JPWO2017169751A1 - 低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法 - Google Patents
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Abstract
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、至適増殖温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度である低温菌及び中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素をコードするＤＮＡを導入して、形質転換体を得る第１の工程と、５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記酵素を発現させる第３の工程と、を含む低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法。
Description
本発明は低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法に関する。
酵素は、低エネルギーで有機物を合成・分解することができ、化学合成のような副生成物を発生させないため、食品、医薬品、化粧品及び機能性材料等の様々な分野において広く用いられている。酵素を製造する方法としては、各種生物体内の酵素を抽出する方法の他、目的とする酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入した形質転換体を培養して当該酵素を発現させる方法が知られており、前記宿主微生物としては、大腸菌や酵母菌等が従来から汎用されている。しかしながら、このような宿主微生物を用いた方法では、目的とする酵素に加えて、当該宿主微生物由来の酵素も同時に発現・活性化してしまうため、目的とする酵素の発現を制御して酵素を効率良く製造する方法の開発が望まれている。
形質転換体を用いた酵素の製造方法としては、例えば、特開２０１１−１６０７７８号公報（特許文献１）において、耐熱性酵素をコードしている遺伝子を用いて抗酸菌を形質転換することにより形質転換体を得る工程と前記形質転換体を加熱処理することにより固定化耐熱性酵素を得る工程とを含む製造方法が記載されている。しかしながら、特許文献１に記載されている方法は超高熱菌又は好熱菌に由来する耐熱性酵素の製造方法であり、得られた酵素は高温で反応させる必要があった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、低温菌及び中温菌に由来する酵素をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の増殖段階と前記酵素の発現段階とを分けることができる低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、至適増殖温度が高温（５０℃以上）の好熱菌に、至適増殖温度が低い（５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い）低温菌及び中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素（低温菌及び中温菌由来酵素）をコードするＤＮＡを導入して得られた形質転換体を、先ず高温（５０℃以上）で培養し、次いで低温（５０℃以下かつ前記高温よりも１０℃以上低い温度）で培養することによって、前記形質転換体の増殖段階と前記低温菌及び中温菌由来酵素の発現段階とを分けることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法は、
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、至適増殖温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度である低温菌及び中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素をコードするＤＮＡを導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記酵素を発現させる第３の工程と、
を含むものである。
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、至適増殖温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度である低温菌及び中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素をコードするＤＮＡを導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記酵素を発現させる第３の工程と、
を含むものである。
本発明の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法においては、第２の工程の培養温度が５５〜８７℃であることが好ましく、また、第３の工程の培養温度が２５〜４５℃であることが好ましい。さらに、本発明の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法においては、前記形質転換体を培養する培養液のＯＤ６００が１以下であるときに第２の工程の培養温度から第３の工程の培養温度に変えることが好ましい。
本発明の酵素反応方法は、上記本発明の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法で得られた酵素と前記酵素の基質とを接触させて反応せしめるものである。
なお、本発明において、「至適増殖温度」とは、微生物が最も急速に増殖する温度を指し、各温度で微生物を一定時間培養して得られる比増殖速度が最も大きくなる温度をその微生物の至適増殖温度とすることができる。
本発明によれば、低温菌及び中温菌に由来する酵素をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の増殖段階と前記酵素の発現段階とを分けることができる低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法を提供することが可能となる。そのため、例えば、低温菌及び中温菌由来酵素が分泌系で発現されるように形質転換体を作製し、高温で増殖させた後に培地を交換してから培養温度を低温に変えることにより、目的の低温菌及び中温菌由来酵素を選択的に培地中に得ることができるため、酵素の回収・精製が容易となる。また、得られる低温菌及び中温菌由来酵素の最適温度付近では、宿主微生物である好熱菌由来の酵素の活性が抑制されるため、形質転換体を含む培養液をそのまま酵素反応に用いることが可能となる。
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
本発明の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法は、
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、至適増殖温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度である低温菌及び中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素（低温菌及び中温菌由来酵素）をコードするＤＮＡを導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記酵素を発現させる第３の工程と、
を含む。
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、至適増殖温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度である低温菌及び中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素（低温菌及び中温菌由来酵素）をコードするＤＮＡを導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記酵素を発現させる第３の工程と、
を含む。
本発明において、「好熱菌」とは、至適増殖温度が５０℃以上である微生物である。このような好熱菌としては、好熱性真正細菌、超好熱性真正細菌、好熱性古細菌及び超好熱性古細菌が挙げられ、発現が容易である観点からは、宿主微生物として真性細菌を用い、下記の低温菌及び中温菌由来酵素として真正細菌由来酵素を発現させることが好ましいことから、好熱性真正細菌又は超好熱性真正細菌であることがより好ましい。なお、本発明において、好熱性とは、微生物の至適増殖温度が５０℃以上８０℃未満であることを指し、超好熱性とは、微生物の至適増殖温度が８０℃以上であることを指す。
前記好熱性真正細菌及び超好熱性真正細菌としては、公的機関から入手可能であり、形質転換体の作製の実績がある、又は形質転換体の作製が比較的容易である傾向にある観点から、ゲオバチルス属、バチルス属、サーマス属、サーモトガ属、シュードサーモトガ属、サーモデスルフォバクテリウム属、アクウィフェクス属であることが好ましく、ゲオバチルス属、バチルス属、サーマス属、サーモトガ属であることがより好ましく、ゲオバチルス属であることが特に好ましい。
前記ゲオバチルス属としては、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・カウストフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・サブテラネウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・ウゼネンシス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｚｅｎｅｎｓｉｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・サーモカテニュラタス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、至適増殖温度：６０℃）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、至適増殖温度：６０℃）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、至適増殖温度：６０℃）が挙げられる。
