JPWO2017110974A1 - 画像処理装置及びプログラム - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、診断対象とする細胞領域をより正確に抽出できる画像処理装置及びプログラムを提供することである。本発明の画像処理装置は、組織標本中の細胞の形態を表す形態画像から、候補領域を抽出する第１抽出手段（制御部２１）と、前記組織標本における１又は複数種類の生体物質の発現を表す画像から、前記生体物質の少なくとも１種類に関する生体物質情報を取得する取得手段（制御部２１）と、前記候補領域の特徴を示す特徴情報、及び／又は前記生体物質情報に基づいて、前記候補領域の中から診断対象領域を抽出する第２抽出手段（制御部２１）と、を備えることを特徴とする。

Description

本発明は、画像処理装置及びプログラムに関する。

近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効果的に設計するため、観察対象細胞上の生体物質の定量が求められている。生体物質の存在を確認する方法として、生体物質認識部位が結合された蛍光物質と、生体物質認識部位に対応した生体物質の結合に基づく、組織分析方法が知られている。

例えば、特許文献１では、組織切片の特定抗原を複数の蛍光物質を内包したナノ粒子を用いて染色し、ナノ粒子の蛍光シグナルに基づいて切片中の特定抗原の情報を生成する方法が記載されている。
特許文献１に記載の方法によれば、蛍光標識材料として高輝度の蛍光物質内包ナノ粒子を用いることにより、蛍光シグナルが組織の自家蛍光等に埋もれることなくドット状に観察される。これにより、ナノ粒子の蛍光シグナルに基づいて、細胞当たりの生体物質の数を容易に計測可能である。

特開２０１２−２０８１０６号公報

しかし、実際のところ、例えばがんの診断に用いる組織標本を撮影した画像においては、しばしば、診断対象であるがん細胞に加えて、間質組織である線維芽細胞、血管内皮細胞、筋上皮細胞、リンパ球、などが観察される。
特許文献１に記載の方法では、このような間質組織も、診断対象の細胞と共に、細胞領域として抽出される。抽出された細胞領域の中に、がんに特徴的な生体物質の発現が観察される場合には、その細胞領域が診断対象のがん細胞であるということがわかる。しかし、がんに特徴的な生体物質の発現が観察されない場合には、その細胞領域が、がんに特徴的な生体物質が発現していないがん細胞か、又は、診断対象外の細胞（間質組織）なのかが判別できない。
従って、特許文献１に記載の方法では、診断対象であるがん細胞の領域のみを抽出することができないため、診断対象細胞当たりの生体物質の数などの診断支援情報に誤差が生じてしまい、誤診につながる可能性があった。

本発明の主な目的は、診断対象とする細胞領域を、より正確に抽出できる画像処理装置及びプログラムを提供することにある。
本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。

１．組織標本中の細胞の形態を表す形態画像から、候補領域を抽出する第１抽出手段と、
前記組織標本における１又は複数種類の生体物質の発現を表す画像から、前記生体物質の少なくとも１種類に関する生体物質情報を取得する取得手段と、
前記候補領域の特徴を示す特徴情報、及び／又は前記生体物質情報に基づいて、前記候補領域の中から診断対象領域を抽出する第２抽出手段と、
を備えることを特徴とする画像処理装置。

２．前記第２抽出手段は、少なくとも前記特徴情報に基づいて診断対象領域を抽出し、
前記特徴情報は、前記候補領域の形状、面積、及び位置の少なくとも一つを含むことを特徴とする、第１項に記載の画像処理装置。

３．前記第２抽出手段は、少なくとも前記生体物質情報に基づいて診断対象領域を抽出し、
前記生体物質情報は、前記生体物質の位置、個数、及び密度の少なくとも一つを含むことを特徴とする、第１項又は第２項に記載の画像処理装置。

４．前記取得手段は、前記組織標本における複数種類の生体物質の発現を表す画像から、複数種類の前記生体物質に関する生体物質情報を取得し、
前記第２抽出手段は、少なくとも第１の生体物質に関する前記生体物質情報に基づいて前記診断対象領域を抽出することを特徴とする、第１項から第３項の何れか一項に記載の画像処理装置。

５．前記第２抽出手段により抽出された診断対象領域における診断支援情報を、前記生体物質情報に基づいて作成する作成手段を備えることを特徴とする、第１項から第４項の何れか一項に記載の画像処理装置。

６．前記第２抽出手段により抽出された診断対象領域における診断支援情報を、第２の生体物質に関する前記生体物質情報に基づいて作成する作成手段を備えることを特徴とする、第４項に記載の画像処理装置。

