Culture object B Culture solution C Waste 1
4 tubes (excretion tube)
5 tubes (culture solution supply tube)
6, 7 Culture
27 tubes (excretion tubes)
26a to 29a
Claims (10)
前記密閉容器内に設けられ、かつ外周面に微小孔が形成された複数の管と、
前記複数の管のうちの少なくとも1本の管に接続され、かつ該管に、培養液を供給または循環させることにより、該管を培養液供給管とする培養液供給装置と、
前記複数の管のうちの前記培養液供給管を除く他の管の少なくとも1本の管に接続され、該管の微小孔を通して、前記被培養物から該管内に浸透してきた老廃物を、前記密閉容器外に排出することにより、該管を排泄管とする排泄装置
とを備えることを特徴とする培養装置。A sealed container having a sealable inlet for charging the culture, and capable of storing the culture;
A plurality of tubes provided in the sealed container and having micropores formed on the outer peripheral surface;
A culture solution supply apparatus connected to at least one of the plurality of tubes and supplying or circulating the culture solution to the tube, thereby using the tube as a culture solution supply tube;
The waste material that is connected to at least one of the plurality of tubes other than the culture solution supply tube, and has permeated into the tube through the micropores of the tube, A culture apparatus comprising: an excretory device that uses the tube as an excretory tube by discharging it out of the sealed container.
前記培養液供給管の両端に接続され、かつ前記培養液供給管に培養液を循環させる培養液循環路と、
前記培養液循環路に設けられ、かつ培養液を循環させるポンプと、
前記培養液循環路に設けられ、かつ循環する培養液をコントロールするコントロールボックスとを備えていることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の培養装置。The culture solution supply device comprises:
A culture solution circulation path connected to both ends of the culture solution supply pipe and circulating the culture solution in the culture solution supply pipe;
A pump provided in the culture solution circulation path and circulating the culture solution;
The culture apparatus according to claim 1, further comprising a control box that is provided in the culture medium circulation path and controls a circulating culture medium.
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