前記バチルス属としては、バチルス・サーマンタルクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、至適増殖温度：５５℃）が挙げられ、前記サーマス属としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：７５℃）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、至適増殖温度：７０℃）が挙げられる。
また、前記サーモトガ属としては、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ 至適増殖温度：８０℃）、サーモトガ・ナフトフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎａｐｈｔｈｏｐｈｉｌａ、至適増殖温度：８０℃）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、至適増殖温度：８５℃）、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ、至適増殖温度：８０℃）が挙げられ、前記シュードサーモトガ属としては、シュードサーモトガ・レティンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ、至適増殖温度：６５℃）が挙げられる。
さらに、前記サーモデスルフォバクテリウム属としては、サーモデスルフォバクテリウム・コムネ（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ、至適増殖温度：７０℃）が挙げられ、前記アクウィフェクス属としては、アクウィフェクス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、至適増殖温度：８５℃）、アクウィフェクス・ピロフィラス（Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：８５℃）が挙げられる。
前記好熱性古細菌及び超好熱性古細菌としては、公的機関から入手可能であり、形質転換体の作製の実績がある、又は形質転換体の作製が比較的容易である傾向にある観点から、アエロパイラム属、アルカエオグロバス属、メタノカルドコッカス属、メタノサーモバクター属、ピロコッカス属、スルフォロバス属であることが好ましい。前記アエロパイラム属としては、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、至適増殖温度：９０℃）が挙げられ、前記アルカエオグロバス属としては、アルカエオグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、至適増殖温度：８５℃）が挙げられ、前記メタノカルドコッカス属としては、メタノカルドコッカス・ヤナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、至適増殖温度：８０℃）が挙げられ、前記メタノサーモバクター属としては、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、至適増殖温度：６５℃）が挙げられる。
また、前記ピロコッカス属としては、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、至適増殖温度：９７℃）、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、至適増殖温度：９５℃）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ、至適増殖温度：９０℃）が挙げられ、前記スルフォロバスとしては、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、至適増殖温度：７０℃）、スルフォロバス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、至適増殖温度：７５℃）が挙げられる。
本発明に係る好熱菌の至適増殖温度としては、５０℃以上であることが必要である。好熱菌の至適増殖温度が前記下限未満であると、形質転換体の増殖段階と酵素の発現段階とを分けることが困難となる。また、前記好熱菌の至適増殖温度としては、形質転換体の増殖段階と酵素の発現段階とをより区別することができ、かつ、形質転換体を増殖させるための培養がより容易であるという観点から、５５〜８７℃であることが好ましく、５５〜６５℃であることがより好ましい。
本発明において、「低温菌及び中温菌」とは、至適増殖温度が５０℃以下である微生物である。また、前記低温菌とは、至適増殖温度が３０℃未満である微生物を指し、前記中温菌とは、至適増殖温度が３０〜５０℃である微生物を指す。このような低温菌及び中温菌としては、真正細菌、古細菌、真核生物が挙げられ、発現が容易である観点からは、宿主微生物として真性細菌を用い、下記の低温菌及び中温菌由来酵素として真正細菌由来酵素を発現させることが好ましいことから、真正細菌であることがより好ましい。
前記低温菌及び中温菌としての真正細菌としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、至適増殖温度：３７℃）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、至適増殖温度：３０℃）、コリネバクテリウム・グルタミウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、至適増殖温度：２８℃）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、至適増殖温度：３０℃）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、至適増殖温度：３７℃）、シュードモナス・メバロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、至適増殖温度：３０℃）が挙げられる。前記低温菌及び中温菌としての古細菌としても、特に制限されないが、例えば、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、至適増殖温度：３７℃）が挙げられる。また、前記低温菌及び中温菌としての真核生物としても、特に制限されないが、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、至適増殖温度：２５℃）が挙げられる。これらの中でも、前記低温菌及び中温菌としては、その微生物由来の酵素の使用実績が多い傾向にある観点から、大腸菌、枯草菌、クロストリジウム・アセトブチリクム、サッカロマイセス・セレビシエが好ましく、大腸菌が特に好ましい。
本発明に係る低温菌及び中温菌の至適増殖温度としては、５０℃以下であり、かつ、低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡを導入する宿主細胞として用いる好熱菌の増殖温度よりも１０℃以上低いことが必要である。低温菌及び中温菌の至適増殖温度が前記上限を超えると、形質転換体の増殖段階と低温菌及び中温菌由来酵素の発現段階とを分けることが困難となる。また、前記低温菌及び中温菌の至適増殖温度としては、形質転換体の増殖段階と酵素の発現段階とをより区別することができ、かつ、酵素の発現量をより多くすることができる傾向にある観点から、２５〜４５℃であることが好ましく、２５〜４０℃であることがより好ましい。
上記の好熱菌、低温菌及び中温菌は、例えば、ＢＧＳＣ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））、ＮＰＭＤ（独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）等の公的な機関や、民間販売会社から入手することができる。
本発明に係る「低温菌及び中温菌由来酵素」は、前記低温菌及び前記中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素である。このような酵素としては、特に限定されないが、例えば、大腸菌由来の糖代謝系酵素、解糖系酵素、非メバロン酸経路酵素、ブタノール発酵酵素、脂肪酸合成酵素；枯草菌由来の解糖系酵素、非メバロン酸経路酵素、ブタノール発酵酵素；コリネバクテリウム・グルタミウム由来のブタノール発酵酵素、シキミ酸経路酵素；ラクトコッカス・ラクチス由来のブタノール発酵酵素；クロストリジウム・アセトブチリクム由来のアセトン−ブタノール−エタノール発酵酵素；シュードモナス・メバロニ由来のメバロン酸経路酵素；メタノサルキナ・マゼイ由来のメバロン酸経路酵素；サッカロマイセス・セレビシエ由来の解糖系酵素、エタノール発酵酵素、メバロン酸経路酵素が挙げられる。
前記大腸菌由来の糖代謝系酵素としては、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）が好ましい。また、前記大腸菌、前記枯草菌又は前記サッカロマイセス・セレビシエ由来の解糖系酵素としては、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ−１、フルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、ピルビン酸キナーゼが好ましい。
前記大腸菌又は前記枯草菌由来の非メバロン酸経路酵素としては、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが好ましい。
前記大腸菌由来のブタノール発酵酵素としては、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼが好ましく、前記枯草菌由来のブタノール発酵酵素としては、アセト乳酸合成酵素が好ましく、コリネバクテリウム・グルタミウム由来のブタノール発酵酵素としては、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、
アルコール脱水素酵素が好ましく、前記ラクトコッカス・ラクチス由来のブタノール発酵酵素としては、ケト酸デカルボキシラーゼが好ましい。
アルコール脱水素酵素が好ましく、前記ラクトコッカス・ラクチス由来のブタノール発酵酵素としては、ケト酸デカルボキシラーゼが好ましい。
前記大腸菌由来の脂肪酸合成酵素としては、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＣＰ−アセチルトランスフェラーゼ、ＡＣＰ−マロニルトランスフェラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、β−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ、３−ヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラーゼ、エノイルＡＣＰレダクターゼが好ましい。