７．コンピュータを、
組織標本中の細胞の形態を表す形態画像から、候補領域を抽出する第１抽出手段、
前記組織標本における１又は複数種類の生体物質の発現を表す画像から、前記生体物質の少なくとも１種類に関する生体物質情報を取得する取得手段、
前記候補領域の特徴を示す特徴情報、及び／又は前記生体物質情報に基づいて、前記候補領域の中から診断対象領域を抽出する第２抽出手段、
として機能させるためのプログラム。

本発明によれば、診断対象とする細胞領域を、より正確に抽出することができる。

診断支援情報生成システムのシステム構成を示す図である。 図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。 第１実施形態における画像解析処理を示すフローチャートである。 候補領域の抽出工程の流れを示すフローチャートである。 蛍光輝点の抽出工程の流れを示すフローチャートである。 第１実施形態のステップＳ１５で重ね合わせられた画像の模式図である。 第２実施形態における画像解析処理を示すフローチャートである。 第２実施形態のステップＳ２５で重ね合わせられた画像の模式図である。 第３実施形態における画像解析処理を示すフローチャートである。 第３実施形態のステップＳ３７で重ね合わせられた画像の模式図である。 第３実施形態の変形例のステップＳ３７で重ね合わせられた画像の模式図である。 第４実施形態における画像解析処理を示すフローチャートである。 第４実施形態のステップＳ４７で重ね合わせられた画像の模式図である。

以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。

＜病理診断支援システム１００の構成＞
図１に、病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。
病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された人体の組織切片の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。

図１に示すように、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａなどのインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。
顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。たとえば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。

顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆなどを備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルターなどにより構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズなどにより構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、または蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）センサーなどを備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。
顕微鏡画像取得装置１Ａでは、明視野観察に適した照射手段および結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段および結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
なお、公知の任意の顕微鏡（例えば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡等）にカメラを設置したものを顕微鏡画像取得装置１Ａとして用いることができる。

なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、たとえば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（たとえば、特表２００２−５１４３１９号公報参照）などを用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。

画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現分布を算出する。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。
図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５などを備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。

制御部２１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）などを備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。
たとえば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されている画像処理プログラムとの協働により画像解析処理を実行し、第１抽出手段、取得手段、第２抽出手段、及び作成手段としての機能を実現する。

操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、各種機能キーなどを備えたキーボードと、マウスなどのポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。

表示部２３は、たとえばＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）などのモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。

通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。

記憶部２５は、たとえばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリーなどで構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データなどが記憶されている。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーターなどを備え、ＬＡＮなどの通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。

＜画像について＞
本実施形態では、画像処理装置２Ａは、例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された、細胞における特定の生体物質の発現を表す画像（例えば、細胞における特定の生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像）、及び細胞核、細胞膜等、細胞の所定の構造の形態を表す形態画像（例えば、明視野画像）を用いて解析を行うことが好ましい。

「明視野画像」とは、例えば、ヘマトキシリン染色試薬（Ｈ染色試薬）、ヘマトキシリン−エオジン染色試薬（ＨＥ染色試薬）を用いて染色された組織切片を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像および撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリン（Ｈ）は青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織など）を染色する。エオジン（Ｅ）は赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織など）を染色する。
細胞の形態画像としては、明視野画像の他に、細胞の診断対象とする構造を特異的に染色可能な蛍光染色試薬を用いて組織切片を染色し、用いた蛍光染色試薬が発する蛍光を撮影した蛍光画像を用いても良い。形態画像の取得に用いることができる蛍光染色試薬としては、例えば、細胞核を染色可能なＤＡＰＩ染色、細胞質を染色可能なパパロニコロウ染色等が挙げられる。また、位相差画像、微分干渉画像、電子顕微鏡画像等を形態画像として用いても良い。

細胞における特定の生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合および／または反応する蛍光物質又は蛍光物質内包ナノ粒子を含む蛍光染色試薬を用いて染色された組織切片に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質を蛍光発光させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。なお、「蛍光物質内包ナノ粒子」とは蛍光物質を内包したナノ粒子であり、詳しくは後述する。

＜蛍光染色試薬や染色方法など＞
以下、細胞に特異的に発現する特定の生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を取得するための蛍光染色試薬や当該蛍光染色試薬を用いた組織切片の染色方法について説明する。

（１）蛍光物質
蛍光染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素および量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜１１００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。

蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子などを挙げることができる。
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などを挙げることができる。これら蛍光有機色素は単独で使用されてもよいし、複数種を混合して使用されてもよい。

量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、またはIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。これら量子ドットも単独で使用されてもよいし、複数種を混合して使用されてもよい。
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。

上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。下記では、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。
たとえば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ_２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ_２、Ｇｅ／ＺｎＳなどを用いることができるが、これらに限定されない。

量子ドットは必要に応じて、有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。たとえば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。

（２）蛍光物質内包ナノ粒子
「蛍光物質内包ナノ粒子」とは、上記のとおり蛍光物質を内包したナノ粒子であって、詳しくは蛍光物質をナノ粒子の内部に分散させたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していてもよいし、結合していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、シリカ、ポリスチレン、ポリ乳酸、メラミンなどを挙げることができる。

蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。
たとえば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア ８巻 ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー ３３巻 ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。

蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０〜８００ｎｍ程度のものを用いることができる。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％以下のものを用いることが好ましい。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた値である。本実施形態では、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とする。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とする。

（３）生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との結合
本実施形態では、特定の生体物質と特異的に結合および／または反応する蛍光染色試薬として、蛍光物質内包ナノ粒子と生体物質認識部位を予め直接結合したものを用いる場合を例にとって説明する。「生体物質認識部位」とは、特定の生体物質と特異的に結合および／または反応する部位である。
特定の生体物質としては、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）などが挙げられる。
したがって、生体物質認識部位としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質など、および前記核酸にハイブリタイズする塩基
配列を有する核酸などが挙げられる。
具体的な生体物質認識部位としては、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体などが挙げられる。
中でも、抗ＨＥＲ２抗体および抗ＥＲ抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたもの（蛍光染色試薬）は、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。

生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着などが挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。

生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との間にはこれらを連結する有機分子があってもよい。たとえば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。

蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。
たとえば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。
具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（たとえば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）などが挙げられる。
シランカップリング剤を用いる場合、２種以上を併用してもよい。

蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。
たとえば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離またはろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。

必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Sulfosuccinimidyl 4[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate：Pierce社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。

蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基などの官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基もつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣまたはｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。

生体物質認識部位の一例として、M.アクチン、M.S.アクチン、S.M.アクチン、ACTH、Alk-1、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、AFP、bcl-2、bcl-6、β-カテニン、BCA 225、CA19-9、CA125、カルシトニン、カルレチニン、CD1a、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD15、CD20、CD21、CD23、CD30、CD31、CD34、CD43、CD45、CD45R、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、"CD99, MIC2"、CD138、クロモグラニン、c-KIT、c-MET、コラーゲン タイプIV、Cox-2、サイクリンD1、ケラチン、サイトケラチン（高分子量）、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン 5/6、サイトケラチン 7、サイトケラチン 8、サイトケラチン 8/18、サイトケラチン 14、サイトケラチン 19、サイトケラチン 20、CMV、E-カドヘリン、EGFR、ER、EMA、EBV、第VIII因子関連抗原、ファッシン、FSH、ガレクチン−３、ガストリン、GFAP、グルカゴン、グリコフォリンＡ、グランザイムB、hCG、hGH、ヘリコバクターピロリ、HBc抗原、HBs抗原、ヘパトサイト特異抗原、HER2、HSV-I、HSV-II、HHV-8、IgA、IgG、IgM、IGF-1R、インヒビン、インスリン、カッパL鎖、Ki67、ラムダL鎖、LH、リゾチーム、マクロファージ、メランA、MLH-1、MSH-2、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、NSE、p27（Kip1）、p53、P63、PAX 5、PLAP、ニューモシスティス カリニ、ポドプラニン（D2-40）、PGR、プロラクチン、PSA、前立腺酸性フォスファターゼ、Renal Cell Carcinoma、S100、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、TAG-72、TdT、サイログロブリン、TSH、TTF-1、TRAcP、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、WT1、Zap-70などの特定抗原を認識する抗体が挙げられる。

なお、蛍光物質又は蛍光物質内包ナノ粒子は、上記のように生体物質認識部位と予め直接結合して用いる他、免疫染色における公知の間接法のように、染色工程において間接的に生体物質認識部位に結合されても良い。具体的には、例えば、組織標本に対して特定の生体物質を抗原とするビオチン化一次抗体を反応させた後、ストレプトアビジンにより修飾された蛍光物質又は蛍光物質内包ナノ粒子を結合させた染色試薬をさらに反応させて、ストレプトアビジンとビオチンが特異的に結合して複合体を形成することを利用して染色しても良い。また、例えば、組織標本に対して、特定タンパクを抗原とする一次抗体を反応させ、さらに当該一次抗体を抗原とするビオチン化二次抗体を反応させた後、ストレプトアビジンにより修飾された蛍光物質又は蛍光物質内包ナノ粒子を反応させて染色しても良い。