前記コリネバクテリウム・グルタミウム由来のシキミ酸経路酵素としては、７−ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼ、３−デヒドロキナ酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、３−ホスホシキミ酸１−カルボキシビニルトランスフェラーゼ、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼが好ましい。
前記クロストリジウム・アセトブチリクム由来のアセトン−ブタノール−エタノール発酵酵素としては、ピルビン酸シンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、エタノールデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼが好ましい。
前記シュードモナス・メバロニ由来のメバロン酸経路酵素としては、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが好ましく、メタノサルキナ・マゼイ又はサッカロマイセス・セレビシエ由来のメバロン酸経路酵素としては、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼが好ましい。前記サッカロマイセス・セレビシエ由来のエタノール発酵酵素としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼが好ましい。
本発明に係る低温菌及び中温菌由来酵素としては、上記のうちの１種を単独で発現させても２種以上を組み合わせて発現させてもよい。これらの中でも、前記低温菌及び中温菌由来酵素としては、使用実績が多い傾向にある観点から、β−ガラクトシダーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼが好ましく、β−ガラクトシダーゼが特に好ましい。
上記の低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡの配列情報は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において入手することができる。
本発明の製造方法に係る第１の工程は、前記好熱菌に、前記低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡを導入して、形質転換体を得る工程である。前記形質転換体を得る方法としては、特に制限されず、公知の方法又は公知の方法に適宜改変を加えた条件を適宜採用することができる。例えば、目的の低温菌及び／又は中温菌から慣行法によって目的の低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡを含む自己複製が可能な発現ベクターを調製して前記好熱菌に導入することによって目的の形質転換体を得ることができる。また、単離したＤＮＡを含む発現ベクターを前記高熱菌に導入し、接合伝達等によって該ＤＮＡを前記高熱菌のゲノムに組み込むことによっても目的の形質転換体を得ることができる。
前記ＤＮＡの単離方法としては、例えば、目的の低温菌及び中温菌由来酵素の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、目的の低温菌及び／又は中温菌のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することによって所望のゲノムＤＮＡを単離する方法；目的の低温菌及び／又は中温菌からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出し、これを基に合成したｃＤＮＡを適当なベクターと連結してＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、目的の低温菌及び中温菌由来酵素の塩基配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって前記ライブラリーから所望のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを単離する方法；人工的に化学合成する方法が挙げられる。
前記発現ベクターは、そのポリヌクレオチド配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含むベクターであり、前記好熱菌内で複製可能であることが好ましく、例えば、プラスミド、ファージ、コスミドを基本に構築することができる。前記発現ベクターの母体となるプラスミドは、発現ベクターを導入する好熱菌の種類や導入方法に応じて適宜選択することができ、具体的には、例えば、ｐＮＷ３３Ｎ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ： ＡＹ２３７１２２．１）、ｐＵＢ１１０（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ： Ｍ１９４６５．１）、ｐＳＴＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ： Ｄ２９９８９．１）、ｐＴＢ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ： Ｍ６３８９１．１）、Ｈｉｒｏｋａｚｕ Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１２年１０月、７８（２０）、ｐ．７３７６‐７３８３に記載のｐＧＡＭ４６プラスミド等のプラスミド及びその誘導体が挙げられる。
前記発現ベクターとしては、前記低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡの他に、これを実際に前記好熱菌に導入して前記酵素を発現させるために、その発現を制御するポリヌクレオチド配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等をさらに含んでいることが好ましい。また、前記低温菌及び中温菌由来酵素を精製するための精製用タグ配列をさらに含んでいることが好ましく、前記低温菌及び中温菌由来酵素を好熱菌外に分泌させる場合には分泌シグナル配列をさらに含んでいることが好ましい。
前記発現を制御するポリヌクレオチド配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、又はシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択方法に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
前記プロモーターとしては、目的の低温菌及び中温菌由来酵素に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｈｉｒｏｋａｚｕ Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１３年９月、７９（１７）、ｐ．５１５１‐５１５８に記載されている、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓの、Ｐｇｋ７０４（推定アミロース代謝遺伝子プロモーター）、Ｐｇｋ１８５９（推定セルビオース代謝遺伝子プロモーター）、Ｐｇｋ１８９４（ミオイノシトール代謝遺伝子プロモーター）、Ｐｇｋ１８９９（ミオイノシトール代謝遺伝子プロモーター）、Ｐｇｋ１９０７（推定Ｌ−アラビノース代謝遺伝子プロモーター）、Ｐｇｋ２１５０（推定Ｄ−ガラクトース代謝遺伝子プロモーター）、ＰｓｉｇＡ（ｄｎａＧ遺伝子、ｓｉｇＡ遺伝子プロモーター）；Ｐａｕｌ Ｐ．Ｌｉｎら、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．、２０１４年７月、２４、ｐ．１９２‐１９９に記載されている、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓの、Ｐｇｌｋ（ヘキソキナーゼ遺伝子プロモーター）、Ｐｐｇｉ（グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子プロモーター）、ＰｐｆｋＡ（ホスホフルクトキナーゼ−１遺伝子プロモーター）、Ｐｇａｐ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター）、Ｐｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター）、Ｐｇｐｍ（ホスホグリセリン酸ムターゼ遺伝子プロモーター）、Ｐｅｎｏ（ホスホピルビン酸ヒドラターゼ遺伝子プロモーター）、Ｐｌｄｈ（乳酸脱水素酵素遺伝子プロモーター）、ＰｇｌｐＤ（グリセロール−リン酸脱水素酵素遺伝子プロモーター）やＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのＰ４３が挙げられる。このようなプロモーターは、一般に、前記低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡの上流に位置させる。
本発明においては、前記発現ベクターにおいて、前記低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡがプロモーターに作動可能に連結していることが好ましく、また、前記発現ベクターが導入される好熱菌と、前記プロモーターの由来する微生物とが近縁にあることが好ましい。例えば、前記発現ベクターが導入される好熱菌がゲオバチルス属である場合、前記プロモーターとしては、グラム陽性の真正細菌由来のプロモーターであることが好ましく、ゲオバチルス属に含まれる真正細菌由来のプロモーター及びバチルス属に含まれる枯草菌由来のプロモーターからなる群から選択される少なくとも１種のプロモーターであることがより好ましい。
前記発現ベクターの作製方法は、特に制限されず、公知の方法、又は公知の方法に適宜修飾、改変を加えた方法を適宜採用することができる。例えば、前記プロモーターと前記低温菌及び中温菌由来酵素をコードするＤＮＡと必要に応じて前記ターミネーター等とを連結して発現カセットを作製し、これをベクターに導入することで前記発現ベクターを得ることができれる。また、前記発現ベクターを作製するための酵素や条件についても特に限定されず、市販のものを適宜選択して用いることができる。
前記好熱菌に前記発現ベクターを導入する形質転換方法としては、特に制限されず、公知の方法を適宜採用することができ、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、接合伝達法、リン酸カルシウム法を用いることができる。また、前記発現ベクターが導入される好熱菌としては、必要に応じて、特定の機能が欠損するように既に形質転換されたものや変異体であってもよい。
本発明に係る第２の工程は、５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる工程である。第２の工程の培養温度が前記下限未満であると、形質転換体の増殖段階と低温菌及び中温菌由来酵素の発現段階とを分けることが困難となる。また、第２の工程の培養温度としては、形質転換体の増殖段階と酵素の発現段階とをより区別することができ、かつ、形質転換体を増殖させるための培養がより容易であるという観点から、５５〜８７℃であることが好ましく、５５〜６５℃であることがより好ましい。
本発明に係る第３の工程は、第２の工程の後、培養温度を、５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて低温菌及び中温菌由来酵素を発現させる工程である。第３の工程の培養温度が前記上限を超えると、形質転換体の増殖段階と低温菌及び中温菌由来酵素の発現段階とを分けることが困難となる。また、第３の工程の培養温度としては、形質転換体の増殖段階と酵素の発現段階とをより区別することができ、かつ、形質転換体の死滅を抑制する観点から、２５〜４５℃であることが好ましく、３０〜４５℃であることがより好ましく、４０〜４５℃であることが更に好ましい。なお、本発明において、第３の工程の培養温度は、発現させる酵素が由来する前記低温菌及び中温菌の至適増殖温度と一致することは必ずしも必要ではなく、本発明の構成において第３の工程の培養温度が上記温度範囲内にあることで低温菌及び中温菌由来酵素を十分に発現させることができる。
また、本発明においては、前記形質転換体が対数増殖期にあるとき、より具体的には前記形質転換体を培養する培養液のＯＤ６００が１以下、さらに好ましくは０．１〜０．９であるときに、培養温度を、第２の工程の培養温度から第３の工程の培養温度に変えることが好ましい。培養温度を変えるときのＯＤ６００が前記下限未満の場合には、形質転換体の増殖が十分ではないために酵素の発現量が少なくなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、酵素を発現させることが困難となる傾向にある。なお、本発明において、ＯＤ６００値とは、形質転換体を培養している培養液（培地、微生物等、培養系に含まれる全成分を含む）の６００ｎｍにおける吸光度のことを指す。
また、本発明において、培養温度を第２の工程の温度から第３の工程の温度に変えた後の培養時間、すなわち、第３の工程の培養時間としては、宿主微生物である好熱菌の種類や培養条件にもよるが、例えば、前記好熱菌としてゲオバチルス属（より好ましくはゲオバチルス・サーモグルコシダシウス）を用いた場合には、１〜４８時間であることが好ましく、３〜４８時間であることがより好ましく、３〜２４時間であることが更に好ましく、３〜１５時間であることが特に好ましい。温度変更後の培養時間が前記下限未満の場合には、酵素の発現量が少なくなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、発現速度が低下して酵素の発現量が安定しなくなる傾向にある。
前記第２の工程及び第３の工程において、形質転換体を培養するその他の条件（培地の組成、培地のｐＨ、ガス（酸素、二酸化炭素等）濃度等）としては、特に制限されず、宿主微生物である好熱菌の種類に応じて、公知の培養条件、又は公知の培養条件に適宜修飾、改変を加えた条件から選択することができる。
本発明の製造方法により、前記第３の工程において、前記好熱菌を用いた形質転換体の増殖を抑制しつつ、目的の低温菌及び中温菌由来酵素を優先的に発現させることができる。例えば、前記発現ベクターとして分泌シグナル配列を含むベクターを用いた場合には、第２の工程後に培地を交換し、第３の工程で低温菌及び中温菌由来酵素を発現させることにより、前記酵素を選択的に培地中に得ることができるため、この培地を粗酵素として酵素反応に用いることができる。また、分泌シグナル配列を含むベクターを用いなかった場合でも、得られる低温菌及び中温菌由来酵素の最適温度付近では、宿主微生物である好熱菌由来の酵素の活性が抑制されるため、形質転換体を含む培養液をそのまま粗酵素として酵素反応に用いることができる。さらに前記酵素としては、形質転換体の培養終了後、形質転換体を遠心分離や濾過等によって回収し、細胞を破砕して得られる液を粗酵素として用いることもできる。また、これらの粗酵素を、限外濾過法等によって濃縮し、防腐剤等を加えて濃縮酵素とすることもできる。また、前記粗酵素又は前記濃縮酵素を、例えば、塩析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることによって精製してもよい。さらに、前記発現ベクターとして精製用タグ配列を含むベクターを用いた場合には、精製用タグを付加した酵素をタグ付きタンパクの精製用カラムを用いて精製してもよい。
本発明の製造方法によって得られた低温菌及び中温菌由来酵素は、前記酵素の種類に応じて、様々な酵素反応に利用することができる。前記酵素反応としては、特に制限されないが、前記酵素と、その基質と、必要に応じて前記酵素の補酵素とを接触させて反応せしめる方法が挙げられる。このような酵素反応における各成分の濃度、溶媒の種類、温度条件、反応温度等については、前記低温菌及び中温菌由来酵素の種類に応じて適宜調整することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
＜ＤＮＡ（ｌａｃＺ）の単離＞
先ず、ＢＬ２１（ＤＥ３）（メルク社）から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムを抽出した。抽出したゲノムを鋳型として、ＨＭ４８プライマー（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）、ＨＭ４９プライマー（配列番号：２に記載のヌクレオチド配列）及びＰＣＲ酵素（ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ、東洋紡社）を用いて大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする配列（ｌａｃＺ、配列番号：３に記載のヌクレオチド配列、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＣＰ００１５０９．３（３３５８４０〜３３２７６６））を増幅させた。増幅させたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、精製したＰＣＲ産物とｐＥＴ２８ａ＋（メルク社）とを、それぞれ、ＮｃｏＩ（タカラバイオ社）及びＮｏｔＩ（タカラバイオ社）で切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
＜ＤＮＡ（ｌａｃＺ）の単離＞
先ず、ＢＬ２１（ＤＥ３）（メルク社）から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムを抽出した。抽出したゲノムを鋳型として、ＨＭ４８プライマー（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）、ＨＭ４９プライマー（配列番号：２に記載のヌクレオチド配列）及びＰＣＲ酵素（ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ、東洋紡社）を用いて大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする配列（ｌａｃＺ、配列番号：３に記載のヌクレオチド配列、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＣＰ００１５０９．３（３３５８４０〜３３２７６６））を増幅させた。増幅させたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、精製したＰＣＲ産物とｐＥＴ２８ａ＋（メルク社）とを、それぞれ、ＮｃｏＩ（タカラバイオ社）及びＮｏｔＩ（タカラバイオ社）で切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
次いで、切断・精製後のＰＣＲ産物（６８ｎｇ）及びｐＥＴ２８ａ＋（２３３ｎｇ）をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（２５μｇ／ｍｌカナマイシン）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌカナマイシン）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｌａｃＺを含むｐＥＳＧ２３プラスミドを抽出した。
＜発現ベクターの調製＞
先ず、ｐＮＷ３３Ｎプラスミド（配列番号：４に記載のヌクレオチド配列、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒより入手）をＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社）で切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。また、Ｋｅｎｊｉ Ｔｓｕｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００３年１１月、３１（２１）に記載の合成ＤＮＡオリゴマーＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｆ及びＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｒの各５’末端をリン酸化させたオリゴマー（ＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｆ（５’末端リン酸化）及びＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｒ（５’末端リン酸化））を９８℃で５分間加熱した後、室温で自然冷却してインサートを作製した。切断・精製後のｐＮＷ３３Ｎと前記インサートとを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ＳｆｉＩ部位を含むｐＮＷ（ＳｆｉＩ）プラスミドを抽出した。