（４）染色方法
組織切片の作製方法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。下記染色方法は病理組織切片に限定せず、培養細胞にも適用可能である。

（４．１）脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に組織切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に組織切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限
定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中で水を交換してもよい。

（４．２）賦活化処理
公知の方法にならい、組織切片の生体物質の賦活化処理を行う。
賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０度、時間は５〜３０分で行うことができる。
次いで、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の組織切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。

（４．３）蛍光染色試薬を用いた染色
蛍光染色試薬のＰＢＳ分散液を組織切片に載せ、組織切片の生体物質と反応させる。
蛍光染色試薬の生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。蛍光染色試薬として、数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織切片に載せてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光染色試薬による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織切片を浸漬させ、未反応の蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。

なお、形態画像を得るためにＨＥ染色試薬を用いるＨＥ染色等を実施する場合は、カバーガラスによる封入前に行う。

（５）蛍光画像の取得
染色した組織切片に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、蛍光染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源と蛍光検出用光学フィルターとを選択する。

＜診断支援情報生成システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、診断支援情報生成システム１００において、細胞の形態を表す形態画像及び細胞における特定の生体物質の発現を表す画像を取得して、解析を行う動作について、具体的な実施形態を挙げて説明するが、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
本発明の画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されている画像処理プログラムとの協働により実行され、制御部２１はその画像処理プログラムにしたがって、以下の実施形態に記載の処理を実行する。

（第１実施形態）
第１実施形態では、ＨＥ染色及び蛍光物質内包ナノ粒子を用いたＫｉ６７タンパクの染色を施された乳癌組織の切片を組織標本として用いて、ＨＥ染色により青紫色に染色された領域を候補領域として抽出し、候補領域の中から、乳がん組織中のがん細胞の細胞核の領域を、診断対象領域として抽出する。
Ｋｉ６７タンパク（以下、特定タンパク）は、例えばがん細胞の細胞核において高濃度に発現することが知られている。
細胞の所定の構造の形態を表す形態画像としては、明視野画像を取得し、細胞における特定の生体物質（ここでは、特定タンパク）の発現を表す画像としては、蛍光画像を取得する。

まず、操作者は、ＨＥ染色試薬と、蛍光染色試薬（抗Ｋｉ６７抗体が結合した蛍光物質内包ナノ粒子）を用いて組織切片を染色する。
その後、顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、（ａ１）〜（ａ５）の手順により明視野画像および蛍光画像を取得する。
（ａ１）操作者は、ＨＥ染色試薬と蛍光染色試薬とによりそれぞれ染色された組織切片をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）ユニットを明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織切片上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野および撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。

上記の画像の取得方法によれば、組織切片のほぼ同一範囲を撮影した蛍光画像及び形態画像が得られるが、蛍光画像及び形態画像は、同一範囲を撮影した画像に限定されず、撮影範囲の少なくとも一部が重なっていればよい。具体的には、例えば、組織切片内の狭い領域を撮影した蛍光画像と、その蛍光画像を撮影した領域を包含する広い範囲を撮影した形態画像を取得して、公知の方法により形態画像と蛍光画像の位置合わせを行った後、後述する画像解析処理を行っても良い。

その後、画像処理装置２Ａを用いて、明視野画像および蛍光画像に基づき画像解析処理を実行する。
図３に、第１実施形態の画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。

まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像（形態画像）が入力されると（ステップＳ１１）、明視野画像から青紫色に染色された細胞核の領域を抽出する（ステップＳ１２：第１抽出工程）。
ステップＳ１２では、図４に示されるとおり、例えば、明視野画像をモノクロ画像に変換し（ステップＳ１２１）、予め定められた閾値でモノクロ画像に閾値処理を施して各画素の値を二値化し（ステップＳ１２２）、二値画像にノイズ処理を実行する（ステップＳ１２３）。

ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理を施すことにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。
ステップＳ１２１〜Ｓ１２３により、明視野画像から候補領域（本実施形態では、細胞核の領域）が抽出された画像（候補領域画像）が生成される。