先ず、ｐＮＷ３３Ｎプラスミド（配列番号：４に記載のヌクレオチド配列、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒより入手）をＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社）で切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。また、Ｋｅｎｊｉ Ｔｓｕｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００３年１１月、３１（２１）に記載の合成ＤＮＡオリゴマーＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｆ及びＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｒの各５’末端をリン酸化させたオリゴマー（ＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｆ（５’末端リン酸化）及びＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｒ（５’末端リン酸化））を９８℃で５分間加熱した後、室温で自然冷却してインサートを作製した。切断・精製後のｐＮＷ３３Ｎと前記インサートとを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ＳｆｉＩ部位を含むｐＮＷ（ＳｆｉＩ）プラスミドを抽出した。
また、Ｐａｕｌ Ｐ．Ｌｉｎら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１４年７月、２４、ｐ．１９２‐１９９に記載されているＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの乳酸脱水素酵素遺伝子プロモーター（ｌｄｈ）を人工的に合成し、これを含むプラスミドを得た。このプラスミドを鋳型として、ＨＭ０５ｂプライマー（配列番号：５に記載のヌクレオチド配列）、ＨＭ０６‐ｍｉｎｕｓプライマー（配列番号：６に記載のヌクレオチド配列）及びＰＣＲ酵素（ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２、東洋紡社）を用いてｌｄｈを増幅させた（ＰＣＲ１）。
さらに、上記で得られたｌａｃＺを含むｐＥＳＧ２３プラスミドを鋳型として、ＨＭ５１プライマー（配列番号：７に記載のヌクレオチド配列）、ＨＭ５２Ｈプライマー（Ｈｉｓ６タグを付加するプライマー、配列番号：８に記載のヌクレオチド配列）及びＰＣＲ酵素（ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２、東洋紡社）を用いてｌａｃＺを増幅させた（ＰＣＲ２）。
ＰＣＲ１及びＰＣＲ２で増幅させたＰＣＲ産物はそれぞれアガロースゲル電気泳動をして長さを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。精製後のＰＣＲ１産物（１００ｎｇ）及びＰＣＲ２産物（１００ｎｇ）、ＨＭ０５ｂプライマー、ＨＭ５２Ｈプライマー、ＰＣＲ酵素（ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２、東洋紡社）を用いて、Ｓｔｅｐ１：９８℃で１０秒、Ｓｔｅｐ２：６０℃で３０秒、Ｓｔｅｐ３：６８℃で４分、Ｓｔｅｐ２からＳｔｅｐ３への温度上昇速度：０．１℃／秒、３５サイクルの条件でフュージョンＰＣＲを行ってｌｄｈ及びｌａｃＺを融合した発現カセットを作製した。
上記で得られたｐＮＷ（ＳｆｉＩ）プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断して前記発現カセットと混合し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２ｘ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｌｄｈ及びｌａｃＺを含むｐＥＳＧ２１Ｈプラスミド（配列番号：９に記載のヌクレオチド配列）を抽出した。
＜形質転換＞
宿主微生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒより取り寄せたゲオバシルス属の好熱菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ ＤＳＭ ２５４２、至適増殖温度：５５℃）を用いた。好熱菌コンピテントセルの作製及び形質転換は、Ｍａｒｋ Ｐ．Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ、２００８年７月、６０（１）、ｐ．４５−５２に記載の方法に従って下記のように行った。
宿主微生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒより取り寄せたゲオバシルス属の好熱菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ ＤＳＭ ２５４２、至適増殖温度：５５℃）を用いた。好熱菌コンピテントセルの作製及び形質転換は、Ｍａｒｋ Ｐ．Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ、２００８年７月、６０（１）、ｐ．４５−５２に記載の方法に従って下記のように行った。
（好熱菌コンピテントセルの作製）
前記好熱菌をＴＧＰ培地プレート（トリプトン：１７ｇ／ｌ、ソイトン：３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４：２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／ｌ、ピルビン酸ナトリウム：４ｇ／ｌ、グリセロール：４ｍｌ／ｌ、寒天（Ａｇａｒ）：１５ｇ／ｌ）に塗布して６０℃で一晩培養後、得られたコロニーを１ｍｌのＴＧＰ培地（トリプトン：１７ｇ／ｌ、ソイトン：３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４：２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／ｌ、ピルビン酸ナトリウム：４ｇ／ｌ、グリセロール：４ｍｌ／ｌ）に植菌して６０℃、１８０ｒｐｍで培養し、続いて５０ｍｌのＴＧＰ培地に植菌してＯＤ６００＝１．６になるまで培養した後、氷上で１０分間冷却した。その後、８０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌し、エレクトロポレーションバッファー（０．５Ｍソルビトール、０．５Ｍマンニトール、１０％グリセロール）に菌を懸濁し、８０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌する作業を４回繰り返した。その後、１．５ｍｌのエレクトロポレーションバッファーに懸濁し、６０μｌずつ分注して−８０℃で保存した。
前記好熱菌をＴＧＰ培地プレート（トリプトン：１７ｇ／ｌ、ソイトン：３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４：２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／ｌ、ピルビン酸ナトリウム：４ｇ／ｌ、グリセロール：４ｍｌ／ｌ、寒天（Ａｇａｒ）：１５ｇ／ｌ）に塗布して６０℃で一晩培養後、得られたコロニーを１ｍｌのＴＧＰ培地（トリプトン：１７ｇ／ｌ、ソイトン：３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４：２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／ｌ、ピルビン酸ナトリウム：４ｇ／ｌ、グリセロール：４ｍｌ／ｌ）に植菌して６０℃、１８０ｒｐｍで培養し、続いて５０ｍｌのＴＧＰ培地に植菌してＯＤ６００＝１．６になるまで培養した後、氷上で１０分間冷却した。その後、８０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌し、エレクトロポレーションバッファー（０．５Ｍソルビトール、０．５Ｍマンニトール、１０％グリセロール）に菌を懸濁し、８０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌する作業を４回繰り返した。その後、１．５ｍｌのエレクトロポレーションバッファーに懸濁し、６０μｌずつ分注して−８０℃で保存した。
（形質転換‐形質転換体の作製‐）
上記で得られた好熱菌コンピテントセル（６０μｌ）とｐＥＳＧ２１Ｈプラスミド（５００ｎｇ）とを混合し、０．１ｃｍのキュベットに入れ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、２５００Ｖ、１０μＦ、６００Ωの電気刺激を与えた。その後、１ｍｌのＴＧＰ培地を添加して１４ｍｌポリプロピレンラウンドボトムチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社）に移し、６０℃で２時間振盪した後、ＴＧＰ培地プレート（１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に塗布して６０℃で一晩培養した。得られたコロニー（４コロニー）をそれぞれ３ｍｌのＬＢ培地に植菌し、６０℃で一晩培養した後、等量の８０％グリセロールを加えて形質転換体のグリセロールストックを作製し、−８０℃で保存した。
上記で得られた好熱菌コンピテントセル（６０μｌ）とｐＥＳＧ２１Ｈプラスミド（５００ｎｇ）とを混合し、０．１ｃｍのキュベットに入れ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、２５００Ｖ、１０μＦ、６００Ωの電気刺激を与えた。その後、１ｍｌのＴＧＰ培地を添加して１４ｍｌポリプロピレンラウンドボトムチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社）に移し、６０℃で２時間振盪した後、ＴＧＰ培地プレート（１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に塗布して６０℃で一晩培養した。得られたコロニー（４コロニー）をそれぞれ３ｍｌのＬＢ培地に植菌し、６０℃で一晩培養した後、等量の８０％グリセロールを加えて形質転換体のグリセロールストックを作製し、−８０℃で保存した。
＜形質転換体の培養＞
先ず、上記で得られた形質転換体のグリセロールストックの一部をＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に入れ、一晩培養した。次いで、５００ｍｌ三角フラスコに１２０ｍｌのＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を入れ、一晩培養した培養液１ｍｌを植菌した。培養機（ＢＲ−４３ＦＬ、タイテック社）を用いて６０℃、１８０ｒｐｍでＯＤ６００＝０．７８５になるまで第２の工程の培養を行った。その後、２００ｍｌ三角フラスコに培養液を３０ｍｌ入れ、培養温度を４２℃に変えて第３の工程の培養を行った。第３の工程の培養を開始してから（培養温度を４２℃に変えてから）０、１．５、３、２４時間培養後の培養液のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。
先ず、上記で得られた形質転換体のグリセロールストックの一部をＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に入れ、一晩培養した。次いで、５００ｍｌ三角フラスコに１２０ｍｌのＬＢ培地（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を入れ、一晩培養した培養液１ｍｌを植菌した。培養機（ＢＲ−４３ＦＬ、タイテック社）を用いて６０℃、１８０ｒｐｍでＯＤ６００＝０．７８５になるまで第２の工程の培養を行った。その後、２００ｍｌ三角フラスコに培養液を３０ｍｌ入れ、培養温度を４２℃に変えて第３の工程の培養を行った。第３の工程の培養を開始してから（培養温度を４２℃に変えてから）０、１．５、３、２４時間培養後の培養液のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。
＜β‐ガラクトシダーゼ活性評価‐酵素反応‐＞
第３の工程の培養を開始してから（培養温度を変えてから）０、３、２４時間培養後に、それぞれ、１４ｍｌポリプロピレンラウンドボトムチューブに３ｍｌの培養液を採り、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した２％ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を５０μｌ添加し、４２℃で１時間振盪しながらインキュベートし、β‐ガラクトシダーゼの活性を評価した。評価はインキュベート後の培養液の外観（色）を目視で観察し、以下の基準：
０：橙色（青色が確認されない（Ｘ−ｇａｌを添加しなかったものと同じ培地の色である）
１：黄色（わずかに青色がかっているがＸ−ｇａｌを添加しなかったものとほとんど変わらない）
２：黄緑色（青色が確認される）
３：緑色
４：青色
に基づいておこなった。なお、評価の数値が大きいほど、酵素が多く発現していると判断できる。
第３の工程の培養を開始してから（培養温度を変えてから）０、３、２４時間培養後に、それぞれ、１４ｍｌポリプロピレンラウンドボトムチューブに３ｍｌの培養液を採り、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した２％ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を５０μｌ添加し、４２℃で１時間振盪しながらインキュベートし、β‐ガラクトシダーゼの活性を評価した。評価はインキュベート後の培養液の外観（色）を目視で観察し、以下の基準：
０：橙色（青色が確認されない（Ｘ−ｇａｌを添加しなかったものと同じ培地の色である）
１：黄色（わずかに青色がかっているがＸ−ｇａｌを添加しなかったものとほとんど変わらない）
２：黄緑色（青色が確認される）
３：緑色
４：青色
に基づいておこなった。なお、評価の数値が大きいほど、酵素が多く発現していると判断できる。
（実施例２）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養温度を３７℃としたこと以外は実施例１と同様にして培養した。第３の工程の培養を開始してから（培養温度を３７℃に変えてから）０、１．５、３、２４時間培養後の培養液のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。また、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を３７℃としたこと以外は実施例１と同様にしてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
形質転換体の培養において、第３の工程の培養温度を３７℃としたこと以外は実施例１と同様にして培養した。第３の工程の培養を開始してから（培養温度を３７℃に変えてから）０、１．５、３、２４時間培養後の培養液のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。また、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を３７℃としたこと以外は実施例１と同様にしてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
（比較例１）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養温度を第２の工程に引き続き６０℃のままとしたこと以外は実施例１と同様にして培養した。また、第２の工程の培養開始時間を−５時間、第３の工程の培養開始時間を０時間として、−３．５、−１、０、１．５、３、２４時間培養後のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。さらに、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を６０℃としたこと以外は実施例１と同様にしてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
形質転換体の培養において、第３の工程の培養温度を第２の工程に引き続き６０℃のままとしたこと以外は実施例１と同様にして培養した。また、第２の工程の培養開始時間を−５時間、第３の工程の培養開始時間を０時間として、−３．５、−１、０、１．５、３、２４時間培養後のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。さらに、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を６０℃としたこと以外は実施例１と同様にしてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
実施例１〜２及び比較例１において得られた増殖曲線を図１に示す。また、β‐ガラクトシダーゼ活性の評価結果を表１に示す。さらに、比較例１の第３の工程の培養開始時（０時間培養後）の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施したときの外観を示す写真を図２Ａに、実施例１〜２及び比較例１の第３の工程の培養開始から３時間培養後の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施したときの外観を示す写真を図２Ｂに、実施例１〜２及び比較例１の第３の工程の培養開始から２４時間培養後の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施したときの外観を示す写真を図２Ｃに、それぞれ示す。
（実施例３）
＜ＤＮＡ（ｌａｃＺ）の単離＞
実施例１と同様にして、ｌａｃＺを含むｐＥＳＧ２３プラスミドを得た。
＜ＤＮＡ（ｌａｃＺ）の単離＞
実施例１と同様にして、ｌａｃＺを含むｐＥＳＧ２３プラスミドを得た。
＜発現ベクターの調製＞
先ず、Ｈｉｒｏｋａｚｕ Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１２年１０月、７８（２０）、ｐ．７３７６‐７３８３に記載のｐＧＡＭ４６プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社）で切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。また、前記合成ＤＮＡオリゴマーＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｆ（５’末端リン酸化）及びＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｒ（５’末端リン酸化））を９８℃で５分間加熱した後、室温で自然冷却してインサートを作製した。切断・精製後のｐＧＡＭ４６と前記インサートとを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ＳｆｉＩ部位を含むｐＧＡＭ４６（ＳｆｉＩ）プラスミドを抽出した。
先ず、Ｈｉｒｏｋａｚｕ Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１２年１０月、７８（２０）、ｐ．７３７６‐７３８３に記載のｐＧＡＭ４６プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社）で切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。また、前記合成ＤＮＡオリゴマーＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｆ（５’末端リン酸化）及びＶｓｆｉＫｐｎ−１Ｒ（５’末端リン酸化））を９８℃で５分間加熱した後、室温で自然冷却してインサートを作製した。切断・精製後のｐＧＡＭ４６と前記インサートとを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ＳｆｉＩ部位を含むｐＧＡＭ４６（ＳｆｉＩ）プラスミドを抽出した。
また、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＨＴＡ４２６ゲノム由来の推定アミロース代謝遺伝子プロモーター（Ｐｇｋ７０４プロモーター（Ｐｇｋ７０４）、配列番号：１０に記載のヌクレオチド配列）を含むプラスミドを鋳型として、ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｆｗプライマー（配列番号：１１に記載のヌクレオチド配列）、ｐｒｏｍｏｔｅｒ‐ｒｖプライマー（配列番号：１２に記載のヌクレオチド配列）及びＰＣＲ酵素（ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ、東洋紡社）を用いてＰｇｋ７０４を増幅させた（ＰＣＲ１）。
さらに、上記で得られたｌａｃＺを含むｐＥＳＧ２３プラスミドを鋳型として、ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂＧａｌＥ−ｆｗプライマー（配列番号：１３に記載のヌクレオチド配列）、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−ｂＧａｌＥ−ｒｖプライマー（配列番号：１４に記載のヌクレオチド配列）及びＰＣＲ酵素（ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ、東洋紡社）を用いてｌａｃＺを増幅させた（ＰＣＲ２）。