次いで、抽出された候補領域の特徴を示す特徴情報を抽出する（ステップＳ１２４）。
特徴情報とは、候補領域に関する情報であれば任意であるが、例えば、候補領域の大きさ（面積、周囲長、短径または長径の長さ、等）及び形状（円形度、短径と長径の比、等）、位置、分布の何れか１つを含む。
円形度の定義は任意であるが、例えば、細胞核の面積をＳ、周囲長をＬとした場合に、４πＳ／Ｌ^２の式で算出される値が１に近いほど、円形に近く、円形度が高いと定義することができる。また、候補領域の面積と候補領域の凸包領域の面積の比である凸包面積比を算出して、これが１に近い場合に円形度が高いと定義してもよい。
位置は、例えば、候補領域の重心の座標として定義できる。
また、分布は、例えば、隣接する候補領域との距離、又は明視野画像中の候補領域の密度として定義できる。

一方、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの蛍光画像が入力されると（ステップＳ１３）、蛍光画像から蛍光輝点が抽出され、特定タンパクに関する生体物質情報が取得される（ステップＳ１４：取得工程）。
ステップＳ１４では、図５に示されるとおり、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分を抽出し（ステップＳ１４１）、色成分抽出後の蛍光画像に閾値処理を施して蛍光輝点が抽出された二値画像（蛍光輝点画像）を生成する（ステップＳ１４２）。
ステップＳ１４１では、染色に用いた蛍光粒子の発光波長成分の輝度が所定の閾値以上である蛍光輝点のみが抽出される。ステップＳ１４２の閾値処理の前に、細胞自家蛍光や他の不要信号成分などのノイズ除去処理が施されてもよい。
ステップＳ１４１〜Ｓ１４２により、蛍光輝点が抽出された画像（蛍光輝点画像）が生成される。
次いで、ステップＳ１４３では、蛍光輝点に基づく生体物質情報が取得される。生体物質情報は、例えば、画像における蛍光輝点の位置（座標）の情報である。

ステップＳ１４の工程の後、候補領域画像と蛍光輝点画像との加算処理を実行して、候補領域と蛍光輝点を重ね合わせる（ステップＳ１５）。
次いで、候補領域の特徴情報に基づいて、候補領域の中から診断対象領域が抽出される（ステップＳ１６：第２抽出工程）。
具体的には、ステップＳ１６において、制御部２１は、予め記憶部２５に記憶されている診断対象の細胞の面積や形状などの特徴のデータを読み出して、候補領域の特徴情報と比較し、候補領域が診断対象領域であるか否かを判別する。

図６は、ステップＳ１５で重ね合わせられた画像の模式図の一例であり、ステップＳ１２で抽出された候補領域１１〜１３、及び、ステップＳ１４で抽出された蛍光輝点１４が示されている
候補領域１１及び１２は、ステップＳ１６において、候補領域の面積、形等に基づいて診断対象のがん細胞であると判別されて、診断対象領域として抽出される。一方、面積が小さい候補領域１３は、ステップＳ１６において、がん細胞ではなく、例えば間質組織である線維芽細胞と考えられるため、診断対象領域として抽出されない。

ステップＳ１７（作成工程）では、ステップＳ１６で抽出された診断対象領域における生体物質情報に基づいて、細胞当たりの特定タンパクの数、密度、分布等の診断支援情報が作成される。

（第２実施形態）
以下、第２実施形態の診断支援情報生成システム１００の動作について説明する。組織標本は、上述した第１実施形態と同様のものを用いることとする。
図７に、第２実施形態における画像解析処理のフローチャートを示す。ステップＳ２１〜Ｓ２５の工程は、上述した第１実施形態のステップＳ１１〜Ｓ１５の工程と同様に行われる。

第２実施形態のステップＳ２６〜Ｓ２７（第２抽出工程）では、ステップＳ２４（取得工程）で取得された生体物質情報に基づいて、候補領域の中から診断対象領域が抽出される。
第２実施形態の第２抽出工程で用いられる生体物質情報の例としては、画像内における蛍光輝点の位置、候補領域当たりの蛍光輝点数、密度などが挙げられる。

図８は、ステップＳ２５で得られた画像の模式図の例を示す。図８において、白い丸は候補領域、黒い丸は蛍光輝点を示す。第２実施形態のステップＳ２６では、蛍光輝点が比較的密集して存在している特定タンパク密集領域２０（図８中、点線で囲まれた領域）が判定される。蛍光輝点の密集の程度の判定方法は任意である。例えば、所定の数以上の蛍光輝点を含む候補領域が互いに近接して密集している場合に、これらの近接した候補領域を包含する領域が、特定タンパク密集領域２０と判定される。
次いで、ステップＳ２７では、特定タンパク密集領域２０の中にある候補領域が診断対象であると判別され、診断対象領域として抽出される。特定タンパク密集領域２０から所定の距離以上離れた位置にある候補領域は、たとえ蛍光輝点を含んでいた場合でも、診断対象ではないと判別され、診断対象領域として抽出されない。

ステップＳ２８（作成工程）では、ステップＳ２７で抽出された診断対象領域における生体物質情報に基づいて、細胞当たりの特定タンパクの数、密度、分布等の診断支援情報が作成される。

第２実施形態の診断対象領域の抽出を行うためには、ある程度の量の特定タンパクの発現を示す蛍光輝点が、画像内にて観察される必要がある。しかし、例えば次のような場合には、第２実施形態の診断対象領域の抽出方法は特に適している。
大腸がんや胃がんの診断では、検体を採取した際、がん細胞が検体の表面からどの深さまで浸潤しているのかが重要であり、かつ、がん細胞が密集している領域から離れた細胞は診断対象としないことが一般的である。従って、このような場合、特定タンパク密集領域の細胞を診断対象とし、特定タンパク密集領域から離れた細胞は診断対象外とすることが好ましい。

（第３実施形態）
以下の第３実施形態では、ＨＥ染色、及び蛍光物質内包ナノ粒子を用いた第１の生体物質及び第２の生体物質（特定タンパク）の染色を施された乳癌組織の切片を組織標本として用いて、ＨＥ染色により青紫色に染色された領域を候補領域として抽出し、候補領域の中から、がん細胞の細胞核の領域を診断対象領域として抽出する。
第３実施形態において、例えば、第１の生体物質は、間質組織である線維芽細胞に発現することが知られている112kDaのタンパク質であり、第２の生体物質（特定タンパク）は、細胞核に発現しているＫｉ６７タンパクである。
第１の生体物質及び第２の生体物質の染色に用いる蛍光物質内包ナノ粒子は、一方が発する蛍光が他方の励起光とならないように選択する。
細胞の所定の構造の形態を表す形態画像としては、明視野画像を取得し、細胞における特定の生体物質（ここでは、第１の生体物質及び第２の生体物質）の発現を表す画像としては、蛍光画像を取得する。

まず、操作者は、ＨＥ染色試薬と、蛍光染色試薬（第１の生体物質及び第２の生体物質の抗体が結合した蛍光物質内包ナノ粒子）を用いて、組織切片を染色する。
その後、顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、（ａ１）〜（ａ６）の手順により明視野画像および蛍光画像を取得する。
（ａ１）操作者は、ＨＥ染色試薬と蛍光染色試薬とによりそれぞれ染色された組織切片をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）ユニットを明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織切片上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野および撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って、第１の生体物質の発現を表す第１の蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ６）視野および撮影倍率を変えずに、励起光及びフィルターを変更して、撮像手段で撮影を行って、第２の生体物質の発現を表す第２の蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。

その後、画像処理装置２Ａにおいて、明視野画像、第１の蛍光画像、および第２の蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
図９に、第３実施形態における画像解析処理のフローチャートを示す。
ステップＳ３１〜Ｓ３２（第１抽出工程）の工程は、上述した第１実施形態のステップＳ１１〜Ｓ１２の工程と同様に行われる。
ステップＳ３３〜Ｓ３４（取得工程）、及びステップＳ３５〜Ｓ３６（取得工程）の工程は、それぞれ、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａから入力される（ａ５）で取得した第１の蛍光画像及び（ａ６）で取得した第２の蛍光画像に対して、上述した第１実施形態のステップＳ１３〜Ｓ１４と同様に行われる。

ステップＳ３６の工程の後、候補領域（細胞核）画像と第１の生体物質及び第２の生体物質の発現をそれぞれ示す蛍光輝点画像との加算処理が実行され、候補領域と蛍光輝点とが重ね合わせられる（ステップＳ３７）。

次いで、ステップＳ３４で取得された第１の生体物質に関する生体物質情報に基づいて、候補領域の中から診断対象領域が抽出される（ステップＳ３８：第２抽出工程）。
具体的には、ステップＳ３８において、各候補領域に第１の生体物質が含まれるか否かに基づいて、候補領域が診断対象領域であるか否かが判別される。