ＰＣＲ１及びＰＣＲ２で増幅させたＰＣＲ産物はそれぞれアガロースゲル電気泳動をして長さを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。精製後のＰＣＲ１産物及びＰＣＲ２産物、ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｆｗプライマー、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−ｂＧａｌＥ−ｒｖプライマー、ＰＣＲ酵素（ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ、東洋紡社）を用いてフュージョンＰＣＲを行い、Ｐｇｋ７０４及びｌａｃＺを融合した発現カセットを作製した。
前記ｐＮＷ（ＳｆｉＩ）プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断してＣＩＡＰ処理（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、タカラバイオ社）を施し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した後、ＨｉｎｄＩＩＩで処理して同様に精製した前記発現カセットと混合して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＰｇｋ７０４及びｌａｃＺを含むｐＥＳＧ２８プラスミドを抽出した。
次いで、得られたｐＥＳＧ２８プラスミドを鋳型として、ＨＭ５８プライマー（配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列）、ＨＭ６０プライマー（配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列）及びＰＣＲ酵素（ＫＯＤ ｐｌｕｓ Ｖｅｒ．２、東洋紡社）を用いてＰｇｋ７０４及びｌａｃＺが連結された配列を増幅させた（ＰＣＲ３）。
ＰＣＲ３で増幅させたＰＣＲ３産物はアガロースゲル電気泳動をして長さを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。また、上記で得られたｐＧＡＭ４６（ＳｆｉＩ）プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した後、同様に精製したＰＣＲ３産物と混合して、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結し、２００μｌの大腸菌ＪＭ１０９ケミカルコンピテントセルに導入した。ＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）にて形質転換体を選抜し、３ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌して増殖させた。増殖させた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＰｇｋ７０４及びｌａｃＺを含むｐＥＳＧ３２プラスミドを抽出した。
＜形質転換＞
宿主微生物として、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１５年１月、８１（１）、ｐ．１４９−１５８に記載のゲオバシルス属の好熱菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２、至適増殖温度：５５℃）を用いた。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２は、鳥取大学大学院工学研究科鈴木宏和博士より入手した。先ず、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１２年９月、２２（９）、ｐ．１２７９−１２８７に記載の方法に従って大腸菌にｐＥＳＧ３２プラスミドを導入した。
宿主微生物として、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１５年１月、８１（１）、ｐ．１４９−１５８に記載のゲオバシルス属の好熱菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２、至適増殖温度：５５℃）を用いた。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２は、鳥取大学大学院工学研究科鈴木宏和博士より入手した。先ず、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１２年９月、２２（９）、ｐ．１２７９−１２８７に記載の方法に従って大腸菌にｐＥＳＧ３２プラスミドを導入した。
すなわち、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１２年９月、２２（９）、ｐ．１２７９−１２８７に記載の大腸菌ＢＲ４０８をＬＢ培地で培養した後、超純水に菌を懸濁・遠心して集菌する作業を３回繰り返した。その後、１０％グリセロールに懸濁して大腸菌コンピテントセルを得た。次いで、得られた大腸菌コンピテントセル（６０μｌ）とｐＥＳＧ３２プラスミドとを混合し、０．１ｃｍのキュベットに入れ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、１８００Ｖ、２５μＦ、２００Ωの電気刺激を与えた。その後、１ｍｌのＬＢ培地を添加して３７℃で１時間振盪した後、ＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、２５μｇ／ｍｌカナマイシン）に塗布して３７℃で一晩培養し、ｐＥＳＧ３２プラスミドが導入された大腸菌ＢＲ４０８（ｐＥＳＧ３２）のコロニーを得た。
次いで、Ｈｉｒｏｋａｚｕ Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１２年１０月、７８（２０）、ｐ．７３７６‐７３８３に記載の方法に従って、接合伝達により、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２にｐＥＳＧ３２プラスミドを導入した。
すなわち、先ず、前記大腸菌ＢＲ４０８（ｐＥＳＧ３２）のコロニーをＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、２５μｇ／ｍｌカナマイシン）で３７℃において、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２をＬＢ培地（抗生物質不添加）で６０℃において、それぞれ、ＯＤ６００＝０．６になるまで培養した。次いで、大腸菌ＢＲ４０８（ｐＥＳＧ３２）とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２とを２：８（質量比）の割合で混合し、減圧濾過によりメンブレンフィルター（ポアサイズ：０．２μｍ、Ｏｍｎｉｐｏｒｅ、メルクミリポア社）に菌を吸着させ、これをＬＢ寒天培地に乗せて３７℃で４〜６時間培養した。
その後、これを最少培地（Ｋ２ＳＯ４：０．３ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ：２．５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ：１ｇ／ｌ、Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、Ｖｉｔａｍｉｎ Ａｓｓａｙ）：１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４：０．４ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：３ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：５ｍｇ／ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：７ｍｇ／ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）：１０ｍＭ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ：１０ｇ／ｌ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ：０．１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ（Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ：ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：４００ｍｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３：１０ｍｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：５０ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４：２００ｍｇ／ｌ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ／ｌ、ＥＤＴＡ：２５０ｍｇ／ｌ））プレートに移し、６０℃で一晩培養して、ｐＥＳＧ３２プラスミド配列がゲノムに組み込まれたＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２（ＭＫ２４２（ｐＥＳＧ３２））のコロニーを得た。
得られたＭＫ２４２（ｐＥＳＧ３２）のコロニーを２００ｍｌのＬＢ培地で培養し、培養液２００μｌを２００ｍｌのＬＢ培地に植菌して培養する作業を４回繰り返した後、培養液１ｍｌを遠心して得られた沈殿を超純水１ｍｌに懸濁した。５０μｌ又は２５０μｌの懸濁液を５ｍｌの選択最少培地１（前記最少培地に１μｇ／ｍｌウラシル、５０μｇ／ｍｌ ５−フルオロオロチン酸を添加した培地）で４〜６時間培養した。その後、１μｌ又は１００μｌの培養液を選択最少培地２（前記最少培地に１０μｇ／ｍｌウラシル、５０μｇ／ｍｌ ５−フルオロオロチン酸を添加した培地）のプレートに塗布し、６０℃で約１日間培養してコロニーを得た。得られたコロニーを更に前記選択最少培地のプレート及びＬＢ培地のプレートにそれぞれ塗布し、前記最少選択培地で増殖しなかったコロニーを選択してそれと対応するＬＢ培地のコロニーからグリセロールストックを作製し、下記の形質転換体の培養及びβ‐ガラクトシダーゼ活性評価に用いた。前記最少選択培地で増殖しなかったコロニーは、ＭＫ２４２（ｐＥＳＧ３２）のうち、ｐＧＡＭ４６由来の配列を含まないもの、すなわち、Ｐｇｋ７０４及びｌａｃＺがゲノムに組み込まれたＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ２４２（ＭＫ２４２（Ｐｇｋ７０４／ｌａｃＺ））である。