図１０は、ステップＳ３２で抽出された候補領域３１〜３３、及び、ステップＳ３４で抽出された第１の生体物質の発現を示す蛍光輝点３４、及びステップＳ３６で抽出された第２の生体物質の発現を示す蛍光輝点３５が見られる、ステップＳ３７で重ね合わせられた画像の模式図の一例である。
候補領域３１及び３２は、ステップＳ３８において、線維芽細胞に発現する112kDaのタンパク質の発現が見られないことから、診断対象のがん細胞であると判別されて、診断対象領域として抽出される。一方、線維芽細胞に発現する112kDaのタンパク質の発現を示す蛍光輝点３４が見られる候補領域３３は、ステップＳ３８において、がん細胞ではなく線維芽細胞であると判別されるため、診断対象領域として抽出されない。

ステップＳ３９（作成工程）では、ステップＳ３８で抽出された診断対象領域における第２の生体物質に関する生体物質情報に基づいて、細胞当たりの第２の生体物質の数、
密度、分布等の診断支援情報が作成される。

（第３実施形態の変形例）
第３実施形態の変形例における画像解析処理は、第３実施形態における画像解析処理（図９のフローチャート参照）と同様に行われる。 上述した第３実施形態の第１の生体物質としてＣＥＡを用いた場合を例にとって、第３実施形態の変形例を説明する。ＣＥＡは上皮系のがん細胞のマーカーとして知られる。
第３実施形態の変形例におけるステップＳ３１〜Ｓ３７の詳細は、第１の生体物質としてＣＥＡを用いる他は、上述した第３実施形態のステップＳ３１〜Ｓ３７と同様である。

第３実施形態の変形例のステップＳ３８（第２抽出工程）では、ステップＳ３４で取得された第１の生体物質（ＣＥＡ）に関する生体物質情報に基づいて、候補領域の中から診断対象領域が抽出される。
具体的には、第３実施形態の変形例におけるステップＳ３８では、各候補領域にＣＥＡが含まれるか否かに基づいて、候補領域が診断対象領域であるか否かが判別される。

図１１は、ステップＳ３２（第１抽出工程）で抽出された候補領域３１Ａ〜３３Ａ、及び、ステップＳ３４（取得工程）で抽出されたＣＥＡの発現を示す蛍光輝点３４Ａ、及びステップＳ３６（取得工程）で抽出された第２の生体物質の発現を示す蛍光輝点３５Ａが見られる、ステップＳ３７で重ね合わせられた画像の模式図の一例である。
候補領域３１Ａ及び３２Ａは、ＣＥＡの発現（蛍光輝点３４Ａ）が見られることから、ステップＳ３８において、診断対象のがん細胞であると判別されて、診断対象領域として抽出される。一方、ＣＥＡの発現が見られない候補領域３３Ａは、ステップＳ３８において、がん細胞ではなく線維芽細胞であると判別されるため、診断対象領域として抽出されない。

第３実施形態の変形例のステップＳ３９（作成工程）は、上述した第３実施形態のステップＳ３９と同様に行われる。

（第４実施形態）
以下、第４実施形態の診断支援情報生成システム１００の動作について説明する。組織標本は、上述した第３実施形態と同様のものを用いることとして説明する。
図１２に、第４実施形態における画像解析処理のフローチャートを示す。
ステップＳ４１〜Ｓ４７の工程は、上述した第３実施形態のステップＳ３１〜Ｓ３７の工程と同様に行う。

第４実施形態のステップＳ４８（第２抽出工程）では、ステップＳ４２（第１抽出工程）で取得された候補領域の特徴情報及びステップＳ４４（取得工程）で取得された第１の生体物質に関する生体物質情報に基づいて、候補領域の中から診断対象領域が抽出される。
具体的には、例えば、ステップＳ４８において、まず、上述した第１実施形態のステップＳ１６と同様に、候補領域の特徴情報に基づいて診断対象領域であると判別された候補領域が抽出される。次いで、抽出された候補領域に第１の生体物質が含まれるか否かに基づいて、さらに第３実施形態のステップＳ３８と同様にして、候補領域が診断対象領域であるか否かが判別される。

図１３は、ステップＳ４２で抽出された候補領域４１〜４５、及び、ステップＳ４４で抽出された第１の生体物質の発現を示す蛍光輝点４６、及びステップＳ４６（取得工程）で抽出された第２の生体物質の発現を示す蛍光輝点４７が見られる、ステップＳ４７で重ね合わせられた画像の模式図の一例である。
ステップＳ４８において、まず、候補領域の面積及び形状に基づいて、候補領域４１〜４３が、診断対象のがん細胞であると判別されて抽出される。一方、円形度が低い候補領域４４及び面積が小さい候補領域４５は、がん細胞ではないと判別されるため、抽出されない。
次いで、抽出された候補領域４１〜４３のうち、候補領域４１及び４２は、線維芽細胞に発現する112kDaのタンパク質の発現を示す蛍光輝点４５が見られないことから、診断対象のがん細胞であると判別されて、診断対象領域として抽出される。一方、線維芽細胞に発現する112kDaのタンパク質の発現を示す蛍光輝点が見られる候補領域４３は、ステップＳ４８において、がん細胞ではなく線維芽細胞であると判別されるため、診断対象領域として抽出されない。

ステップＳ４９（作成工程）では、ステップＳ４８で抽出された診断対象領域における第２の生体物質に関する生体物質情報に基づいて、細胞当たりの第２の生体物質の数、密度、分布等の診断支援情報が作成される。

以上説明した第１〜第４実施形態によれば、細胞の特徴情報及び／又は生体物質情報に基づいて、候補領域の中から、診断対象でない細胞を除いた診断対象領域が抽出される。
これにより、診断対象領域における生体物質の発現に基づいて診断支援情報を作成することができるので、観察対象細胞における特定タンパクの発現を正確に定量可能であり、診断の精度が向上する。

なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。

上記実施形態では、診断支援情報を１種の特定タンパクのみに基づいて作成したが、複数の特定タンパクに対し、発光波長が互いに異なる２種以上の蛍光粒子を用いてもよい。

また、上記実施形態では、特定タンパクの例として乳癌におけるＫｉ６７タンパクを挙げたが、これに限定されない。診断対象となる病変（がん）種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた特定タンパクの発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。

また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ（搬送波）も適用される。
その他、診断支援情報生成システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。

本発明は、診断対象とする細胞領域を精度良く抽出可能であることを特徴とし、高精度な病理診断情報の生成に特に好適に利用することができる。

１Ａ 顕微鏡画像取得装置
２Ａ 画像処理装置
２１ 制御部
２２ 操作部
２３ 表示部
２４ 通信Ｉ／Ｆ
２５ 記憶部
２６ バス
３Ａ ケーブル
１１〜１３ 候補領域
１４ 蛍光輝点
２０ 特定タンパク密集領域
３１〜３３ 候補領域
３４、３５ 蛍光輝点
３１Ａ〜３３Ａ 候補領域
３４Ａ、３５Ａ 蛍光輝点
４１〜４５ 候補領域
４６、４７ 蛍光輝点
１００ 診断支援情報生成システム

Claims (7)

1. 組織標本中の細胞の形態を表す形態画像から、候補領域を抽出する第１抽出手段と、
   前記組織標本における１又は複数種類の生体物質の発現を表す画像から、前記生体物質の少なくとも１種類に関する生体物質情報を取得する取得手段と、
   前記候補領域の特徴を示す特徴情報、及び／又は前記生体物質情報に基づいて、前記候補領域の中から診断対象領域を抽出する第２抽出手段と、
   を備えることを特徴とする画像処理装置。
2. 前記第２抽出手段は、少なくとも前記特徴情報に基づいて診断対象領域を抽出し、
   前記特徴情報は、前記候補領域の形状、面積、及び位置の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１に記載の画像処理装置。
3. 前記第２抽出手段は、少なくとも前記生体物質情報に基づいて診断対象領域を抽出し、
   前記生体物質情報は、前記生体物質の位置、個数、及び密度の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の画像処理装置。
4. 前記取得手段は、前記組織標本における複数種類の生体物質の発現を表す画像から、複数種類の前記生体物質に関する生体物質情報を取得し、
   前記第２抽出手段は、少なくとも第１の生体物質に関する前記生体物質情報に基づいて前記診断対象領域を抽出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の画像処理装置。
5. 前記第２抽出手段により抽出された診断対象領域における診断支援情報を、前記生体物質情報に基づいて作成する作成手段を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の画像処理装置。
6. 前記第２抽出手段により抽出された診断対象領域における診断支援情報を、第２の生体物質に関する前記生体物質情報に基づいて作成する作成手段を備えることを特徴とする請求項４に記載の画像処理装置。
7. コンピュータを、
   組織標本中の細胞の形態を表す形態画像から、候補領域を抽出する第１抽出手段、
   前記組織標本における１又は複数種類の生体物質の発現を表す画像から、前記生体物質の少なくとも１種類に関する生体物質情報を取得する取得手段、
   前記候補領域の特徴を示す特徴情報、及び／又は前記生体物質情報に基づいて、前記候補領域の中から診断対象領域を抽出する第２抽出手段、
   として機能させるためのプログラム。

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