＜形質転換体の培養＞
形質転換体として上記で得られたＭＫ２４２（Ｐｇｋ７０４／ｌａｃＺ）を用い、第２の工程の培養をＯＤ６００＝０．４２５になるまで行ったこと以外は実施例１と同様にして形質転換体の培養を行い、第３の工程の培養を開始してから（培養温度を４２℃に変えてから）０、１．５、３、６、２４、３０時間培養後の培養液のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。
形質転換体として上記で得られたＭＫ２４２（Ｐｇｋ７０４／ｌａｃＺ）を用い、第２の工程の培養をＯＤ６００＝０．４２５になるまで行ったこと以外は実施例１と同様にして形質転換体の培養を行い、第３の工程の培養を開始してから（培養温度を４２℃に変えてから）０、１．５、３、６、２４、３０時間培養後の培養液のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。
＜β‐ガラクトシダーゼ活性評価‐酵素反応‐＞
第３の工程の培養を開始してから（培養温度を変えてから）０、３、６時間培養後の培養液をそれぞれ用いたこと以外は実施例１と同様にして、β‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。また、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート時間を３時間としたものについても同様にβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
第３の工程の培養を開始してから（培養温度を変えてから）０、３、６時間培養後の培養液をそれぞれ用いたこと以外は実施例１と同様にして、β‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。また、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート時間を３時間としたものについても同様にβ‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
（実施例４）
第３の工程の培養温度を３７℃としたこと以外は実施例３と同様にして形質転換体の培養を行い、増殖曲線を得た。また、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を３７℃としたこと以外は実施例３と同様にして、β‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
第３の工程の培養温度を３７℃としたこと以外は実施例３と同様にして形質転換体の培養を行い、増殖曲線を得た。また、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を３７℃としたこと以外は実施例３と同様にして、β‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
（比較例２）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養温度を第２の工程に引き続き６０℃のままとしたこと以外は実施例３と同様にして形質転換体の培養を行い、第２の工程の培養開始時間を−２．５時間、第３の工程の培養開始時間を０時間として、−２．５、−１、０、１．５、３、６、２４、３０時間培養後のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。さらに、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を６０℃としたこと以外は実施例３と同様にして、β‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
形質転換体の培養において、第３の工程の培養温度を第２の工程に引き続き６０℃のままとしたこと以外は実施例３と同様にして形質転換体の培養を行い、第２の工程の培養開始時間を−２．５時間、第３の工程の培養開始時間を０時間として、−２．５、−１、０、１．５、３、６、２４、３０時間培養後のＯＤ６００を計測して増殖曲線を得た。さらに、Ｘ−ｇａｌを添加した後のインキュベート温度を６０℃としたこと以外は実施例３と同様にして、β‐ガラクトシダーゼ活性評価を実施した。
実施例３〜４及び比較例２において得られた増殖曲線を図３に示す。また、β‐ガラクトシダーゼ活性の評価結果（インキュベート時間：１時間）を表２に示す。さらに、比較例２の第３の工程の培養開始時（０時間培養後）の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価（インキュベート時間：１時間）を実施したときの外観を示す写真を図４Ａに、実施例３〜４及び比較例２の第３の工程の培養開始から３時間培養後の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価（インキュベート時間：１時間）を実施したときの外観を示す写真を図４Ｂに、実施例３〜４及び比較例２の第３の工程の培養開始から６時間培養後の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価（インキュベート時間：１時間）を実施したときの外観を示す写真を図４Ｃに、それぞれ示す。
また、比較例２の第３の工程の培養開始時（０時間培養後）の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価（インキュベート時間：３時間）を実施したときの外観を示す写真を図５Ａに、実施例３〜４及び比較例２の第３の工程の培養開始から３時間培養後の培養液についてβ‐ガラクトシダーゼ活性評価（インキュベート時間：３時間）を実施したときの外観を示す写真を図５Ｂに、それぞれ示す。
以上の結果から明らかなように、本発明の製造方法（実施例１〜４）においては、第３の工程において、低温菌及び中温菌（大腸菌）に由来する酵素（β‐ガラクトシダーゼ）をコードするＤＮＡ（ｌａｃＺ）を導入した形質転換体の増殖が抑制され、かつ、前記酵素が十分に発現することが確認された。
以上説明したように、本発明によれば、低温菌及び中温菌に由来する酵素をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の増殖段階と前記酵素の発現段階とを分けることができる低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法を提供することが可能となる。
配列番号：１
＜２２３＞ ＨＭ４８プライマー
配列番号：２
＜２２３＞ ＨＭ４９プライマー
配列番号：４
＜２２３＞ ｐＮＷ３３Ｎプラスミド
配列番号：５
＜２２３＞ ＨＭ０５ｂプライマー
配列番号：６
＜２２３＞ ＨＭ０６‐ｍｉｎｕｓプライマー
配列番号：７
＜２２３＞ ＨＭ５１プライマー
配列番号：８
＜２２３＞ ＨＭ５２Ｈプライマー
配列番号：９
＜２２３＞ ｐＥＳＧ２１Ｈプラスミド
配列番号：１１
＜２２３＞ ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｆｗプライマー
配列番号：１２
＜２２３＞ ｐｒｏｍｏｔｅｒ‐ｒｖプライマー
配列番号：１３
＜２２３＞ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂＧａｌＥ−ｆｗプライマー
配列番号：１４
＜２２３＞ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−ｂＧａｌＥ−ｒｖプライマー
配列番号：１５
＜２２３＞ ＨＭ５８プライマー
配列番号：１６
＜２２３＞ ＨＭ６０プライマー
＜２２３＞ ＨＭ４８プライマー
配列番号：２
＜２２３＞ ＨＭ４９プライマー
配列番号：４
＜２２３＞ ｐＮＷ３３Ｎプラスミド
配列番号：５
＜２２３＞ ＨＭ０５ｂプライマー
配列番号：６
＜２２３＞ ＨＭ０６‐ｍｉｎｕｓプライマー
配列番号：７
＜２２３＞ ＨＭ５１プライマー
配列番号：８
＜２２３＞ ＨＭ５２Ｈプライマー
配列番号：９
＜２２３＞ ｐＥＳＧ２１Ｈプラスミド
配列番号：１１
＜２２３＞ ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｆｗプライマー
配列番号：１２
＜２２３＞ ｐｒｏｍｏｔｅｒ‐ｒｖプライマー
配列番号：１３
＜２２３＞ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂＧａｌＥ−ｆｗプライマー
配列番号：１４
＜２２３＞ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−ｂＧａｌＥ−ｒｖプライマー
配列番号：１５
＜２２３＞ ＨＭ５８プライマー
配列番号：１６
＜２２３＞ ＨＭ６０プライマー
Claims (5)
- 至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、至適増殖温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度である低温菌及び中温菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物に由来する酵素をコードするＤＮＡを導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記酵素を発現させる第３の工程と、
を含む低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法。 - 第２の工程の培養温度が５５〜８７℃である請求項１に記載の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法。
- 第３の工程の培養温度が２５〜４５℃である請求項１又は２に記載の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法。
- 前記形質転換体を培養する培養液のＯＤ６００が１以下であるときに第２の工程の培養温度から第３の工程の培養温度に変える請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法。
- 請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法で得られた酵素と前記酵素の基質とを接触させて反応せしめる、酵素反応方法。
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